Технология рекомбинантной ДНК
реклама
Технология рекомбинантной ДНК Рекомбинантная ДНК — искусственно созданная последовательность ДНК путем объединения нескольких последовательностей ДНК • Части рекомбинантной ДНК могут быть получены исскуственным путем или клонированы из организмов • Рекомбинантную ДНК получают с использованием живых клеток Подходы к изучению специфичных последовательностей ДНК Ключевые этапы клонирования ДНК Создание рекомбинантной ДНК Трансформация Ключевые этапы клонирования ДНК Амплификация Выделение рекомбинантной ДНК Необходимые элементы • Клонируемая ДНК (чужеродная ДНК) • Вектор (молекула переносчик ДНК) • Способ объединения вектора и клонируемой ДНК • Клетка-хозяин (host cell) • Способ переноса ДНК в клетку-хозяин (трансформация) • Способ отбора клеток, успешно прошедших трансформацию (селекция, скрининг) Создание рекомбинантной ДНК с использование рестрикции Рестрикция Лигирование «Липкие» и «тупые» концы рестриктаз ПЦР для клонирования в вектор Вектор — молекула ДНК, обеспечивающая перенос клонирующей ДНК в клетку-хозяин и последующую репликацию • Плазмиды • Вирусы (бактериофаги) • Искусственные хромосомы Плазмиды — несущественные двуцепочечные молекулы ДНК, реплицирующиеся в клетке независимо от основной хромосомной ДНК • Характерны, как правило, для одноклеточных (бактерии, дрожжи и тд) • Как правило, кольцевые молекулы ДНК (встречаются линейные) • Размер от 2 kb до 200 kb • В клетке могут присутствовать разные типы плазмид • Эписомы – плазмиды, способные встраиваться в хромосому бактерии 11 Плазмиды • Однокопийные • Мультикопийные Минимальный состав плазмиды: • Ориджин репликации • Селективный маркёр • Полилинкер 12 Плазмидный вектор pUC19 • ori – мультикопийная плазмида (> 100 копий на клетку) • полининкер • AmpR – селективный маркер (устойчивость к ампициллину) • lacI + lacZ – дополнительный селективный маркер (бело-голубая селекция) Бактериофаги (фаги) - вирусы, поражающие клетки бактерий • Могут существовать вне клетки бактерии • Для репликации должны инфицировать клетку бактерии • ДНК или РНК, в одно- или двуцепочечной форме, линейная или кольцевая Геном фага λ • Линейная dsDNA 48,5 kb. Внутри клетки замыкается в кольцо. • Фаг заражает бактерию E. coli. Может реплицироваться независимо или встаиваться в геном клетки. • Несущественный фрагмент 23 kb нужен только для встраивания в геном клетки-хозяина. Искусственные хромосомы • Позволяют клонировать большие фрагменты ДНК • Низкое количество копий на клетку • BAC (bacterial artificial chromosome) • PAC (P1 artificial chromosome) • YAC (yeast artificial chromosome) YAC • Емкость до 2 Mb • 3 необходимых элемента: – CEN – центромера – TEL – теломеры – ARS (autonomous replication sequence) – ориджин репликации Бактериальная плазмида YAC Клетка-хозяин • Бактерии (напр., Escherichia coli) Клетка-хозяин • Бактерии (напр., Escherichia coli) • Дрожжи (напр., Saccharomyces cerevisiae) Клетка-хозяин • Бактерии (напр., Escherichia coli) • Дрожжи (напр., Saccharomyces cerevisiae) • Растительные клетки Клетка-хозяин • • • • Бактерии (напр., Escherichia coli) Дрожжи (напр., Saccharomyces cerevisiae) Растительные клетки Животные клетки HeLa CHO и тд. и тп... Трансформация • Перенос чужеродной ДНК внутрь клеткихозяина • В каждую клетку попадает, как правило, одна молекула рекомбинантной ДНК • Большое количество способов, адаптированных для разных типов клеток Электропорация - один из наиболее эффективных методов трансформации одноклеточных организмов 24 Пример эксперимента по клонированию Селекция • Позитивная (прямая) – выживает лишь искомый тип клеток, несущий определенный ген – устойчивость к антибиотикам и другим токсичным агентам – способность расти на среде без какого-либо питательного вещества • Негативная – избирательная гибель клеток, несущих определенный ген • Визуальная • Тотальный скрининг – индивидуально тестируются все клеточные клоны Плазмидный вектор pUC19 • ori – мультикопийная плазмида (> 100 копий на клетку) • полининкер • AmpR – селективный маркер (устойчивость к ампициллину) • lacI + lacZ – дополнительный селективный маркер (бело-голубая селекция) Позитивная + визуальная селекция Бело-голубая селекция В питательную среду добавляют: антибиотик, X-gal, IPTG X-gal 28 Тотальный скрининг Применение клонирования ДНК • Изоляция и амплификация интересующего фрагмента ДНК • Создание библиотек ДНК • Секвенирование ДНК • Изменение последовательности ДНК (мутирование) • Синтез белков Библиотеки ДНК - большое число молекул векторной ДНК со встроенными фрагментами чужеродной (анализируемой) ДНК BAC libraries 33 Скрининг фаговых библиотек Для поиска и клонирования интересующих генов Получение ssDNA (для секвенирования, мутагенеза) Вектор М13 Плазмида + фаг = Фагмида Мутагенез Мутагенез для: • изучения функций генов • получения генов и белков с измененными свойствами Синтез белков • Экспрессионное клонирование – клонирование с целью экспрессии генов и синтеза белков • Гетерологичная экспрессия – экспрессия генов одного организма в клетках другого • Рекомбинантные белки – белки, полученные в ходе гетерологичной экспресии Гетерологичная экспрессия: • конститутивная – постоянный синтез белка • индуцибильная – синтез белка при определенных условиях Синтез белков Индуцибильная экспрессия Fusion protein vectors • При клонировании получаются химерные гены => при экспрессии синтезируются химерные белки • К белкам добавляются различные форагменты для: – облегчения очистки – обеспечения направленного транспорта – облегчения визуализации белка Фаговый дисплей (phage display) А – получение библиотек в фаговых частицах В – скрининг библиотеки при помощи специфичных антител (рекомбинантные белки экспрессируются на поверхность фага) Применение гетерологичной экспресии • Синтез белковых лекарств – инсулин • Получение организмов с новыми свойствами – ГМО • Лечение генетических заболеваний Системы гетерологичной экспрессии • • • • • Бактериальные Дрожжевые Растительные Культуры клеток насекомых Культуры клеток млекопитающих и человека • Трансгенные растения и животные Модификации белков Важна не только аминокислотная последовательность белков, но и посттрансляционные модификации Экспрессия в молоке трансгенных животных Экспрессия в молоке трансгенных животных СПАСИБО ЗА ВНИМАНИЕ
