ТЕХНОЛОГИЯ ВЫДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ L
реклама
НТП: ПЕРЕРАБОТКА УДК 577.112.387.2:612.398.193 ТЕХНОЛОГИЯ ВЫДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ LФЕНИЛАЛАНИНАММОНИЙЛИАЗЫ* С.А. СУХИХ, аспирант О.О. БАБИЧ, кандидат технических наук, руково дитель научнообразовательного центра Л.С. СОЛДАТОВА, аспирант Кемеровский ТИПП Email: stasasp@rambler.ru Резюме. Выбраны рациональные условия осажде ния фермента Lфенилаланинаммонийлиазы орга ническим растворителем. Установлены оптималь ные параметры очистки препарата с использовани ем мембранных и хроматографических методов. Ключевые слова: фенилкетонурия, фенилаланин, Lфенилаланинаммонийлиаза, гидролизаты бел ка, специализированные продукты. В последние годы во всем мире особое внима ние уделяется созданию специализированных и ле чебных продуктов питания. К ним относятся продук ты, предназначенные для систематического упот ребления в составе пищевых рационов, сохраняю щие и укрепляющие здоровье благодаря наличию веществ, способных оказывать благоприятный эф фект на физиологические функции и процессы об мена веществ в организме [1]. При некоторых заболеваниях применение раци онов с включением специализированных и лечебных продуктов – единственный метод, позволяющий пре дупреждать развитие последствий болезни. К числу таких заболеваний относятся наследственные на рушения аминокислотного обмена [1, 2]. Среди них наиболее распространенное заболе вание – фенилкетонурия. В его основе лежит нару шение активности фенилаланин4гидроксилазы, осуществляющего превращение фенилаланина в ти розин [2]. Отсутствие этого фермента в организме приводит к накоплению в тканях и жидкостях боль ного как самого фенилаланина, так и его производ ных, которые оказывают прямое токсическое дей ствие на центральную нервную систему, вызывают нарушения в белковом обмене, обмене липо и гли копротеидов [2, 3]. До сих пор единственный эффективный методом лечения фенилкетонурии – диетотерапия, постро енная по принципу резкого ограничения поступле ния фенилаланина с пищей [4]. Для этого из рацио на исключают продукты с высоким содержанием со ответствующей аминокислоты. Адекватной заменой им служат специализированные продукты на осно ве смеси аминокислот или белковые эквиваленты с минимальным содержанием фенилаланина [2, 4]. Традиционная технология получения продуктов для питания больных фенилкетонурией основана на се лективной адсорбции или мембранном фракциониро вании частичных гидролизатов белка. Расщепление полипептидной цепи молекулы белка проводят проте азами, при этом степень гидролиза достигает 30…60 %, что не обеспечивает полного удаления фенилала *Работа выполнена в рамках федеральной целевой про граммы «Научные и научнопедагогические кадры иннова ционной России» на 20092013 годы. 78 нина. Последующая адсорбция или мембранное фракционирование – не достаточно эффективны, по скольку при этом могут быть удалены только моле кулы фенилаланина, находящиеся в свободном со стоянии. Кроме того, на поверхности сорбента оста ется значительное количество аминокислот, что вы зывает необходимость подбора соответствующих элюентов для их удаления и в дальнейшем дополни тельного обогащения полученных гидролизатов до физиологических потребностей организма [4, 5]. На наш взгляд, целесообразнее использовать ре акцию биотрансформации фенилаланина с помощью фермента Lфенилаланинаммонийлиазы (ФАЛ, PAL, КФ 4.3.1.5), обладающего высокой специфич ностью к этой аминокислоте, в целенаправленных энзиматических гидролизатах молочного белка, по лученных в результате действия комплекса специ ально подобранных ферментов. Это обеспечит мак симальное удаление фенилаланина из полипептид ной цепи и позволит разработать технологию полу чения молочного белкового эквивалента для специ ализированных продуктов, предназначенных для пи тания больных фенилкетонурией [5]. Существенное препятствие для повсеместного использования этого фермента в России полное отсутствие его производства. В связи с этим цель наших исследований – раз работка технологии выделения и очистки фермент ного препарата Lфенилаланинаммонийлиазы. Условия, материалы и методы. Исследования осуществляли в научнообразовательном центре Ке меровского ТИПП. Объект исследований – фермент Lфенилала нинаммонийлиаза (ФАЛ, PAL), продуцированный клетками E. Coli. На предварительном этапе прово дили молекулярное клонирование гена pal в клет ках E. Coli, получение рекомбинантного штамма продуцента, обеспечивающего устойчивую экспрес сию гена pal, и наработку биомассы с использова нием стандартных методик [5]. Для выделения ферментного препарата исполь зовали метод осаждения смешивающимися с водой органическими растворителями (ацетон, этиловый и изопропиловый спирт). Для осаждения Lфенилаланинаммонийлиазы ацетоном необходимо правильно подобрать рН ре акционной среды, рабочую концентрацию раство рителя и температурный режим, так как совместно эти факторы способны оказывать существенное воздействие на биологическую и каталитическую ак тивность, а также выход целевого белка. Для предотвращения денатурации ферментного препарата при осаждении органическими раство рителями, согласно [5], температурный режим не должен превышать 0±2 оС. Поэтому процесс осаж дения белковой фракции из экстракта проводили при такой температуре. Очистку фермента осуществляли мембранными методами – диализ, ультрафильтрация и микрофиль трация, а затем методом хроматографии с карбок симетилцелюллозой (КМцеллюлозой) и диэтилами ноэтилцеллюлозой (ДЭАЭцеллюлозой). Достижения науки и техники АПК, №092010 НТП: ПЕРЕРАБОТКА Удаление остатков молекул ацетона из выделен ного ферментного препарата проводили методом диализа. Для концентрирования белкового раство ра, полученного после разрушения клеточной сус пензии, его подвергали ультрафильтрации через мембраны марки УПМ различной пористости и про ницаемости для низкомолекулярных веществ и ра створителя. Для очистки концентрата от контаминирующей микрофлоры методом микрофильтрации использо вали фильтры с различным диаметром пор. Для повышения каталитической активности ферментного препарата и удаления положительно заряженных белков осуществляли ионообменную хроматографию на колонке с КМцеллюлозой. Ра створ фермента наносили на колонку (2,2×10,0 см) и элюировали градиентом концентраций NaCl в фосфатном буфере (рН 6,5) со скоростью 10,0 см3/ ч. Элюат собирали порциями по 3,0±0,1 см3. В каж дой фракции определяли концентрацию белка на экспрессанализаторе Rapid N и удельную актив ность PAL. Хроматографиию с ДЭАЭцеллюлозой осуществ ляли с использованием фосфатного буфера с рН 6,5, скорость элюирования 10,0 см3/ч. Определение массовой доли белка проводили с использованием экспрессанализатора RAPID N Сube (ELEMENTAR, Германия), действие которого ос новано на определении теплопроводности молеку лярного азота при сжигании анализируемого веще ства известной массы в условиях высокой темпера туры (около 900°C). Для разделения фракций белков использовали денатурирующий полиакриламидный гель (12 % разделяющий и 4 % фокусирующий) с 0,1 %ным до децилсульфатом натрия. Электрофорез проводили на однократном электродном буфере с добавлени ем 0,1% 0,1%ного додецилсульфата натрия при 15 мА. Гель окрашивали 0,2 %ным Кумасси R250. Про смотр и фотографирование гелей осуществляли на УФтрансиллюминаторе TCP20M при длине волны излучения 312 нм. Сохранение и обработку данных осуществляли с помощью гельдокументирующей системы VitranPhoto. Результаты и обсуждение. Наибольший выход фермента наблюдается при осаждении раствором аце тона с массовой долей растворителя 90 % (рис. 1). Это, вероятно, связано с тем, что PAL в процессе осажде Рис. 1. Влияние массовой доли органических раство рителей на эффективность осаждения PAL при концентра ции органического растворителя: 1 – 50 %; 2 – 60 %; 3 – 70 %; 4 – 80 %; 5 – 90 %; 6 – 96%; % – ацетон; – изопропило вый спирт; – этиловый спирт. Достижения науки и техники АПК, №092010 ния взаимодействует с этанолом и изопропанолом. Еще одно преимуществом ацетона перед этано лом и изопропанолом – высокая летучесть, что по зволяет легко удалять его из растворенного осадка при пониженном давлении. В связи с этим ацетон обладает менее выраженным денатурирующим эф фектом. Наибольший выход белка наблюдлся при прове дении процесса осаждения в интервалах рН 9,0±0,5 (рис. 2). Рис. 2. Влияние активной кислотности на выход белка. Сравнительный анализ результатов ультрафиль трации ферментного раствора с использованием мембран марки УПМ с различной пористостью по казал, что оптимальное соотношение производи тельности, выхода PAL по активности и степени очи стки в процессе ультраконцентрирования обеспе чивает полиамидная мембрана марки УПМ67. При ее использовании можно получить концентрат с удельной активностью 843,0±50,6 Е/мг белка, что указывает на эффективность применения стадии ультрафильтрации для изготовления ферментных препаратов высокой степени очистки. Результаты микробиологических исследований свидетельствует о том, что микрофильтрация кон центрата через мембраны с размерами пор 0,60 и 0,40 мкм недостаточно эффективна, поскольку на блюдается развитие колоний микроорганизмов на питательной среде в процессе инкубации при тем пературе 37±2 оС в течение 12 ч. Стерилизующая фильтрация с использованием мембран с диамет ром пор 0,22 мкм позволила получить готовый про Рис. 3. Профиль элюции PAL на КМцелюллозе. 79 НТП: ПЕРЕРАБОТКА Рис. 4. Профиль элюции PAL на ДЭАЭцеллюлозе. дукт, соответствующий по микробиологическим по казателям требованиям Государственной фармакопеи. Удельная активность фермента после проведе ния ионообменной хроматографии на колонке с КМ целлюлозой составила 1156,0±66,4 Е/мг белка. В ходе исследования выявлено, что подобран ные условия хроматографии с ДЭАЭцеллюлозой позволяют сорбировать на носитель положительно Таблица. Характеристика стадий очистки фер ментного препарата Объем , 3 см Экстракция сырья 150,0 Диализ 80,0 Ультрафильтрация 25,0 Хроматография на: КМ-целлюлозе 15,0 ДЭАЕ-целлюлозе 15,0 Стадия процесса МассоУдельная вая доля активность, белка, % Е/мг белка 1,60±0,1 103,0±6,2 1,17±0,07 506,0±30,4 1,00±0,06 843,0±50,6 Выход , % 100 95 82 0,65±0,05 1156,0±66,4 0,54±0,03 1293,0±77,6 85 80 заряженные белки. Фермент выходит в пике несор бированных белков, что дает возможность значи тельно повысить каталитическую активность PAL, а также удалить часть примесей белковой природы. В полученном после очистки с помощью ионооб менной хроматографии диэтиламиноэтилцеллюло зой (ДЭАЭцеллюлоза) продукте массовая доля белка составляет 0,54±0,03 %, удельная активность 1293,0±77,6 Е/мг белка (см. табл.) В целом следует отметить, что применение хро матографии с использованием КМцелюллозы по зволяет избирательно выделять PAL из раствора. Однако при этом для полученного препарата харак терно высокое содержание примесей, о чем свиде тельствует неравномерный хроматографический профиль (рис. 3). При последующей очистке фермента хроматог рафией на ДЭАЭцеллюлозе каталитическая актив ность PAL зарегистрирована в двух пиках, характе ризующихся фер ментативной ак тивностью по отно шению к фенила ланину (рис. 4). Электрофоре тические исследо вания фракций белка, содержа щихся в конечном продукте (рис. 5), показали наличие полосы, соответ ствующей по моле кулярной массе L Рис. 5. Электрофореграмма фенилаланинам м о н и й л и а з е очищенного фермента: 1 – контроль; 2 – опытный образец. (76880 Да), а также гомогенность и чистоту ферментного препарата. Выводы. Таким образом, рациональные усло вия осаждения ферментного препарата PAL – мас совая доля ацетона 90 %, рН реакционной среды – 9,0±0,5, температура – 0±2оС; очистки – диализ про тив дистиллированной воды при температуре 0±2оС в течение 24 ч; ультрафильтрация на мембранах марки УПМ67; микрофильтрация на мембранах с диаметром пор 0,22 мкм; сорбция белка сначала на колонке с КМцеллюлозой, а потом на колонке с ДЭАЭцеллюлозой. Это позволяет отделить инерт ные белки и другие полимерные вещества, снижаю щие потребительские и каталитические свойства L фенилаланинаммонийлиазы. Литература. 1. Кочеткова А.А., Нестерова И.Н. Функциональные ингредиенты и концепция здорового питания // Вопросы питания. – 2002. – № 2. – С.47. 2. Копылова Н.В. Фенилкетонурия: классификация, диагностика, диетотерапия // Вопросы детской диетологии. – 2004. – Т.2. – №6. – С. 3146. 3. Ладодо К.С. Руководство по лечебному питанию детей. – М.: Медицина, 2000. – 384 с. 4. Диетотерапия наследственных нарушений аминокислотного обмена / Е.П. Рыбакова, Т.В. Бушуева, К.С. Ладодо и др. // Вопросы детской диетологии. – 2005. – Т. 3. – №1. – С.1117. 5. Телишевская, Л.Я. Белковые гидролизаты. Получение, состав, применение / Под ред. Панина А.Н. – М.: «Аграр ная наука». – 2000. – 295 с. TECHNOLOGY OF ALLOCATION AND CLEARING OF L PHENYLALANINEAMMONIALYASE S.A. Suсhih, O.O. Babich, L.S. Soldatova Summary. Various ways of treatment of hereditary disease phenylketonuria are considered. It is shown that the most perspective way of treatment of phenylketonuria is use of reaction of biotransformation of phenylalanine by means of enzyme Lfenylalanineammonialyase. The rational conditions of sedimentation of a fermental preparation by organic solvents are chosen. Optimum parameters of clearing Lfenylalanineammonialyase with use membrane and chromatographic methods are established. The expediency of use Lfenylalanineammonia lyase in technology of obtaining of specialized products is shown. Key words: phenylketonuria, phenylalanine, Lfenylalanineammonialyase, protein hydrolysate; specialized products. Достижения науки и техники АПК, №092010 80
