МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В. ЛОМОНОСОВА Биологический факультет на правах рукописи КАЛАШНИКОВ Денис Сергеевич СВОЙСТВА МИТОХОНДРИАЛЬНОЙ NADH:УБИХИНОН ОКСИДОРЕДУКТАЗЫ (КОМПЛЕКСА I) В СОСТАВЕ МЕМБРАННЫХ ПРЕПАРАТОВ МОЗГА 03.01.04 – биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 2011 Диссертационная работа выполнена на кафедре биохимии биологического факультета Московского государственного университета имени М. В. Ломоносова. Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Виноградов Андрей Дмитриевич Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Звягильская Рената Александровна кандидат биологических наук, Берцова Юлия Васильевна Ведущая организация: Научный центр неврологии РАМН Защита диссертации состоится 23 мая 2011 года в 15 часов 30 минут на заседании диссертационного совета Д.501.001.71 при Мо сковском государственном университете имени М. В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, ГСП-1, Ленинские горы, Московский государственный университет имени М. В. Ломоносова, биологический факультет, большая биологическая аудитория (ББА). С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета Московского государственного университета имени М. В. Ломоносова. Автореферат разослан «___» ____________2011 года. Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук Медведева М.В. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Конечный этап запасания энергии при окислительном распаде питательных веществ в клетках млекопитающих происходит в митохондриях, где уровень NAD+, необходимый для поддержания о к и с л и т е л ь н о го м е т а б ол и зм а , о бе с п еч и ва е т с я N A D H : уб и х и н о н оксидоредуктазой (дыхательным комплексом I). Митохондриальный комплекс I и л и е го гом ол о г и п р о ка р и от ( N D H - 1 ) кат а л и з и ру ют о к и с л е н и е митохондриального или цитоплазматиче ского NADH убихиноном, сопровождающееся векторным переносом протонов через сопрягающую мембрану. Комплекс I митохондрий сердца крупного рогатого скота построен из 45 различных субъединиц и содержит, по меньшей мере, 9 индивидуальных редокс-кофакторов. Бактериальные опероны, кодирующие NDH-1, содержат только 13-14 генов, и продукты их транскрипции гомологичны 14 «главным» субъединицам митохондриального комплекса I. Поскольку каталитические свойства митохондриального фермента и его прокариотических гомологов почти одинаковы, можно считать, что только 14 из 45 субъединиц фермента млекопитающих необходимы для катализа. Функции остальных, более чем 30 дополнительных субъединиц остаются неизвестными. Подавляющее большинство сведений о каталитических и регуляторных свойствах комплекса I млекопитающих получено при изучении очищенного фермента или различных препаратов митохондрий сердца крупного рогатого скота. В последние годы в литературе широко обсуждаются корреляции между возникновением и развитием некоторых нейродегенеративных заболеваний (болезни Паркинсона, Альцгеймера, ретинопатии) и дефектами функционирования комплекса I. В обсуждениях используются данные о свойствах фермента или ферментных Список сокращений: ∆µH+ − трансмембранный электрохимический градиент протонов, ∆ψ − разность электрических потенциалов по обе стороны внутренней митохондриальной мембраны, FCCP − п-трифторметоксикарбонилцианидфенилгидразон, FMN – флавинмононуклеотид, HAR – гексааминорутений (III) хлорид, Q1 − водорастворимый гомолог природного убихинона, содержащий 1 изопреноидный остаток в положении 5 1,4бензохинонового кольца, БСА − бычий сывороточный альбумин, ДТТ − 1,4-дитиотреитол, ДТНБ − 5,5-дитио-бис-(2-нитробензойная кислота), СМЧ − субмитохондриальные частицы, М-СМЧ − субмитохондриальные частицы мозга, МТ-СМЧ − субмитохондриальные частицы мозга, полученные из «тяжелых» митохондрий, МО-СМЧ − субмитохондриальные частицы мозга, полученные из суммарной фракции митохондрий, С-СМЧ − субмитохондриальные частицы сердца, СОД − супероксид-дисмутаза. 3 препаратов (митохондрии, субмитохондриальные фрагменты) сердечной мышцы. Неизвестно, существует ли тканевая или видовая специфичность комплекса I млекопитающих, отражающаяся в его каталитических или регуляторных свойствах. В нашей лаборатории показано существование двух медленно в з а и м о п р е в р а щ а ю щ и хс я ф о р м ко м п л е кс а I : а к т и в н о й ( A ) и деактивированной (D). Активация комплекса I требует затравочного медленного каталитического цикла. Активная форма деактивируется (A→D переход) в условиях, когда каталитические обороты фермента невозможны (нет субстрата – NADH или нет акцептора – окисленного убихинона) и этот переход имеет такой высокий активационный барьер, что его наблюдение в минутной шкале возможно только при температуре >30°С. Такое поведение фермента, повидимому, обеспечивает регулирование суммарной скорости окислительного фосфорилирования в митохондриях. Показано, что переход от нормоксии к аноксии интактного изолированного сердца сопровождается синхронным переходом комплекса I из его активного состояния в деактивированное. Таким образом, явление, обнаруженное и проанализированное на простых объектах, удалось проследить в ряду: изолированный фермент – фермент в составе м е м б р а н ы – ф е рм е н т в и н т а кт н ы х м и тохо н д р и я х – ф е рм е н т в функционирующем органе. Если переход комплекса I из активного состояния в деактивированное имеет отношение к регулированию его каталитической активности, то разумно предположить, что в матриксе митохондрий присутствуют вещества-регуляторы, влияющие на скорости перехода и положение равновесия между активной и деактивированной формами фермента. Свободные жирные кислоты претендуют на роль одного из таких регуляторов. В нашей лаборатории, недавно было показано, что пальмитиновая кислота снижает скорость активации деактивированной формы фермента сердца, в концентрациях, существенно более низких, чем те, которые необходимы для ингибирования его активности. Цель работы. Получить препараты митохондрий мозга, пригодные для изучения каталитических и регуляторных свойств митохондриальной NADH:убихинон оксидоредуктазы (комплекса I) мозга и сравнить их со свойствами аналогичных препаратов сердца. 4 Для достижения этой цели требовалось решить следующие задачи: 1. Наладить метод, пригодный для получения митохондрий мозга в препаративных количествах; 2. Получить и охарактеризовать препарат «вывернутых» сопряженных субмитохондриальных частиц мозга (М-СМЧ); 3. Охарактеризовать основные свойства комплекса I мозга по сравнению с известными для фермента сердца; 4. Оценить влияние свободных жирных кислот и двухвалентных катионов на каталитические характеристики комплекса I мозга. Научная новизна и практическое значение работы. Разработана процедура получения сопряженных инвертированных («inside-out») субмитохондриальных частиц мозга и охарактеризованы свойства комплекса I в составе такого препарата. Показано, что свойства комплекса I митохондрий мозга, в частности, параметры активации-деактивации, практически не отличаются от таковых препарата сердечной мышцы. Показано, что совместное действие Ca 2+ и свободных жирных кислот приводит к развивающемуся во времени ингибированию каталитической активности комплекса I в составе М-СМЧ, в условиях (высокие значения pH), которые могут, по-видимому, реализоваться в функционирующих митохондриях. Полученный препарат инвертированных субмитохондриальных частиц мозга может служить в качестве экспериментальной модели, пригодной для изучения дефектов комплекса I, связанных с различными патологическими состояниями (ишемическое повреждение, нейродегенеративные заболевания). Апробация работы. Результаты работы были доложены на заседании кафедры биохимии биологического факультета МГУ, 16-ой Европейской Конференции по Биоэнергетике (The 16th European Bioenergetics Conference, Warsaw, 2010), XVII Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2010), 14-ой Международной Пущинской школе-конференции «Биология – наука XXI века» (Пущино, 2010). Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ, включая 2 статьи и 3 тезисов научных докладов. Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 127 страницах, содежит 23 рисунка и 7 таблиц, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. 5 СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Митохондрии мозга получали спо собом, описанным Ли и сотр. [Lee et al., 1993], с модификациями, обусловленными использованием большого количества ткани. Принцип метода состоит в том, что измельченную ткань обрабатывают протеазой (субтилизином А), затем гомогенизируют. Обработка протеазой позволяет существенно увеличить выход митохондрий. Гомогенат фильтруют и центрифугируют. Полученный осадок отбрасывают, а из супенат ант а цент рифугированием о с аждают митохонрии. Промывка полученного препарата средой, содержащей 0,25 М сахарозу и 10 мМ Tрис-HCl (pH 7,8) позволяет разделить полученные митохондрии на две равные фракции. Нижний слой полученного в результате промывки осадка – «тяжелые» митохондрии – плотный и более темный, а верхний слой – «легкие» митохондрии – более светлый и рыхлый. «Легкие» и «тяжелые» митохондрии суспенировали отдельно, замораживали и хранили при температуре –20°С. В некоторых опытах СМЧ (см. ниже) получали из общей фракции митохондрий (без деления на «легкие» и «тяжелые»). М-СМЧ получали способом, принятым в нашей лаборатории для препаратов из сердца быка [Kotlyar and Vinogradov, 1990]. Принцип метода заключается в обработке суспензии митохондрий ультразвуком, что приводит к образованию замкнутых инвертированных (inside-out) мембранных фрагментов. Полученный препарат хранили в жидком азоте. Активацию и сопряжение М-СМЧ проводили способом, принятым в нашей лаборатории [Burbaev et al., 1989]. К суспензии добавляли малонат, конечная концентрация 1 мМ (для активации сукцинатдегидрогеназы вытеснением прочно связного оксалоацетата [Kotlyar and Vinogradov, 1984]) и олигомицин 0,5 мкг/мг белка (искусственное сопряжение блокированием протонных каналов FO·F1–АТPазы [Lee and Ernster, 1966]). Суспензию инкубировали 30 мин при 30°С при хорошем перемешивании и разводили стандартной средой до конечной концентрации 0,5 мг/мл. К суспензии добавляли NADPH (1 мМ), инкубировали 1 ч при 25°С при постоянном перемешивании (для активации комплекса I [Burbaev et al., 1989]) и центрифугировали при 26 тыс. g (1 ч, 4°С). Осадки суспендировали в небольшом объеме 0,25 М сахарозы, содержащем 0,1 мМ малонат, разливали в ампулы и хранили в жидком азоте. 6 Деактивированные М-СМЧ получали прогреванием суспензии активных М-СМЧ 15–20 мин при 30°С. Получение «препарата белков митохондриального матрикса». Суспензию митохондрий мозга крысы, полученных описанным выше способом, оттаивали, разводили холодной водой до концентрации 15 мг/мл и добавляли K+-ЭДТА до конечной концентрации 1 мМ. Суспензию насыщали аргоном, доводили pH 0,05 М раствором NH4OH до 8,6 и озвучивали 5 раз по 30 сек с перерывами в 1 мин. Суспензию центрифугировали при 26 тыс. g 15 мин. Осадок отбрасывали, а супернатант центрифугировали при 200 тыс. g (1 час, 6°С). К полученному супернатанту приливали 1⁄10 часть от его объема 100 мМ Трис-HCl (pH 7,5) доводили pH до 6,0 уксусной кислотой и центрифугировали 1 ч 200 тыс. g (0оС). Измеряли объем полученного супернатанта и вносили концентрированный (1 М) раствор сахарозы до конечной концентрации 0,25 М и доводили pH полученного раствора до 7,4 добавлением 1М KOH. Д л я п о л у ч е н и я п р е п а р ат а м и т охо н д р и й , п р о н и ц а е м ы х д л я низкомолекулярных соединений [Gostimskaya et al., 2003], суспензию митохондрий мозга крысы, полученных по описанной выше методике (30 мг/ мл), разбавляли (в 20 раз) средой, содержавшей 150 мМ сахарозу, 10 мМ HEPES, 0,5 мМ ЭГТА (рН 7,4) и БСА (1 мг/мл), добавляли аламетицин и MgCl2 до конечной концентрации 40 мкг/мл и 2,5 мМ, соответственно. Смесь инкубировали 5 мин при комнатной температуре, разбавляли в 2,5 раза охлаждённой средой выделения, не содержащей аламетицина, MgCl2 и БСА и центрифугировали 15 мин при 30 тыс. g. Осадок суспендировали в минимальном объеме среды выделения, не содержащей БСА. Суспензию митохондрий хранили на льду. В ряде опытов аламетицин (20 мкг/мл) и MgCl2 (1 мМ) вносили непосредственно перед измерением активности. Поглощение кислорода измеряли амперометрически (закрытый электрод Кларка) при комнатной температуре. Среда измерения активностей содержала 0,25 M сахарозу, 10 мМ KCl, 0,2 мМ ЭДТА, 5 мМ К+-фосфат (pH 7,4) и субстраты окисления: NADH (1 мМ), при измерении NADH-оксидазной, или сукцинат (10 мМ), при измерении сукцинат-оксидазной активностей. При измерении сукцинат-оксидазы СМЧ предварительно преинкубировали в присутствии 5 мМ сукцината (~5–10 мин), а среда измерения активностей дополнительно содержала ротенон (5 мкМ). 7 Содержание гема а определяли в солюбилизированных препаратах (5%-ный дезоксихолат калия (рН 8,5), 30 мин при 25°С). Равные объемы образцов (0,25 мл), содержащих 10–15 мг белка, добавляли в две кюветы с 0,1 М K+-фосфатным буфером (рН 7,0). После добавления в одну из кювет дитионита (гидросульфита Na) и перемешивания регистрировали дифференциальный спектр «восстановленный образец минус окисленный» в диапазоне 510–630 нм (спектрофотометр Cintra 20, GBC с интегрирующей сферой). Содержание гема а рассчитывали, как описано у Ли и сотр. [Lee et al., 1993] (коэффициент молярного поглощения ε605–630 = 24·103 М−1 см−1). Количество комплекса I в препарате определяли титрованием NADHоксидазной активности пиерицидином, ротеноном или NADH-OH после инкубации субмитохондриальных частиц (1 мг/мл) с ингибиторами в течение 15 мин при 25°С. NADH оксидазную и NADH:акцептор редуктазные активности СМЧ измеряли фотометрически по убыли NADH (коэффициент молярного поглощения ε340 = 6,22·103 М−1 см−1 или ε380 = 1,25·103 М−1 см−1) в стандартной среде при 25°С, содержащей NADH (100 мкМ), грамицидин D (0,2 мкг/мл) и БСА (2 мг/мл), реакцию начинали внесением СМЧ (20 мкг/мл). NADH:Q1редуктазную активность измеряли в стандартной среде, содержавшей дополнительно Q1 (80 мкМ) и миксотиазол (5 мкМ). При измерении NADH:HAR (III) редуктазной активности [Sled and Vinogradov, 1993] стандартная среда дополнительно содержала HAR, NADH и антимицин А (1 мкг/мл). Максимальную скорость NADH:HAR редуктазной реакции определяли по линейным анаморфозам михаэлисовских зависимостей, полученных при постоянной концентрации HAR (5 мМ) и различных концентрациях NADH или п р и п о с т о я н н о й ко н ц е н т р а ц и и N A D H ( 1 , 2 м М ) и р а з л и ч н ы х концентрациях HAR. Аэробное сукцинат-зависимое восстановление NAD+ (обратный перенос электронов), осуществляемое за счет работы сукцинат-оксидазы, регистрировали ф отом е т р и ч е с к и п о у в е л и ч е н и ю п о гл о щ е н и я п р и 3 4 0 н м (спектрофотометр «Hitachi 557»), используя коэффициент молярного поглощения ε 340 = 6,22·10 3 М −1 см −1 . Стандартная среда содержала дополнительно NAD+ (5 мМ) и сукцинат (5 мМ). При измерении аэробного обратного переноса электронов на феррицианид стандартная среда 8 дополнительно содержала феррицианид (1 мM) и сукцинат (5 мМ). Реакцию регистрировали по уменьшению оптической плотности при 420 нм (ε420 = 1,0.103 М−1 см−1), затем добавляли ротенон (5 мкМ). Скорость реакции рассчитывали как разницу между исходной активностью и активностью в присутствии ротенона. Генерацию супероксида измеряли спектрофотометрически в стандартной среде при 550 нм по чувствительному к СОД (3 ед/мл в среде измерения) восстановлению 15 мкМ ацетилированного цитохрома с (ε550 = 20·103 М−1 см−1) [Azzi et al., 1975] при 30°С. Белок определяли с биуретовым реактивом, используя БСА в качестве стандарта для построения калибровочной кривой. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ I. Субмитохондриальные фрагменты мозга На предварительном этапе работы мы опробовали не сколько о п убл и ко ва н н ы х м е тод о в п ол у ч е н и я м и тохо н д р и й м о з г а к р ы с ы . Главными критериями при выборе способа получения митохондрий были относительная простота и быстрота процедуры, позволяющей получить хорошо сопряженные препараты. Этим критериям лучше всего соответствовала процедура, описанная Lee и сотр. [Lee et al, 1993] (табл. 1). В дальнейшем мы пользовались указанным способом получения препаратов из мозга свиньи, не измеряя характеристик полученных митохондрий. Таблица 1. Основные свойства митохондрий мозга крысы * Реакция Удельная активность (2-электрон-эквивалента в мин на мг белка) ×106 малат/глутамат-оксидаза дыхание в состоянии 4 дыхание в состоянии 3 ADP/O 0,005 0,04 2,6 сукцинат-оксидаза дыхание в состоянии 4 0,015 дыхание в состоянии 3 0,1 + FCCP** 0,2 ADP/O 1,9 * Приведены результаты типичных экспериментов. Различия в значениях, полученных в серии аналогичных опытов не привышал ± 20%. ** Оптимальную для стимуляции дыхания концентрацию FCCP (0,32 мкМ) подбирали предварительно. 9 В табл. 2 приведены каталитические активности М-СМЧ. Для сравнения приведены также величины активностей, измеренные в нашей лаборатории в тех же условиях для СМЧ сердца быка и препарата Кейлина-Хартри – классического объекта изучения дыхательной цепи [Vinogradov and King, 1979]. Максимальные удельные NADH-оксидазные активности препаратов из мозга и сердца оказались примерно одинаковыми (0,82 против 1,0 мкмоль/мин на мг белка, для МТ-СМЧ и С-СМЧ, соответственно) для препаратов, полученных из «тяжелых» митохондрий мозга и сердца. NADH-оксидазные (функционирование полной дыхательной цепи) и ротенон-чувствительные NADH:хинон (Q1) редуктазные (функционирование собственно комплекса I) активности, также оказались примерно одинаковыми. Это означает, что лимитирующая стадия суммарной Та бл и ц а 2 . К ат а л и т и ч е с к и е а к т и в н о с т и с у б м и т охо н д р и а л ь н ы х фрагментов (30°С, рН 8,0)* Реакции Удельная активность (2-электрон-эквивалента в мин на мг белка) ×106 препарат МО-СМЧ МТ-СМЧ C(Т)-СМЧ** Кейлина-Хартри*** NADH оксидаза – олигомицин, 0,63 0,82 + грамицидин D + олигомицин 0,09 0,16 + аламетицин**** 0,66 0,94 Сукцинат оксидаза – олигомицин, 0,15 0,17 + грамицидин D + олигомицин 0,05 0,05 NADH:акцептор редуктазы NADH → Q1 0,65 NADH → ГАР 8,0 Обратный перенос электронов сукцинат → NAD+ не 0,03 сукцинат → феррицианид детектируем 0,03 Генерация О2• NADH → О2 0,43 ×10 −3 + ротенон не 0,65 ×10 −3 сукцинат → О2 определяли 0,53 ×10 −3 + ротенон 0,25 ×10 −3 * 1,0 0,62 0,94 0,45 1,0 10,0 0,25 0,46 ×10 −3 0,68 ×10 −3 0,48 ×10 −3 0,16 ×10 −3 не детектируем не определяли Приведены результаты типичных экспериментов. Различия в значениях, полученных в серии аналогичных опытов не привышали ± 20%. ** Активности, измеренные при 25°С [Kotlyar and Vinogradov, 1990; Grivennikova and Vinogradov, 2006]. *** Измерено в 50 мМ К+-фосфатном буфере (рН 7,8) при 25°С [Vinogradov and King, 1979]. **** Конечная концентрация аламетицина и MgCl2, соответственно 20 мкг/мл и 1 мМ. 10 полностью разобщенной NADH оксидазной реакции – восстановление свободного убихинона терминальным железо-серным кластером N2 и дыхание субмитохондриальных фрагментов в присутствии NADH количественно можно оценивать как каталитическую активность собственно комплекса I. Комплекс I к ат а л и з и р о в а л о к и с л е н и е N A D H и с к у с с т в е н н ы м а к ц е п т о р о м – гексааминорутением (III) со скоростью, более чем в десять раз превышающей NADH-оксидазную реакцию. NADH:гексааминорутений (III)-редуктазная реакция не чувствительна к ротенону и пиерицидину – специфическим ингибиторам восстановления убихинона комплексом I. Аламетицин только незначительно стимулировал NADH оксидазную активность М-СМЧ (табл. 2), что позволяет считать что ~90% потенциально активного комплекса I доступно для NADH. Сукцинат оксидазная активность М-СМЧ оказалась существенно меньше, чем С-СМЧ или препарата Кейлина-Хартри. Нам не удалось измерить энергозависимое восстановление NAD+ (или феррицианида) сукцинатом (обратный перенос электронов) в М-СМЧ, полученных из суммарной фракции митохондрий мозга; препараты, полученные из «тяжелых» митохондрий мозга, катализировали эту реакцию с удельными активностями существенно (в 10 раз) меньшими, чем С-СМЧ (табл. 2). В табл. 3 приведены результаты измерения содержания цитохромоксидазы и комплекса I в митохондриях и СМЧ, полученных из мозга и сердца. Содержание цитохромоксидазы в М-СМЧ существенно ниже, чем в С-СМЧ. Это может быть обусловлено как истинным различием в содержании фермента в препаратах из сердца и мозга, так и существенно большими примесями других мембран немитохондриального происхождения в М-СМЧ. Содержание комплекса I в МТ-СМЧ оценивали по остаточной активности, измеренной после титрования NADH-ОН [Kotlyar et al., 2005] и двумя другими специфическими ингибиторами комплекса I: ротеноном и пиерицидином [Grivennikova et al., 2003]. Оно оказалось примерно вдвое меньшим, чем в препаратах из сердца. Существенное различие между препаратами из сердца и мозга обнаруживается при сравнении относительного содержания цитохромоксидазы и комплекса I (табл. 3). Данные о содержании комплекса I и его каталитических активностях позволяют оценить (сравнительно) числа оборотов фермента в полностью разобщенной NADH оксидазной реакции. Такая оценка дает величины 250 с –1 и 140 с –1 (30°С, рН 8,0) для комплекса I в мембранах СМЧ мозга и сердца, соответственно. Это различие 11 указывает либо на существование тканеспецифичных изоформ комплекса I, либо, что более вероятно, на различия в фосфолипидном составе внутренней мембраны митохондрий мозга и сердца; известно, что каталитическая активность комплекса I зависит от фосфолипидов [Heron et al., 1977]. Таблица 3. Содержание компонентов дыхательной цепи в митохондриях и субмитохондриальных фрагментах различных животных Объект, орган, препарат комплекс I* гем a, нмоль/мг белка гем a / (титр ингибитора, 3 −1 −1 (ΔA605–630, ε = 24·10 М см ) комплекс I нмоль/мг белка) Свинья мозг митохондрии «суммарная фракция» 0,15 «легкие» 0,10 «тяжелые» 0,19 М-СМЧ МО-СМЧ 0,17 МТ-СМЧ 0,22 0,06 ~3,7 0,64 0,65 0,12 ~5,4 Крупный рогатый скот сердце митохондрии «тяжелые» С (Т)-СМЧ * Приведены результаты типичных экспериментов. Величины титров для ротенона, пиерицидина [Grivennikova et al., 2003] и NADH-OH [Kotlyar et al., 2005; Grivennikova et al., 2007] совпадают с точностью ± 20%. II. Медленные обратимые изменения каталитической активности комплекса I в субмитохондриальных фрагментах мозга Как было отмечено в разделе «Общая характеристика работы», необычное свойство комплекса I сердца [Kotlyar and Vinogradov, 1990] – его существование в виде двух медленно взаимопревращающихся форм: каталитически активной (A) и каталитически неактивной – деактивированной (D). Медленный, спонтанный переход из активного в деактивированное состояние происходит в отсутствие одного из субстратов (NADH или окисленного убихинона). В условиях, обеспечивающих каталитический оборот фермента, происходит его активация. Скорость A/D-перехода сильно зависит от температуры, хорошо заметная деактивация комплекса I сердца быка четко выражена только при температуре свыше 30°С [Kotlyar and Vinogradov, 1990]. Переход комплекса I из 12 деактивированной в активную форму замедляется при высоких pH или в присутствии двухвалентных катионов, в частности Ca2+ [Kotlyar et al., 1992]. D-форма фермента может быть необратимо модифицирована целым рядом SH-реагентов [Kotlyar et al., 1992; Gavrikova and Vinogradov, 1999; Gostimskaya et al., 2006], которые предотвращают оборот-зависимую активацию фермента, в то время как A-форма не чувствительна к их действию. Можно воспользоваться чувствительностью D-формы к SH-модификаторам (в частности, ДТНБ) для количественной оценки соотношения A- и D- форм фермента в любом препарате, содержащем комплекс I [Gostimskaya et al., 2006]: в условиях, когда SH-реагент быстро реагирует с D-формой, кинетика необратимого ингибирования двухфазна – доля быстрой фазы пропорциональна доле D-формы, а медленная фаза отражает кинетику деактивации фермента. На рис. 1 показана зависимость остаточной активности NADH оксидазы М-СМЧ от времени инкубации препарата в присутствии ДТНБ при разных температурах. Полученные данные показывают, что: 1) примерно половина комплекса I в препарате находится в виде D-формы; 2) процесс деактивации сильно зависит от температуры (практически отсутствует при 25°С) и 3) как активная, так и деактивированная формы фермента в указанных условиях стабильны – ингибирование, вызванное реакцией с ДТНБ полностью обращается избытком дитиотреитола. Рис. 1. Кинетика ингибирования NADH оксидазной активности МО-СМЧ SH-реагентом (ДТНБ). МО-СМЧ вносили в среду, содержавшую 1 мМ ДТНБ, до конечного содержания 1 мг/мл и инкубировали при разных температурах (кривая 1 – 25°С, кривая – 30°С, кривая 3 – 37°С) в течение указанного на абциссе времени. За 100% принимали активно сти, измеренные при указанных температурах (0,5; 0,6 и 0,74 мкмоль/мин на мг белка при 25°С, 30°С и 37°С, соответственно). Стрелкой показано внесение в среду инкубации 5 мМ ДТТ. Процесс деактивации (медленная фаза ингибирования ДТНБ) примерно соответствует кинетике первого порядка (рис. 2), энергия активации составляет 230 кДж/моль (практически совпадает со значением ранее определенным для препаратов комплекса I сердца [Kotlyar and Vinogradov, 1990]). 13 Рис. 2. Линейные анаморфозы кинетики и н г и б и р ов а н и я N A D H о кс и д а з н о й активности МО-СМЧ SH-реагентом (ДТНБ). МО-СМЧ активировали инкубацией в присутствии NADPH и прослеживали кинетику ингибирования при разных температурах так, как указано в подписи к рис. 1 (см. выше). Прямые 1, 2 и 3 – температура инкубации 25°С, 30°С и 37°С, соответственно. Значения констант скоростей реакций первого порядка: 0,02 мин−1; 0,1 мин−1 и 0,4 мин−1 при 25°С, 30°С и 37°С, соответственно. Так же, как было установлено для комплекса I митохондрий сердца, cкорость активации фермента (длительность наблюдаемой лаг-фазы) в процессе реакции сильно зависит от рН (рис. 3), тогда как NADH:Q1-редуктазная и NADH оксидазная активности А-формы оказываются постоянными в интервале рН 7-9. A Б Рис. 3. Кинетика NADH:Q 1 -редуктазной реакции активных и деактивированных МО-СМЧ при разных pH (А) и линейные анаморфозы кинетики NADH:Q1-редуктазной реакции деактивированных МО-СМЧ (В). МО-СМЧ активировали инкубацией в присутствии NADPH и прослеживали кинетику NADH:Q1-редуктазной реакции при pH 7,0 (кривая 1). МО-СМЧ деактивировали прогреванием 15 мин при 30°С, прослеживали кинетику NADH:Q1-редуктазной активности деактивированных МО-СМЧ при двух различных pH: pH 7,0 (кривая 2) и pH 9,0 (кривая 3). Значения констант скоростей реакций первого порядка – 0,7 мин−1 (прямая 2) и 0,2 мин−1 (прямая 3). Наши результаты показали, что существенных различий между свойствами полной дыхательной цепи и комплекса I в митохондриях нервной ткани и мышцы сердца нет. Различия, если они существуют, следует искать в 14 механизмах, контролирующих активность комплекса I. Полученный препарат М-СМЧ вполне пригоден для таких поисков. III. Ингибирование комплекса I в субмитохондриальных фрагментах мозга жирными кислотами: влияние Ca2+ В настоящее время известно более двух десятков ингибиторов комплекса I, специфиче ски блокирующих перено с электронов от терминального железо-серного центра N-2 к убихинону. Химические структуры этих ингибиторов настолько разнообразны, что сколько-нибудь оправданных выводов о строении участка их связывания сделать невозможно. Считают, что существует достаточно объемная гидрофобная полость, где связываются ротенон, пиерицидин, Тритон X-100, катионные детергенты и пр. С в о б од н ы е ж и р н ы е к и с л о т ы т а к ж е и н г и б и р у ю т ко м п л е кс I [Loskovich et al., 2005]. Было показано, что пальмитиовая кислота – ингибитор NADH: убихинон редуктазной реакции, катализируемой активной формой (A) комплекса I. Кроме того, пальмитиновая кислота специфически ингибирует активацию комплекса I (переход D→A). Содержание свободных жирных кислот в митохондриях (в частности мозга) может существенно увеличиваться в некоторых патологических состояниях (например, при аноксии с последующей реоксигенацией), поэтому их можно рассматривать в качестве факторов, способных нарушать функционирование дыхательной цепи. Еще одним возможным регулятором активности комплекса I могут быть ионы Ca2+ [Kotlyar et al., 1992]. В условиях in vitro дышащие митохондрии способны аккумулировать большие количества кальция, концентрация которого в митохондриальном матриксе зависит от многих факторов, таких как природа проникающего аниона, pH или присутствие нуклеотидов. Мы исследовали влияние свободных жирных кислот, а также ионов Са2+ на каталитическую активность комплекса I в инвертированных СМЧ мозга. На рис. 4 А показано, что добавление высоких концентрации Ca2+ к MO-СМЧ при щелочном значении pH приводит к развивающемуся во времени ингибированию NADH-оксидазной активности. Такое торможение обращается при добавлении избытка ЭГТА (кривая 3). В таких условиях ингибирование сукцинатоксидазной активности МО-СМЧ не происходит (результаты не приведены), а остаточная NADH-оксидазная активность MO-СМЧ полностью чувствительна к 15 ротенону. Таким образом, ингибирование NADH-оксидазной активности МО-СМЧ под действием Ca2+ направлено на комплекс I. Катализируемое комплексом I восстановление искусственного акцептора электронов (HAR) было не чувствительно к Ca2+, поэтому можно считать, что торможение направлено на участок связывания убихинона. Для увеличения NADH-оксидазной активности МОСМЧ (связывание свободных жирных кислот), в реакционную смесь вносили БСА, который незначительно (на ∼20%) увеличивал NADH-оксидазную активность. Оказалось, что БСА почти полностью предотвращает ингибирование NADHоксидазной активности МО-СМЧ ионами Ca2+(кривая 2). Этот результат указал на то, что ингибирование комплекса I под действием свободных жирных кислот [Loskovich et al., 2005] и Са2+ (рис. 4 А) взаимозависимо и это явление потребовало дальнейшего изучения. Можно было предложить два объяснения роли Ca2+ в усилении ингибирующего действия жирных кислот. Согласно первому, Ca2+ связываясь с комплексом I, увеличивает доступность (сродство) фермента для жирной кислоты. Другая возможность состояла в том, что наблюдаемое явление обусловлено взаимодействием: Ca2+ – жирные кислоты – мембранные фосфолипиды. Если справедливо первое объяснение, то следовало ожидать, что Ca2+ точно также, или сходным образом будет влиять на торможение активности A Б Рис. 4. Влияние Ca2+ на NADH-оксидазную активность МО-СМЧ. А. 10 мМ CaCl2 и 15 мМ ЭГТА были добавлены, где указано, к МО-СМЧ (10 мкг белка/мл), окисляющим 100 мкМ NADH в стандартной среде измерения оксидазной активности при pH 8,9 и 30°С. Кривая 1 – проба содержала БСА (2 мг/мл) без добавления Ca2+; кривая 2 – Ca2+ добавлен к пробе, содержащей БСА; кривая 3 – в среде нет БСА. Б. Ингибирование NADH-оксидазной активности ротеноном в присутствии Ca2+ (10 мМ). Рот е н о н ( 5 · 1 0 – 8 М ) д о б а вл е н к М О - С М Ч ( 2 0 м к г бе л ка / м л ) , о к и с л я ю щ и м 100 мкМ NADH (pH 8,7; 30°С). 16 комплекса I другими, отличными от жирных кислот гидрофобными ингибиторами. На рис. 4 Б показано, что это не так: Ca2+ не влиял ни на скорость торможения комплекса I ротеноном, ни на конечный уровень ингибирования. Мы оценили pH-зависимость ингибирования NADH-оксидазной активности СМЧ под действием Ca2+ (при некотором, по-видимому, постоянном уровне эндогенных свободных жирных кислот) (рис. 5). Как скорость Ca2+ индуцированного ингибирования, так и остаточная NADH-оксидазная активность сильно зависели от pH, с кажущейся pKa около 8,5 (рис. 5 А). Следует отметить, что величины остаточной NADH-оксидазной активности являются условными, а кривую pH-зависимости (рис. 5, Б) следует рассматривать только как ориентировочную, поскольку Ca2+-зависимое ингибирование NADH-оксидазной активности МО-СМЧ развивается во времени. A Б Рис. 5. Зависимость альбумин-чувствительного торможения NADHоксидазной активности МО-СМЧ ионами Ca2+ от pH. А. Кривая регистрации NADH-оксидазной активности (концентрации NADH и CaCl2 – 100 мкМ и 10 мМ, соответственно; 10 мкг белка МО-СМЧ / мл, 30°С); значения pH указаны на кривых. Б. Степень ингибирования дыхания, наблюдаемая через 10 мин после добавки Ca2+, выраженная в процентах по отношению к контролю (без добавления Ca2+). Контрольные значения (0,5 мкмоль окисленного NADH в мин на мг белка МО-СМЧ) практически не зависели от pH. На рис. 6 показано, что 10 мМ Ca2+, в уменьшенном, по сравнению с рис. 1, временном диапазоне очень незначительно ингибирует NADHоксидазную активность (рис. 6, кривая 1), так же как и пальмитат, который вызывает медленно развивающееся торможение (рис. 6, кривая 2). Когда к СМЧ, дышащим в присутствии пальмитиновой кислоты, по крайней мере, в течение 1 мин, был добавлен Ca 2+ , наблюдалось почти мгновенное ингибирование NADH-оксидазной активно сти (рис. 6, кривая 3). 17 Если пальмитиновую кислоту вносили после добавления Са2+, то торможения не происходило (если жирные кислоты оказываются в растворе, содержащем Са2+, то образуется выпадающая в осадок нерастворимая соль и ингибирование не происходит.), и активность оставалась такой же, как в присутствии только Са2+ (рис. 6, кривые 4 и 1, соответственно). Результаты, представленные на рис. 6, показывают, что Са2+ значительно усиливает ингибирующее действие мембрано-связанных жирных кислот. Рис. 6. Ингибирование NADH-оксидазной активности МО-СМЧ ионами и пальмитиновой кислотой. Ca2+ 10 мМ CaCl 2 и 50 мкМ пальмитат добавляли (где указано) к пробам М О СМЧ (10 мкг белка/мл), окисляющим 100 мкМ NADH (pH 8,9; 30°С). Удельная активность МО-СМЧ в отсутствие ингибиторов – 0,6 мкмоль/мин на мг белка. Мы сравнили Ca2+-зависимое ингибирование активности комплекса I в присутствии четырех других жирных кислот: лауриловой, миристиновой, стеариновой и пальмитолеиновой. Наиболее эффективным ингибитором оказалась пальмитиновая кислота (рис. 7). Рис. 7. Специфичность действия жирных кислот на Ca2+-зависимое ингибирование NADH-оксидазной активности МО-СМЧ. Условия опыта, как на рис. 6 (кривая 3); остаточная активность измерена после добавления Ca 2+ . Концентрация добавленных жирных кислот – 50 мкМ. 18 Несмотря на то, что приведенные выше данные показали синергизм ингибирующего действия Ca2+ и свободных жирных кислот, они с трудом могли быть оценены количественно из-за того, что торможение развивается во времени. Чтобы преодолеть эту трудность, ингибирующий эффект Ca2+ определяли в условиях, когда СМЧ инкубировали 30 мин (время, предположительно необходимое для уравновешивания реакционной смеси) в присутствии пальмитиновой кислоты и измеряли остаточную NADH-оксидазную активность в присутствии возрастающей концентрации Ca2+. В этом случае кажущееся сродство к Ca2+ возрастало и полумаксимальное ингибирование происходило уже при 0,3 мМ Ca2+. Дальнейшее увеличение времени инкубации (с жирными кислотами) не влияло на характер кривой титрования (рис. 8 А). Полумаксимальное ингибирование NADH-оксидазной активности, при «равновесном» титровании пальмитиновой кислотой в присутствии высокой концентрации Ca2+ (10 мМ) происходило при 0,5 мкмоль жирной кислоты на мг белка (рис. 8 Б). А Б Рис. 8. Титрование ингибирующего эффекта Ca2+ (А) и пальмитата (Б) на NADH-оксидазную активность МО-СМЧ. А. МО-СМЧ преинкубировали 30 мин (pH 8,7; 22°С) в присутствии пальмитата (1 мкмоль на мг белка) и измеряли остаточную активность в присутствии указанной концентрации Ca2+. Б. МО-СМЧ преинкубировали 30 мин (pH 8,7; 22°С) с указанной концентрацией пальмитата и измеряли остаточную NADH-оксидазную активность в присутствии 1,5 мМ CaCl2. Ранее в нашей лаборатории было показано, что, с одной стороны, активация комплекса I замедляется при щелочных значениях pH и (или) в присутствии двухвалентных катионов [Kotlyar et al., 1992], а с другой – блокируется пальмитиновой кислотой [Loskovich et al., 2005]. Сопоставление этих фактов с результатами, представленными выше, позволило предположить, 19 что влияние Ca2+ и щелочных значений pH на D→A переход на самом деле обусловлено присутствием эндогенных жирных кислот в мембранах СМЧ. Мы подтвердили это предположение (рис. 9). NADH-оксидаза активированных МО-СМЧ была не чувствительна к Ca2+ (рис. 9, кривая 1). Деактивация комплекса I (преинкубация при 37°С) приводила к появлению лаг-фазы окисления NADH (рис. 9 А, кривая 2), длительность которой существенно увеличивалась в присутствии Ca 2+ (рис. 9 А, кривая 3). В присутствии БСА (рис. 9 Б) картина существенно изменилась: Ca2+ только незначительно увеличивал лаг-фазу при окислении NADH деактивированным препаратом (рис. 9 Б, кривые 2 и 3). А Б Рис. 9. Влияние альбумина на активацию деактивированной NADHоксидазы. МО-СМЧ (4 мг белка/мл) деактивировали преинкубацией при 37°С в течение 15 мин. Окисление NADH при 30°С и начинали внесением 20 мкг белка МО-СМЧ/мл. А – среда не содержала альбумина, Б – к среде добавлен БСА (2 мг/мл). Кривая: 1 – активированный препарат МО-СМЧ, 2 – деактивированные СМЧ, 3 – в пробу добавлен 0,5 мМ CaCl2. IV. Влияние белков митохондриального матрикса на ингибирование NADHоксидазной активности МO-СМЧ пальмитиновой кислотой Препараты СМЧ и интактных митохондрий отличаются тем, что активный нуклеотид-связывающий центр комплекса I в составе СМЧ ориентирован в окружающий раствор. В митохондриях периферическая часть комплекса I экспонирована в матрикс и находится в окружении «концентрированного» раствора белков матрикса. Такие белки могут, с одной стороны, взаимодействовать с комплексом I, влияя на его каталитическую активность, а, с другой стороны, могут связывать свободные жирные кислоты. Чтобы выяснить 20 может ли содержимое матрикса повлиять на характер ингибирования комплекса I под действием жирных кислот, мы оценили влияние белков матрикса митохондрий на ингибирование NADH-оксидазной активности МО-СМЧ под действием пальмитиновой кислоты. Полученные результаты представлены на рис. 10. Добавление БСА (0,1–0,2 мг в мл, что соответствует возможному связыванию не менее 10 и 20 нмоль пальмитиновой кислоты) приводит к появлению отчетливой лаг-фазы на графике зависимости ингибирования комплекса I под действием жирной кислоты (кривые 2 и 3 на рис. 10, А), по сравнению с той же зависимостью в отсутствие БСА (кривая 1 на рис. 10, А). Характер зависимости, представленной на рис. 10, Б (кривые 2 и 3) свидетельствует о том, что белки митохондриального матрикса потенциально могут связывать свободные жирные кислоты и защищать комплекс I от ингибирования жирными кислотами. А Б пальмитат, мкмоль/мг белка МО-СМЧ пальмитат, мкмоль/мг белка МО-СМЧ Рис. 10. Влияние альбумина и белков митохондриального матрикса на торможение NADH-оксидазной активности МO-СМЧ пальмитиновой кислотой (pH 7,0; 25°С). А. Ингибирование NADH-оксидазной активности МО-СМЧ (10 мкг/мл) под действием пальмитиновой кислоты в присутствии БСА. Кривая 1 – в отсутствии добавленного БСА (контроль), кривые 2 и 3 – в присутствии БСА (0,1 и 0,2 мг/мл, соответственно). Б. Ингибирование NADH-оксидазной активности МО-СМЧ (10 мкг/мл) под действием пальмитиновой кислоты в присутствии белков митохондриального матрикса. Кривая 1 – в отсутствии белков митохондриального матрикса (контроль), кривые 2 и 3 – в присутствии белков митохондриального матрикса (0,05 и 0,25 мг/мл, соответственно). За 100% принимали значение NADH-оксидазной активности в отсутствии пальмитиновой кислоты. NADH-оксидазная активность собственно «препарата белков митохондриального матрикса» отсутствовала. 21 ВЫВОДЫ 1. Получены сопряженные СМЧ мозга и охарактеризованы основные свойства комплекса I в их составе. 2. Каталитические активности и параметры A/D-перехода комплекса I в субмитохондриальных фрагментах мозга практически не отличаются от таковых, ранее описанных для препаратов сердца. 3. Торможение активации комплекса I ионами двухвалентных металлов при щелочных значениях pH обусловлено эндогенными жирными кислотами. 4. Ионы Ca2+ pH-зависимо увеличивают скорость и степень ингибирования комплекса I эндогенными и добавленными жирными кислотами. В ряду проанализированных жирных кислот – пальмитиновая кислота наиболее эффективный ингибитор комплекса I. 5. Белки митохондриального матрикса частично защищают комплекс I от ингибирующего действия пальмитиновой кислоты. 22 СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Калашников Д.С., Гривенникова В.Г., Виноградов А.Д. (2011) Субмитохондриальные фрагменты митохондрий мозга: общие характеристики и каталитические свойства NADH:убихинон оксидоредуктазы (комплекса I). Биохимия, 76, 253–263. 2. Калашников Д.С., Гривенникова В.Г., Виноградов А.Д. (2011) Ингибирование митохондриальной NADH:убихинон оксидоредуктазы (комплекса I) мозга жирными кислотами: влияние Сa2+. Биохимия, (принято к публикации). 3. Калашников Д.С. (2010) NADH: убихинон оксидоредуктаза (комплекс I) из митохондрий мозга. XVII международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов – 2010», секция «Биология», Тезисы докладов, Москва, МАКС Пресс, 52–53. 4. Калашников Д.C. (2010) NADH:убихинон оксидоредуктаза (комплекс I) из митохондрий мозга свиньи. 14-я Пущинская международная школаконференция молодых ученых «Биология – наука ХХI века», Сборник тезисов, Пущино, 30. 5. Kalashnikov D.S., and Vinogradov A.D. (2010) NADH:ubiquinone oxidoreductase (complex I) of brain mitochondria. Biochim. Biophys. Acta , 1797, 16th European Bioenergetics Conference Short Reports. p. 17. Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (Гранты № 05-04-48809, 06-04-48931, 08-04-00594, 09-04-00505) и NIH Fogarty International Research grant 5R03TW007825. 23