021507 B1 021507 B1 (11) 021507

Евразийское
патентное
ведомство
(19)
(11)
021507
(13)
B1
(12)
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ К ЕВРАЗИЙСКОМУ ПАТЕНТУ
(45)
Дата публикации и выдачи патента
2015.07.30
(21)
Номер заявки
(51) Int. Cl. C07K 16/18 (2006.01)
A61K 39/395 (2006.01)
A61P 25/28 (2006.01)
201100180
(22)
Дата подачи заявки
2006.01.27
(54)
ПРЕПАРАТ АНТИТЕЛА ПРОТИВ А БЕТА ПЕПТИДА
B1
021507
(72)
Изобретатель:
(74)
Представитель:
(57)
Изобретение предусматривает стабилизированный препарат, содержащий гуманизированное антиАβ антитело в концентрации от 0,1 до 100 мг/мл, которое содержит легкую цепь, содержащую
вариабельную область легкой цепи, имеющую остатки 1-112 SEQ ID NO:1, и константную область
легкой цепи; и тяжелую цепь, содержащую вариабельную область тяжелой цепи, имеющую остатки
1-119 SEQ ID NO:2, и константные области тяжелой цепи; гистидин в концентрации от 5 до 15 мМ;
маннит в концентрации 2 до 6% вес./об.; метионин в концентрации от 5 до 15 мМ и полисорбат в
концентрации от 0,001 до 0,01% вес./об.; причем рН препарата составляет около 5,5-6,5. При этом
предусмотрены дозированная лекарственная форма и содержащий её фармацевтический набор.
Стабилизированный препарат применяется для получения лекарственного средства для лечения
или профилактики заболевания, характеризующегося отложениями Аβ пептида, например, болезни
Альцгеймера.
Луизи Донна, Уорн Николас У.,
Кантор Энджела (US)
Дементьев В.Н. (RU)
B1
(56) US-A1-2003202972
US-A1-2004197324
WO-A-03105894
WO-A-2004055164
WO-A-03009817
WO-A-03039485
VIDANOVIC D. ET AL.: "Effects of
nonionic surfactants on the physical stability of
immunoglobulin G in aqueous solution during
mechanical agitation". DIE PHARMAZIE. JUN 2003,
vol. 58, no. 6, June 2003 (2003-06), pages 399-404,
XP001247319, ISSN: 0031-7144, the whole document
WANG WEI: "Instability, stabilization,
and
formulation
of
liquid
protein
pharmaceuticals". INTERNATIONAL JOURNAL OF
PHARMACEUTICS, AMSTERDAM, NL, vol. 185,
no. 2, 20 August 1999 (1999-08-20), pages 129-188,
XP002323952, ISSN: 0378-5173, the whole document
EP-A-0597101
WO-A-03016466
021507
(31) 60/648,631
(32) 2005.01.28
(33) US
(43) 2011.10.31
(62) 200701596; 2006.01.27
(71)(73) Заявитель и патентовладелец:
ЯНССЕН САЙЕНСИЗ АЙРЛЭНД
ЮСИ (IE); ВАЙЕТ ЭЛЭЛСИ (US)
021507
Предпосылки создания изобретения
Болезнь Альцгеймера (AD) является нейродегенеративным заболеванием, характеризующимся наличием амилоидных бляшек, нейрофибриллярных клубков и значительной недостаточности нейронов. βАмилоидный белок (также называемый Аβ пептид), основной компонент сенильных бляшек, участвует в
патогенезе болезни Альцгеймера (Selkoe (1989) Cell 58: 611-612; Hardy (1997) Trends Neurosci. 20: 154159). Показано, что β-амилоид проявляет как непосредственную токсичность в отношении культивированных нейронов (Lorenzo and Yankner (1996) Ann. NY Acad. Sci. 777: 89-95), так и токсичность, опосредованную различными медиаторами (Koh et al. (1990) Brain Research 533: 315-320; Mattson et al. (1992) J.
Neurosciences 12: 376-389). Кроме того, исследования на in vivo моделях, включая мышиную модель линии PDAPP и крысиную модель, позволили связать β-амилоид с изучением недостаточности, изменённой
когнитивной функцией и ингибированием долговременной потенциации в гиппокампе (Chen et al. (2000)
Nature 408: 975-985; Walsh et al. (2002) Nature 416: 535-539). Поэтому основное внимание сосредоточено
на терапевтических средствах, которые изменяют уровни β-амилоида, чтобы теоретически уменьшить
тяжесть или даже аннулировать само заболевание.
Одна методология лечения AD, которая недавно появилась в результате успешных исследований на
мышах PDAPP и крысах в качестве экспериментальных моделей, заключается в иммунизации индивидуумов для того, чтобы предоставить иммуноглобулины, такие как антитела (как в случае пассивной иммунизации, при которой терапевтические иммуноглобулины вводят субъекту), или для генерации иммуноглобулинов (активная иммунизация, при которой иммунная система субъекта активируется, продуцируя иммуноглобулины к вводимому антигену), специфичных к β-амилоиду. В свою очередь, эти антитела способствуют снижению массы бляшек, предупреждая агрегацию β-амилоида (Solomon et al. (1997)
Neurobiology 94: 4109-4112) или стимулируя микроглиальные клетки к фагоцитозу и удалению бляшек
(Bard et al. (2000) Nature Medicine 6: 916-919). Кроме того, например, гуманизированное IgG1 моноклональное антитело к Аβ пептиду (гуманизированное антитело 3D6) может эффективно лечить AD с помощью селективного связывания Аβ пептида.
Для того чтобы белок и, в частности, антитело оставались биологически активными, препарат должен сохранять интактной конформационную целостность, по меньшей мере, коровой последовательности аминокислот белка, в то же время предупреждая расщепление многочисленных функциональных
групп белка. Пути деградации белков могут включать химическую нестабильность (т.е. любой процесс,
который включает модификацию белка за счёт образования или расщепления связи, что приводит к новой химической частице) или физическую нестабильность (т.е. изменения в структуре высшего порядка
белка). Химическая нестабильность может являться результатом дезамидирования, рацемизации, гидролиза, окисления, бета-элиминирования или дисульфидного обмена. Физическая нестабильность может
возникать, например, в результате денатурации, агрегации, осаждения (преципитации) или адсорбции.
Общий обзор об устойчивости белковых фармацевтических препаратов (см., например, Manning, et al.
(1989) Pharmaceutical Research 6: 903-918). Кроме того, желательно поддерживать устойчивость, когда
полипептиды-носители не входят в состав препарата.
Хотя возможная нестабильность белков встречается часто, невозможно предсказать конкретно результаты нестабильности для конкретного белка. Любая такая нестабильность теоретически может привести к образованию полипептидного побочного продукта или производного, обладающего пониженной
активностью, повышенной токсичностью и/или повышенной иммуногенностью. Действительно, преципитация (осаждение) полипептида может привести к тромбозу, негомогенности лекарственной формы и
иммунным реакциям. Таким образом, безопасность и эффективность любого фармацевтического препарата полипептида прямо связаны с его стабильностью.
Следовательно, продолжает существовать необходимость в препаратах, которые не только сохраняют стабильность и биологическую активность биологических полипептидов, например Аβсвязывающих полипептидов, при хранении и доставке, но также пригодны для терапевтического введения различными способами.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение включает препараты, созданные с целью придать стабильность и сохранить
биологическую активность введённого биологически активного белка, в частности белков или полипептидов, связывающих Аβ, таких, например, как антитела к Аβ или их фрагменты или участки. Кроме того,
изобретение предусматривает полипептидные препараты, например, такие как стабилизированные жидкие полипептидные препараты, устойчивые к образованию нежелательных полипептидных побочных
продуктов.
Целостность антиген-связывающих полипептидов для терапевтического применения особенно важна, так как если полипептид образует побочные продукты, например, полученные при стоянии агрегаты
или фрагменты, являющиеся результатом расщепления, биоактивность может быть утрачена, при этом
ставится под угрозу терапевтическая активность молекулы на стандартную дозу. Кроме того, существует
острая необходимость стабилизировать терапевтические полипептиды, предполагаемые для специализированных функций, для доставки и применения по определённым биологическим показаниям, например,
-1-
021507
для лечения нейродегенеративных состояний, при которых полипептид должен преодолеть гематоэнцефалический барьер (ВВВ) и связать целевой антиген.
Изобретение предусматривает стабилизированный препарат, включающий по меньшей мере один
Аβ-связывающий полипептид по меньшей мере один агент, регулирующий тоничность, причём этот
агент присутствует в количестве, достаточном для того, чтобы сделать препарат пригодным для введения, и по меньшей мере один буферный агент в количестве, достаточном для поддержания физиологически приемлемого рН. Препарат может быть лиофилизированным или жидким препаратом. Препараты
включают по меньшей мере один антиоксидант, например, такой как аминокислотный антиоксидант,
например, такой как метионин. В препаратах агентом, регулирующим тоничность, является маннит. В
препаратах по меньшей мере один буферный агент представляет собой сукцинат, фосфат натрия или
аминокислоту, такую как гистидин. При этом стабилизатор предпочтительно представляет собой полисорбат 80.
Настоящее изобретение предусматривает стабилизированный препарат, содержащий (а) гуманизированное анти-Аβ антитело в концентрации от 0,1 до 100 мг/мл, которое содержит легкую цепь, содержащую вариабельную область легкой цепи, имеющую остатки 1-112 SEQ ID NO:1, и константную область легкой цепи; и тяжелую цепь, содержащую вариабельную область тяжелой цепи, имеющую остатки 1-119 SEQ ID NO:2, и константные области тяжелой цепи; (b) гистидин в концентрации от 5 до 15
мМ; (с) маннит в концентрации 2 до 6% вес./об.; (d) метионин в концентрации от 5 до 15 мМ; и (е) полисорбат в концентрации от 0,001 до 0,01% вес./об.; причем рН препарата составляет около 5,5-6,5.
В некоторых вариантах препарат содержит гистидин в концентрации 10 мМ.
В другом варианте изобретения препарат содержит маннит в концентрации 4% вес./об.
В следующем варианте полисорбат содержится в препарате в концентрации 0,005% вес./об.
Согласно другому варианту изобретения метионин содержится в препарате в концентрации 10 мМ.
Гуманизированное антитело может содержат легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, и тяжелую цепь, содержащую аминокислотные остатки 1-448 последовательности SEQ ID NO:2.
При этом концентрация гуманизированного антитела может составлять от 17 до 23 мг/мл.
В следующем варианте препарат дополнительно содержит от 2 до 6% вес./об. сахарозы.
В некоторых препаратах антитело против Аβ связывает непрерывный эпитоп, который включает
остатки внутри 1-7 и внутри 13-28 аминокислотных остатков Аβ. В некоторых препаратах антитело является биспецифическим антителом или антителом, полученным по способу, описанному в опубликованной международной патентной заявке WO 03/070760. В некоторых таких препаратах эпитоп представляет собой непрерывный эпитоп. Антитело против Аβ может представлять собой гуманизированное
3D6 антитело, гуманизированное 10D5 антитело, гуманизированное 12В4 антитело, гуманизированное
266 антитело, гуманизированное 12А11 антитело или гуманизированное 15С11 антитело.
Изотип антитела может представлять собой IgM, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 или любой другой фармацевтически приемлемый изотип. В предпочтительных препаратах изотип представляет собой человеческий IgG1 или человеческий IgG4. В некоторых жидких препаратах концентрация антитела против Аβ
составляет примерно 0,1-60 мг/мл, примерно 40-60 мг/мл, примерно 50 мг/мл, примерно 30 мг/мл, примерно 17-23 мг/мл, примерно 20 мг/мл, примерно 17 мг/мл, примерно 10 мг/мл, примерно 5 мг/мл, примерно 2 мг/мл или около 1 мг/мл, предпочтительно около 17-23 мг/мл.
В некоторых препаратах по меньшей мере один агент, регулирующий тоничность, представляет собой D-маннит и он присутствует в концентрации около 1-10% вес./об., около 2-6% вес./об. или предпочтительно около 4% вес./об. В некоторых препаратах гистидин присутствует в концентрации около 0,1-25
мМ, около 5-15 мМ, предпочтительно около 5 мМ или около 10 мМ. В некоторых препаратах метионин
присутствует в концентрации 5-15 мМ или предпочтительно около 10 мМ. В предпочтительных препаратах стабилизатором является полисорбат 80 и он присутствует в концентрации около 0,001-0,01%
вес./об., около 0,005-0,01% вес./об. или около 0,005% вес./об. рН Препарата около 5,5-6,5, около 6,0-6,5,
около 6,2, около 6,0 или около 5,5, предпочтительно около 6,0.
Некоторые препараты являются устойчивыми в замороженном состоянии. Препарат может быть
пригоден для парентерального, внутривенного, внутримышечного, подкожного, интракраниального или
эпидурального введения, предпочтительно для внутривенного или подкожного введения. Некоторые
препараты могут быть пригодны для нацеленной доставки в мозг или цереброспинальную жидкость
субъекта. Препарат может практически не содержать консервантов. Некоторые препараты устойчивы по
меньшей мере в течение примерно 12 месяцев, по меньшей мере в течение примерно 18 месяцев, по
меньшей мере в течение примерно 24 месяцев или по меньшей мере в течение примерно 30 месяцев. Некоторые препараты устойчивы при температуре примерно от -80 до 40°С, примерно от 0 до 25°С, примерно от 0 до 10°С, предпочтительно примерно от -80 до -50°С или примерно от 2 до 8°С.
Другие препараты устойчивы по меньшей мере в течение 24 месяцев при температуре около 2-8°С
и включают полисорбат 80 в примерной концентрации 0,001-0,01 вес./об. Некоторые из таких препаратов
имеют рН около 6,0-6,5 и включают около 10 мМ гистидина, около 4% вес./об. маннита и около 1 мг/мл,
-2-
021507
около 2 мг/мл или около 5 мг/мл Аβ антитела.
В этих препаратах антитело против Аβ предпочтительно представляет собой гуманизированное 3D6
антитело, гуманизированное 10D5 антитело, гуманизированное 12В4 антитело, гуманизированное 266
антитело, гуманизированное 12А11 антитело или гуманизированное 15С11 антитело.
Предпочтительный препарат устойчив по меньшей мере в течение примерно 24 месяцев при температуре около 2-8°С, имеет рН около 5,5-6,5 и включает примерно 2-23 мг/мл, предпочтительно около 1723 мг/мл гуманизированного 3D6 антитела, около 10 мМ гистидина и около 10 мМ метионина, около 4%
вес./об. маннита и полисорбат 80 в примерной концентрации 0,001-0,01% вес./об., более предпочтительно около 0,005% вес./об. полисорбата 80. В таких препаратах гуманизированное 3D6 антитело может
присутствовать в примерной концентрации 20-23 мг/мл.
Другой предпочтительный препарат устойчив, по меньшей мере в течение примерно 24 месяцев
при температуре около 2-8°С, имеет рН около 6,0-6,5 и включает примерно 2-30 мг/мл гуманизированного 266 антитела, около 10 мМ гистидина и около 10 мМ метионина, около 4% вес./об. маннита и полисорбат 80 в примерной концентрации 0,001-0,01% вес./об., например, около 0,005% вес./об. полисорбата
80. В некоторых таких препаратах гуманизированное антитело 266 присутствует в примерной концентрации около 17-23 мг/мл или около 20-23 мг/мл.
Настоящее изобретение также предусматривает жидкий препарат, включающий антитело против
Аβ, маннит и гистидин. В некоторых из таких препаратов содержится около 20 мг/мл антитела против
Аβ, около 10 мМ L-гистидина, около 10 мМ метионина, около 4% маннита, около 0,005% полисорбата 80
и имеет рН около 6.
Другой такой препарат включает около 5-20 мг/мл антитела против Аβ, около 5-10 мМ Lгистидина, около 10 мМ метионина, около 10% маннита, около 4% маннита, около 0,005% полисорбата
80 и имеет рН около 6,0-6,5. Настоящее изобретение также предусматривает препарат, пригодный для
внутривенного введения, который включает около 20 мг/мл антитела против Аβ, около 10 мМ Lгистидина, около 10 мМ метионина, около 4% маннита и имеет рН около 6 и включает около 0,005% полисорбата 80.
Способ поддержания стабильности препарата гуманизированного антитела против Аβ, который
должен храниться при температуре около (-50)-(-80)°С с последующим хранением при температуре около 2-8°С, предусматривает (i) объединение (смешивание) около 40-60 мг/мл гуманизированного антитела
против Аβ, около 1-2 мг/мл L-гистидина, около 1-2 мг/мл метионина и около 0,05 мг/мл полисорбата 80;
(ii) доведение рН примерно до 6,0; (iii) фильтрование в криососуд и замораживание; (iv) оттаивание; (v)
добавление маннита и разбавителя в количествах, достаточных для получения в результате конечной
концентрации около 4% маннита, около 2-20 мг/мл гуманизированного антитела к Аβ; около 5-10 мМ
гистидина; около 10 мМ метионина и около 0,005% полисорбата 80; (vi) фильтрование; (vii) перенос в
стеклянный флакон и герметизация; и (viii) хранение при температуре около 2-8°С.
Настоящее изобретение также предусматривает набор, включающий контейнер с препаратом по
данному описанию и инструкции по применению.
Настоящее изобретение также предусматривает фармацевтическую стандартную лекарственную
форму, включающую примерно 10-250 мг антитела против Аβ, около 4% маннита, около 5-10 мМ гистидина, около 10 мМ метионина и 0,001-0,1% полисорбата 80. Некоторые из таких фармацевтических стандартных лекарственных форм включают около 40-60 мг, около 60-80 мг, около 80-120 мг, около 120-160
мг или около 160-240 мг антитела против Аβ. Некоторые из таких препаратов до момента введения пациенту можно хранить в стеклянном флаконе (ампуле) при температуре около 2-8°С.
Кроме того, настоящее изобретение предусматривает терапевтический продукт, включающий стеклянный флакон (ампулу) с препаратом, содержащим около 10-250 мг антитела против Аβ, около 4%
маннита, около 5-10 мМ гистидина, около 10 мМ метионина и около 0,005% полисорбата 80. Некоторые
из таких терапевтических продуктов дополнительно включают маркировку для применения, включая
инструкции по применению подходящего объёма, необходимого для получения дозы около 0,15-5 мг/кг
веса пациента. Обычно флакон (ампула, пузырёк) представляет собой флакон (ампулу, пузырёк) на 1, 2,
5, 10, 25 или 50 мл. Доза некоторых из таких терапевтических продуктов составляет около 0,5-3 мг/кг,
предпочтительно около 1-2 мг/кг. В некоторых таких терапевтических продуктах концентрация антитела
против Аβ равна примерно 10-60 мг/мл, предпочтительно около 20 мг/мл. Препарат некоторых таких
терапевтических продуктов предназначен для подкожного введения или внутривенного введения.
Настоящее изобретение также предусматривает способ профилактического или терапевтического
лечения заболевания, характеризующегося отложениями Аβ пептида, которое включает внутривенное
или подкожное введение стандартной дозы фармацевтического препарата по данному описанию.
Другие признаки и преимущества данного изобретения будут очевидны из нижеприведённого подробного описания и формулы изобретения.
Краткое описание фигур
На фиг. 1 дано схематическое изображение теоретически ожидаемой структуры IgG антитела и
-3-
021507
приблизительных положений внутрицепных и межцепных дисульфидных связей, сайтов гликозилирования (обозначены шестигранником), гипервариабельных областей (CDR), каркасных областей (затенённые) и константных областей.
На фиг. 2 изображены полные аминокислотные последовательности лёгкой и тяжёлой цепей гуманизированного 3D6 антитела против Аβ, вариант 2 (hu3D6.v2), последовательности SEQ ID NO:1 и SEQ
ID NO:2 соответственно. Гипервариабельные области (CDR) лёгкой цепи, т.е. CDR1, CDR2 и CDR3, находятся соответственно в положениях остатков 24-39, 55-61 и 94-102 (верхняя панель). Гипервариабельные области (CDR) тяжёлой цепи цепи, т.е. CDR1, CDR2 и CDR3, находятся соответственно в положениях остатков 40-44, 50-65 и 99-108 (нижняя панель). Ожидаемые внутримолекулярные дисульфидные связи иллюстрируются с помощью соединений включённых цистеиновых остатков. Цистеиновые остатки,
предположительно, образующие внутримолекулярные дисульфидные связи, подчеркнуты и связь показана. Связанный с N-концом консенсусный сайт гликозилирования тяжёлой цепи антитела указан курсивом в положениях остатков 299-301 (нижняя панель). Ожидаемый С-концевой лизин в тяжёлой цепи показан в скобках.
На фиг. 3 графически изображён ожидаемый срок хранения препаратов антитела (в присутствии
или в отсутствие полисорбата 80 (PS80)), полученных по настоящему изобретению и хранящихся при
5°С.
На фиг. 4 графически изображён ожидаемый срок хранения препаратов антитела (в присутствии
или в отсутствие PS80), полученных по настоящему изобретению и хранящихся при 25°С.
На фиг. 5 графически изображён ожидаемый срок хранения препаратов антитела (в присутствии
или в отсутствие PS80), полученных по настоящему изобретению и хранящихся при 40°С.
На фиг. 6 графически изображено прогнозированная деградация препаратов с PS80, полученных по
настоящему изобретению и хранящихся при 5°С.
На фиг. 7 графически изображён анализ методом эксклюзионной по размеру хроматографии (SEC)
препаратов с PS80, полученных по настоящему изобретению, хранящихся при 5°С и повторно обработанных с целью свести к минимуму меру изменчивости анализа.
На фиг. 8 графически изображено предсказание расщепления препаратов без PS80, изготовленных в
соответствии с настоящим изобретением и хранящихся при 5°С.
На фиг. 9 изображена хроматограмма, которая показывает, что присутствие PS80 сдвигает побочные продукты, обнаруживаемые в стабилизированном полипептидном препарате, от высокомолекулярных к низкомолекулярным, не изменяя профиль мономерного антитела.
На фиг. 10 (А и В) графически изображено ингибирование образования нежелательных побочных
продуктов в полипептидном препарате, содержащем IgG2, в частности, высокомолекулярных полипептидных агрегатов, при добавлении антиоксиданта, такого как свободный метионин.
Подробное описание изобретения
Для чёткого понимания описания и формулы изобретения ниже представлены следующие определения.
Применяемый в данном описании термин "амилоидогенное заболевание" включает любое заболевание, ассоциированное с (или вызванное) образованием или отложением нерастворимых амилоидных
фибрилл. Типичные амилоидогенные заболевания включают, но без ограничения, системный амилоидоз,
болезнь Альцгеймера, диабет зрелого возраста, болезнь Паркинсона, болезнь Хантингтона, лобновисочную деменцию и прионные трансмиссивные губчатые (спонгиформные) энцефалопатии (куру и
болезнь Кройтцфельда-Якоба у людей и почесуха и BSE (коровье бешенство) у овец и крупного рогатого
скота соответственно). Различные амилоидогенные заболевания определяются или характеризуются
природой полипептидного компонента отложений фибрилл. Например, у субъекта или больного болезнью Альцгеймера β-амилоидный белок (например, дикого типа, вариант или усечённый (процессированный) β-амилоидный белок) является типичным полипептидным компонентом амилоидного отложения.
Соответственно болезнь Альцгеймера является примером "заболевания, характеризующегося отложениями Аβ", или "заболевания, ассоциированного с отложениями Аβ", например, в мозге субъекта или
пациента.
Термины "β-амилоидный белок", "β-амилоидный пептид", "β-амилоид", "Аβ" и "Аβ пептид" применяются в данном описании взаимозаменяемо.
Термин "Аβ-связывающий полипептид" включает полипептиды, способные специфически связываться с Аβ пептидом (пептидами) или с эпитопом (эпитопами) внутри указанных Аβ пептидов. Как правило, Аβ-связывающие полипептиды содержат, по меньшей мере, функциональный участок иммуноглобулина или иммуноглобулиноподобного домена, например, рецептор, который содержит одну или более
вариабельных областей или гипервариабельных областей (CDR), которые сообщают полипептиду свойство специфического связывания. Предпочтительные антиген-связывающие полипептиды включают антитела, например IgM, IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4.
Термин "антитело" относится к молекулам иммуноглобулинов и иммунологически активным участкам молекул иммуноглобулинов (молекул, которые содержат сайт связывания антигена, который спе-4-
021507
цифически связывает антиген), включая моноклональные антитела (в том числе полноразмерные моноклональные антитела), поликлональные антитела, полиспецифические антитела (например, биспецифические антитела), химерные антитела, CDR-привитые антитела, гуманизированные антитела, человеческие антитела и одноцепочечные антитела (scFvs). Выражение "моноклональное антитело" или "композиция моноклинального антитела" по данному описанию относится к популяции молекул антитела, которые содержат только один вид антиген-связывающего сайта, способного распознавать и связываться с
конкретным эпитопом целевого антигена, например эпитоп(ы) Аβ. Таким образом, композиция моноклонального антитела, как правило, выявляет специфичность и аффинность единичного связывания с
конкретным целевым антигеном, в отношении которого она является иммунореагирующей. Термин "одноцепочечное антитело" относится к белку, имеющему структуру из двух полипептидных цепей, состоящую из тяжёлой и лёгкой цепей, причём указанные цепи стабилизированы, например, межцепными
пептидными линкерами, который способен специфически связывать антиген. Методы получения одноцепочечных антител, специфических к целевому антигену, описаны, например, в патенте США 4946778.
Термин "фрагмент антитела" включает F(ab')2 фрагменты, Fab фрагменты, Fab' фрагменты, Fd фрагменты, Fv фрагменты и фрагменты однодоменного антитела (DAbs). Иммунологически активные участки
иммуноглобулинов включают, например, F(ab) и F(ab')2 фрагменты. Методы конструирования Fab фрагментов описаны (см., например, Huse, et al. (1989) Science 246: 1275-1281). Другие фрагменты антител
можно получать методами, известными в уровне техники, включая, но без ограничения: (i) фрагмент
F(ab')2, получаемый расщеплением молекулы антитела с помощью пепсина; (ii) фрагмент Fab, получаемый восстановлением дисульфидных мостиков фрагмента F(ab')2; (iii) фрагмент Fab', получаемый обработкой молекулы антитела папаином и восстановителем, и (iv) фрагменты Fv. Различные фрагменты
можно также получать известными в уровне техники методами рекомбинантной ДНК (генетической инженерии). Антитела нечеловеческого происхождения можно "гуманизировать" методами, описанными,
например, в патенте США 5225539. В одном методе CDR нечеловеческого происхождения вводят в человеческое антитело или в консенсусную последовательность каркаса антитела. Затем для модулирования аффинности или иммуногенности можно ввести дальнейшие изменения в каркас антитела.
Термин "домен" относится к глобулярной области полипептида тяжёлой или лёгкой цепи, содержащей иммуноглобулиновую складку. Иммуноглобулиновая складка состоит из структуры βскладчатого листа (вторичная структура) и включает единственную дисульфидную связь. Далее домены
называются в данном описании "константные" или "вариабельные", в зависимости от относительного
отсутствия разнообразия (изменчивости, вариантов) внутри доменов различных членов класса в случае
"константного" домена, или заметного разнообразия (изменчивости) внутри доменов различных членов
класса в случае "вариабельного" домена. "Домены" антитела или полипептида часто в уровне техники с
равным основанием (взаимозаменяемо) называют "области" антитела или полипептида. "Константные"
домены лёгкой цепи антитела с равным основанием (взаимозаменяемо) называют "константные области
лёгкой цепи", "константные домены лёгкой цепи", "CL" области или "CL" домены. "Константные" домены тяжёлой цепи антитела с равным основанием (взаимозаменяемо) называют "константные области
тяжёлой цепи", "константные домены тяжёлой цепи", "СН" области или "СН" домены. "Вариабельные"
домены лёгкой цепи антитела с равным основанием (взаимозаменяемо) называют "вариабельные области
лёгкой цепи", "вариабельные домены лёгкой цепи", "VL" области или "VL" домены. "Вариабельные" домены тяжёлой цепи антитела с равным основанием (взаимозаменяемо) называют "вариабельные области
тяжёлой цепи", "вариабельные домены тяжёлой цепи", "VH" области или "VH" домены.
Термин "область" может также относиться к части или к участку цепи антитела или домена цепи
антитела (например, к части или к участку тяжёлой или лёгкой цепи антитела или к части или участку
константного или вариабельного домена по данному описанию), а также к более дискретным частям или
участкам указанных цепей или доменов. Например, лёгкая и тяжёлая цепи или вариабельные домены
лёгкой и тяжёлой цепи включают "гипервариабельные области" или "CDR", вкрапленные среди "каркасных областей" или "FR" по данному описанию.
Термин "антитело против Аβ" ("антитело к Аβ") включает антитела (и их фрагменты), способные
связывать эпитоп(ы) Aβ пептида. Антитела против Аβ включают, например, антитела к Аβ, описанные в
опубликованной патентной заявке США No. 20030165496А1, опубликованной патентной заявке США
No. 20040087777A1, опубликованной международной патентной заявке No. WO 02/46237A3 и опубликованной международной патентной заявке No. WO 04/080419A2. Другие антитела против Аβ описаны,
например, в опубликованных международных патентных заявках No. WO 03/077858A2 и WO
04/108895А2, каждая из них озаглавлена "Гуманизированные антитела, которые распознают бетаамилоидный пептид", опубликованной международной патентной заявке No. WO 03/016466A2, озаглавленной "Антитела против Аβ", опубликованной международной патентной заявке No. WO 0162801A2,
озаглавленной "Гуманизированные антитела, которые блокируют амилоидный бета-пептид", опубликованной международной патентной заявке No. WO 02/088306A2, озаглавленной "Гуманизированные антитела", и опубликованной международной патентной заявке No. WO 03/070760A2, озаглавленной "Антитела против Аβ и их применение".
-5-
021507
Термин "фрагмент" относится к части или к участку антитела или цепи антитела, содержащим
меньше аминокислотных остатков, чем интактное или полноразмерное антитело или интактная или полноразмерная цепь антитела. Фрагменты можно получать химической или ферментативной обработкой
интактного или полноразмерного антитела или интактной или полноразмерной цепи антитела. Фрагменты можно также получать методами рекомбинантной ДНК. Примеры фрагментов включают Fab, Fab',
F(ab')2, Fabc и/или Fv фрагменты. Термин "антиген-связывающий фрагмент" относится к полипептидному фрагменту иммуноглобулина или антитела, который связывает антиген или конкурирует с интактным
антителом, из которого он образован, за специфическое связывание антигена.
Термин "конформация" относится к третичной структуре белка или полипептида, такого, например,
как антитело, цепь антитела, его домен или область. Например, выражение "конформация лёгкой (или
тяжёлой) цепи" относится к третичной структуре вариабельной области лёгкой (или тяжёлой) цепи, а
выражение "конформация антитела" или "конформация фрагмента антитела" относится к третичной
структуре антитела или его фрагмента.
Термин "специфическое связывание" антитела означает, что антитело проявляет заметную аффинность к конкретному антигену или эпитопу и, как правило, не проявляет значительной перекрёстной реактивности. В типичных вариантах изобретения антитело не проявляет перекрёстной реактивности
(кросс-реактивности) (например, не реагирует перекрёстно с не-Аβ пептидами или с отдалёнными или
далёкими эпитопами на Аβ). "Заметное (значительное)" или предпочтительное связывание включает связывание с аффинностью по меньшей мере 10-6, 10-7, 10-8, 10-9 М или 10-10 М. Предпочтительна аффинность больше чем 10-7 М, более предпочтительна аффинность больше чем 10-8 М. Предполагается также,
что в объём настоящего изобретения входят значения, промежуточные между представленными в данном описании значениями, а предпочтительная аффинность связывания может быть указана как интервал
аффинностей, например 10-6-10-10 М, предпочтительно 10-7-10-10 М, более предпочтительно 10-8-10-10 М.
Антитело, которое "не проявляет заметной перекрёстной реактивности", представляет собой антитело,
которое не связывается заметно с нежелательной частицей (нежелательным объектом) (например, с нежелательным белком, полипептидом или пептидом). Например, антитело, которое специфически связывается с Аβ, будет заметно связывать Aβ, но не будет в значительной степени реагировать с не-Аβ белками или пептидами (например, не-Аβ белками или пептидами, входящими в состав бляшек). Антитело,
специфическое к конкретному эпитопу, не будет заметно перекрёстно реагировать с удалёнными или
отличными эпитопами на том же самом белке или пептиде. Специфическое связывание можно определить любым общепризнанным в уровне техники методом определения такого связывания. Предпочтительно специфическое связывание определяют по методу Скетчарда или методами конкурентного связывания.
Связывающие фрагменты получают методами рекомбинантной ДНК или ферментативным или химическим расщеплением интактных иммуноглобулинов. Фрагменты для связывания (связывающиеся
фрагменты) включают Fab, Fab', F(ab')2, Fabc, Fv, единичные цепи и одноцепочечные антитела. Под иммуноглобулином или антителом, отличным от "биспецифических" или "бифункциональных" иммуноглобулинов или антител, понимают иммуноглобулин или антитело, имеющие идентичные сайты связывания. "Биспецифическое" или "бифункциональное антитело" представляет собой искусственное гибридное антитело, имеющее две различных пары тяжёлая/лёгкая цепь и два различных сайта связывания.
Биспецифические антитела можно получать различными методами, включая слияние гибридом или связывание Fab' фрагментов (см., например, Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79: 315-321 (1990);
Kostelny et al., J. Immunol. 148, 1547-1553 (1992)).
"Антиген" представляет собой молекулу (например, белковую, полипептидную, пептидную молекулу, молекулу углеводорода или малую молекулу), содержащую антигенную детерминанту, с которой
специфически связывается антитело.
Термин "эпитоп" или "антигенная детерминанта" относится к сайту на антигене, с которой иммуноглобулин или антитело (или их антиген-связывающий фрагмент) специфически связывается. Эпитопы
могут образовываться из соседних аминокислот или несоседних (ненепрерывных) аминокислот, оказавшихся рядом (наложившихся) за счёт третичной структуры-фолдинга белка. Эпитопы, образованные из
непрерывных (соседних) аминокислот, обычно сохраняются при экспозиции с денатурирующими растворителями, тогда как эпитопы, образованные за счёт "третичного фолдинга", обычно утрачиваются при
обработке денатурирующими растворителями. Эпитоп, как правило, включает по меньшей мере 3, 4, 5, 6,
7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15 аминокислот в уникальной пространственной конформации. Методы определения пространственной конформации эпитопов включают, например, рентгеновскую кристаллографию (рентгеноструктурный анализ (РСА)) и 2-мерный ядерный магнитный резонанс (см., например,
Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996)).
Термин "стабилизированный препарат" или "стабилизированный жидкий полипептидный препарат"
включает препараты, находящийся в которых полипептид практически сохраняет свою физическую и
химическую природу (идентичность) и целостность при стоянии. Различные аналитические методы измерения стабильности белка доступны в уровне техники и представлены в данном описании (обзор в
-6-
021507
Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Pubs.
(1991), и Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90 (1993)). Стабильность можно измерять при выбранной температуре для выделенного периода времени. Для быстрого тестирования препарат можно хранить при более высокой или "прогрессивной" ("ускоряющей") температуре, например при 40°С, в течение от 2 недель до 1 месяца или более, в это время измеряется стабильность. В типичных вариантах изобретения препарат устойчив к образованию побочных продуктов сложного полипептида, например, высокомолекулярных продуктов агрегации, низкомолекулярных продуктов деградации (разложения) или
фрагментации или их смесей. Термин "стабильность ("устойчивость") относится к промежутку времени,
в течение которого молекула данного вида, такого как антитело, сохраняет свою первоначальную химическую природу, например, первичную, вторичную и/или третичную структуру.
Термин "побочный продукт" включает нежелательные продукты, которые снижают или уменьшают
долю терапевтического полипептида в данном препарате. Типичные побочные продукты включают агрегаты терапевтического полипептида, фрагменты терапевтического полипептида (например, получающиеся при деградации полипептида в процессе дезамидирования или гидролиза), или их смеси.
Термин "высокомолекулярные полипептидные агрегаты" включает агрегаты терапевтического полипептида, фрагментов терапевтического полипептида (например, полученных при деградации полипептида, например, гидролизом) или их смесей, которые затем подвергаются агрегации. Обычно высокомолекулярные агрегаты представляют собой комплексы, молекулярная масса которых выше молекулярной
массы терапевтического мономерного полипептида. В случае антитела, например IgG антитела, молекулярная масса таких агрегатов выше примерно 150 кДа. Однако, в случае других терапевтических полипептидов, например, одноцепочечных антител, молекулярная масса которых обычно составляет 25 кДа,
такие агрегаты обычно имеют молекулярную массу больше 25 кДа.
Термин "низкомолекулярный продукт деградации (распада, разложения) полипептида" включает,
например, фрагменты терапевтического полипептида, например, получающиеся при дезамидировании
или гидролизе. Обычно низкомолекулярные продукты деградации представляют собой комплексы с молекулярной массой ниже молекулярной массы терапевтического мономерного полипептида. В случае
антитела, например IgG антитела, молекулярная масса таких продуктов деградации ниже примерно 150
кДа. Однако, в случае других терапевтических полипептидов, например, одноцепочечных антител, молекулярная масса которых обычно составляет 25 кДа, такие агрегаты обычно имеют молекулярную массу
ниже 25 кДа.
Термин "способ (путь) введения" ("способ применения") включает общепринятые в уровне техники
способы применения (введения) для доставки терапевтического полипептида, например, такие как парентеральный, внутривенный, внутримышечный, подкожный, интракраниальный или эпидуральный. Для
введения терапевтического полипептида при лечении нейродегенеративного заболевания могут быть
желательны внутривенный, эпидуральный или интракраниальный способы введения.
Термин "лечение" ("обработка") по данному описанию определяется как применение или введение
терапевтического агента пациенту или применение или введение терапевтического агента в выделенную
ткань или клеточную линию пациента, у которого наблюдается заболевание, симптом заболевания или
предрасположенность к заболеванию, с целью излечения, заживления, облегчения, задержки, ослабления, изменения, ликвидации, смягчения, улучшения состояния или воздействия на заболевание, симптомы заболевания или предрасположенность к заболеванию.
Термин "эффективная доза" или "эффективная дозировка" определяется как количество, достаточное для достижения или, по меньшей мере, частичного достижения заданного эффекта. Термин "терапевтически эффективная доза" определяется как количество, достаточное для излечения или, по меньшей
мере, частичного подавления заболевания и его осложнений у пациента, уже страдающего этим заболеванием. Количества, эффективные для этого применения, зависят от тяжести инфекции и общего состояния собственной иммунной системы пациента.
Термин "пациент" ("больной") включает человека и других млекопитающих субъектов, которые получают либо профилактическое, либо терапевтическое лечение.
Термин "стандартная лекарственная форма" (или "унифицированная лекарственная форма") по данному описанию относится к физически дискретной единице (дискретному элементу), пригодной (пригодному) в качестве однократной дозы для приёма пациентами, проходящими лечение, причём каждая
единица содержит заданное количество активного соединения, рассчитанное таким образом, чтобы вызывать нужный терапевтический эффект, вместе с требующимся фармацевтическим носителем, разбавителем или эксципиентом. Характеристика стандартных лекарственных форм по изобретению диктуется
уникальными свойствами активного соединения, конкретным ожидаемым терапевтическим эффектом и
ограничениями, свойственными технике приготовления лекарственного средства из активного соединения для лечения пациентов, и непосредственно зависит от всех этих факторов.
Действительные уровни доз активного ингредиента (например, Аβ-полипептидов) в препаратах по
настоящему изобретению могут меняться таким образом, чтобы получать количество активного ингредиента, эффективное для достижения заданного терапевтического ответа для конкретного пациента, кон-7-
021507
кретной композиции и конкретного способа введения, при этом не будучи токсичным для пациента. Выбранный уровень дозы зависит от различных фармакокинетических факторов, включая активность конкретных используемых композиций по настоящему изобретению, способа введении, времени введения,
скорости экскреции конкретного используемого соединения, длительности лечения, другие лекарства,
соединения и/или материалы, используемые в комбинации с конкретными применяемыми композициями, возраст, пол, вес, условия, общее состояние здоровья и медицинский анамнез пациента, проходящего
лечение, и подобные факторы, общеизвестные в медицине.
Термин "разбавитель" по данному описанию относится к раствору, пригодному для изменения или
создания типичной или подходящей концентрации или подходящих концентраций по данному описанию.
Краткий обзор
Настоящее изобретение предусматривает препараты полипептидов, связывающих Аβ-пептид, в частности, антитела против Аβ, а также их участки и/или фрагменты. В некоторых аспектах изобретение
предусматривает стабилизированные жидкие полипептидные препараты для терапевтического применения. В частности, изобретение предусматривает стабилизацию Аβ-связывающих полипептидов, например, антител и их антиген-связывающих фрагментов, для применения в лечении амилоидогенных заболеваний и/или нарушений. В частности, изобретение предусматривает препараты, стабилизированные
таким образом, что активный терапевтический полипептид активен в течение длительного периода времени, и его можно вводить различными способами. Это особенно важно в случае тех Аβ-связывающих
полипептидов (например, антител), которые предназначены для лечения амилоидогенных заболеваний
и/или нарушений. В других аспектах изобретение предусматривает единственно устойчивый препарат
антитела, который устойчив к различным стрессам, таким как замерзание, лиофилизация, нагревание
и/или реконструкция (реконституция, восстановление). Кроме того, типичные препараты по настоящему
изобретению способны сохранять стабильность, биологическую активность, чистоту и качество антитела
в течение длительного периода времени (например, в течение времени хранения препарата один год или
более) и даже при неблагоприятных температурах. Кроме того, типичные препараты по настоящему изобретению пригодны для введения субъекту или пациенту (например, внутривенного введения субъекту
или пациенту), например человеку, страдающему амилоидогенным заболеванием или нарушением, или
человеку, у которого прогнозируется амилоидогенное заболевание или нарушение.
Препараты
В одном аспекте настоящее изобретение предусматривает стабилизированный препарат, включающий Аβ-связывающий полипептид, агент, регулирующий тоничность, причём этот агент, регулирующий
тоничность, присутствует в количестве, достаточном для создания стабилизированного препарата, пригодного для внутривенной инфузии, и аминокислоту или её производное, причём аминокислота или её
производное присутствует в количестве, достаточном для поддержания физиологически приемлемого
рН. В типичном варианте настоящее изобретение предусматривает стабилизированный препарат, включающий антитело против Аβ пептида, маннит и гистидин.
В одном варианте настоящее изобретение предусматривает стабилизированный препарат, включающий Аβ-связывающий полипептид, агент, регулирующий тоничность, причём этот агент, регулирующий тоничность, присутствует в количестве, достаточном для создания препарата, пригодного для
внутривенной инфузии, и аминокислоту или её производное, причём аминокислота или её производное
присутствует в количестве, достаточном для поддержания физиологически приемлемого рН. В типичном
варианте агентом, регулирующим тоничность, является маннит. В другом типичном варианте аминокислота представляет собой гистидин.
В другом аспекте настоящее изобретение предусматривает стабилизированный препарат, включающий Аβ-связывающий полипептид. Аβ-связывающие полипептиды, пригодные для стабилизации в
препарате по изобретению, включают антитела и их фрагменты, в частности антитела, способные связывать терапевтическую мишень, вовлечённую в амилоидогенное заболевание или нарушение. Соответственно терапевтические полипептиды стабилизированы по изобретению для того, чтобы избежать образования побочных продуктов, обычно высокомолекулярных агрегатов, низкомолекулярных фрагментов,
полученных деградацией, или их смесей, с помощью добавления антиоксидантов в достаточном количестве с тем, чтобы ингибировать образование таких побочных продуктов. Антиоксиданты включают метионин и его аналоги в концентрациях, достаточных для получения заданного ингибирования нежелательных побочных продуктов, обсуждаемых ниже. Необязательно, стабилизированные полипептидные
препараты по изобретению дополнительно содержат агент, регулирующий тоничность, причём этот
агент, регулирующий тоничность, присутствует в количестве, достаточном для создания стабилизированного препарата, пригодного для нескольких различных способов применения, например, для внутривенной инфузии, и аминокислоту или её производное, причём аминокислота или её производное присутствует в количестве, достаточном для поддержания физиологически приемлемого рН. В типичном варианте настоящее изобретение предусматривает стабилизированный препарат, включающий антитело против Аβ, метионин, маннит и гистидин.
-8-
021507
В одном варианте настоящее изобретение предусматривает стабилизированный жидкий препарат,
включающий терапевтически активный Аβ-связывающий полипептид, отличающийся тем, что полипептид при хранении может образовывать побочный продукт, и антиоксидант, причём антиоксидант присутствует в количестве, достаточном для уменьшения образования побочного продукта при стоянии препарата. В типичном варианте изобретения антиоксидант представляет собой метионин или его аналог.
В некоторых вариантах изобретения Аβ-связывающий полипептид выбирают из группы, состоящей
из антитела, Fv фрагмента антитела, Fab фрагмента антитела, Fab'(2) фрагмента антитела, Fd фрагмента
антитела, одноцепочечного антитела к Аβ (scFv), фрагмента однодоменного антитела (Dab), полипептида
со структурой бета-складчатого листа, включающего по меньшей мере одну гипервариабельную область
антитела (CDR), и неглобулярного полипептида, включающего по меньшей мере одну гипервариабельную область антитела. В типичных вариантах изобретения Аβ-связывающий полипептид присутствует в
концентрации около 0,1-60 мг/мл. В других типичных вариантах препараты по настоящему изобретению
включают Аβ-связывающий полипептид в примерной концентрации 30 мг/мл. В других типичных вариантах препараты по настоящему изобретению включают Аβ-связывающий полипептид в примерной концентрации 20 мг/мл. В других примерах осуществления изобретения препараты по изобретению включают Аβ-связывающий полипептид в примерной концентрации 17 мг/мл.
В примерах осуществления изобретения Аβ-связывающий полипептид представляет собой антитело к Аβ. В некоторых вариантах настоящего изобретения антитело к Аβ выбирают из группы, состоящей
из гуманизированного 3D6 антитела, гуманизированного 10D5 антитела, гуманизированного 12В4 антитела, гуманизированного 266 антитела, гуманизированного 12А11 антитела и гуманизированного 15С11
антитела. В примерах осуществления настоящего изобретения антитело против Аβ связывает эпитоп,
включающий аминокислотные остатки Аβ пептида, выбранные из группы, состоящей из аминокислотных остатков 1-7, 1-5, 3-7, 3-6, 13-28, 16-21, 19-22, 33-40 и 33-42. В некоторых вариантах настоящего
изобретения антитело против (к) Аβ является антителом субтипа, выбранного из группы, состоящей из
человеческого IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. В конкретном варианте настоящего изобретения антитело против
Аβ является человеческим иммуноглобулином субтипа IgG1.
Аβ-полипептид может образовывать побочный продукт, выбранный из группы, состоящей из высокомолекулярного полипептидного агрегата, низкомолекулярного продукта деградации полипептида и их
комбинаций. Высокомолекулярные агрегаты могут включать комплексы антитело: антитело, комплексы
антитело: фрагмент антитела, комплексы фрагмент антитела: фрагмент антитела или их комбинации.
Низкомолекулярные полипептидные продукты деградации могут включать лёгкую цепь антитела, тяжёлую цепь антитела, комплекс лёгкой цепи антитела и тяжёлой цепи антитела, фрагмент антитела и их
комбинации.
В одном варианте настоящего изобретения жидкий препарат по настоящему изобретению включает
Аβ-связывающий полипептид, маннит и гистидин. В типичном варианте настоящего изобретения Аβсвязывающий полипептид представляет собой антитело к (против) Аβ. В некоторых вариантах настоящего изобретения антитело к Аβ выбирают из группы, состоящей из гуманизированного 3D6 антитела,
гуманизированного 10D5 антитела, гуманизированного 12В4 антитела, гуманизированного 266 антитела,
гуманизированного 12А11 антитела и гуманизированного 15С11 антитела. В других примерах осуществления настоящего изобретения антитело против Аβ связывает эпитоп, включающий аминокислотные
остатки Аβ пептида, выбранные из группы, состоящей из аминокислотных остатков 1-7, 1-5, 3-7, 3-6, 1328, 16-21, 19-22, 33-40 и 33-42. В некоторых вариантах настоящего изобретения антитело против (к) Аβ
является антителом субтипа, выбранного из группы, состоящей из IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. В конкретном варианте настоящего изобретения антитело против Аβ является иммуноглобулином субтипа IgG1.
Препараты по настоящему изобретению включают маннит в количестве, достаточном для поддержания изотоничности препарата. В примерах вариантов настоящего изобретения маннит присутствует в
количестве около 2% вес./об.-около 6% вес./об. Препараты по настоящему изобретению включают гистидин в количестве, достаточном для сохранения физиологически приемлемого рН. В примерах вариантов настоящего изобретения гистидин присутствует в примерной концентрации 5-15 мМ. В других примерах вариантов настоящего изобретения гистидин присутствует в примерной концентрации 10 мМ.
В примерах вариантов настоящего изобретения антиоксидант представляет собой метионин или его
аналог. В одном варианте настоящего изобретения метионин или его аналог присутствует в концентрации около 5-15 мМ. В другом варианте изобретения метионин или его аналог присутствует в концентрации около 10 мМ.
Препарат дополнительно включает стабилизатор - полисорбат. В примерах вариантов настоящего
изобретения стабилизатор представляет собой полисорбат 80. В некоторых вариантах изобретения полисорбат 80 присутствует в количестве 0,001-0,01% вес./об. В других вариантах изобретения полисорбат 80
присутствует в количестве около 0,005%. Ещё в одних вариантах настоящего изобретения полисорбат 80
присутствует в примерном количестве около 0,01% вес./об.
В некоторых вариантах изобретения препарат имеет рН около 5-6,5.
-9-
021507
В некоторых вариантах изобретения препарат устойчив к замораживанию. В других вариантах настоящего изобретения препарат пригоден для внутривенного введения. В примере варианта настоящего
изобретения препарат пригоден для внутримышечного или подкожного введения. В примере варианта
изобретения препарат применим для доставки к мозгу субъекта.
В некоторых вариантах настоящего изобретения препарат пригоден для доставки в цереброспинальную жидкость субъекта. В других вариантах изобретения препарат практически не содержит консервантов.
В некоторых вариантах настоящего изобретения препарат устойчив по меньшей мере в течение
примерно 12 месяцев. В некоторых вариантах препарат устойчив по меньшей мере в течение примерно
18 месяцев. В некоторых вариантах препарат устойчив по меньшей мере в течение примерно 24 месяцев.
В некоторых вариантах настоящего изобретения препарат устойчив по меньшей мере в течение примерно 30 месяцев.
В примерах вариантов настоящего изобретения препарат устойчив при температуре примерно от 80 до 40°С. В некоторых примерах вариантов изобретения препарат устойчив при температуре примерно
от 0 до 25°С. Предпочтительно препарат устойчив при температуре примерно от 2 до 8°С.
Предпочтительный препарат, пригодный для внутривенного введения, включает около 20 мг/мл антитела против Аβ, около 10 мМ L-гистидина, около 10 мМ метионина, около 4% маннита, около 0,005%
полисорбата 80 и имеет рН около 6. В другом примере варианта настоящего изобретения препарат, пригодный для внутривенного введения, включает около 10 мг/мл антитела против Аβ, около 10 мМ Lгистидина, около 10 мМ метионина, около 10% маннита, около 0,005% полисорбата 80 и имеет рН около
6,5.
В некоторых вариантах вышеуказанных препаратов по настоящему изобретению антитело против
Аβ выбирают из группы, состоящей из гуманизированного 3D6 антитела, гуманизированного 10D5 антитела, гуманизированного 12В4 антитела, гуманизированного 266 антитела, гуманизированного 12А11
антитела или гуманизированного 15С11 антитела. Один такой препарат имеет рН около 6,0-6,5 и включает около 10 мМ гистидина, около 4% вес./об. маннита и около 2-20 мг/мл антитела против Аβ, выбранного из группы, состоящей из гуманизированного 3D6 антитела, гуманизированного 10D5 антитела, гуманизированного 12В4 антитела, гуманизированного 12А11 антитела. В некоторых препаратах антитело
против Аβ связывает эпитоп внутри аминокислотных остатков, выбранных из группы, состоящей из
аминокислотных остатков 1-7, 1-5, 3-7, 3-6, 13-28, 16-21, 19-22, 33-40 и 33-42 Аβ-пептида. В некоторых
препаратах антитело против Аβ связывает непрерывный эпитоп, который включает остатки внутри остатков 1-7, внутри остатков 13-28 Аβ-пептида. В некоторых таких препаратах антитело является биспецифическим антителом или антителом, полученным по методу, описанному в опубликованной международной патентной заявке WO 03/070760. В некоторых таких препаратах эпитоп представляет собой непрерывный эпитоп.
В другом аспекте настоящего изобретения фармацевтическая стандартная лекарственная форма
включает эффективное количество препарата по любому из вышеприведенных вариантов изобретения
для лечения заболевания у пациента путём введения лекарственной формы пациенту. В одном примере
варианта изобретения фармацевтическая стандартная лекарственная форма представляет собой контейнер, содержащий препарат по настоящему изобретению. В одном примере варианта изобретения контейнер представляет собой флакон (ампулу, пузырёк), содержащий около 1-2000 мг Аβ-связывающего полипептида. В другом варианте изобретения флакон (ампула, пузырёк) содержит около 50-1500 мг Аβсвязывающего полипептида. Ещё в одном примере варианта изобретения флакон (ампула, пузырёк) содержит около 5-50 мг Аβ-связывающего полипептида.
В примерах вариантов настоящего изобретения флакон (пузырёк, ампула) имеет объём около 2-100
мл. В других вариантах изобретения объём флакона (пузырька, ампулы) составляет около 2-10 мл.
В некоторых вариантах изобретения фармацевтическая стандартная лекарственная форма по настоящему изобретению пригодна для внутривенного вливания пациенту.
Также в настоящем описании представлены наборы, включающие фармацевтическую стандартную
лекарственную форму по данному описанию и инструкцию по применению. В одном варианте настоящего изобретения контейнер, содержащий фармацевтическую стандартную лекарственную форму, представляет собой контейнер с прикреплённой этикеткой с руководством по применению. В одном примере
варианта изобретения контейнер снабжён этикеткой с руководством по профилактическому применению. В другом примере варианта изобретения контейнер снабжён этикеткой с руководством по терапевтическому применению.
Настоящее изобретение предусматривает способ повышения стабильности Аβ-связывающего полипептида в жидком фармацевтическом препарате, причём полипептид демонстрирует образование побочного продукта при хранении в жидком препарате, этот способ включает введение в препарат антиоксиданта в количестве, достаточном для уменьшения количества образующегося побочного продукта полипептида. В примерах вариантов изобретения Аβ-связывающий полипептидный компонент выбирают из
группы, состоящей из антитела, Fv фрагмента антитела, Fab фрагмента антитела, Fab'(2) фрагмента анти- 10 -
021507
тела, Fd фрагмента антитела, одноцепочечного антитела (scFv), фрагмента однодоменного антитела
(Dab), полипептида со структурой бета-складчатого листа, включающего по меньшей мере одну гипервариабельную область антитела (CDR), неглобулярного полипептида, включающего по меньшей мере
одну CDR область антитела. В одном варианте изобретения побочный продукт выбирают из группы, состоящей из высокомолекулярного полипептидного агрегата, низкомолекулярного продукта деградации
полипептида и их комбинаций. В другом варианте изобретения антиоксидант выбирают из группы, состоящей из метионина и его аналога.
В некоторых вариантах изобретения способ получения препарата по любому из вышеприведённых
вариантов настоящего изобретения включает объединение (смешение) эксципиентов препарата. В примере варианта изобретения способ приготовления препарата по любому из вышеприведённых вариантов
изобретения включает объединение (смешение, комбинирование) Аβ-связывающего полипептида с одним или более разбавителем, причём один или более разбавителей включают эксципиенты препарата.
В примере варианта изобретения способ приготовления фармацевтической стандартной лекарственной формы включает объединение препарата по любому из вышеприведённых вариантов изобретения
в подходящем контейнере. В другом примере варианта изобретения способ приготовления препарата по
любому из вышеприведённых вариантов изобретения включает объединение раствора, содержащего Аβсвязывающий полипептид и по меньшей мере часть эксципиентов препарата, с разбавителем, содержащим остальные эксципиенты.
Полипептиды для применения в стабилизированных препаратах по изобретению
Полипептид, из которого готовят препарат по изобретению, представленный в данном описании,
получают общепринятыми в уровне техники методами, которые включают, например, синтетические
методы (такие как методы рекомбинантной ДНК и пептидный синтез или комбинация этих методов), или
их можно выделять из эндогенных источников полипептида. В некоторых вариантах изобретения выбранный полипептид представляет собой антиген-связывающий полипептид, более предпочтительно
антитело, в частности антитело против (к) Аβ. Методы получения антиген-связывающего полипептида, в
частности, антител, описаны ниже.
Поликлональные антитела
Поликлональные антитела можно получать иммунизацией подходящего субъекта иммуногеном.
Титр антитела в иммунизированном субъекте можно контролировать во времени стандартными методами, такими как твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA) с применением иммобилизованного
целевого антигена. При желании молекулы антитела, нацеленные на целевой антиген, можно выделять
из организма млекопитающего (например, из крови) и очищать далее общепринятыми методами, такими
как хроматографии на протеин А-сефарозе, при этом получают антитело, например, фракцию IgG. Через
соответствующее время после иммунизации, когда титры антитела против антигена наиболее высоки,
клетки, продуцирующие антитело, можно получать от субъекта и использовать для получения моноклональных антител стандартными методами, такими как метод гибридом, впервые описанный Kohler and
Milstein (1975) Nature 256: 495-497 (см. также Brown et al., (1981) J. Immunol. 127: 539-46; Brown et al.,
(1980) J. Biol. Chem. 255: 4980-83; Yeh et al., (1976) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 2927-31; и Yeh et al.,
(1982) Int. J. Cancer 29: 269-75). О получении химерных поликлональных антител см. Buechler et al., патент США 6420113.
Моноклональные антитела
Для получения моноклонального антитела можно использовать любые протоколы, используемые
для слияния лимфоцитов и иммортализованных клеточных линий (см., например, G. Galfre et al. (1977)
Nature 266: 55052; Gefter et al. Somatic Cell Genet, цитируется выше; Lerner, Yale J. Biol. Med., цитируется
выше; Kenneth, Monoclonal Antibodies, цитируется выше). Кроме того, рядовой специалист понимает, что
существует множество вариантов таких методов, которые также могут применяться. Обычно бессмертная линия клеток (например, клеточная линия миеломы) происходит из того же вида млекопитающего,
что и лимфоциты. Например, мышиные гибридомы можно получать слиянием лимфоцитов мыши, иммунизированной иммуногенным препаратом по настоящему изобретению, с иммортализованной мышиной клеточной линией. Предпочтительные бессмертные клеточные линии представляют собой клеточные линии мышиной миеломы, чувствительные к культуральной среде, содержащей гипоксантин, аминоптерин и тимидин ("HAT среда"). Любую из ряда клеточных линий миеломы можно использовать в
качестве партнёра по слиянию в соответствии со стандартными методами, например, клеточные линии
миеломы Р3-NS1/1-Ag4-1, P3-x63-Ag8.653 или Sp2/O-Ag14. Эти клеточные линии миеломы можно получить из АТСС. Обычно HAT-чувствительные клетки мышиной миеломы сливают с мышиными спленоцитами, используя полиэтиленгликоль ("ПЭГ", "PEG"). Клетки гибридомы, полученные в результате
слияния, затем выбирают, используя среду HAT которая убивает неслитые или непродуктивно слитые
клетки миеломы (неслитые спленоциты умирают через несколько дней, так как они не трансформируются). Клетки гибридомы, продуцирующие моноклональное антитело по изобретению, детектируют скринингом супернатантов гибридомных культур на антитела, которые связывают целевой антиген, например, Аβ, стандартным методом ELISA.
- 11 -
021507
Рекомбинантные антитела
В качестве альтернативы получению гибридом, секретирующих моноклональные антитела, моноклональное антитело можно идентифицировать и выделять скринингом комбинаторной библиотеки рекомбинантных иммуноглобулинов (например, фаг-дисплейной библиотеки антител) с использованием
целевого антигена, чтобы тем самым выделить членов библиотеки иммуноглобулина, которые связывают целевой антиген. Наборы для создания и скрининга фаг-дисплейных библиотек выпускаются промышленностью (например, Recombinant Phage Antibody System, от Pharmacia, No. по каталогу. 27-940001; и SurfZAP Phage Display Kit, от Stratagene, No. по каталогу 240612). Кроме того, примеры методов и
реагентов, особенно пригодные для создания и скрининга дисплейной библиотека антител, можно найти
(см., например, в Ladner et al. патент США 5223409; Kang et al. опубликованная Международная патентная заявка РСТ WO 92/18619; Dower et al. опубликованная Международная патентная заявка РСТ WO
91/17271; Winter et al. опубликованная Международная патентная заявка РСТ WO 92/20791; Markland et
al. опубликованная Международная патентная заявка РСТ WO 92/15679; Breitling et al. опубликованная
Международная патентная заявка РСТ WO 93/01288; McCafferty et al. опубликованная Международная
патентная заявка РСТ WO 92/01047; Garrard et al. опубликованная Международная патентная заявка РСТ
WO 92/09690; Ladner et al. опубликованная Международная патентная заявка РСТ WO 90/02809; Fuchs et
al. (1991) Bio/Technology 9: 1370-1372; Hay et al. (1992) Hum. Antibod. Hybridomas 3: 81-85; Huse et al.
(1989) Science 246: 1275-1281; Griffiths et al. (1993) EMBO J 12: 725-734; Hawkins et al. (1992) J. Mol. Biol.
226: 889-896; Clarkson et al. (1991) Nature 352: 624-628; Gram et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:
3576-3580; Garrad et al. (1991) Bio/Technology 9: 1373-1377; Hoogenboom et al. (1991) Nuc. Acid Res. 19:
4133-4137; Barbas et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7978-7982; и McCafferty et al. Nature (1990)
348: 552-554).
Химерные и гуманизированные антитела
Кроме того, рекомбинантные антитела, такие как химерные и гуманизированные моноклональные
антитела, содержащие участки как человеческого, так и "нечеловеческого" происхождения, которые
можно получать стандартными методами рекомбинантной ДНК, входят в объём изобретения.
Термин "гуманизированный иммуноглобулин" или "гуманизированное антитело" относится к иммуноглобулину или антителу, которые включают по меньшей мере одну гуманизированную цепь иммуноглобулина или антитела (т.е. по меньшей мере одну гуманизированную лёгкую или тяжёлую цепь).
Термин "гуманизированная цепь иммуноглобулина" или "гуманизированная цепь антитела" (т.е. "гуманизированная лёгкая цепь иммуноглобулина" или "гуманизированная тяжёлая цепь иммуноглобулина")
относится к цепи иммуноглобулина или антитела (т.е. лёгкой или тяжёлой цепи соответственно), имеющей вариабельную область, которая включает вариабельную каркасную область, главным образом (в
основном, практически), человеческого иммуноглобулина или антитела и гипервариабельные области
(CDR) (например, по меньшей мере одна область CDR, предпочтительно две области CDR, более предпочтительно три области CDR), главным образом, иммуноглобулина или антигена "нечеловеческого"
происхождения, и дополнительно включает константные области (например, по меньшей мере одну константную область или её участок в случае лёгкой цепи, и три константных области в случае тяжёлой цепи). Выражение "гуманизированная вариабельная область" (например, "гуманизированная вариабельная
область лёгкой цепи" или "гуманизированная вариабельная область тяжёлой цепи") относится к вариабельной области, которая включает вариабельную каркасную область, главным образом, (из) человеческого иммуноглобулина или антитела и гипервариабельные области (CDR) главным образом, иммуноглобулина или антигена "нечеловеческого" происхождения.
Выражение "главным образом (практически), (из) человеческого иммуноглобулина или антитела"
или "главным образом (практически) человеческий" означает, что при выравнивании с аминокислотной
последовательностью человеческого иммуноглобулина или антитела с целью сравнения область по
меньшей мере на 80-90%, 90-95% или на 95-99% идентична (имеет идентичность по меньшей мере 8090%, 90-95% или 95-99%) (т.е. имеет идентичность локальной последовательности) человеческой последовательности каркасной или константной области, что делает возможными, например, консервативные
замены, замены консенсусной последовательности, замены зародышевой линии, обратные мутации и т.п.
Введение консервативных замен, замен консенсусной последовательности, замен зародышевой линии,
обратных мутаций и т.п. часто называют "оптимизацией" гуманизированного антитела или цепи. Выражение "главным образом (практически, в основном) (из) иммуноглобулина или антитела "нечеловеческого" происхождения" или "главным образом (практически, в основном) нечеловеческий" означает наличие
последовательности иммуноглобулина или антитела по меньшей мере на 80-95%, предпочтительно по
меньшей мере на 90-95%, более предпочтительно на 96, 97, 98 или 99% идентичной последовательности
иммуноглобулина или антитела организма нечеловеческого происхождения, например, отличного от человека млекопитающего.
Соответственно все области или остатки гуманизированного иммуноглобулина или антитела, или
гуманизированной цепи иммуноглобулина или антитела, за исключением CDR, практически (в основном) идентичны соответствующим областям или остаткам одной или более последовательностей нативного человеческого иммуноглобулина. Выражение "соответствующая область" или "соответствующий
- 12 -
021507
остаток" относится к области или остатку на второй аминокислотной или нуклеотидной последовательности, которые занимают то же самое (т.е. эквивалентное) положение, что и область или остаток на первой аминокислотной или нуклеотидной последовательности, когда первая и вторая последовательности
оптимально выравниваются с целью сравнения.
Термин "значительная (заметная) идентичность" означает, что две полипептидные последовательности при оптимальном выравнивании, таком как с помощью программ GAP или BESTFIT с применением средневзвешенных значений гэпов (пробелов) по умолчанию, имеют идентичность последовательностей по меньшей мере 50-60%, предпочтительно идентичность последовательностей по меньшей мере
60-70%, более предпочтительно идентичность последовательностей по меньшей мере 70-80%, более
предпочтительно идентичность последовательностей по меньшей мере 80-90%, ещё более предпочтительно идентичность последовательностей по меньшей мере 90-95% и ещё более предпочтительно идентичность последовательностей по меньшей мере 95% или более (например, идентичность последовательностей 99% или более). Термин "практическая идентичность (практически идентичный)" означает,
что две полипептидные последовательности при оптимальном выравнивании, таком как с помощью программ GAP или BESTFIT с применением средневзвешенных значений гэпов (пробелов) по умолчанию,
имеют идентичность последовательностей по меньшей мере 80-90%, предпочтительно идентичность последовательностей по меньшей мере 90-95% и более предпочтительно идентичность последовательностей по меньшей мере 95% или более (например, идентичность последовательностей 99% или более).
Для сравнения последовательностей обычно одна последовательность служит в качестве эталонной последовательности, с которой сравниваются тестируемые последовательности. При использовании алгоритма сравнения последовательностей тестируемая и эталонная последовательности вводятся в компьютер, при необходимости задаются координаты последовательностей и устанавливаются параметры программы "Алгоритм последовательности". Затем, используя алгоритм сравнения последовательностей,
рассчитывают процент идентичности последовательностей для тестируемой (тестируемых) последовательности (последовательностей) относительно эталонной последовательности, исходя из заданных (установленных) параметров программы.
Оптимальное выравнивание последовательностей для сравнения можно проводить, например, используя алгоритм локальной гомологии (алгоритм построения локального выравнивания) СмитаВатермана (Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981)), алгоритм построения глобального выравнивания Нидельмана-Вунша (Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970)), поиск подобия методом
Пирсона и Липмана (Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988), компьютеризованную
реализацию этих алгоритмов (GAP, BESTFIT, FASTA и TFASTA в пакете программ Wisconsin Genetics
Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), или визуальное изучение (см. в
общем Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology). Примером алгоритма, пригодного для определения идентичности последовательностей и подобия последовательностей в процентах, является алгоритм BLAST, описанный в Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403 (1990). Программа для осуществления
BLAST анализов общедоступна через National Center for Biotechnology Information (на Интернет сервере
National Institutes of Health NCBI). Обычно для проведения сравнения последовательностей можно использовать параметры программы по умолчанию, хотя можно также использовать специальные параметры пользователя. Для аминокислотных последовательностей программа BLASTP по умолчанию использует длину слова (W) 3, ожидание (Е) 10 и матрицу BLOSUM62 (см. Henikoff &Henikoff, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 89: 10915 (1989)).
Предпочтительно положения остатков, не являющихся идентичными, различаются консервативными аминокислотными заменами. С целью классификации аминокислотных замен в качестве консервативных или неконсервативных аминокислоты делят на следующие группы: группа I (гидрофобные боковые цепи): leu, met, ala, val, leu, ile; группа II (нейтральные гидрофильные боковые цепи): cys, ser, thr;
группа III (кислые боковые цепи): asp, glu; группа IV (основные боковые цепи): asn, gin, his, lys, arg;
группа V (остатки, влияющие на ориентацию цепи): gly, pro; и группа VI (ароматические боковые цепи):
trp, tyr, phe. Консервативные замены включают замены аминокислотами того же класса. Неконсервативные замены представляют собой замену члена одного из этих классов на член другого класса.
Предпочтительно гуманизированные иммуноглобулины или антитела связывают антиген с аффинностью, превышающей аффинность соответствующего негуманизированного антитела в три, четыре или
пять раз. Например, если негуманизированное антитело обладает аффинностью связывания 10-9 М, величина аффинности связывания гуманизированных антител будет равна по меньшей мере 3×10-8 М, 4×10-8
М, 5×10-8 М или 10-9 М. При описании связывающих свойств цепи иммуноглобулина или антитела цепь
можно описывать на основании её способности "направлять (нацеливает) на связывание антигена (с антигеном) (например, Aβ)". Говорят, что цепь "направляет на связывание антигена", когда она сообщает
интактному иммуноглобулину (или его антиген-связывающему фрагменту) свойство специфического
связывания или аффинность связывания. Говорят, что мутация (например, обратная мутация) существенно влияет на способность тяжёлой или лёгкой цепи направлять связывание с антигеном, если она изменяет (например, понижает) аффинность связывания интактного иммуноглобулина или антитела (или
- 13 -
021507
его антиген-связывающего фрагмента), содержащего указанную цепь, по меньшей мере, на порядок по
сравнению с аффинностью антитела (или его антигенсвязывающего фрагмента), содержащего эквивалентную цепь, в которой отсутствует указанная мутация. Мутация "несущественно влияет (например,
снижает) на способность тяжёлой или лёгкой цепи "направлять связывание с антигеном", если она изменяет (например, понижает) аффинность связывания интактного иммуноглобулина или антитела (или его
антигенсвязывающего фрагмента), содержащего указанную цепь, только в два, три или четыре раза по
сравнению с аффинностью антитела (или его антигенсвязывающего фрагмента), содержащего эквивалентную цепь, в которой отсутствует указанная мутация.
Термин "химерный иммуноглобулин" или "химерное антитело" относится к иммуноглобулину или
антителу, вариабельные области которого образованы из первого вида, а константные области которых
происходят второго вида. Химерные иммуноглобулины или антитела можно конструировать, например,
генетической инженерией (методами рекомбинантной ДНК), при использовании сегментов гена иммуноглобулина, принадлежащих к различным видам. Не предполагается, что термины "гуманизированный
иммуноглобулин" или "гуманизированное антитело" охватывают химерные иммуноглобулины или антитела, определяемые ниже. Хотя гуманизированные иммуноглобулины или антитела являются химерными по своей конструкции (т.е. содержат области более чем из одного вида белка), они включают дополнительные признаки (т.е. вариабельные области, содержащие донорные CDR остатки и акцепторные
каркасные остатки), не обнаруживаемые в химерных иммуноглобулинах или антителах по определению
в данном описании.
Такие химерные и гуманизированные моноклональные антитела можно получать методами рекомбинантной ДНК, известными в уровне техники (см., например, методы, описанные в Robinson et al. Международная патентная заявка PCT/US 86/02269; Akira, et al. Европейская патентная заявка 184187; Taniguchi, M., Европейская патентная заявка 171496; Morrison et al. Европейская патентная заявка 173494;
Neuberger et al. опубликованная Международная патентная заявка РСТ WO 86/01533; Cabilly et al. патент
США 4816567; Cabilly et al. Европейская патентная заявка 125023; Better et al. (1988) Science 240: 10411043; Liu et al. (1987) Proc. Natl Acad. Sci. USA 84: 3439-3443; Liu et al. (1987) J. Immunol. 139: 3521-3526;
Sun et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 214-218; Nishimura et al. (1987) Canc. Res. 47: 999-1005;
Wood et al. (1985) Nature 314: 446-449; и Shaw et al. (1988) J. Natl. Cancer Inst. 80: 1553-1559); Morrison, S.
L. (1985) Science 229: 1202-1207; Oi et al. (1986) BioTechniques 4: 214; Winter патент США 5225539; Jones
et al. (1986) Nature 321: 522-525; Verhoeyan et al. (1988) Science 239: 534; и Beidler et al. (1988) J. Immunol.
141: 4053-4060).
Человеческие антитела из трансгенных животных и фаговый дисплей
Или же, в настоящее время можно получать трансгенных животных (например, мышей), способных
после иммунизации продуцировать полный спектр человеческих антител в отсутствие продуцирования
эндогенного иммуноглобулина. Например, было описано, что гомозиготная делеция гена шарнирной
области тяжёлой цепи антитела (JH) у химерных мышей и мышей с мутацией в зародышевой линии приводит к полному ингибированию продуцирования эндогенного антитела. Перенос набора генов зародышевой линии человеческого иммуноглобулина в таких мышей с мутацией в зародышевой линии приводит к продуцированию человеческих антител при контрольном заражении антигеном.
Полностью человеческие антитела могут также быть получены из фаг-дисплейных библиотек (Hoogenboom et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991)). Химерные поликлональные антитела можно также получать их фаг-дисплейных библиотек (Buechler et al. патент США 6420113).
Биспецифические антитела, полипептиды-слитое антитело и одноцепочечные антитела
Биспецифические антитела (BsAbs) представляют собой антитела, обладающие специфичностью
связывания по меньшей мере к двум эпитопам. Такие антитела можно получать из полноразмерных антител или фрагментов антител (например, F(ab)'2 биспецифических антител). Способы получения биспецифических антител известны в уровне техники. Традиционное получение полноразмерных биспецифических антител основано на коэкспрессии двух пар тяжёлая-лёгкая цепь иммуноглобулина, где две цепи
имеют различные специфичности (Millstein et al., Nature, 305: 537-539 (1983)). Вследствие произвольного
набора тяжёлой и лёгкой цепей иммуноглобулина эти гибридомы (квадромы) продуцируют теоретическую смесь молекул различных антител (см. Международную патентную заявку WO 93/08829 и
Traunecker et al., EMBO J., 10: 3655-3659 (1991)).
Биспецифические антитела также включают сшитые антитела или "гетероконъюгаты" антител ("гетероконъюгатные" антитела). Например, одно из антител в гетероконъюгате может быть связано с авидином, другое с биотином или другой "полезной нагрузкой". "Гетероконъюгатные" антитела можно получать любыми подходящими методами сшивания (перекрёстного связывания). Подходящие сшивающие
агенты общеизвестны в уровне техники и раскрываются в патенте США 4676980, наряду с различными
методами сшивания.
Ещё в одном варианте изобретения антитело может быть слито химическими или генетическими
методами с полезной нагрузкой, такой как реактивная (реакционноспособная), детектируемая или функциональная частица, например, иммунотоксин, для получения полипептида, продукта слияния антитела.
Такие полезные нагрузки включают, например, иммунотоксины, химиотерапевтические агенты и радио- 14 -
021507
изотопы, все они общеизвестны в уровне техники.
Одноцепочечные антитела также пригодны для стабилизации по изобретению. Фрагменты содержат вариабельный домен тяжёлой цепи (VH), связанный с вариабельным доменом лёгкой цепи (VL) линкером, который способствует тому, что каждая вариабельная область связана с другой и воссоздают антиген-связывающий карман исходного (родительского) антитела, из которого получают области VL и
VH (см. Gruber et al., J. Immunol., 152: 5368 (1994)).
Понятно, что любые из вышеприведённых полипептидных молекул индивидуально или в комбинации пригодны для приготовления в виде стабилизированных препаратов по изобретению.
Антитела против Аβ
Как правило, препараты по настоящему изобретению включают ряд антител для лечения амилоидогенных заболеваний, в частности болезни Альцгеймера, с помощью нацеливания на Аβ пептид.
Термины "Аβ антитело", "антитело против Аβ" и "анти Аβ" ("антитело к Аβ") в данном описании
используются взаимозаменяемо в отношении антитела, которое связывается с одним или более эпитопов
или антигенных детерминант человеческого амилоидного белка-предшественника (АРР), Аβ белка или
обоих. Типичные эпитопы или антигенные детерминанты могут находиться внутри АРР, но предпочтительно находятся внутри Aβ пептида АРР. Существует множество изоформ АРР, например, АРР695,
АРР751 и АРР770. Аминокислотам в АРР присвоены номера в соответствии с последовательностью изоформы АРР770 (см., например, инвентарный номер в GenBank Р05067). Примерами известных специфических изотипов АРР, существующих в настоящее время в организме человека, являются полипептид из
695 аминокислот, описанный Kang et. al. (1987) Nature 325: 733-736, который назван "нормальным" АРР;
полипептид из 751 аминокислоты, описанный Ponte et al. (1988) Nature 331: 525-527 (1988) и Tanzi et al.
(1988) Nature 331: 528-530; и полипептид из 770 аминокислот, описанный Kitaguchi et. al. (1988) Nature
331: 530-532. В результате протеолитического процессинга АРР под действием различных секретаз in
vivo или in situ, Аβ обнаруживается как в "короткой форме", длиной 40 аминокислот, так и в "длинной
форме", протяжённостью 42-43 аминокислоты. Короткая форма, Аβ40, состоит из остатков 672-711 АРР.
Длинная форма, например, Аβ42 или Аβ43, состоит из остатков 672-713 или 672-714 соответственно. Участок гидрофобного домена АРР находится на карбокси-конце Аβ и может быть ответственен за способность Аβ к агрегации, в частности, в длинной форме. Аβ пептид может находиться в жидкостях организма или может выделяться из жидкостей организма человека и других млекопитающих, например цереброспинальной жидкости, включая как здоровых индивидуумов, так и индивидуумов, страдающих амилоидогенными нарушениями.
Термины "β-амилоидный белок", "β-амилоидный пептид", "β-амилоид", "Аβ" и "Аβ пептид" употребляются в данном описании взаимозаменяемо. Аβ пептид (например, Аβ39, Аβ40, Аβ41, Аβ42 и Аβ43)
представляет собой внутренний фрагмент ~4-кДа из 39-43 аминокислот АРР. Например, Аβ40, состоит
из остатков 672-711 АРР, а Аβ42 состоит из остатков 672-713 АРР. Аβ пептиды включают пептиды, получающиеся в результате расщепления секретазой АРР и синтетических пептидов, имеющих такую же
или практически такую же последовательность, что и продукты расщепления. Аβ пептиды могут происходить из различных источников, например тканей, клеточных линий или жидкостей организма (например, сыворотки или цереброспинальной жидкости). Например, Аβ может происходить из АРРэкспрессирующих клеток, таких как клетки яичников китайского хомячка (СНО), стабильно трансфецируемых с помощью APP717→F5, как описано, например, в Walsh et al., (2002), Nature, 416, pp. 535-539.
Препарат Аβ можно получать из тканевых источников (см., например, Johnson-Wood et al., (1997), Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 94: 1550). Или же, Аβ пептиды можно синтезировать методами, общеизвестными
специалистам в данной области техники (см., например, Fields et al., Synthetic Peptides: A User's Guide, ed.
Grant, W.H. Freeman & Co., New York, NY, 1992, p. 77). Следовательно, пептиды можно синтезировать,
используя автоматические методы твердофазного синтеза по Меррифильду с α-аминогруппой, защищенной либо t-Boc, либо F-moc группой, используя защищенные аминогруппы в боковых цепях, например, на синтезаторе модели Applied Biosystems Peptide Synthesizer Model 430A или 431. Более протяжённые пептидные антигены можно синтезировать, используя общеизвестные методы рекомбинантной
ДНК. Например, полинуклеотид, кодирующий пептид или слитый пептид, можно синтезировать или молекулярно клонировать и ввести в подходящий вектор экспрессии для трансфекции и гетерологичной
экспрессии подходящей клеткой-хозяином. Аβ Пептид также относится к родственным Аβ последовательностям, которые получаются в результате мутаций в Аβ области нормального гена.
Типичные эпитопы или антигенные детерминанты, с которыми связывается Аβ антитело, могут находиться внутри человеческого амилоидного белка-предшественника (АРР), но предпочтительно находятся в Аβ пептиде АРР. Типичные эпитопы или антигенные детерминанты внутри Аβ локализованы
внутри N-конца, центральной области или С-конца Аβ. "N-концевой эпитоп" представляет собой эпитоп,
или антигенную детерминанту, локализованный (локализованную) внутри N-конца, или включающий
(включающую) N-конец Аβ-пептида. Типичные N-концевые эпитопы включают остатки внутри аминокислот 1-10 или 1-12 Аβ, предпочтительно из остатков 1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7, 2-6, 2-7, 3-6 или 3-7 Аβ42.
- 15 -
021507
Другие примеры N-концевых эпитопов начинаются в остатках 1-3 и заканчиваются в остатках 7-11 Аβ.
Другие примеры N-концевых эпитопов включают остатки 2-4, 5, 6, 7 или 8 Аβ, остатки 3-5, 6, 7, 8 или 9
Аβ или остатки 4-7, 8, 9 или 10 Аβ42. "Центральные эпитопы" представляют собой эпитопы или антигенные детерминанты, содержащие остатки, локализованные внутри центрального или среднего участка
Аβ пептида. Примеры центральных эпитопов включают остатки внутри аминокислот 13-28 Аβ, предпочтительно из остатков 14-27, 15-26, 16-25, 17-24, 18-23 или 19-22 Аβ. Другие примеры центральных эпитопов включают остатки внутри аминокислот 16-24, 16-23, 16-22, 16-21, 18-21, 19-21, 19-22, 19-23 или
19-24 Аβ. "С-концевые" эпитопы или антигенные детерминанты локализованы внутри С-конца или
включают С-конец Аβ пептида и включают остатки внутри аминокислот 33-40, 33-41 или 33-42 Аβ. "СКонцевые эпитопы" представляют собой эпитопы или антигенные детерминанты, содержащие остатки
внутри С-конца Аβ пептида (например, примерно внутри аминокислот 30-40 или 30-42 Аβ. Другие примеры С-концевых эпитопов или антигенных детерминант включают остатки 33-40 или 33-42 Аβ.
Когда говорят, что антитело связывается с эпитопом внутри заданных остатков, таких как Аβ 3-7,
это означает, что антитело специфически связывается с полипептидом, содержащим заданные (определённые) остатки (т.е. Аβ 3-7 в данном примере). Данное антитело необязательно контактирует с каждым
остатком внутри Аβ 3-7. Не каждая единичная аминокислотная замена или делеция внутри Аβ 3-7 необязательно значительно влияет на аффинность связывания. В различных вариантах изобретения Аβ антитело является специфическим в отношении концов. Применяемый в данном описании термин "специфический к концу (в отношении конца, конец-специфический)" относится к антителу, которое специфически
связывается с N-концевыми или с С-концевыми остатками Аβ пептида, но не распознаёт те же остатки,
присутствующие в более протяжённом варианте Аβ, содержащем эти остатки, или в АРР. В различных
вариантах изобретения антитело Аβ является "С-конец-специфическим" ("специфическим к С-концу").
Применяемый в данном описании термин "С-конец-специфический" ("специфический к С-концу") означает, что антитело специфически распознаёт свободный С-конец Аβ пептида. Примеры Аβ антител, специфических к С-концу, включают Аβ антитела, которые распознают Аβ пептид, заканчивающийся остатком 40, но не распознают Аβ пептид, заканчивающийся остатком 41, 42 и/или 43; распознают Аβ пептид, заканчивающийся остатком 42, но не распознают Аβ пептид, заканчивающийся остатком 40, 41
и/или 43; и т.д.
В одном варианте изобретения Аβ антитело может представлять собой 3D6 антитело или его вариант или 10D5 антитело или его вариант, они оба описаны в опубликованной патентной заявке США No.
20030165496A1, в опубликованной патентной заявке США No. 20040087777А1, опубликованной международной патентной заявке No. WO 02/46237A3 и опубликованной международной патентной заявке No.
WO 04/080419A2. Описание антител 3D6 и 10D5 можно также найти в опубликованной международной
патентной заявке No. WO 02/088306A2 и в опубликованной международной патентной заявке No. WO
02/088307A2. Дополнительные антитела 3D6 описаны в патентной заявке США No. 11/303478 и международной патентной заявке No. PCT/US 05/45614. 3D6 представляет собой моноклональное антитело
(mAb), которое специфически связывается с N-концевым эпитопом, локализованным в человеческом βамилоидном пептиде, конкретно, с остатками 1-5. Для сравнения, 10D5 является mAb, которое специфически связывается с N-концевым эпитопом, локализованным в человеческом β-амилоидном пептиде,
конкретно, с остатками 3-6. Клеточная линия, продуцирующая моноклональное антитело 3D6 (RB96
3D6.32.2.4), депонирована в Американской коллекции типовых культур (АТСС), Manassas, VA 20108,
USA, 8 апреля 2003 года согласно Будапештскому договору под номером РТА-5130. Клеточная линия,
продуцирующая моноклональное антитело 10D5 (RB44 10D5.19.21), депонирована в АТСС 8 апреля
2003 года согласно Будапештскому договору под номером РТА-5129.
Примерами вариантных 3D6 антител являются антитела, имеющие, например, гуманизированную
лёгкую цепь, содержащую аминокислотные последовательности вариабельной области, представленные
как SEQ ID NO:3 или SEQ ID NO:5, и гуманизированную тяжёлую цепь, содержащую аминокислотные
последовательности вариабельной области, представленные как SEQ ID NO:4 или SEQ ID NO:6. Другими примерами вариантных 3D6 антител являются антитела, имеющие, например, гуманизированную
аминокислотную последовательность лёгкой цепи, представленную как SEQ ID NO:7 и гуманизированную аминокислотную последовательность тяжёлой цепи, представленную как SEQ ID NO:8.
Примерами вариантных 10D5 антител являются антитела, имеющие, например, гуманизированную
лёгкую цепь, содержащую аминокислотные последовательности вариабельной области, представленные
как SEQ ID NO:9 или SEQ ID NO:11, и гуманизированную тяжёлую цепь, содержащую аминокислотные
последовательности вариабельной области, представленные как SEQ ID NO:10 или SEQ ID NO:12. Другими примерами вариантных 10D5 антител являются антитела, имеющие, например, гуманизированную
аминокислотную последовательность лёгкой цепи, представленную как SEQ ID NO:13, и гуманизированную аминокислотную последовательность тяжёлой цепи, представленную как SEQ ID NO:14. Такие
вариантные антитела подробнее описаны в международной патентной заявке WO 02/088306A2.
В другом варианте изобретения антитело может являться 12В4 антителом или его вариантом, опи- 16 -
021507
санным в опубликованной патентной заявке США No. 20040082762A1 и в опубликованной международной патентной заявке No. WO 03/077858A2. 12В4 представляет собой mAb, которое специфически связывается с N-концевым эпитопом, локализованным в человеческом β-амилоидном пептиде, конкретно, с
остатками 3-7.
Примерами вариантных 12В4 антител являются антитела, имеющие, например, гуманизированную
лёгкую цепь (или лёгкую цепь), содержащую аминокислотные последовательности вариабельной области, представленные как SEQ ID NO:15 или SEQ ID NO:17, и гуманизированную тяжёлую цепь, содержащую аминокислотные последовательности вариабельной области, представленные как SEQ ID NO:16,
SEQ ID NO:18 или SEQ ID NO:19.
Ещё в одном варианте изобретения антитело может представлять собой 12А11 антитело или его вариант, описанные в опубликованной патентной заявке США No. 20050118651А1, в патентной заявке
США No. 11/303478, в опубликованной международной патентной заявке No. WO 04/108895A2 и в международной патентной заявке No. PCT/US 05/45614. 12А11 представляет собой mAb, которое специфически связывается с N-концевым эпитопом, локализованным в человеческом β-амилоидном пептиде, конкретно, с остатками 3-7.
Примерами вариантных 12А11 антител являются антитела, имеющие, например, гуманизированную
лёгкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность вариабельной области, представленную
как SEQ ID NO:20, и гуманизированную тяжёлую цепь, содержащую аминокислотные последовательности вариабельной области, представленные как
Ещё в одном варианте изобретения антитело может представлять собой 6С6 антитело или его вариант, описанные в патентной заявке США No. 11/304986 и в международной патентной заявке No. PCT/US
05/45515, озаглавленной "Гуманизированные антитела, распознающие бета-амилоидный пептид". 6С6
представляет собой mAb, которое специфически связывается с N-концевым эпитопом, локализованным в
человеческом β-амилоидном пептиде, конкретно, с остатками 3-7. Клеточная линия, продуцирующая
антитело 6С6, депонирована 1 ноября 2005 года в АТСС по условиям Будапештского договора под регистрационным номером РТА-7200.
Ещё в одном варианте изобретения антитело может представлять собой 2Н3 антитело, описанное в
патентной заявке США No. 11/304986 и в международной патентной заявке No. PCT/US 05/45515, озаглавленной "Гуманизированные антитела, распознающие бета-амилоидный пептид". 2Н3 представляет
собой mAb, которое специфически связывается с N-концевым эпитопом, локализованным в человеческом β-амилоидном пептиде, конкретно, с остатками 2-7.
Ещё в одном варианте изобретения антитело может представлять собой антитело 15С11 или его вариант, описанные в патентной заявке США No. 11/304986 и в международной патентной заявке No.
PCT/US 05/45515, озаглавленной "Гуманизированные антитела, распознающие бета-амилоидный пептид". 15С11 представляет собой mAb, которое специфически связывается с центральным эпитопом, локализованным в человеческом β-амилоидном пептиде, конкретно, с остатками 19-22.
Ещё в одном варианте изобретения антитело может представлять собой антитело 266, описанное в
опубликованной патентной заявке США No. 20050249725A1 и в опубликованной международной патентной заявке No. WO 01/62801A2. 266 представляет собой mAb, которое специфически связывается с
центральным эпитопом, локализованным в человеческом β-амилоидном пептиде, конкретно, с остатками
16-24. Клеточная линия, продуцирующая моноклональное антитело 266, депонирована в АТСС 20 июля
2004 года по условиям Будапештского договора и имеет регистрационный номер РТА-6123.
Примерами вариантных 266 антител являются антитела, имеющие, например, гуманизированную
лёгкую цепь, содержащую аминокислотные последовательности вариабельной области, представленные
SEQ ID NO:42 или SEQ ID NO:44, и гуманизированную тяжёлую цепь, содержащую аминокислотные
последовательности вариабельной области, представленные как SEQ ID NO:43 или SEQ ID NO:45. Другими примерами вариантных 266 антител являются антитела, имеющие, например, гуманизированную
аминокислотную последовательность лёгкой цепи, представленную как SEQ ID NO:46, и гуманизированную аминокислотную последовательность тяжёлой цепи, представленную как SEQ ID NO:47. Такие
вариантные антитела подробнее описаны в опубликованной патентной заявке США No. 20050249725A1
и в опубликованной международной патентной заявке WO 01/62801А2.
Ещё в одном варианте изобретения антитело может представлять собой 2В1 антитело или его вариант, описанное в патентной заявке США No. 11/304986 и в международной патентной заявке No. PCT/US
05/45515, озаглавленной "Гуманизированные антитела, распознающие бета-амилоидный пептид". 2В1
представляет собой mAb, которое специфически связывается с центральным эпитопом, локализованным
в человеческом β-амилоидном пептиде, конкретно, с остатками 19-23.
- 17 -
021507
Ещё в одном варианте изобретения антитело может представлять собой 1С2 антитело или его вариант, описанное в патентной заявке США No. 11/304986 и в международной патентной заявке No. PCT/US
05/45515, озаглавленной "Гуманизированные антитела, распознающие бета-амилоидный пептид". 1С2
представляет собой mAb, которое специфически связывается с центральным эпитопом, локализованным
в человеческом β-амилоидном пептиде, конкретно, с остатками 16-23.
Ещё в одном варианте изобретения антитело может представлять собой 9G8 антитело или его вариант, описанное в патентной заявке США No. 11/304986 и в международной патентной заявке No. PCT/US
05/45515, озаглавленной "Гуманизированные антитела, распознающие бета-амилоидный пептид". 9G8
представляет собой mAb, которое специфически связывается с центральным эпитопом, локализованным
в человеческом β-амилоидном пептиде, конкретно, с остатками 16-21.
Клеточные линии, продуцирующие антитела 2В1, 1С2 и 9G8, депонированы 1 ноября 2005 года в
АТСС согласно Будапештскому договору под регистрационными номерами РТА-7202, РТА-7199 и РТА7201 соответственно.
Антитела, которые специфически связываются с С-концевыми эпитопами, локализованными в βамилоидном пептиде, для применения по настоящему изобретению включают, но без ограничения,
369.2В, описанное в патенте США No. 5786180, озаглавленном "Моноклональное антитело 369.2В, специфическое к β А4 пептиду". Подробное описание антител для применения в настоящем изобретении
можно найти, например, в Bussiere et al., (Am. J. Pathol. 165(3): 987-95 (2004)); Bard et al. (PNAS 100(4):
2023-8 (2003)); Kajkowski et al. (J. Biol. Chem. 276(22): 18748-56 (2001)); Games et al. (Ann. NY Acad. Sci.
920: 274-84 (2000)); Bard et al. (Nat. Med. 6(8): 916-9 (2000)) и в международной патентной заявке No. WO
03015691A2, озаглавленной "Обеспечение быстрого улучшения познавательной способности у субъекта
с болезнью Альцгеймера, синдромом Дауна, церебральной амилоидной ангиопатией или умеренным когнитивным нарушением заключается во введении антитела против А бета". Более подробное описание
фрагментов антитела для применения в настоящем изобретении можно найти, например, в Bales et al.
(Abstract P4-396, с. S587, представленном на постерной сессии Р4: Therapeutics and Therapeutic StrategiesTherapeutic Strategies, Amyloid-Based) и Zameer et al. (Abstract P4-420, с. S593, представленном на постерной сессии Р4: Therapeutics and Therapeutic Strategies-Therapeutic Strategies, Amyloid-Based).
Антитела для применения в настоящем изобретении, можно получать методами рекомбинантной
ДНК или синтетическими методами. Например, антитело можно получать в культуре рекомбинантных
клеток, используя, например, СНО клетки, NIH 3Т3 клетки, PER.C6 клетки, NS0 клетки, VERO клетки,
фибробласты эмбрионов цыплят или ВНК клетки. Кроме того, в настоящем изобретении рассматриваются антитела с минорными модификациями, которые сохраняют первичное функциональное свойство связывать Аβ пептид. В конкретном варианте изобретения антитело является гуманизированным антителом
3D6 против Аβ-пептида, которое селективно связывает Аβ пептид. Более конкретно, гуманизированное
антитело 3D6 против Аβ-пептида создано для специфического связывания с NH2-концевым эпитопом,
например, аминокислотными остатками 1-5, локализованными в человеческом β-амилоидном 1-40 или 142 пептиде, находящемся в бляшечных отложениях в мозге (например, в мозге пациентов, страдающих
болезнью Альцгеймера).
На фиг. 1 представлено схематическое изображение предсказанной структуры типичного гуманизированного антитела против Аβ пептида. Полные аминокислотные последовательности лёгкой и тяжёлой
цепей h3D6v2, предсказанные исходя из ДНК последовательности соответствующих экспрессирующих
векторов, показаны на фиг. 2 (где остатки нумеруются, начиная с остатка 1, с NH2-конца лёгкой и тяжёлой цепей) и в SEQ ID NO:1 и SEQ ID NO:2 соответственно. Последний аминокислотный остаток, кодированный последовательностью ДНК тяжёлой цепи, Lys449, не наблюдается в зрелой секретированной
форме h3D6v2 и, не ограничиваясь какой-либо единственной теорией, следует отметить, что он, повидимому, удаляется во время внутриклеточного процессирования под действием СНО клеточных протеаз. Следовательно, СООН-конец тяжёлой цепи h3D6v2, необязательно, представляет собой Gly448.
Процессирование СООН-концевого лизина наблюдалось в рекомбинантных антителах и антителах из
плазмы и, очевидно, не влияет на их функцию (Harris (1995) J. Chromatogr. A. 705: 129-134). Очищенное
h3D6v2 после трансляции модифицируют, добавляя N-связанные гликаны к Fc участку тяжёлой цепи,
как известно, содержащему единичный консенсусный сайт N-гликозилирования. Сайт N-гликозилирования визуализирует три основных биантенных нейтральных олигосахаридных структуры, наблюдаемых
обычно в аналогичном сайте N-гликозилирования IgG белков млекопитающих.
Другим примером гуманизированного антитела против Аβ пептида является вариант 1 гуманизированного антитела 3D6 (hu3D6vl), имеющий последовательность, представленную на фиг. 2, за исключением замены D→ Y в положении 1 лёгкой цепи.
В различных вариантах настоящего изобретения антитело против Аβ (например, гуманизированное
антитело 3D6 против Аβ пептида) присутствует в концентрации примерно от 0,1 мг/мл примерно до 100
мг/мл, примерно от 0,1 мг/мл примерно до 75 мг/мл, примерно от 0,1 мг/мл примерно до 50 мг/мл, примерно от 0,1 мг/мл примерно до 40 мг/мл, примерно от 0,1 мг/мл примерно до 30 мг/мл, примерно от 10
мг/мл примерно до 20 мг/мл, примерно от 20 до 30 мг/мл или выше, например, примерно вплоть до 100
- 18 -
021507
мг/мл, примерно до 200 мг/мл, примерно до 500 мг/мл или около 1000 мг/мл или более. Предпочтительно
антитело против Аβ присутствует в концентрации около 17-23 мг/мл. В различных вариантах изобретения антитело против Аβ присутствует в концентрации около 1, 2, 5, 10, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23,
24, 25 или 30 мг/мл. В конкретном варианте изобретения антитело (например, гуманизированное антитело 3D6 против Аβ пептида) присутствует в концентрации около 17 мг/мл. В другом конкретном варианте
изобретения антитело (например, гуманизированное антитело 3D6 против Аβ пептида) присутствует в
концентрации около 20 мг/мл. В другом конкретном варианте изобретения антитело (например, гуманизированное антитело 3D6 против Аβ пептида) присутствует в концентрации около 30 мг/мл. Предполагаются, что интервалы, промежуточные между вышеприведёнными концентрациями, например, около
12-17 мг/мл, также входят в объём настоящего изобретения. Например, предполагается, что включены
интервалы с комбинациями некоторых из вышеприведённых величин в качестве как верхнего, так и/или
нижнего пределов.
Эксципиенты
В различных вариантах настоящее изобретение предусматривает препарат, который включает различные эксципиенты, включая, но без ограничения, буфер, антиоксидант, агент, регулирующий тоничность, и стабилизатор. Кроме того, препараты могут содержать дополнительный агент для корректировки рН (например, HCl) и разбавитель (например, воду). В другом варианте изобретения для корректировки рН можно использовать различные формы гистидина. Частично эксципиенты служат для поддержания стабильности и биологической активности антитела (например, за счёт сохранения подходящей конформации белка) и/или для поддержания рН.
Буферный агент
В различных аспектах настоящего изобретения препараты включают буферный агент (буфер). Буфер служит для поддержания физиологически приемлемого значения рН. Кроме того, буфер может служить для повышения изотоничности и химической устойчивости (стабильности) препарата. Как правило,
препарат должен иметь физиологически приемлемое значение рН. В различных вариантах настоящего
изобретения препарат имеет рН 5,5-6,5, предпочтительно около 6,0-6,5. В конкретном варианте изобретения препарат имеет рН около 6. Предполагается также, что в объём изобретения входят интервалы,
промежуточные между вышеприведёнными уровнями рН, предпочтительно 6,0 или 6,2. Например, предполагается что включены интервалы величин, использующих комбинацию любых из вышеприведённых
значений в качестве верхних и/или нижних пределов. Значение рН можно при необходимости корректировать известными в уровне техники методами. Например, при необходимости для доведения рН до заданных уровней можно добавлять различные формы гистидина.
В предпочтительном варианте изобретения буфер представляет собой гистидин (например, Lгистидин). В другом варианте изобретения препарат включает аминокислоту, такую как гистидин, который присутствует в количестве, достаточном для поддержания физиологически приемлемого рН препарата. Гистидин является примером аминокислоты, обладающей буферной способностью в пределах физиологического значения рН. Буферными свойствами гистидин обязан своей имидазольной группе. В
одном примере варианта изобретения буфером является L-гистидин (основание) (например, C6H9N3O2,
М.в. 155.15).
В другом варианте изобретения буфер представляет собой L-гистидин моногидрохлорид моногидрат (например, C6H9N3O2⋅HCl⋅H2O, М.в. 209.63). В другом примере варианта изобретения буфер представляет собой смесь L-гистидина (основания) и L-гистидина моногидрохлорида моногидрата.
В одном варианте изобретения концентрация буфера (например, L-гистидина) составляет 5-15 мМ,
предпочтительно 5 или 10 мМ. В различных вариантах изобретения буфер может присутствовать в концентрации около 6, 7, 8, 9, 11, 12, 13, 14 или 15 мМ. В конкретном варианте изобретения буфер присутствует в примерной концентрации 10 мМ. Предполагается, что интервалы, промежуточные между вышеуказанными концентрациями, являются частью данного изобретения. Например, предполагается, что
включены интервалы величин, использующих комбинацию любых из вышеприведённых значений в качестве верхних и/или нижних пределов. В некоторых вариантах изобретения буфер присутствует в количестве, достаточном для поддержания физиологически приемлемого значения рН.
Агент, регулирующий тоничностъ
В различных аспектах настоящего изобретения препарат включает агент, регулирующий тоничность. Отчасти агент, регулирующий тоничность, способствует поддержанию изотоничности препарата и
поддержанию уровней белка. Отчасти агент, регулирующий тоничность, способствует сохранению уровня, соотношения или доли терапевтически активного полипептида, присутствующего в препарате. Применяемый в данном описании термин "тоничность" относится к поведению биологических компонентов
в жидкой среде или в растворе. Осмотическое давление изотонических растворов такое же, что и осмотическое давление плазмы крови, и, следовательно, их можно вливать внутривенно субъекту, не изменяя
осмотического давления плазмы крови субъекта. Действительно, в одном варианте изобретения агент,
регулирующий тоничность, присутствует в количестве, достаточном для того, чтобы сделать препарат
пригодным для внутривенного вливания (инфузии). Часто агент, регулирующий тоничность, служит
- 19 -
021507
также в качестве наполнителя. Собственно агент может способствовать тому, что белок преодолевает
различные воздействия, такие как замораживание и сдвиг.
Агент, регулирующий тоничность представляет собой маннит (например, D-маннит, например,
С6Н14О6, М.в. 182.17).
В одном варианте изобретения агент, регулирующий тоничность, присутствует в концентрации
примерно от 2% вес./об. примерно до 6% вес./об. или примерно от 3% вес./об. примерно до 5% вес./об. В
другом варианте изобретения агент, регулирующий тоничность, присутствует в концентрации примерно
от 3,5% вес./об. примерно до 4.5% вес./об. В другом конкретном варианте изобретения агент, регулирующий тоничность, присутствует в примерной концентрации 6% вес./об.
Также предполагается, что интервалы концентраций, промежуточные между вышеприведёнными
значениями, например, около 3,2-4,3% вес./об., являются частью данного изобретению. Например, предполагается, что включены интервалы величин, использующих комбинацию любых из вышеприведённых
значений в качестве верхних и/или нижних пределов. Агент, регулирующий тоничность, должен присутствовать в количестве, достаточном для поддержания тоничности препарата.
Антиоксидант
В различных аспектах настоящего изобретения препарат включает антиоксидант таким образом,
чтобы, частично, сохранить препарат (например, предупреждая окислением).
Антиоксидантом является метионин.
В одном варианте изобретения антиоксидант (метионин, такой как L-метионин, например,
CH3SCH2CH2CHCNH2)CO2H, М.в.=149,21) присутствует в концентрации 5-15 мМ. В различных вариантах изобретения антиоксидант может присутствовать в концентрации 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15
мМ. Предпочтительно концентрация антиоксиданта составляет 10 мМ. В другом предпочтительном варианте изобретения концентрация антиоксиданта составляет 15 мМ. Например, предполагается, что
включены интервалы величин, использующих комбинацию любых из вышеприведённых значений в качестве верхних и/или нижних пределов. В некоторых вариантах изобретения антиоксидант должен присутствовать в количестве, достаточном для сохранения препарата, частично, за счёт предупреждения
окисления.
Стабилизатор
В различных аспектах настоящего изобретения препарат включает стабилизатор, также известный
как поверхностно-активное вещество (сурфактант). Стабилизаторы представляют собой химические соединения, которые взаимодействуют с биологическими молекулами и/или основными фармацевтическими эксципиентами в препарате и стабилизируют их. В некоторых вариантах изобретения стабилизаторы
можно использовать в сочетании с пониженной температурой хранения. Стабилизаторы обычно защищают белок от влияния поверхности раздела воздух/раствор и раствор/поверхность, которое, иначе, могло вызвать агрегацию белка.
В предпочтительном варианте изобретения стабилизатором является полисорбат 80.
В одном варианте изобретения концентрация стабилизатора (например, полисорбата 80) равна примерно 0,001-0,01% вес./об., примерно 0,001-0,009% вес./об. или примерно 0,003-0,007% вес./об. Предпочтительно концентрация стабилизатора равна примерно 0,005% вес./об. В другом конкретном варианте
изобретения стабилизатор присутствует в примерной концентрации около 0,01% вес./об. Предполагается, что интервалы, промежуточные между вышеприведёнными концентрациями, например, около 0,0020,006% вес./об., также являются частью настоящего изобретения. Например, предполагается, что включены интервалы величин, использующих комбинацию любых из вышеприведённых значений в качестве
верхних и/или нижних пределов. Стабилизатор должен присутствовать в количестве, достаточном для
стабилизации Аβ-связывающего полипептида (например, антитела против Аβ).
Другие фармацевтически приемлемые носители, эксципиенты или стабилизаторы, такие как носители, эксципиенты или стабилизаторы (см. описанные в Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition,
Osol, A. Ed. (1980)) могут быть включены в состав препарата при условии, что они не оказывают вредного воздействия на заданные характеристики препарата. В конкретном варианте изобретения препарат
практически не содержит консервантов, в то время как в альтернативных вариантах изобретения консерванты можно добавлять по мере необходимости. Например, криопротектанты или "лиопротектанты"
(вещества, защищающие при лиофилизации) можно включать, например, если препарат будет лиофилизированным.
Ещё в одном аспекте препарат включает Аβ-связывающий полипептид (например, антитело против
Аβ), маннит, гистидин, метионин и полисорбат 80. В другом аспекте изобретения препарат включает 20
мг/мл Аβ-связывающего полипептида (например, антитела против Аβ), 10 мМ гистидина, 10 мМ метионина, 4% вес./об. маннита, 0,005% вес./об. полисорбата 80 и имеет рН около 6. Предпочтительный препарат включает около 17-23 мг/мл гуманизированного 3D6 антитела, около 10 мМ гистидина, около 10
мМ метионина, около 4% вес./об. маннита, около 0,005% полисорбата 80 и имеет рН около 5,5-6,5. Другой предпочтительный препарат включает около 10-30 мг/мл гуманизированного 266 антитела, около 10
мМ гистидина, около 10 мМ метионина, около 4% вес./об. маннита и имеет рН около 5,5-6,5.
- 20 -
021507
Примеры вариантов настоящего изобретения предусматривают концентрированные препараты Аβсвязывающего полипептида (антитела против Аβ), часто пригодного в качестве объёмной лекарственной
формы. Кроме того, примеры вариантов настоящего изобретения устойчивы к замораживанию, лиофилизации и/или реконституции (восстановлению). Кроме того, примеры вариантов настоящего изобретения
стабильны по меньшей мере в течение примерно 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22,
23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 месяцев. В конкретных вариантах препараты по настоящему изобретению
стабильны по меньшей мере в течение примерно 12 месяцев, по меньшей мере около 18 месяцев, по
меньшей мере около 24 месяцев или по меньшей мере около 30 месяцев.
Согласно изобретению препарат может храниться при температурах примерно -80-40°С, примерно
0-25°С, примерно 0-15°С или примерно 0-10°С, предпочтительно примерно при 2-8°С. В различных вариантах изобретения препарат может храниться примерно при 0°С, 1°С, 2°С, 3°С, 4°С, 5°С, 6°С, 7°С,
8°С, 9°С или 10°С. В конкретном варианте изобретения препарат хранится примерно при 5°С. Как правило, препарат устойчив и сохраняет биологическую активность в этих интервалах. Предполагается, что
интервалы, промежуточные между вышеприведёнными температурами, например, около 2-17°С, также
являются частью настоящего изобретения. Например, предполагается, что включены интервалы величин,
использующих комбинацию любых из вышеприведённых значений в качестве верхних и/или нижних
пределов.
Препараты по настоящему изобретению пригодны для доставки различными методами. В некоторых вариантах изобретения препарат вводят парентерально, например, внутривенно или внутримышечно. Кроме того, можно направлять доставку препарата в мозг (например, таким образом, что антитело
может проникать через гематоэнцефалический барьер) или цереброспинальную жидкость. В конкретном
варианте изобретения препарат вводят внутривенно.
Эффективные дозы препаратов по настоящему изобретению варьируются в зависимости от множества различных факторов, включая способы введения, нацеленный сайт, физиологическое состояние пациента, является пациент человеком или животным, другие вводимые лекарства, и является ли лечение
профилактическим или терапевтическим. Обычно пациентом является человек, но можно также лечить
нечеловеческих млекопитающих, включая трансгенных млекопитающих. Для оптимизации безопасности
и эффективности необходимо титровать дозы.
Типичные дозы для пассивной иммунизации с помощью антитела составляют примерно 0,0001-100
мг/кг, примерно 0,01-5 мг/кг, примерно 0,15-3 мг/кг, примерно 0,5-2 мг/кг, предпочтительно примерно 12 мг/кг массы тела хозяина. В некоторых типичных вариантах изобретения дозы могут быть около 0,5,
0,6, 0,7, 0,75, 0,8, 0,9, 1,0, 1,2, 1,25, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,75, 1,8, 1,9 или 2,0 мг/кг. Другие типичные дозы
для пассивной иммунизации равны около 1-20 мг/кг. В некоторых примерах вариантов изобретения дозы
могут быть около 5, 10, 15 или 20 мг/кг. Такие дозы можно вводить субъектам ежедневно, через день,
еженедельно или по любой другой схеме, определённой эмпирическим анализом. Типичное лечение
включает введение многократных доз в течение продолжительного периода, например, по меньшей мере
в течение шести месяцев. Другие типичные схемы лечения включают введение один раз в две недели,
или один раз в месяц, или один раз в 3-6 месяцев. Типичные схемы применения включают 1-10 мг/кг или
15 мг/кг ежедневно, 30 мг/кг через день или 60 мг/кг еженедельно. В некоторых способах два или более
моноклональных антитела с различными специфичностями связывания вводят одновременно, в этом
случае доза каждого вводимого антитела находится в указанных пределах.
Антитело обычно вводят в виде многократных доз. Интервалы между единичными дозами могут
составлять неделю, месяц или год. Интервалы могут также быть нерегулярными по показаниям уровней
антитела к Аβ в крови пациента. В некоторых способах дозу корректируют таким образом, чтобы достичь концентрации антитела в плазме 1-1000 мкг/мл, а в некоторых способах 25-300 мкг/мл. Или же, антитело можно вводить в виде препарата пролонгированного действия, в этом случае требуется реже вводить препарат. Доза и частота меняются в зависимости от периода полужизни антитела в организме пациента. Вообще, у человеческих антител наблюдается наиболее продолжительный период полужизни,
затем идут гуманизированные антитела, химерные антитела и нечеловеческие антитела.
Доза и частота введения может меняться в зависимости от того, является ли лечение профилактическим или терапевтическим. При профилактическом применении препараты, содержащие настоящие антитела или их "коктейль", вводят пациенту ещё не на стадии заболевания с целью повышения сопротивляемости организма пациента. Такое количество определяется как "профилактически эффективная доза".
При таком применении точные количества опять зависят от состояния здоровья пациента и общего иммунитета, но обычно находятся в интервале 0,1-0,25 мг на дозу, в основном 0,5-2,5 мг на дозу. Относительно низкую дозу вводят через относительно нечастые интервалы в течение продолжительного периода времени. Некоторые пациенты продолжают получать лечение всю оставшуюся жизнь.
При некоторых терапевтических применениях требуются относительно высокие дозы (например, от
около 0,5 или 1 до примерно 200 мг/кг антитела на дозу (например, 0,5, 1, 1,5, 2, 5, 10, 20, 25, 50 или 100
мг/кг), при этом чаще всего применяют дозы 5-25 мг/кг) через относительно короткие интервалы до
уменьшения или прекращения прогрессирования заболевания и, предпочтительно до тех пор, пока у па- 21 -
021507
циента не будет наблюдаться частичное или полное уменьшение интенсивности симптомов заболевания.
Затем пациенту можно назначать профилактический режим.
Особенно предпочтительно создавать препараты по изобретению в стандартной лекарственной
форме для простоты введения и однородности дозировки. Препараты по изобретению могут быть в виде
капсул, ампул, в лиофилизированном виде или в упаковке для многократного приёма. Термин "контейнер" относится к чему-либо, например, к держателю, резервуару (ёмкости) или сосуду, в который объект
(изделие) или жидкость могут помещаться или содержаться, например, для хранения. Стандартная лекарственная форма может содержать любой препарат по данному описанию, включая суспензии, растворы и эмульсии активного ингредиента вместе с агентами, составляющими рецептуру, такими как суспендирующие, стабилизирующие и/или диспергирующие агенты. В типичном варианте изобретения фармацевтическую стандартную лекарственную форму можно добавлять в мешок для внутривенного вливания
(например, мешок на 50, 100, или 250, или 500 мл) с походящим разбавителем, например, стерильной
апирогенной водой или физиологическим солевым раствором, перед тем как вводить её пациенту, например, внутривенным вливанием. В случае некоторых фармацевтических стандартных лекарственных
форм перед добавлением в мешок для внутривенной инфузии может потребоваться реконституция подходящим разбавителем, в особенности в случае лиофилизированных форм. В типичных вариантах изобретения фармацевтическая стандартная лекарственная форма представляет собой контейнер, содержащий препарат по данному описанию. Например, контейнер может представлять собой стеклянную, типа
I, ампулу (пробирку) на 10 мл. Обычно контейнер должен сохранять стерильность и стабильность препарата. Например, пробирка может быть закрыта латексной пробкой. Кроме того, в различных вариантах
изобретения контейнер можно сделать таким образом, чтобы легко было извлечь около 100 мг препарата
или активного ингредиента (например, для разового применения). Или же контейнер может применяться
для больших количеств препарата или активного ингредиента, например, около 10-5000 мг, около 1001000 мг и около 100-500 мг, около 40-250 мг, около 60-80 мг, около 80-120 мг, около 120-160 мг или интервалы между ними, например, около 100-200 мг. Предполагается, что интервалы, промежуточные между вышеприведёнными количествами, например, около 25-195 мг, также являются частью настоящего
изобретения. Например, предполагается, что включены интервалы величин, использующих комбинацию
любых из вышеприведённых значений в качестве верхних и/или нижних пределов. В конкретном варианте изобретения препарат часто поступает в виде жидкости в стандартной лекарственной форме.
В другом аспекте настоящее изобретение предусматривает набор, включающий фармацевтическую
стандартную лекарственную форму (например, контейнер с препаратом по данному описанию) и инструкции по применению. Соответственно контейнер и набор можно создать таким образом, чтобы обеспечить достаточное количество препарата для многократного применения. В различных вариантах изобретения набор может дополнительно содержать разбавитель. Разбавитель может включать эксципиенты, по отдельности или вместе. Например, разбавитель может включать модификатор тоничности, такой
как маннит, буферный агент, такой как гистидин, стабилизатор, такой как полисорбат 80, антиоксидант,
такой как метионин, и/или их комбинации. Разбавитель может содержать другие эксципиенты, например,
защитное средство при лиофилизации ("лиопротектант"), если специалист в данной области техники сочтёт это необходимым.
Дополнительные применимые варианты изобретения представлены в разделе данной заявки, озаглавленном "Сущность изобретения".
Данное изобретение далее иллюстрируется с помощью нижеприведённых примеров, которые не
следует рассматривать как ограничивающие. Содержание всех ссылочных материалов, патентов и опубликованных патентных заявок, приводимых на всём протяжении данной заявки, а также в фигурах, вводится в данное описание в качестве ссылки.
Примеры
Как правило, в практике применения настоящего изобретения, если не указано иначе, используют
традиционные методы химии, молекулярной биологии, методы рекомбинантной ДНК, иммунологии (в
частности, например, методы антител) и стандартные методы получения полипептидов (см., например,
Sambrook, Fritsch and Maniatis, Molecular Cloning: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); Antibody
Engineering Protocols (Methods in Molecular Biology), 510, Paul, S., Humana Pr (1996); Antibody
Engineering: A Practical Approach (Practical Approach Series, 169), McCafferty, Ed., Irl Pr (1996); Antibodies:
A Laboratory Manual, Harlow et al., C.S.H.L. Press, Pub. (1999); и Current Protocols in Molecular Biology,
eds. Ausubel et al., John Wiley & Sons (1992)).
Пример I. Клонирование и экспрессия гуманизированного антитела против А бета
Примером антитела для препарата в соответствии со способами настоящего изобретения является
3D6. 3D6 mAb является специфическим к N-концу Aβ пептида, и было показано, что оно опосредует фагоцитоз (например, индуцируют фагоцитоз) амилоидной бляшки. 3D6 не распознаёт секретированный
АРР или полноразмерный АРР, но детектирует только Аβ вид с аминоконцевой аспарагиновой кислотой.
Следовательно, 3D6 является специфическим в отношении конца антителом. Клеточная линия, обозначенная RB96 3D6.32.2.4, продуцирующая антитело 3D6, имеющая в АТСС регистрационный номер РТА- 22 -
021507
5130, депонирована 8 апреля 2003 года. Клонирование, характеристики и гуманизация 3D6 антитела описано в опубликованной патентной заявке США No. 20030165496A1. Коротко говоря, гуманизацию мышиного моноклонального антитела против Аβ пептида (обозначенного как m3D6) проводят, выделяя
последовательности ДНК вариабельных областей лёгкой цепи и тяжёлой цепи m3D6 (VL и VH) обратной
транскрипцией-полимеразной цепной реакцией (ОТ-ПЦР, RT-PCR). На основании последовательностей
ДНК VL и VH m3D6 идентифицируют гомологичные человеческие каркасные области. Чтобы гарантировать, что гуманизированное антитело сохраняет способность взаимодействовать с Аβ-пептидным антигеном, в гуманизированной 3D6 последовательности сохраняют важные остатки мышиной VL и VH каркасной последовательности, чтобы сохранить общую структуру областей константного домена (CDR)
применительно к человеческим последовательностям каппа лёгкой цепи и IgG1 тяжёлой цепи. Последовательности ДНК, кодирующие гуманизированные 3D6 VL и VH последовательности, идентифицированные этим способом (включая 5' последовательность сигнального пептида и 3' интронную последовательность в донорном сайте сплайсинга), получают отжигом синтезированных перекрывающих ДНК олигонуклеотидов с последующими ДНК-полимеразными реакциями достройки. Целостность каждой из гуманизированных последовательностей вариабельной области контролируют секвенированием ДНК. На
фиг. 1 схематически представлена предсказанная структура гуманизированного антитела 3D6 против Аβ
пептида, названного h3D6v2. На фиг. 2 определяются полные аминокислотные последовательности лёгкой и тяжёлой цепей h3D6v2.
Гуманизированное антитело 3D6 экспрессируется трансфекцией линии клеток-хозяев яичников китайского хомячка (СНО) при использовании плазмид экспрессии, кодирующих гены лёгкой цепи и тяжёлой цепи антитела против Аβ. СНО клетки, экспрессирующие антитело, выделяют стандартными методами селекции лекарства с помощью метотрексата/амплификации гена. Отбирают клональную СНО клеточную линию, имеющую фенотипы с заданными продуктивностью и ростом, и применяют для установления экспрессирующей антитело линии клеток, используя химически определённую (с определённым
химическим составом) среду, не содержащую компонентов животного или человеческого происхождения.
Пример II. Получение лекарственного вещества гуманизированного антитела против Аβ
Процесс получения полипептида начинается с оттаивания исходной культуры клональных клеток,
устойчиво экспрессирующих антитело против Аβ пептида. Клетки культивируют в среде с определённым химическим составом, не содержащей животных или человеческих белков. Затем культуры выращивают и используют для инокуляции (внесения посевного материала) биореактора, который, в свою
очередь, используют для инокуляции многократных циклов промышленного биореактора. Промышленный биореактор работает в режиме с периодической подпиткой. В конце производственного цикла "урожай" в кондиционированной среде осветляют микрофильтрацией, получая препарат для последующего
процессинга.
Процессы очистки состоят из стадий стандартной хроматографии с последующей фильтрацией.
Очищенное антитело концентрируют ультрафильтрацией и диафильтрацией переводят в буфер для препарата, не содержащий полисорбат 80. Необязательно, полисорбат 80 (растительного происхождения)
добавляют в пул ретентата после ультрафильтрации/диафильтрации с последующей фильтрацией для
удерживания бактерий. Лекарственное вещество хранят в замороженном состоянии при -80°С и выдерживают для дальнейшей переработки в лекарственный продукт, включая стабилизированные жидкие
препараты по данному описанию.
Пример III. Приготовление препарата антитела и плацебо
Получают две партии лекарственного продукта антитела. Начальную партию получают смешением
(компаундированием) лекарственного вещества с получением не содержащего животных и человеческих
белков препарата, содержащего 20 мг активного вещества антитела против Аβ пептида на мл, 10 мМ гистидина, 10 мМ метионина, 4% маннита, 0,005% полисорбата 80, рН 6,0. В асептических условиях пузырьки (ампулы) заполняют лекарственным продуктом, по 100 мг активного вещества антитела против
Аβ/пузырёк (ампула). Пузырёк (ампула) с конечным лекарственным продуктом не содержит консервантов и предполагается только для одноразового пользования.
Вторую партию лекарственного продукта получают аналогично с применением буфера для препарата без полисорбата 80.
Пример IV. Анализ стабильности препарата, содержащего и не содержащего полисорбат 80
Стабильность и, в особенности, физико-химическая целостность (такая как агрегация, дезамидирование, гидролиз и/или перегруппировка дисульфидной связи) препарата оценивают следующими общеизвестными в уровне техники методами: внешний вид; рН; концентрация белка (А280); ELISA, отчасти,
в качестве теста на биоактивность; электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата (SDS-PAGE), отчасти в качестве теста на агрегацию; эксклюзионная (ситовая)-высокоэффективная
жидкостная хроматография (SEC-ВЭЖХ), отчасти, в качестве теста на агрегацию и стабильность в целом; катионообменная высокоэффективная жидкостная хроматография (СЕХ-ВЭЖХ), отчасти, в качестве теста на дезамидирование и стабильность в целом; и пептидное картирование. Этими методами оце- 23 -
021507
нивают регенерацию и целостность препарата в условиях тестирования при различных температурах.
Анализ внешнего вида препарата проводят для того, чтобы определить качество препарата в различные временные точки. Визуально анализируют прозрачность, цвет и присутствие (макро)частиц. Например, анализируют степень опалесценции в сравнении с эталонной суспензией. Анализ внешнего вида
препаратов, приготовленных в присутствии и в отсутствие полисорбата 80, в соответствии с настоящим
изобретением, показывает, что оба препарата являются годными после хранения при температурах 80°С, 5°С, 25°С и 40°С в каждой из следующих временных точек: начальной, 1 месяц, 2 месяца, 3 месяца,
6 месяцев, 9 месяцев и 12 месяцев.
Проверку величины рН проводят для определения поддержания рН препарата в приемлемом интервале около 5,5-6,5. Анализ рН препаратов, приготовленных в присутствии и в отсутствие полисорбата 80,
в соответствии с настоящим изобретением, показывает, что оба препарата являются годными после хранения при температурах -80, 5, 25 и 40°С в каждой из следующих временных точек: начальной, 1 месяц,
2 месяца, 3 месяца, 6 месяцев, 9 месяцев и 12 месяцев. В целом, рН нигде не опускается ниже 5,8 и не
превышает 6,2.
Анализ концентрации белка с помощью А280 осуществляют для определения поддержания концентрации белка в препарате в приемлемом интервале около 17-23 мг/мл. Анализ концентрации белка в препаратах, приготовленных в присутствии и в отсутствие полисорбата 80, в соответствии с настоящим изобретением, показывает, что оба препарата являются годными после хранения при температурах -80, 5, 25
и 40°С в каждой из следующих временных точек: начальной, 1 месяц, 2 месяца, 3 месяца, 6 месяцев, 9
месяцев и 12 месяцев. За исключением концентраций белка, немного превышающих 23 мг/мл в препарате, не содержащем полисорбата 80, при хранении при 5, 25 и 40°С во временной точке 3 месяца, концентрация белка остаётся в приемлемых пределах. Соответственно анализ концентрации белка не показывает заметной потери белка, даже в условиях форсированного (ускоренного) режима, в особенности для
препаратов с полисорбатом 80. Кроме того, не удаётся продемонстрировать заметное изменение концентрации белка в зависимости от времени или температуры после начальной временной точки.
Сохранение биологической активности проверяют, отчасти, методами ELISA. Биологическую активность анализируют в единицах связывания (BU)/мг, причём приемлемой активностью является ≥ 2500
BU/мг или 50% (т.е. 5000 BU/мг равно 100%). Анализ методом ELISA препаратов, приготовленных в
присутствии и в отсутствие полисорбата 80, в соответствии с настоящим изобретением, показывает, что
оба препарата, в целом, являются годными после хранения при температурах -80, 5, 25 и 40°С в каждой
из следующих временных точек: начальной, 1 месяц, 2 месяца, 3 месяца, 6 месяцев, 9 месяцев и 12 месяцев. За исключением биологической активности немного ниже 50% во временной точке 12 месяцев для
обоих препаратов при хранении при 40°С, биологическая активность в других случая остаётся в приемлемых пределах.
SEC-ВЭЖХ анализ проводят в качестве теста на агрегацию, чистоту и стабильность в целом. Циклы
SEC-ВЭЖХ с применением в качестве подвижной фазы буфера, содержащего двухосновный фосфат натрия, показали, что препарат годен, если SEC-ВЭЖХ анализ определяет содержание IgG мономера ≥
90%, при сравнении с высокомолекулярным продуктом и низкомолекулярным продуктом. SEC-ВЭЖХ
анализ препаратов, приготовленных в присутствии и в отсутствие полисорбата 80, в соответствии с настоящим изобретением, показывает, что оба препарата, в целом, являются годными после хранения при
температурах -80, 5, 25 и 40°С в каждой из следующих временных точек: начальной, 1 месяц, 2 месяца, 3
месяца, 6 месяцев, 9 месяцев и 12 месяцев. За исключением процентного содержания мономера ниже
90% в обоих препаратах, хранившихся при 40°С, в каждой временной точке, начиная с 6 месяцев и позже
(где анализ выявляет по меньшей мере более 10% низкомолекулярного продукта в обоих препаратах в
каждой временной точке), процентное содержание мономера в других случаях находится в приемлемых
пределах. В целом, SEC-ВЭЖХ анализ показывает, что профили высокомолекулярных и низкомолекулярных соединений во времени отличаются в образцах, содержащих и не содержащих полисорбат 80,
мономерная форма антитела, в целом, остаётся постоянной, например, во временной точке 12 месяцев,
когда препарат хранится при 5°С.
Анализ методом СЕХ-ВЭЖХ проводят в качестве теста на аминирование и стабильность в целом.
Циклы СЕХ-ВЭЖХ с применением в качестве подвижной фазы буфера, содержащего NaCl, дают профиль элюции и время удерживания преобладающих пиков, которые анализируют как аналогичные или
не аналогичные стандартным профилям эталонов. Анализ СЕХ-ВЭЖХ препаратов, приготовленных в
присутствии и в отсутствие полисорбата 80, в соответствии с настоящим изобретением, показывает, что
оба препарата, в целом, являются годными после хранения при температурах -80, 5, 25 и 40°С в каждой
из следующих временных точек: начальной, 1 месяц, 2 месяца, 3 месяца, 6 месяцев, 9 месяцев и 12 месяцев. За исключением профиля элюции и времени удерживания преобладающих пиков, не аналогичных
эталонным пикам в обоих препаратах, хранившихся при 40°С, в каждой временной точке, начиная с 3
месяцев и позже, преобладающие пики в других случаях аналогичны эталонным пикам.
В целом, анализ препаратов с полисорбатом 80, хранившихся при 5°С, позволяет сделать следующие особенно важные заключения: 1) опалесценция, рН, ELISA, СЕХ-ВЭЖХ, SEC-ВЭЖХ и SDS-PAGE
- 24 -
021507
анализы, все, показывают минимальные изменения в препарате через 9 месяцев; 2) препараты, хранившиеся при 5°С, выглядят скорее как эталонные образцы через 9 месяцев, нежели как "ускоренные" образцы; 3) пептидное картирование показывает изменения при 5°С; и 4) тенденция, наблюдающаяся в
данных SEC-ВЭЖХ при 5°С, позволяет прогнозировать стабильность в течение по меньшей мере 17,2
месяцев (см. фиг. 6), однако, если исключить изменчивость (вариабельность) колонки, прибора и буфера,
данные позволяют предсказать стабильность более чем в течение 30 месяцев (см. фиг. 7). Кроме того,
"ускоренные" образцы с полисорбатом 80, хранившиеся при 25°С, признаны годными через 9 месяцев
(фиг. 4).
Кроме того, анализ препаратов без полисорбата, хранившихся при 5°С, позволяет сделать следующие особенно важные заключения: 1) опалесценция, рН и ELISA анализы, все, показывают минимальные
изменения в препарате через 9 месяцев; 2) результаты анализов методами СЕХ-ВЭЖХ и SDS-PAGE показывают данные, сравнимые с эталонными образцами или с контролем или с образцом, хранившимся
при -80°С, во временной точке 9 месяцев; 3) анализ SEC-ВЭЖХ показывает минорные изменения через 9
месяцев, хотя более заметные изменения наблюдаются при повышенных ("ускоренных") температурах; и
4) тенденция, наблюдающаяся в данных SEC-ВЭЖХ при 5°С, позволяет прогнозировать стабильность в
течение по меньшей мере 18 месяцев, даже при вариабельности результатов анализа (см. фиг. 8).
На фиг. 3-5 графически показаны прогнозы относительно сроков хранения препаратов (содержащих
и не содержащих PS80), приготовленных по данному изобретению и хранящихся при 5, 25 и 40°С соответственно. В общем, на фиг. 3-5 показано, что хранение препаратов по настоящему изобретению при
повышенных температурах уменьшает предполагаемый срок хранения. На фиг. 3, в частности, показано,
что препарат имеет предполагаемый срок хранения по меньшей мере 18 часов, когда препарат хранится
при 5°С. Фиг. 4 показывает, что хранение препарата при комнатной температуре (25°С) может снижать
срок хранения примерно до 12 месяцев. Далее, фиг. 5 показывает, что хранение препарата при 40°С может снижать срок хранения примерно до 4 месяцев.
Пример V. Исследование стабильности при использовании метионина в качестве антиоксиданта
Проводятся исследования по определению влияния метионина на сохранение стабильности антитела и препаратов антитела. В целом, результаты показывают, что метионин желаемым образом снижает
образование высокомолекулярного продукта (HMW). Кроме того, метионин снижает зависимое от температуры повышение процентного содержания HMW (см. фиг. 10).
Кроме того, исследование стабильности в зависимости от рН (при рН 5,8, 6,0 и 6,2) проводят через
6 хранения при различных температурах (5 и 40°С) на четырёх следующих образцах антитела (IgG2 антитело против В7.2): (1) образец, включающий антитело, 10 мМ гистидина, 150 мМ NaCl; (2) образец,
включающий антитело, 10 мМ гистидина, 150 мМ NaCl и 0,01% PS80; (3) образец, включающий антитело, 10 мМ гистидина, 150 мМ NaCl и 10 мМ метионина; и (4) образец, включающий антитело, 10 мМ
гистидина, 150 мМ NaCl, 10 мМ метионина и 0,01% PS80. Проводят анализ методом SEC-ВЭЖХ. Результаты показывают, что метионин снижает зависящее от температуры увеличение процентного содержания побочного продукта (например, HMW побочных продуктов) в указанном интервале рН, например,
примерно при рН от 5,8 до 6,2 (см. фиг. 10). Как показано на фиг. 10, в образцах, содержащих метионин,
наблюдается низкое количество продуктов агрегации при хранении при 40°С в течение шести недель,
аналогичное количеству продуктов агрегации в образцах, хранящихся при 5°С в течение шести месяцев.
Пример VI. Анализ эксципиентов IsG1 антитела дифференциальной сканирующей калориметрией
Основной целью белкового лекарственного препарата является стабилизация белка в его нативной,
биологически активной форме. Обычно это можно осуществить скринингом различных эксципентов в
основном препарате и мониторингом их влияния на молекулярную массу и активность молекулы. Эти
параметры являются показателями стабильности. Другой мерой стабильности является тепловая (термическая) денатурация, которую можно контролировать различными биофизическими методами. Обычно
повышенную стабильность белка определяют высокие температуры плавления, денатурации или разложения. Соответственно контролируют тепловые (термические) свойства типичного IgG1 моноклонального антитела в присутствии различных эксципиентов с помощью VP-капиллярного дифференциального
сканирующего калориметра (VP-Capillary Differential Scanning Calorimeter). Конкретно, определяют кажущиеся (средние) величины Тпл (Tm) препаратов, содержащих 10 мМ гистидина (рН 6,0) с различными
эксципиентами. Показано, что некоторые эксципиенты обеспечивают повышенную или пониженную
тепловую (термическую) стабильность. Так как повышенную стабильность белка объясняют высокой
температурой плавления, предполагалось, что особенно желательными эксципиентами в образцах будут
эксципиенты, сообщающие повышенную Tm2 (Тпл2) или Tm3 (Тпл3) по сравнению с контрольными значениями Tm2/Tm3 (Тпл2/Тпл3) (соответственно 74,9 и 83,4°С) (таблица, см. ниже).
Исходя из этого сделан вывод, что эксципиенты, такие как глюкоза (с концентрацией в препарате 4
или 10%), сахароза (с концентрацией в препарате 4 или 10%) и маннит (с концентрацией в препарате 4
или 10%), особенно хорошо стабилизируют жидкий полипептидный препарат, в частности препарат антитела IgG.
- 25 -
021507
Результаты анализа эксципиентов
Эквиваленты
Специалисты в данной области техники определят или смогут подтвердить с помощью лишь обычных экспериментов многие эквиваленты конкретных вариантов изобретения по данному описанию.
Предполагается, что такие эквиваленты охватываются нижеприведённой формулой изобретения.
- 26 -
021507
- 27 -
021507
- 28 -
021507
- 29 -
021507
- 30 -
021507
- 31 -
021507
- 32 -
021507
- 33 -
021507
- 34 -
021507
- 35 -
021507
- 36 -
021507
- 37 -
021507
- 38 -
021507
- 39 -
021507
- 40 -
021507
- 41 -
021507
- 42 -
021507
- 43 -
021507
- 44 -
021507
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Стабилизированный препарат, содержащий
(a) гуманизированное анти-Аβ антитело в концентрации от 0,1 до 100 мг/мл, которое содержит легкую цепь, содержащую вариабельную область легкой цепи, имеющую остатки 1-112 SEQ ID NO:1, и
константную область легкой цепи; и тяжелую цепь, содержащую вариабельную область тяжелой цепи,
имеющую остатки 1-119 SEQ ID NO:2, и константные области тяжелой цепи;
(b) гистидин в концентрации от 5 до 15 мМ;
(c) маннит в концентрации 2 до 6% вес./об.;
(d) метионин в концентрации от 5 до 15 мМ и
(e) полисорбат в концентрации от 0,001 до 0,01% вес./об.;
причем рН препарата составляет около 5,5-6,5.
2. Препарат по п.1, содержащий гистидин в концентрации 10 мМ.
3. Препарат по п.1 или 2, содержащий маннит в концентрации 4% вес./об.
4. Препарат по любому из пп.1-3, содержащий полисорбат в концентрации 0,005% вес./об.
5. Препарат по любому из пп.1-4, содержащий метионин в концентрации 10 мМ.
6. Препарат по п.1, в котором гуманизированное антитело содержит легкую цепь, содержащую
аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1, и тяжелую цепь, содержащую аминокислотные остатки 1-448 последовательности SEQ ID NO:2.
7. Препарат по п.6, содержащий гуманизированное антитело в концентрации от 17 до 23 мг/мл.
8. Препарат по п.1, который дополнительно содержит от 2 до 6% вес./об. сахарозы.
9. Дозированная лекарственная форма, содержащая стабилизированный препарат по любому из
пп.1-8, который содержит 10-250 мг гуманизированного антитела.
10. Дозированная лекарственная форма по п.9, в которой количество гуманизированного антитела
составляет 80-120 мг.
11. Фармацевтический набор, содержащий
(a) ампулу, содержащую дозированную лекарственную форму по п.9; и
(b) этикетку с инструкцией по применению надлежащий дозы, необходимой для получения дозы
антитела 0,0001-100 мг/кг веса пациента.
12. Набор по п.11, в котором доза составляет 0,15-5 мг/кг.
- 45 -
021507
13. Набор по п.12, в котором доза составляет 0,5-3 мг/кг.
14. Набор по п.11, в котором доза составляет 1-2 мг/кг.
15. Набор по п.11, в котором доза составляет от 0,1 до 25 мг.
16. Набор по п.11, в котором этикетка дополнительно содержит инструкцию для введения дозы
подкожно.
17. Набор по п.11, в котором этикетка дополнительно содержит инструкцию для введения дозы
внутривенно.
18. Применение стабилизированного препарата по любому из пп.1-8 для получения лекарственного
средства для лечения или профилактики заболевания, характеризующегося отложениями Аβ пептида.
19. Применение по п.18, в котором заболевание представляет собой болезнь Альцгеймера.
Фиг. 1
Фиг. 2
Фиг. 3А
- 46 -
021507
Фиг. 3В
Фиг. 4А
Фиг. 4В
Фиг 5А
- 47 -
021507
Фиг. 5В
Фиг. 6
Фиг. 7А
Фиг. 7В
- 48 -
021507
Фиг. 8
Фиг. 9
Фиг. 10А
Фиг. 10В
Евразийская патентная организация, ЕАПВ
Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
- 49 -