150 краткие сооБщения Гранзим В освобождается в цитозоль

краткие сообщения
УДК 577.151.54:618.36:616.523.-036.11
ОЦЕНКА ИНДУЦИРУЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ ГРАНЗИМА В НА АПОПТОЗ ЯДЕР
СИНЦИТИОТРОФОБЛАСТА ПЛАЦЕНТЫ, ВЫЗВАННОГО ОБОСТРЕНИЕМ
ГЕРПЕС-ВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ ВО ВРЕМЯ БЕРЕМЕННОСТИ
Михаил Тимофеевич ЛУЦЕНКО
Дальневосточный научный центр физиологии и патологии дыхания СО РАМН
675000, г. Благовещенск, ул. Калинина, 22
В гомогенате плаценты беременных, перенесших обострение герпес-вирусной инфекции, отмечено по мере
нарастания в периферической крови титра антител к возбудителю инфекции увеличение содержания гранзима
В. Одновременно в синцитиотрофобласте нарастало содержание ядер в состоянии апоптоза.
Ключевые слова: синцитиотрофобласт, апоптоз, гранзим В, герпес.
Гранзим В освобождается в цитозоль
клетки‑мишени при ее соприкосновении
с NK-лимфоцитами. Будучи протеолитическим
ферментом, гранзим В превращает прокаспазу-3
в активную каспазу-3, под влиянием которой инициируется апоптоз ядер клетки‑мишени [1–7].
Однако в доступной литературе нет сведений, отражающих влияние герпес‑вирусной
инфекции на увеличение содержания гранзима
В в плаценте родильниц, перенесших во время
беременности обострение герпес‑вирусной
инфекции, что повлияло бы на увеличение
процентного содержания ядер в состоянии
апоптоза в синцитиотрофобласте.
Цель исследования — показать нарушение
морфофункционального состояния синцитиотрофобласта ворсинок плаценты вследствие
увеличения содержания в плаценте гранзима
В при обострении герпес‑вирусной инфекции
во время беременности, оценивая это подсчетом числа ядер, индуцированных в апоптоз.
Материал и методы
Исследовали активность герпес‑вирусной
инфекции в периферической крови у 15 беременных, перенесших в третьем триместре
вспышку герпес‑вирусной инфекции и 20 беременных, не болевших в течение всего периода
гестации (контроль). Исследования проводились на базе стационара акушерского отделения
клиники Дальневосточного научного центра
физиологии и патологии дыхания СО РАМН
с учетом требований Хельсинской декларации
Всемирной ассоциации «Этические принципы
проведения научных медицинских исследований с участием человека» с поправками 2000 г.
и в соответствии с «Правилами клинической
практики в Российской Федерации», утвержденными Приказом Минздрава РФ от 19.06.2003 г.
№ 266. Титр антител к вирусу герпеса определяли иммуноферментным методом на спектрофотометре «Stat‑Fax‑2100» (США).
Активность гранзима B в гомогенате плаценты здоровых беременных и беременных,
перенесших в третьем триместре вспышку
герпес‑вирусной инфекции, определяли иммуноферментным методом с использованием реагентов «Bender MedSystems» (Австрия) на спектрофотометре «Stat‑Fax‑2100» (США).
Морфологическую классификацию апоптоза
проводили на парафиновых срезах плаценты
по метке повреждающихся концов фрагментов ДНК (in situ end‑labeling, ISEL‑метод) [8].
Срезы после дегидратации в дистиллированной
воде в течение 30 мин инкубировали в 3% растворе перекиси водорода и отмывали 0,15 М
забуференным солевым раствором (PBS)
(0,15 М NaCl на 0,1 М фосфатном буфере pH 7,5).
Затем срезы инкубировали в смеси 0,3 М NaCl
и 30 мМ цитрата натрия (pH 7,0, 80 °С, 20 мин),
отмывали в 0,15 М PBS и инкубировали в 1 мг/мл
на 0,15 М PBS растворе проназы (Calbiochem,
Германия) при комнатной температуре в течение 30 мин, после чего отмывали 0,15 М PBS
и буфером А (50 мМ трисгидрохлорид, 5 мМ
хлорид магния, 10 мМ β-меркаптоэтанол
и 0,005% раствор бычьего сывороточного альбумина (БСА), pH 7,5). Последовательно инкубировали (18°С, 2 час) в смеси из 4 нуклеотидов (0,01 мМ dATF, dCTF, dGTF, «Puomega
Madison WI», США и 0,001 мМ biotin‑II‑dUTP,
«Sigma», США) и ДНК полимеразы-1 Е. coli
(20 ед/мл; «Promega», США), приготовленной на буфере А. Затем отмывали буфером А,
а вслед за ним 0,5 М PBS. Окончательно
срезы инкубировали с конъюгатом пероксидазы (Vectastam Elite ABC Kit‑Vector, США),
Луценко М.Т. — академик РАМН, e-mail: cfpd@amur.ru
150
Бюллетень со рамн, ТОМ 30, № 6, 2010 г.
Луценко М.Т. Оценка индуцирующего действия гранзима В на апоптоз ядер синцитиотрофобласта... / с. 150-151
разведенным 1:25 0,5 М PBS, в который введены 1% БСА и 0,5% твин-20 и в течение 10 мин
окрашивали 0,04% раствором 3,3‑диамино‑бензидинтетрахлорида на 0,05 М трис‑буфере (pH 7,5)
и перекиси водорода в конечной концентрации 0,015%. Промывали дистиллированной
водой, обезвоживали и заключали в бальзам.
Метод обладает высокой чувствительностью даже для ядер, которые только начинают
запрограммированную гибель. С его помощью
можно увидеть конденсацию хроматина, плотно
прилегающего к ядерной оболочке.
Результаты
Исследования показали, что по мере нарастания титра антител в периферической крови
беременных в третьем триместре увеличивается
содержание гранзима B в гомогенате плаценты
родильниц, перенесших в третьем триместре
обострение герпес‑вирусной инфекции.
При титре антител к вирусу герпеса 1:3200
содержание гранзима B в гомогенате плаценты
составляло 283,14 ± 18,00 пг/мл, при титре
1:6400 — 712,84 ± 23,00 пг/мл, а при титре
1:12800 увеличилось до 1007,53 ± 31,50 пг/мл
(в контроле — 251,10 ± 31,00 пг/мл, p < 0,001).
Одновременно нами подсчитывалось количество ядер синцитиотрофобласта, находившихся в состоянии апоптоза. На 2000 ядер в ворсинках плаценты при содержании гранзима B
283,14 ± 18,00 пг/мл насчитывалось 1,5 ± 0,09% ядер
в состоянии апоптоза, при 712,84 ± 23,00 пг/мл —
2,0 ± 0,12%. При содержании гранзима B
1007,53 ± 31,50 пг/мл число ядер в синцитиотрофобласте в состоянии апоптоза возрастало
до 3,50 ± 0,08% (в контроле — 1,0 ± 0,009%, p < 0,001).
Таким образом, при вспышке герпес‑вирусной
инфекции у беременных в третьем триместре увеличивается содержание гранзима B в плаценте,
что индуцирует апоптоз ядер синцитиотрофобласта — тем более выраженный, чем больше в гомогенате плаценты содержится гранзима B.
Выводы
При обострении герпес‑вирусной инфекции
в плаценте беременной увеличивается содержание
гранзима В, что приводит к нарастанию процента
ядер синцитиотрофобласта в состоянии апоптоза.
Список литературы:
1. Козлов В.К., Молчанов О.Е., Жаринов Г.Ц. Иммунотерапия рекомбинантными цитокинами в лечении
онкологических больных // Успехи клинической
иммунологии и аллергологии. – 2002. (1). 263–279.
Kozlov V.R., Molchanov O.E., Zcharinov G.Z.
Immunotherapy by recombinant cytokines in treatment
of oncological patients // Uspekhi klinicheskoi immunologii
i allergologii, RAEN. 2002. 1. 263–279.
2. Евдонин А.Л., Медведева Н.Д. Внеклеточный
белок теплового шока 70 и его функция // Цитология. 2009. 51. (2). 130–137.
Evdonin A.L., Medvedeva N.D. Extracellular
protein of thermal shock 70 and its function // Tsitologiya.
2009. 51. 2. 130–137.
3. Синцов А.В., Коваленко Е.И., Ханин М.А. Апоптоз, индуцированный гранзимом B // Биоорг. химия.
2008. 34. (6). 725–733.
Sintsov A.V., Kovalenko E.I., Khanin M.A.
Apoptosis induced by granzyme B // Bioorg. khimiya.
2008. 34. (6). 725–733.
4. Агол В.Н. Генетически запрограммированная
смерть клетки // Соросовский образоват. журн. 1996. (6). 20–24.
Agol V.N. Genetically programmed cell death //
Sorosovskii obrazovat. zhurn. 1996. (6). 20–24.
5. Kawaguchi Y., Kono K., Mizukami Y. et al. Mechanisms
of escape from trastuzumal-mediated ADCC in esophageal
sguamous cell carcinoma: relation to susceptibility to perforingranzyme // Anticancer Res. 2009. 29. (6). 2137–2146.
6. Podack E.R., Hengartner H., Lihtenheld M.G.
A central role of perforin in cytolisis // Annu. Res.
Immunol. 1991. 9. 129–157.
7. Fuwthrop D.J., Boobis A.R., Davies D.S. Mechanisms
of cell death // Arch. Toxicol. 1991. 65. 437–444.
8. Погорелов В.М. Козинец Г.И. Морфология апоптоза при нормальном и злокачественном гемопоэзе //
Гематология и трансфузиология. 1995. 43. (5). 21–24.
Pogorelov V.M., Kozinets G.I. Apoptosis morphology
at normal and malignant haemopoiesis // Gematologiya
i transfuziologiya. 1995. (5). 21–24.
ESTIMATION OF GRANZYME B INDUCING EFFECT ON APOPTOSIS NUCLEUS OF PLACENTA
SYNCYTIOTROPHOBLAST CAUSED BY AGRAVATION OF HERPES-VIRUS INFECTION
AT THE TIME OF PREGNANCY
Michael Timofeevich LUTSENKO
Far Eastern Research Center for Physiology and Respiratory Pathology of SB RAMS
22, Kalinin str., Blagoveshtchensk, 675000
It has been revealed that granzymes B concentration increases in homogenate placenta of the pregnants, underwent
aggravation of herpes-virus infection, while antibody titre to infectious invader increases. Simultaneously, the number
of nucleus at apoptosis in syncytiotrophoblast grows.
Key words: syncytiotrophoblast, apoptosis, granzymes B, herpes.
Lutsenko M.T. — academician of RAMS, e-mail: cfpd@amur.ru
Бюллетень со рамн, ТОМ 30, № 6, 2010 г.
151