Технология рекомбинантной ДНК

Технология рекомбинантной
ДНК
Рекомбинантная ДНК
— искусственно созданная последовательность ДНК
путем объединения нескольких последовательностей
ДНК
• Части рекомбинантной ДНК могут быть получены
исскуственным путем или клонированы из
организмов
• Рекомбинантную ДНК получают с использованием
живых клеток
Подходы к изучению специфичных
последовательностей ДНК
Ключевые этапы клонирования ДНК
Создание
рекомбинантной ДНК
Трансформация
Ключевые этапы клонирования ДНК
Амплификация
Выделение
рекомбинантной ДНК
Необходимые элементы
• Клонируемая ДНК (чужеродная ДНК)
• Вектор (молекула переносчик ДНК)
• Способ объединения вектора и клонируемой
ДНК
• Клетка-хозяин (host cell)
• Способ переноса ДНК в клетку-хозяин
(трансформация)
• Способ отбора клеток, успешно прошедших
трансформацию (селекция, скрининг)
Создание рекомбинантной ДНК
с использование рестрикции
Рестрикция
Лигирование
«Липкие» и «тупые» концы
рестриктаз
ПЦР для клонирования в вектор
Вектор
— молекула ДНК, обеспечивающая перенос
клонирующей ДНК в клетку-хозяин и
последующую репликацию
• Плазмиды
• Вирусы (бактериофаги)
• Искусственные хромосомы
Плазмиды
— несущественные двуцепочечные молекулы ДНК,
реплицирующиеся в клетке независимо от основной
хромосомной ДНК
• Характерны, как правило, для одноклеточных
(бактерии, дрожжи и тд)
• Как правило, кольцевые молекулы ДНК
(встречаются линейные)
• Размер от 2 kb до 200 kb
• В клетке могут присутствовать разные типы плазмид
• Эписомы – плазмиды, способные встраиваться в
хромосому бактерии
11
Плазмиды
• Однокопийные
• Мультикопийные
Минимальный состав плазмиды:
• Ориджин репликации
• Селективный маркёр
• Полилинкер
12
Плазмидный вектор pUC19
• ori – мультикопийная плазмида (> 100 копий на клетку)
• полининкер
• AmpR – селективный маркер (устойчивость к ампициллину)
• lacI + lacZ – дополнительный селективный маркер (бело-голубая селекция)
Бактериофаги (фаги)
- вирусы, поражающие клетки бактерий
• Могут существовать вне клетки бактерии
• Для репликации должны инфицировать
клетку бактерии
• ДНК или РНК, в одно- или двуцепочечной
форме, линейная или кольцевая
Геном фага λ
• Линейная dsDNA 48,5 kb. Внутри клетки
замыкается в кольцо.
• Фаг заражает бактерию E. coli. Может
реплицироваться независимо или встаиваться в
геном клетки.
• Несущественный фрагмент 23 kb нужен только
для встраивания в геном клетки-хозяина.
Искусственные хромосомы
• Позволяют клонировать большие
фрагменты ДНК
• Низкое количество копий на клетку
• BAC (bacterial artificial chromosome)
• PAC (P1 artificial chromosome)
• YAC (yeast artificial chromosome)
YAC
• Емкость до 2 Mb
• 3 необходимых элемента:
– CEN – центромера
– TEL – теломеры
– ARS (autonomous replication sequence) – ориджин репликации
Бактериальная
плазмида
YAC
Клетка-хозяин
• Бактерии (напр., Escherichia coli)
Клетка-хозяин
• Бактерии (напр., Escherichia coli)
• Дрожжи (напр., Saccharomyces cerevisiae)
Клетка-хозяин
• Бактерии (напр., Escherichia coli)
• Дрожжи (напр., Saccharomyces cerevisiae)
• Растительные клетки
Клетка-хозяин
•
•
•
•
Бактерии (напр., Escherichia coli)
Дрожжи (напр., Saccharomyces cerevisiae)
Растительные клетки
Животные клетки
HeLa
CHO
и тд. и тп...
Трансформация
• Перенос чужеродной ДНК внутрь клеткихозяина
• В каждую клетку попадает, как правило,
одна молекула рекомбинантной ДНК
• Большое количество способов,
адаптированных для разных типов клеток
Электропорация
- один из наиболее эффективных методов трансформации
одноклеточных организмов
24
Пример эксперимента по
клонированию
Селекция
• Позитивная (прямая) – выживает лишь искомый тип клеток,
несущий определенный ген
– устойчивость к антибиотикам и другим токсичным агентам
– способность расти на среде без какого-либо питательного вещества
• Негативная – избирательная гибель клеток, несущих
определенный ген
• Визуальная
• Тотальный скрининг – индивидуально тестируются все
клеточные клоны
Плазмидный вектор pUC19
• ori – мультикопийная плазмида (> 100 копий на клетку)
• полининкер
• AmpR – селективный маркер (устойчивость к ампициллину)
• lacI + lacZ – дополнительный селективный маркер (бело-голубая селекция)
Позитивная + визуальная селекция
Бело-голубая селекция
В питательную среду добавляют: антибиотик, X-gal, IPTG
X-gal
28
Тотальный скрининг
Применение клонирования ДНК
• Изоляция и амплификация интересующего
фрагмента ДНК
• Создание библиотек ДНК
• Секвенирование ДНК
• Изменение последовательности ДНК
(мутирование)
• Синтез белков
Библиотеки ДНК
- большое число молекул векторной
ДНК со встроенными фрагментами
чужеродной (анализируемой) ДНК
BAC libraries
33
Скрининг фаговых библиотек
Для поиска и клонирования интересующих генов
Получение ssDNA
(для секвенирования, мутагенеза)
Вектор М13
Плазмида + фаг
= Фагмида
Мутагенез
Мутагенез для:
• изучения функций генов
• получения генов и белков с измененными свойствами
Синтез белков
• Экспрессионное клонирование – клонирование
с целью экспрессии генов и синтеза белков
• Гетерологичная экспрессия – экспрессия генов
одного организма в клетках другого
• Рекомбинантные белки – белки, полученные в
ходе гетерологичной экспресии
Гетерологичная экспрессия:
• конститутивная – постоянный синтез белка
• индуцибильная – синтез белка при определенных условиях
Синтез белков
Индуцибильная экспрессия
Fusion protein vectors
• При клонировании получаются химерные
гены => при экспрессии синтезируются
химерные белки
• К белкам добавляются различные
форагменты для:
– облегчения очистки
– обеспечения направленного транспорта
– облегчения визуализации белка
Фаговый дисплей (phage display)
А – получение библиотек в фаговых частицах
В – скрининг библиотеки при помощи специфичных антител
(рекомбинантные белки экспрессируются на поверхность фага)
Применение гетерологичной
экспресии
• Синтез белковых лекарств – инсулин
• Получение организмов с новыми свойствами
– ГМО
• Лечение генетических заболеваний
Системы гетерологичной экспрессии
•
•
•
•
•
Бактериальные
Дрожжевые
Растительные
Культуры клеток насекомых
Культуры клеток млекопитающих и
человека
• Трансгенные растения и животные
Модификации белков
Важна не только аминокислотная последовательность белков, но и
посттрансляционные модификации
Экспрессия в молоке
трансгенных животных
Экспрессия в молоке
трансгенных животных
СПАСИБО ЗА ВНИМАНИЕ