На правах рукописи ГОРБУНОВА Анна Николаевна ГИДРОЛИЗ
реклама
На правах рукописи ГОРБУНОВА Анна Николаевна ГИДРОЛИЗ РАЦЕМИЧЕСКИХ АМИДОВ ФЕРМЕНТАМИ ПОЧВЕННЫХ АКТИНОБАКТЕРИЙ 03.02.03 Микробиология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Пермь – 2014 2 Работа выполнена в лаборатории молекулярной микробиологии и биотехнологии ФГБУН Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь Научный руководитель: кандидат биологических наук, доцент Максимов Александр Юрьевич Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор, заведующая лабораторией водной микробиологии Института клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН Немцева Наталия Вячеславовна кандидат биологических наук, начальник отдела учебно-методического и научного обеспечения ГБОУ ВПО «Пермская государственная медицинская академия имени академика Е.А. Вагнера» Минздрава России Чемурзиева Наталья Вадимовна Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН (410049, г. Саратов, просп. Энтузиастов, 13) Защита состоится «__»___________ 2015 г. в __ часов на заседании Диссертационного совета ДМ 004.019.01 в Институте экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН по адресу: 614081, г. Пермь, ул. Голева, д. 13. Факс: (342) 280 92 11. Автореферат диссертации размещен на официальном сайте Министерства образования и науки РФ (http://vak.ed.gov.ru) и сайте Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН (http://www.iegm.ru). С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИЭГМ УрО РАН и на сайте ИЭГМ УрО РАН (http://www.iegm.ru). Автореферат разослан «__» __________ 2015 г. Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук Максимова Юлия Геннадьевна 3 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. В последние годы ученые всего мира уделяют большое внимание исследованию свойств, путей получения и возможностей применения аминокислот (Leuchtenberger et al., 2005). Являясь не только структурными элементами белков и других эндогенных соединений, аминокислоты имеют большое функциональное значение. Их применяют в пищевой промышленности, в животноводстве и ветеринарии для питания и лечения животных (Сафонова, 1974; Bercovici, Fuller, 1995). Некоторые аминокислоты нашли применение в здравоохранении, в изготовлении косметических средств, в качестве питательных сред для производства вакцин (James, 2003). Намечаются пути использования аминокислот в химической промышленности (Schoemaker et al., 1992). Непротеиногенные аминокислоты выступают в качестве предшественников новых инсектицидов, гербицидов и полусинтетических антибиотиков (Breuer et al., 2004; Kamphius et al., 1990). В настоящее время основой крупнотоннажного производства аминокислот служит микробиологический синтез - около 60% от производимого объема (Leuchtenberger et al., 2005). В меньшей степени распространен химический синтез, а также получение аминокислот путем гидролиза белков. Микробиологический способ получения аминокислот основан на способности микроорганизмов синтезировать все L-аминокислоты, а в определенных условиях, — обеспечивать их «сверхсинтез». Однако, живые организмы, с которыми приходится работать, очень чувствительны к малейшему изменению условий, концентрация целевого продукта получается низкой, что требует увеличения размеров реакторов. При микробиологическом синтезе образуются только L-аминокислоты, метод не позволяет получать непротеиногенные аминокислоты и их производные (Якубке, Ешкайт, 1985). В результате химического синтеза образуется рацемическая смесь аминокислот, требующая разделения, а в большинстве других случаев доля одного из изомеров ненамного превышает содержание второго (Nakamura et al., 1980). Одним из перспективных путей получения оптически чистых аминокислот является использование отдельных ферментов. В настоящее время интенсивно изучаются процессы ферментативного разделения рацемической смеси амидов аминокислот с помощью стереоселективных амидаз. Эти ферменты обладают широкой субстратной специфичностью, катализируют реакции без образования побочных продуктов, а сам процесс трансформации проводится в водных растворах при температуре 25-35°С. Кроме того, наличие амидаз, стереоспецифичных как к L-, так и к D-изомерам, позволяет осуществлять выбор схемы процесса разделения рацематов аминокислот в зависимости от того, какой из двух оптических изомеров необходимо получить. В связи с этим, поиск новых биокатализаторов стереоселективного гидролиза рацемических амидов, а также изучение их каталитических свойств и влияния внешних 4 факторов на стереоизомерию ферментативных реакций является актуальной задачей биотехнологии. Стереоселективность является определяющим свойством в гидролизе рацемических аминокислотных амидов. Известно, что большинство выделенных и охарактеризованных на данный момент амидаз проявляют S-селективность (Sharma et al., 2009). Однако стереоспецифичность ферментов не является строгой и зависит от ряда различных факторов таких, как рН реакционной среды, температура, метод иммобилизации фермента, структура субстрата. Несмотря на то, что амидазы выступают эффективными биокатализаторами стереоселективного гидролиза, в научной литературе практически не встречаются данные, касающиеся влияния различных факторов на их стереоселективные свойства. Цель настоящего исследования – поиск новых штаммов бактерий, способных к стереоселективной биотрансформации амидов и изучение катализируемых ими процессов в гомогенных и гетерогенных системах. Основные задачи исследования: 1. Выделить и селекционировать микроорганизмы, способные к стереоселективному гидролизу рацемических амидов. 2. Исследовать влияние различных факторов среды на рост и амидазную активность штаммов. 3. Изучить влияние ряда факторов реакционной среды (температуры, рН) и различных способов иммобилизации на стереоселективные и каталитические свойства амидаз. 4. Определить способность изолятов к стереоселективному гидролизу D,Lфенилглицинонитрила. 5. Исследовать способность активных изолятов к биотрансформации фенилаланинамида. Научная новизна. Селекционированы культуры бактерий, способные к стереоселективному гидролизу амидов аминокислот. Разработаны и синтезированы праймеры, комплементарные нуклеотидным последовательностям генов, кодирующих известные D-аминокислотные амидазы грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов. Впервые определено влияние различных факторов – состав культуральной среды, температура и рН реакционной среды – на стереоселективные свойства амидаз штаммов Rodococcus rhodochrous 4-1 и Arthrobacter sp. 6-1. Изучено влияние иммобилизации на каталитические и стереоселективные свойства биокатализаторов на основе целых бактериальных клеток и выделенных амидаз. Оптимизированы условия процесса биотрансформации D,L-фенилглицинонитрила и Lфенилаланинамида. Теоретическое и практическое значение работы. Полученные экпериментальные данные расширяют представления о процессах стереоселективной трансформации амидов клетками бактерий. Определено влияние различных факторов внешней среды на стереоселективные свойства амидаз. Установлено, что для 5 проявления стереоселективности амидазы в гетерогенном катализе определяющим фактором является присутствие носителя, который изменяет соотношение образующихся изомеров, что может быть использовано для увеличения энантиомерной чистоты продуктов ферментативной реакции. Показана возможность получения изомеров фенилглицина и фенилаланина при трансформации соответвующих амидов стереоселективными амидазами. Оптимизирована среда культивирования наиболее перспективного изолята Arthrobacter sp., выделенного с целью дальнейшего использования в качестве биокатализатора гидролиза рацемических амидов. Основные положения, выносимые на защиту: 1. Штаммы – продуценты амидаз R. rhodochrous 4-1 и Arthrobacter sp. 6-1 способны к стереоселективной трансформации D,L-лактамида с максимальным энантиомерным избытком 44 и 43% соответственно. Иммобилизация клеток и оптимизация условий роста бактерий не дают увеличения энантиомерной чистоты продукта. 2. Иммобилизация амидазы методом ковалентной сшивки с активированным хитозаном приводила к повышению термо- и операционной стабильности; методом поперечно сшитых ферментных агрегатов - к повышению стереоселективности трансформации амидов. 3. Изученные штаммы трансформировали D,L-фенилглицинонитрил до Lфенилглицина с разной степенью стереоселективности, гидролизовали Lфенилаланинамид до L-фенилаланина. Апробация работы и публикации. Основные результаты диссертационной работы доложены и обсуждены на IV, V, VI, VII Всероссийском с международным участием конгрессе студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз Россия» (Воронеж, 2011; Тверь, 2012; Иркутск, 2013; Екатеринбург, 2014), Международной школеконференции «Биология - наука 21 века» (Пущино, 2014). Результаты проведенных исследований опубликованы в 10 научных работах: 4 статьи в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ, тезисы 6 докладов. Объем и структура диссертации. Работа изложена на 126 страницах машинописного текста, содержит 36 рисунков и 16 таблиц, состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов, трех глав результатов собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы. Список литературы включает 189 наименований работ, в том числе 17 отечественных и 172 зарубежных авторов. Связь работы с научными программами и собственный вклад автора. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом НИР Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН и является частью исследований, проводимых по теме «Биохимические и генетические системы трансформации органических соединений у бактерий, перспективных для биотехнологий» (номер государственной регистрации 0120.0406511). Исследования выполнены при поддержке гранта РФФИ №13-04-96050-р_урал_а «Исследование стереоселективной биотрансформации амидов 6 и сложных эфиров почвенными бактериями с применением энзимологических, метагеномных и геномных методов», 2013-2015 гг. Личный вклад автора состоял в планировании и проведении экспериментов, критическом анализе полученных результатов. Автор участвовал в подготовке результатов работы к публикации и их представлении на научных конференциях. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Объекты и методы исследования Объекты исследования. Объектом исследования явились штаммы, выделенные из образцов антропогенно-загрязненной почвы, а также штаммы лабораторной коллекции, обладающие амидазной активностью. Образцы почвы были отобраны на территории Подольского завода цветных металлов и предоставлены сотрудниками кафедры физиологии растений и микроорганизмов (ПГНИУ, Пермь). Для дальнейших исследований были отобраны два штамма Arthrobacter sp. 6-1 и Rodococcus rhodochrous 4-1, обладающие амидазной активностью и стереоселективностью. Выделение и идентификация амидгидролизующих бактерий. Штаммы выделяли методом прямого высева. Навеску почвы (1,0 г) тщательно суспендировали в 100 мл стерильного фосфатного буфера при постоянном перемешивании в течение 30 мин. Полученный раствор использовали для разведений и последующего параллельного высева на чашки Петри с агаризованной минеральной средой N, содержащей селективный субстрат – лактамид в концентрации 10 мМ. На 3-7 сутки роста отбирали среди образовавшихся колоний наиболее крупные, а также морфологически различающиеся колонии, и переносили на чашки Петри со свежей селективной средой. Чистую культуру пересевали в колбы с жидкой средой аналогичного состава и культивировали в течение 5-7 суток. Селекцию проводили на минеральной среде N с добавлением лактамида до конечной концентрации 50 мМ в качестве единственного источника углерода и азота. Предварительную идентификацию штаммов, проявляющих амидазную активность, проводили путем ПЦР-анализа с праймерами к генам 16S рРНК, сконструированными на основе последовательностей, представленных в базе данных GenBank и синтезированными ООО «Евроген», г. Москва. Идентификацию штамма Arthrobacter sp. 6-1, отобранного для дальнейших исследований, проводили на основании культурально-морфологических и биохимических характеристик согласно определителю бактерий Берджи (Хоулт, 1997). Среды и субстраты для культивирования. Бактериальные штаммы культивировали на синтетической среде N следующего состава (г/л): KH2PO4 - 1.0; K2HPO4×3H2O - 1.6; NaCl - 0.5; MgSO4×7H2O - 0.5; CaCl2 - 0.005; CoCl2×6H2O – 0.01; FeSO4×7H2O - 0.005; рН 7.2 ± 0.2 (Максимов и др., 2003). Агаризованную среду получали добавлением бакто-агара (Sigma) до конечной концентрации 1,5 %. В качестве источника углерода для штамма R. rhodochrous 4-1 использовали глюкозу в конечной концентрации 0,1%. В качестве источника азота – ацетонитрил в 7 концентрации 10 мМ. Источники углерода и азота для штамма Arthrobacter sp. 6-1 варьировали. Бактериальный рост оценивали по изменению оптической плотности суспензии клеток при λ=540 нм с учетом разведения на фотоэлектроколориметре КФК-3, либо на спектрофотометре Ultrospec 3300 pro с использованием кварцевой кюветы (длина пути 1 см). Соответствие единицы ОП весу сухих клеток определяли для каждого штамма взвешиванием на аналитических весах предварительно высушенной биомассы из 1 мл суспензии известной ОП. Определение амидазной активности и стереоселективности штаммов. Удельную активность клеток определяли как количество акриловой кислоты в мкмоль, образуемое за 1 минуту биомассой бактерий, соответствующей 1 мг сухого веса. Удельную активность фермента рассчитывали на 1 мг белка. Единица амидазной активности клеток (1 ЕД) соответствует 1 мкмоль кислоты/мг клеток/мин, в случае амидазной активности ферментного препарата – 1 мкмоль кислоты/мг белка/мин. Амидазную активность бактериальной суспензии и ферментного препарата предварительно оценивали спектрофотометрически (Ultraspec 3000) по возрастанию оптической плотности реакционной среды при проведении минутной реакции с акриламидом в качестве субстрата при λ=230 нм (Кузнецова, 2004). Стереоселективные свойства штаммов определяли путем трансформации D,Lлактамида, D- и L-изомеры молочной кислоты анализировали спектрофотометрически на планшетном ридере Tecan infinite M200 pro (“Tecan”, Швейцария) при использовании набора реактивов для энзиматического определения D- и L-молочной кислоты (“R-Biopharm”, Германия), следуя инструкциям производителя. Энантиомерный избыток (ее) рассчитывали по формуле , где Х и У – доли энантиомеров. При этом суммарную концентрацию энантиомеров молочной кислоты принимали за 100%. Выделение амидазы. Клеточную суспензию центрифугировали 10 мин при 10000 g, клеточный осадок отмывали фосфатным буфером, содержащим 44 мМ бутират натрия. Осадок клеток ресуспендировали в 10 мл фосфатного буфера, содержащего бутират натрия в указанной концентрации. Озвучивание клеток проводили на ультразвуковом дезинтеграторе при 22 кГц 10 раз по 15 секунд с охлаждением на льду. Суспензию, содержащую разрушенные клетки, центрифугировали 20 мин при скорости вращения 10000 g с охлаждением (4°С). Высаливание белка осуществляли следующим образом: к 10 мл надосадочной жидкости добавляли 2,08 г сульфата аммония (концентрация сульфата аммония составляет 35% от насыщения) и центрифугировали 20 мин при 10000 g с охлаждением. В результате чего образовался осадок, который растворили в 10 мл фосфатного буфера, содержащего бутират натрия. К 10 мл надосадочной жидкости добавили 1,63 г сульфата аммония (концентрация сульфата аммония составляет 60% от насыщения) и 8 центрифугировали 20 мин при 10000 g с охлаждением. Образовавшийся осадок растворили в 10 мл фосфатного буфера, содержащего бутират натрия. На каждом этапе после растворения осадка спектрофотометрически измеряли амидазную активность по отношению к акриламиду. По активности определяли, в какой пробе находится амидаза. Высаливание амидазы происходило при добавлении сульфата аммония до 60% от насыщающей концентрации. Ферментный препарат хранили при -18°С. Количество белка в пробе определяли по методу Бредфорд с красителем Кумасси бриллиантовым синим G-250. В качестве стандарта использовали бычий сывороточный альбумин. К 1 мл пробы добавляли 1 мл реагента Кумасси, выдерживали в течение 5 мин для развития окраски, измеряли оптическую плотность при λ=595 нм. По калибровочному графику рассчитывали концентрацию белка в пробе. Иммобилизация. Адсорбцию клеток с амидазной активностью проводили в течение 2 часов при 22ºС из 10 мл бактериальной суспензии на 500 мг активного угля БАУ (ООО “УралХимСорб”, Россия). Массу клеток в мл суспензии определяли взвешиванием на аналитических весах предварительно высушенной до постоянного веса биомассы в известном объеме суспензии. Количество адсорбированных клеток определяли по разности оптической плотности (ОП540) культуральной среды до и после сорбции. Сорбционную емкость выражали в мг сухого веса на г сорбента. Иммобилизацию ферментного препарата осуществляли следующими методами: методом ковалентной сшивки с хитозаном, методом адсорбции и методом поперечносшитых ферментных агрегатов (ПСФА). Для иммобилизации амидазы методом ковалентной сшивки с хитозаном готовили 2%-ный (вес/об.) раствор хитозана в 2%-ной (об./об.) уксусной кислоте. Гранулы готовили следующим образом: 2 мл 2%-ного хитозана накапывали через иглу шприца в 1М раствор KOH объемом 5 мл. В этом растворе гранулы затвердевали в течение 40 мин, далее их промывали фосфатным буфером 3 раза по 10 мл до нейтральной реакции промывных вод. Активацию гранул проводили 0,1%-ным бензохиноном в течение 15 минут. Затем гранулы промывали фосфатным буфером 3 раза по 10 мл. К хитозановым гранулам добавляли 2 мл ферментного препарата, выдерживали 40 мин при температуре 22-24°С, промывали фосфатным буфером до исчезновения белка в промывных водах. Концентрацию связанного белка определяли по разности концентрации белка в растворе до и после контакта с гранулами. Для иммобилизации амидазы методом адсорбции использовали 2 углеродсодержащие носители: мезопористый Сибунит, Sуд = 441 м /г (Институт катализа им. Г.К. Борескова СО РАН, г. Новосибирск, Россия) и Сферический углеродминеральный сорбент (СУМС), Sуд = 220 м2/г (Россия) (Коваленко и др., 2007). Раствор белка (2 мл) инкубировали с 200 мг носителя при 22–25°С в течение 2 часов на шейкере со скоростью вращения 10000 g, носитель отмывали 0,01 М калий-фосфатным буфером, рН 7,2±0,2 до исчезновения белка в промывных водах. Количество адсорбированного белка определяли по разности концентрации белка в растворе до и после контакта с носителем. 9 Поперечно-сшитые ферментные агрегаты получали фракционированием белка сульфатом аммония как описано выше с одновременной обработкой 0,1%-ным раствором глутарового альдегида, либо 0,1%-ным раствором бензохинона. Определение продуктов реакции трансформации нитрилов и амидов. Трансформацию нитрилов и амидов изолированной амидазой проводили в 10 мМ калий-натрий фосфатного буфера, рН 7,2, при начальной концентрации субстрата 10-50 мМ. Реакцию проводили в течение 60 мин и останавливали добавлением концентрированной HCl до конечной концентрации в растворе 5%. Пробы центрифугировали при 10000 g в течение 10 мин. Продукты реакции анализировали методами ТСХ и ВЭЖХ. Восходящую тонкослойную хроматографию продуктов трансформации фенилаланинамида проводили на пластинках Сорбфил (АО «Сорбполимер», г. Краснодар). В качестве подвижной фазы использовали систему вода-пропанол-аммиак в соотношении 1:8:1. Исследуемые вещества на хроматограмме обнаруживали путем опрыскивания пластинок 0,1%-ным раствором нингидрина в этиловом спирте и последующем нагревании при 110°С в течение 10 мин. Количественный анализ субстратов и продуктов реакции трансформации нитрилов и амидов аминокислот проводили методом ВЭЖХ при использовании жидкостного хроматографа “Shimadzu LC-10A” (Япония), оснащенного диодной матрицей. Концентрацию акриламида и акриловой кислоты определяли на колонке Synergi 4u Hydro–RP 80A (250 × 4.6 мм). В качестве подвижной фазы использовали 25 мМ NaH2PO4, скорость потока составляла 0,75 мл/мин при 25°C, детекцию проводили при длине волны 200 нм. Концентрацию фенилглицинонитрила, L-фенилглицина, фенилаланинамида и фенилаланина определяли на колонке CROWNPAK® CR(-). В качестве элюента использовали раствор HClO4 (pH 2,0) и 10%-ного метанола, скорость потока составляла 0,3 мл/мин при 30°C, детекцию проводили при длине волны 210 нм. Количественные данные были получены при сравнении со стандартной кривой известных концентраций исследуемых соединений. Выделение ДНК и полимеразная цепная реакция. Препараты хромосомной ДНК получали фенольным методом, модифицированным для выделения ДНК из актиномицетов. Для этого колонии бактерий переносили в пробирки для микроцентрифугирования типа ″эппендорф″, ресуспендировали в 0,5 мл раствора SSC (NaCl 0,15 М, цитрат натрия 0,015 М, лизоцим 5 мг), выдерживали при 37ºС в течение 30 мин. Добавляли 50 мкл 20%-ного раствора SDS, перемешивали и выдерживали в течение 10 мин при 65ºС в твердотельном термостате ″Термит″ (Россия). Добавляли 0,5 мл фенола и центрифугировали при 10000 g в течение 10 мин. Супернатант (водную фазу) переносили в чистую микропробирку, добавляли равный объем (0,5 мл) хлороформа, перемешивали и центрифугировали при 10000 g 3 мин. Водную фазу переносили в чистую микропробирку и добавляли равный объем изопропанола (0,5 мл), центрифугировали при 10000 g 3 мин. Полученную смесь выдерживали при -18ºС в 10 течение 1 ч и центрифугировали в течение 5 мин при 10000 g. Полученный осадок высушивали и растворяли в 100 мкл ТЕ-буфера (10 мМ трис-HCl, 1 мМ ЭДТА, рН 8,0). Амплификацию ДНК проводили с применением термостабильной Taq-полимеразы производства ООО «СибЭнзим» (Новосибирск) на термоциклере Т3 (Biometra, Германия). Олигонуклеотидные праймеры, специфичные к генам известных Dаминокислотных амидаз, были разработаны с использованием баз данных GenBank по заданным последовательностям и синтезированы в Мировой лаборатории «Микробных и клеточных биотехнологий», Пермь. Режим амплификации для праймеров, специфичных к генам D-аминокислотных амидаз включал: денатурацию – 60 с при 94ºС, отжиг – 60 с при 56ºС для праймеров BrIDAA, при 57ºС – для праймеров BrDAA и при 50ºС для праймеров OchDAA; элонгацию – 80 с при 72ºС (35 циклов); в завершающем цикле – дополнительно 60 с при 72ºС. Электрофоретическое разделение продуктов ПЦР-реакции проводили в 1,2-1,5%ном агарозном геле в трис-боратном буфере при напряженности поля 5 В/см. Для оценки молекулярной массы фрагментов ДНК использовали молекулярные маркеры 1 kb и 100 b (ООО «СибЭнзим» и Axigen®). Визуализацию полос и документирование данных осуществляли после окрашивания геля бромистым этидием с использованием системы гель-документации BioDocAnalyze (Biometra, Германия). Секвенирование ДНК. Очистку ПЦР-продукта перед секвенированием осуществляли двумя способами: 1) с использованием смеси ферментов ExoSAPMix (Fermentas Life Sciences): Exonuclease I(Exo I) - 1мкл, Shrimp Alkaline Phosphatase - 10 мкл, деионизованная вода 89 мкл. Обработка ПЦР-продуктов: 2 мкл ExoSAPMix на 25 мкл ПЦР-продукта. Инкубация при 37°С 40 мин, 85°С - 15 мин; 2) путем гель-электрофореза с помощью аппарата E-Gel (Invitrogen) согласно инструкции фирмы-производителя. Секвенирующую реакцию проводили в следующей реакционной среде: Big Dye Terminator (Applied Biosystems, США) - 8 мкл, очищенный ПЦР продукт - 1мкл, праймер-1мкл, деионизованная вода-10 мкл. Температурный режим секвенирующей ракции: 95°С – 1 мин, 95°С - 10 сек, 50°С - 5 сек, 60°С - 4 мин, 25 циклов. После секвенирующей реакции проводили чистку и переосаждение образцов двумя методами: 1) с использованием Big Dye XTerminator Purification Kit (Applied Biosystems, США): 90 мкл SAM Solution+20 мкл Terminator на 20 мкл продукта. Полученную смесь встряхивали на вортексе 10000 g в течение 30 мин, после чего осаждали центрифугированием; 2) к образцу (20 мкл) добавляли 2 мкл 7,5 М ацетата аммония и 60 мкл 96%-ного этанола. Выдерживали смесь в течение 20 мин при -18°С и центрифугировали 15 мин при 10000 g. Надосадочную жидкость сливали, к осадку добавляли 100 мкл 70%-ного этанола, выдерживали в течение 2 минут при комнатной температуре и 11 центрифугировали 15 мин при 10000 g. После переосаждения сливали надосадочную жидкость, осадок высушивали при 50°С, растворяли в 10 мкл смеси MegaBACE Loading Solution (70% формамид, 1% ЭДТА, 29% H20) и анализировали нуклеотидную последовательность с помощью системы секвенирования ДНК MegaBACE1000 (APBiotech). Полученные нуклеотидные последовательности обрабатывали с помощью пакета программ MegaBACE1000 и программы Chromas lite 2.1. Сравнение нуклеотидных последовательностей проводили с применением программ ClustalW 2.0.9 и YACWGUI 1.2. Для построения графического изображения филогенетического древа использовали программу YACWGUI 1.2. Статистическая обработка. Все эксперименты проводились не менее чем в трехкратной повторности. При статистической обработке определяли среднее арифметическое, стандартное отклонение и доверительные интервалы. Достоверность различий определяли с использованием t-критерия Стьюдента (Лакин, 1990). Различия считались значимыми при р<0,05. Анализ результатов проводили с помощью прикладных программ MS Office XP Excel и Statistica 5.0. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Выделение и селекция штаммов, способных к стереоселективной трансформации D,L-лактамида. С целью выделения амидгидролизующих бактерий были взяты почвенные образцы, отобранные на территории Подольского завода цветных металлов. Для первичного отбора микроорганизмов использовали минеральную среду N, содержащую в качестве селективного субстрата 50 мМ лактамид. Клоны микроорганизмов, способных к утилизации лактамида, выделяли методами накопительной культуры и прямого высева. Все культуры были протестированы на наличие амидазной активности. В результате предварительного отбора получено 45 клонов, имеющих амидазную активность выше 1,5 ЕД. Культуры, выделенные из образцов почв, а также штаммы лабораторной коллекции были исследованы на способность к стереоселективному гидролизу D,L-лактамида. В ходе работы было показано, что 45 штаммов гидролизовали лактамид без стереоселективности, 18 гидролизовали D-изомер лактамида и 10 - L-изомер. В результате селекции были отобраны две культуры 4-1 и 6-1, гидролизующие D,L-лактамид с образованием D-молочной кислоты с максимальным энантиомерным избытком 44 и 43% соответственно (таблица 1). 12 Таблица 1 – Штаммы бактерий, проявляющие активность и стереоселективность по отношению к D,L-лактамиду Штамм R. rhodochrous 11-8 R. erythropolis 6-2 1 R. erythropolis 11-2 R. rhodochrous 4-1 R. erythropolis 11-1-3 R. rhodochrous 38 R. erythropolis 7-1 R. rhodochrous 43 R. erythropolis 13 M. murale Ac 3 M. invictum Ac 2 Dietzia maris Ac 6 Dietzia timorensis lc 5 Micrococcus flavus lc 6 R. cerastii lc 9 R. erythropolis 5-1 Arthrobacter sp. 6-1 Активность амидазы, Стереоселективность ее, % мкмоль/мг/мин L-изомер 29±1,7 5,9±0,47 D-изомер 30±1,4 2,6±0,18 D-изомер 27±1,8 4,2±0,29 D-изомер 44±3,5 5,8±0,43 L-изомер 28±1,6 1,8±0,10 D-изомер 24±1,1 1,6±0,12 L-изомер 38±1,9 1,9±0,16 D-изомер 18±0,9 1,8±0,13 D-изомер 20±1,2 2,3±0,19 D-изомер 12±0,7 4,1±0,35 L-изомер 17±0,8 2,6±0,19 L-изомер 34±1,5 3,9±0,26 D-изомер 21±1,3 1,4±0,08 D-изомер 42±2,5 3,6±0,27 D-изомер 17±0,89 2,5±0,17 D-изомер 23±1,7 1,7±0,11 1,6±0,12 D-изомер 43±2,8 Наличие D-амидазы + + + + + + + Для идентификации генов, кодирующих D-стереоспецифические ферменты, проведен ПЦР анализ 20 наиболее активно растущих изолятов с применением набора праймеров, специфичных к генам известных D-аминокислотных амидаз грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов. Установлено, что у 13 штаммов грамположительных бактерий присутствовали фрагменты ДНК размером около 750 п.н., гомологичные генам D-амидаз, ранее обнаруженных у Brevibacterium iodinum TPU 5850 GenBank, AB233405.1 (рисунок 1 и 2). 1 kb Ac 8 Ac 3 Ac 4 Ac 2 lc 2 lc 14 lc 21 lc 26 lc 25 6-2 1 lc 5 4-1 5-1 6-1 7-12 7-1 13 750 п.н. – lc 4 lc 26 38 lc 21 43 3-12 13 1 kb Рисунок 1 – ПЦР-продукты, соответствующие гену D-аминокислотной амидазы Brevibacterium iodinum TPU 5850. 750 п.н. – Рисунок 2 – ПЦР-продукты, соответствующие гену D-аминокислотной амидазы Brevibacterium iodinum TPU 5850. У одного штамма из группы грамположительных микроорганизмов амплифицирована последовательность, соответствующая гену D-амидазы аминокислот Brevibacillus borstelensis BCS-1, GenBank AF441121.1. Ни в одном из образцов геномной ДНК выделенных почвенных изолятов не удалось обнаружить нуклеотидных последовательностей гомологичных гену Dаминокислотной амидазы Ochrobactrum anthropi SV3, GenBank AB026907.1. Проведена идентификация бактерий, способных к стереоселективному гидролизу D,L-лактамида. Видовая принадлежность изолятов была определена путем анализа секвенированных фрагментов гена 16S рРНК, полученных при амплификации с праймерами к генам 16S рРНК, сконструированными и синтезированными на основе последовательностей, представленных в базе данных GenBank. Показано, что большую часть бактерий, способных к биотрансформации рацемического субстрата, составляют грамположительные аэробные бактерии родов Microbacterium, Dietzia, Rhodococcus, Arthrobacter, Micrococcus (таблица 2). 14 Таблица 2 – Идентификация почвенных изолятов, проявляющих амидазную активность по отношению к D,L-лактамиду Изолят Типовой вид % сходства lc 17 lc 24 Ac 2 Ac 7 lc 15 lc 20 lc 28 Ac 3 lc 11 lc 23 Ac 5 Ac 6 lc 5 lc 6 lc 9 5-1 7-1 6-1 Microbacterium invictum DC-200T (AM949677) Microbacterium invictum DC-200T (AM949677) Microbacterium invictum DC-200T (AM949677) Microbacterium invictum DC-200T (AM949677) Microbacterium murale 1-Gi-001T (HE585693) Microbacterium murale 1-Gi-001T (HE585693) Microbacterium murale 1-Gi-001T (HE585693) Microbacterium murale 1-Gi-001T (HE585693) Microbacterium oxydans DSM 20578T (Y17227) Dietzia maris DSM 43672T (X79290) Dietzia maris DSM 43672T (X79290) Dietzia maris DSM 43672T (X79290) Dietzia timorensis ID05-A0528T (AB377289) Micrococcus flavus LW4T (DQ491453) Rhodococcus cerastii C5T (FR714842) Rhodococcus erythropolis DSM 43066Т (M85131) Rhodococcus erythropolis DSM 43066Т (M85131) Arthrobacter sp. Мl4T (AB272798) 100 100 100 100 99 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100 98 Количество проверенных нуклеотидов 676 667 664 641 644 713 665 745 434 674 659 714 641 718 613 705 672 753 Для дальнейшего изучения был выбран изолят 6-1, идентифицированный методом секвенирования последовательности 16S рРНК и физиолого-биохимическим тестам как Arthrobacter sp. Штамм 4-1 был взят из лабораторной коллекции нитрилгидролизующих культур и идентифицирован ранее как R. rhodochrous. Влияние среды культивирования на стереоселективные свойства внутриклеточных амидаз штаммов R. rhodochrous 4-1 и Arthrobacter sp. 6-1. Оптимизация условий культивирования позволяет не только увеличить скорость роста и выход биомассы биотехнологически значимого штамма, но и повысить его продуктивность в отношении желаемых субстратов. При подборе оптимального состава среды для данного штаммов были исследованы различные вещества в качестве источников углерода и азота. Установлено, что штамм R. rhodochrous 4-1 проявляет максимальную амидазную активность при использовании сорбита в качестве источника углерода. Максимальная активность амидазы Arthrobacter sp. 6-1 была зарегистрирована при росте клеток на муравьиной кислоте. Среди использованных источников азота максимальный рост клеток R. rhodochrous 4-1 и Arthrobacter sp. 6-1 наблюдался в присутствии ацетонитрила, который обеспечивал достаточно высокий уровень ферментативной активности. Повышение амидазной активности культуры 4-1 наблюдалось также в присутствии мочевины. По данным литературы известно, что оптимизация условий культивирования позволяет повысить не только активность, но и энантиоселективность фермента (Wu, 15 2002). В результате проведенных экспериментов было установлено, что при выращивании штаммов 4-1 и 6-1 с использованием оптимальных источников углерода и азота наблюдалось незначительное повышение (2-15%) стереоселективных свойств по отношению к D,L-лактамиду (таблица 3). Таблица 3 – Влияние среды культивирования на D-стереоселективные свойства внутриклеточных амидаз Среда культивирования штамма ОП540 Активность амидазы, мкмоль/мг/мин Оптическая чистота D-молочной кислоты (ее, %) Arthrobacter sp. 6-1 Контроль: среда N-, глюкоза, хлорид аммония Среда N-, муравьиная кислота, ацетонитрил Среда N-, муравьиная кислота, нитрат аммония Среда N-, лимонная кислота, ацетонитрил Среда N-, лимонная кислота, нитрат аммония 0,38±0,017 2,03±0,18 43 ±2,8 0,53±0,021 6,27±0,45 51 ±1,7 0,37±0,015 5,91±0,37 58 ±2,3 0,58±0,034 5,62±0,48 45 ±3,6 0,41±0,028 5,31±0,42 47 ±2,8 R. rhodochrous 4-1 Контроль: среда N-, глюкоза, хлорид аммония Среда N-, инозит, мочевина Среда N-, инозит, ацетонитрил Среда N-, сорбит, мочевина Среда N-, сорбит, ацетонитрил 0,38±0,025 3,17±0,29 44 ±3,5 0,58±0,047 0,73±0,053 0,61±0,042 0,76±0,058 4,58±0,36 5,16±0,43 5,98±0,38 6,56±0,47 40 ±3,1 38 ±4,7 46 ±2,9 53 ±2,6 Влияние иммобилизации на стереоселективные свойства внутриклеточных амидаз. Изучение влияния иммобилизации штаммов 4-1 и 6-1 на стереоселективность внутриклеточных амидаз также проводили путем трансформации рацемического лактамида до D- или L-изомера молочной кислоты. Клетки штаммов иммобилизовали методом адсорбции на активном березовом угле (БАУ). Суспендированные клетки R. rhodochrous 4–1 и Arthrobacter sp. 6-1 гидролизовали лактамид до D- и L-молочной кислоты с соотношением энантиомеров 76 к 24% и 72 к 28% соответственно, тогда как адгезированные не проявляли стереоселективных свойств (таблица 4). 16 Таблица 4 – Стереоселективный гидролиз рацемического лактамида свободными и иммобилизованными клетками Клетки Свободные R. rhodochrous 4-1 Иммобилизованные R. rhodochrous 4-1 Свободные Arthrobacter sp. 6-1 Иммобилизованные Arthrobacter sp. 6-1 Активность амидазы, мкмоль/мг/мин Количество адсорбированных клеток, % Селективность ее, % 5,8±0,43 100 D-изомер 34±2,6 1,05±0,076 43±2,8 рацемат - 1,6±0,12 100 D-изомер 23±1,7 0,35±0,017 37±4,7 рацемат - Известно, что многие оптически активные вещества обладают лишь ограниченной устойчивостью. В случае снижения доли одного из оптических изомеров при трансформации иммобилизованными на углеродном носителе клетками, возможно, происходит рацемизация молочной кислоты. Известно, что рацемизация чаще может происходить не самопроизвольно, а вызываться различными физико-химическими воздействиями, причем катализаторами рацемизации могут выступать щелочные агенты (Потапов, 1988). В данном случае, скорее всего, причиной снижения оптической чистоты образующегося раствора молочной кислоты при гидролизе адгезированными клетками является не изменение скорости образования изомеров, а присутствие носителя в образце, приводящее к рацемизации. Таким образом, установлено, что оптимальными источниками углерода и азота для роста и проявления амидазной активности штамма R. rhodochrous 4-1 являлись дульцит и ацетонитрил, для штамма Arthrobacter sp. 6-1 - муравьиная кислота и ацетонитрил. Стереоселективность, проявленная штаммами на этих питательных средах, незначительно отличалась от стереоселективности культур при росте на контрольной среде, а иммобилизация клеток на углеродном адсорбенте БАУ приводила к снижению оптической чистоты образующегося продукта. Иммобилизация ферментных препаратов амидаз R. rhodochrous 4-1 и Arthrobacter sp. 6-1. Амидазы штаммов R. rhodochrous 4-1 и Arthrobacter sp. 6-1 были иммобилизованы различными методами – методом ковалентной сшивки с хитозаном, методом адсорбции и методом поперечно сшитых агрегатов. Установлено, что фермент R. rhodochrous, ковалентно иммобилизованный на хитозане, сохраняет 50-60% исходной активности при гидролизе акриламида и проявляет большую термостабильность по сравнению со свободным. Иммобилизованный фермент Arthrobacter sp. 6-1 не проявлял высокой активности по отношению к акриламиду. Изучена операционная стабильность амидазы, ковалентно присоединенной к активированному хитозану. При проведении последовательных циклов конверсии акриламида установлено, что иммобилизованный ферментный препарат сохраняет 17 около 20% активности, измеренной в первом цикле, после 5-кратной трансформации (рисунок 3). Активность, ЕД 3 2 1 0 24 48 72 96 Время, ч 120 144 Рисунок 3 – Операционная стабильность иммобилизованной амидазы R. rhodochrous 4-1. За 144 ч при последовательной конверсии 0,05 М раствора акриламида 0,84 мг фермента катализировали образование 32 мг акриловой кислоты. Для исследования термической инактивации свободной и иммобилизованной амидазы проводили определение остаточной активности фермента при температурах 50–70°С (рисунок 4). А Б Активность,% Активность,% 160 2 120 1 80 40 0 100 2 80 60 1 40 20 0 0 10 20 30 40 50 60 Время, мин 0 10 20 30 40 50 60 Время, мин Активность,% В 100 80 60 2 40 20 0 1 0 10 20 30 40 50 60 Рисунок 4 - Термостабильность свободной (1) и иммобилизованной (2) амидазы R. rhodochrous 4-1: А - воздействие температуры 50°С, Б - воздействие температуры 60°С, В - воздействие температуры 70°С. Время, мин Обнаружено, что остаточная активность иммобилизованного фермента при 60°С после 60 минут инкубации составила 87% от начальной (рисунок 4, Б). Нагревание фермента при 70°С в течение 30 минут приводило к неполной инактивации 18 иммобилизованного фермента: он сохранял 14% каталитической активности (рисунок 4, В). Было показано, что при воздействии повышенной температуры иммобилизованный фермент более стабилен, чем находящийся в растворе: константы скорости инактивации для иммобилизованного препарата амидазы при любой температуре будут ниже, чем для свободного фермента. Значения констант скорости термической инактивации свободной и ковалентно иммобилизованной амидазы представлены в таблице 5. Таблица 5 - Термоинактивация свободной и иммобилизованной амидазы R. rhodochrous 4-1 Кин, мин-1 Амидаза 50°С 60°С 70°С В растворе 6.1 × 10-3 2.9 × 10-2 1.2 × 10-1 Иммобилизованная 2.3 × 10-3 2.3 × 10-2 1.0 × 10-1 Таким образом, ковалентная сшивка амидазы с носителем приводит к стабилизации ее структуры, предотвращая диссоциацию на субъединицы при повышении температуры, что приводит к повышению термостабильности иммобилизованного фермента. Изучено сохранение активности иммобилизованного биокатализатора на основе амидазы, ковалентно присоединенной к активированному хитозану, в полностью дегидратированном состоянии. Так, при высушивании гранул хитозана иммобилизованный фермент сохранял 60% исходной активности, что подтверждает возможность длительного хранения высушенного иммобилизованного ферментного препарата. Изучали влияние различных методов иммобилизации на стереоселективные свойства амидаз R. rhodochrous 4–1 и Arthrobacter sp. 6-1. Отмечено, что при ковалентной сшивке ферментов обоих штаммов с активированным хитозаном стереоселективность реакции снижается (рисунок 5, Г). Так, энантиомерный избыток Dмолочной кислоты в реакции, катализируемой ферментом 4-1 в растворе, составил 78%, тогда как в реакции, катализируемой ковалентно присоединенной к хитозану амидазой – всего 18%. Самую низкую стереоселективность наблюдали у препаратов амидаз, полученных методом адсорбционной иммобилизации (рисунок 5, Б, В). Так, фермент штамма 4-1, иммобилизованный на СУМС, гидролизовал D,L-лактамид с энантиомерным избытком 20%, тогда как фермент, адсорбированный на Сибуните, гидролизовал субстрат без стереоселективности. Были получены поперечно-сшитые ферментные агрегаты при высаливании сульфатом аммония с одновременной сшивкой бифункциональными реагентами – глутаровым альдегидом и бензохиноном. Было показано, что иммобилизованные амидазы штаммов, полученные данным методом, проявляют более высокую D-стереоселективность, чем ферментные препараты в 19 растворе (рисунок 5, Д, Е). Так, биокатализатор 4-1, полученный сшивкой глутаровым альдегидом, катализировал гидролиз D,L-лактамида с энантиомерным избытком Dизомера до 92%, а поперечно сшитые агрегаты амидазы Arthrobacter sp. 6-1 при использовании глутаральдегида и бензохинона – 84 и 95% соответственно. R. rhodochrous 4-1 Arthrobacter sp. 6-1 ее,% 120 100 80 60 40 20 0 А Б В Г Д Е Рисунок 5 – Влияние иммобилизации на стереоселективные свойства штаммов R. rhodochrous 4-1 и Arthrobacter sp. 6-1: А – амидаза в растворе, Б – адсорбция на сибуните, В – адсорбция на СУМСе, Г – ковалентная сшивка с хитозаном, Д – поперечная сшивка 0,1% глутаровым альдегидом, Е – поперечная сшивка 0,1% бензохиноном. Влияние температуры и рН на стереоселективные свойства ферментных препаратов амидаз. В процессе изучения температурной зависимости стереоселективности поперечно сшитых ферментных препаратов амидаз (ПСФА) было показано, что образование изомеров молочной кислоты происходит в диапазоне температур от 30 до 60°С, проявление максимальной активности ферментов - при 60°С (рисунок 6). А 1,6 1,2 0,8 2 0,4 1 0 30 50 Температура, о С 70 120 100 80 60 40 20 0 ее,% 100 2,5 Активность, ЕД Активность, ЕД 2 10 Б ее,% 2 80 1,5 1 1 2 0,5 0 60 40 20 0 10 30 50 70 о Температура, С Рисунок 6 - Зависимость энантиомерного избытка (1) и активности (2) поперечно сшитых препаратов амидаз от температуры: А - R. rhodochrous 4-1, Б Arthrobacter sp. 6-1. Исследование влияния рН среды на активность и стереоселективность препаратов амидаз показало, что стереоселективность обоих ферментов достигает максимума при рН 6.0 (рисунок 7). Тогда как максимум активности (1,51 ЕД) наблюдается при рН 7.0 Arthrobacter sp. 6-1 и рН 7.0-8.0 - R. rhodochrous 4-1 (2,01 и 2,32 ЕД соответственно). 20 Б 3 ее,% 80 2 1 2 Активность, ЕД Активность, ЕД А 60 40 1 20 0 0 5 6 7 8 9 ее,% 100 2 1,6 1,2 80 60 2 1 0,8 0,4 40 20 0 10 0 5 рН 6 7 8 9 10 рН А мг/л L-фенилглицина Рисунок 7 – Влияние рН среды на энантиомерный избыток (1) и активность (2) амидаз: А - R. rhodochrous 4-1, Б - Arthrobacter sp. 6-1. Биотрансформация D,L-фенилглицинонитрила. Скрининг микроорганизмов, способных к гидролизу D,L-фенилглицинонитрила (D,L-ФГН) проводили среди почвенных изолятов, а также среди нитрилутилизирующих штаммов лабораторной коллекции. Наибольшей удельной активностью по отношению к субстрату обладали клетки штаммов 10и, 25, М1, 4-1, Ас 6 и 6-1. Исследование динамики гидролиза D,LФГН показало, что штамм Rhodococcus rhodochrous 4-1 обладает максимальной активностью гидролиза субстрата (рисунок 8). На основании полученных результатов он был выбран для дальнейшего исследования. 10и Ас6 10 8 6 4 2 0 0 25 6-1 1 М1 4-1 2 Рисунок 8 - Динамика гидролиза D,L-ФГН с образованием Lфенилглицина клетками штаммов с наибольшей нитрилгидролизующей активностью. Условия процесса: фосфатный буфер (рН 7,2), продолжительность 2 часа. Время гидролиза, ч Дальнейшие исследования по трансформации рацемического фенилглицинонитрила проводили с использованием изолированных нитрилгидролизующих ферментов – нитрилгидратазы и амидазы. Изучали влияние концентрации субстрата и температуры реакции на активность и стереоселективность L-специфичной амидазы. Было показано, что высокие концентрации субстрата значительно снижали энантиомерный избыток реакции и увеличивали активность амидазы. Максимальный энантиомерный избыток (93,6%) наблюдали при концентрации фенилглицинонитрила 10 мМ (рисунок 9, А). Максимальный энантиомерный избыток (87%) наблюдали при температуре 10°С, максимальную активность фермента (1,1 мкмоль/мг/мин) при 40°С (рисунок 9, Б). 21 Б ее,% 120 100 80 60 40 20 0 1,6 1,2 1 0,8 2 0,4 0 0 200 400 600 ее,% Активность, ЕД Активность, ЕД А 1,6 1,2 0,8 2 0,4 0 10 800 100 80 60 40 20 0 1 30 50 70 90 о Температура, С Концентрация, мМ Рисунок 9 - Влияние условий реакции на энантиомерный избыток (1) и активность (2) амидазы R. rhodochrous 4-1: А - концентрация D,L фенилглицинонитрила, Б - температуры реакции. Для повышения биокаталитической эффективности процесса трансформации D,LФГН неселективная нитрилгидратаза и L-специфическая амидаза были совместно иммобилизованы методом поперечно-сшитых агрегатов. В результате экспериментов было показано, что биоконверсия 10 мМ D,L-фенилглицинонитрила при температуре 10°С поперечно сшитыми агрегатами амидазы ведет к получению L-фенилглицина с выходом 48% и энантиомерным избытком 98%. Биотрансформация L-фенилаланинамида. Методом тонкослойной хроматографии был проведен качественный анализ продуктов трансформации Lфенилаланинамида. Установлено, что гидролиз фенилаланинамида до аминокислоты фенилаланина осуществляют 16 штаммов (рисунок 10). Амид Кислота К А 11-1-3 11-2 4-1 6-2 1 А К 121 7-1 10 122 7ри 9их Рисунок 10 – Разделение продуктов биотрансформации L-фенилаланинамида методом ТСХ: К-фенилаланин, А-фенилаланинамид. Методом ВЭЖХ была проведена количественная оценка гидролазной активности микроорганизмов. Выявлено, что изученные штаммы 4-1 и 6-1 трансформировали Lфенилаланинамид с образованием L-фенилаланина, однако максимальную активность по отношению к субстрату проявил штамм R. erythropolis 6-2 1. 22 Заключение. В результате проведенных исследований изучены основные факторы, влияющие на стереоселективные свойства амидаз, как изолированных, так и функционирующих в клетке. При сравнении амидгидролизующей активности 45 почвенных изолятов и 30 лабораторных культур разных видов отобраны штаммы R. rhodochrous 4-1 и Arthrobacter sp. 6-1, клетки которых обладали наибольшей Dстереоселективностью по отношению к D,L-лактамиду – модельному рацемическому субстрату. Максимальный энантиомерный избыток D-изомера (44 и 43% соответственно) наблюдали при биотрансформации D,L-лактамида (50 мМ) в течение 1 часа. Оптимизация состава культуральной среды позволила увеличить амидазную активность с 2,0 до 6,2 ЕД для штамма Arthrobacter sp. 6-1 и с 3,1 до 6,5 ЕД для R. rhodochrous 4-1, однако значительного повышения оптической чистоты продукта не произошло. Иммобилизация клеток методом адсорбции привела не только к снижению амидазной активности, но и к полной потере стереоселективности ферментов. В ходе дальнейшей работы было установлено, что изолированные ферменты проявляют более высокую стереоселективность, чем амидазы, имеющие внутриклеточную локализацию. Так, полученные ферментные препараты амидаз штаммов R. rhodochrous 4-1 и Arthrobacter sp. 6-1 катализировали гидролиз D,Lлактамида с энантиомерным избытком 78 и 64% соответственно. В экспериментах по иммобилизации было установлено, что метод ковалентной сшивки амидазы с активированным хитозаном приводит к повышению термо- и операционной стабильности фермента, тогда как метод поперечно сшитых ферментных агрегатов (ПСФА) позволяет увеличить стереоселективность трансформации D,L-лактамида. С использованием иммобилизованных амидаз, полученных сшивкой глутаровым альдегидом, оптическая чистота D-молочной кислоты увеличилась до 92% в случае с ферментом R. rhodochrous 4-1 и до 84% с ферментом Arthrobacter sp. 6-1. Проведена оценка возможности биотрансформации D,L-фенилглицинонитрила и L-фенилаланинамида с использованием стереоселективных амидаз штаммов R. rhodochrous 4-1 и Arthrobacter sp. 6-1. Исследования показали, что штамм R. rhodochrous 4-1 обладает максимальной активностью по отношению к D,Lфенилглицинонитрилу среди исследованных культур. Оптимальными условиями биоконверсии рацемического субстрата, которые соответствуют низкой скорости спонтанного (неферментативного) гидролиза с одновременной высокой активностью и стереоселективностью биокатализатора, являются концентрация фенилглицинонитрила 10 мМ, температура реакции 10˚С, биокатализатор - поперечно сшитые агрегаты амидазы R. rhodochrous 4-1. Выявлено, что изученные штаммы 4-1 и 6-1 трансформировали L-фенилаланинамид с образованием L-фенилаланина, однако максимальную активность по отношению к субстрату проявил штамм R. erythropolis 6-2 1. Таким образом, по результатам исследований предложен новый подход к увеличению энантиомерной чистоты продукта, основанный на получении поперечно сшитых агрегатов амидаз R. rhodochrous 4-1 и Arthrobacter sp. 6-1. Изученные штаммы 23 являются перспективными в качестве биокатализаторов стереоселективного гидролиза амидов. ВЫВОДЫ 1. В процессе селекции получены штаммы – продуценты амидаз R. rhodochrous 4-1 и Arthrobacter sp. 6-1, способные к стереоселективной трансформации D,Lлактамида с максимальным энантиомерным избытком 44 и 43% соответственно. 2. Установлено, что оптимальными источниками углерода и азота для роста и проявления амидазной активности R. rhodochrous 4-1 являются дульцит и ацетонитрил, Arthrobacter sp. 6-1 – муравьиная кислота и ацетонитрил соответственно. Показано, что оптимизированная среда не влияет на стереоселективные свойства штаммов по отношению к D,L-лактамиду. 3. Иммобилизация амидазы R. rhodochrous 4-1 методом ковалентной сшивки с 2% хитозаном привела к повышению термо- и операционной стабильности фермента. Показана возможность длительного хранения высушенного иммобилизованного ферментного препарата. 4. Образование поперечно сшитых агрегатов амидаз позволило увеличить стереоселективность трансформации D,L-лактамида с 78 до 92% для фермента из R. rhodochrous 4-1 и с 64 до 84% для фермента из Arthrobacter sp. 6-1 по сравнению с их нативной формой. 5. Определено, что максимальный энантиомерный избыток реакции трансформации D,L-лактамида наблюдается при рН 6.0 и температуре 40-60°С. 6. Установлено, что оптимальными условиями для биотрансформации D,Lфенилглицинонитрила являются температура реакции 10°С, концентрация субстрата 10 мМ, а наиболее эффективным биокатализатором этого процесса – поперечно сшитые ферментные агрегаты амидазы R. rhodochrous 4-1. Список работ, опубликованных по теме диссертации Публикации в изданиях, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ 1. Павлова, Ю.А. Сравнительный анализ последовательностей генов амидаз почвенных актинобактерий рода Rhodococcus / Ю.А. Павлова, А.Н. Неустроева (Горбунова), А.Ю. Максимов // Известия Самарского научного центра РАН. – 2011. – Т.13, №5(3). – С. 272-276. 2. Павлова, Ю.А. Симбиотические почвенные бактерии, трансформирующие нитрилы и амиды карбоновых кислот / Ю.А. Павлова, А.Н. Неустроева (Горбунова) // Вестник Оренбургского университета. – 2011. – №16. – С.38-41. 3. Павлова, Ю.А. Исследование влияния температуры, рН и ингибиторов на активность энантиоселективной амидазы Rhodococcus erythropolis / Ю.А. Павлова, А.Н. Неустроева (Горбунова), А.Ю. Максимов, В.А. Демаков // Вестник уральской медицинской академической науки. – 2011. – №4/1(38). – С.44-45. 4. Максимова, Ю.Г. Трансформация амидов адгезированными клетками родококков, обладающими амидазной активностью / Ю.Г. Максимова, А.Н. Горбунова, 24 А.С. Зорина, А.Ю. Максимов, Г.В. Овечкина, В.А. Демаков // Прикладная биохимия и микробиология. – 2015. – Т. 51, № 1. – С. 53-58. Публикации в других журналах и сборниках 5. Неустроева (Горбунова), А.Н. Исследование каталитических свойств амидаз штаммов Rhodococcus / А.Н. Неустроева (Горбунова), А.Ю. Максимов // Материалы IV Всероссийского с международным участием конгресса студентов и аспирантовбиологов «Симбиоз Россия 2011». – Воронеж, 2011. – C. 27-29. 6. Павлова, Ю.А. Амидазы почвенных бактерий рода Rhodococcus / Ю.А. Павлова, А.Н. Неустроева (Горбунова) // Материалы IV Всероссийского с международным участием конгресса студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз Россия 2011». – Воронеж, 2011. – C. 153-156. 7. Неустроева (Горбунова), А.Н. ПЦР-анализ генов D-аминокислотных амидаз почвенных изолятов / А.Н. Неустроева (Горбунова), А.Ю. Максимов // Материалы V Всероссийского с международным участием Конгресса студентов и аспирантовбиологов «Симбиоз Россия 2012». – Тверь, 2012. – С. 180-182. 8. Неустроева (Горбунова), А.Н. Каталитические свойства амидазы, иммобилизованной на активированном хитозане / А.Н. Неустроева (Горбунова), Ю.Г. Максимова, А.Ю. Максимов, Г.В. Овечкина // Материалы VI Всероссийского с международным участием конгресса студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз Россия 2013». – Иркутск, 2013. – С. 99-101. 9. Горбунова, А.Н. Иммобилизация амидазы Rhodococcus rhodochrous 4-1 / А.Н. Горбунова, Ю.Г. Максимова // Биология – наука XXI века: 18 Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых. Сборник тезисов. – 2014. – С. 18-19. 10. Горбунова, А.Н. Энантиоселективный ферментативный гидролиз D,Lфенилглицинонитрила / А.Н. Горбунова, Ю.Г. Максимова, А.Ю. Максимов // Материалы VII Всероссийского с международным участием конгресса студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз Россия 2014». – Екатеринбург, 2014. – С. 111-113. 25 26 27 ГОРБУНОВА Анна Николаевна ГИДРОЛИЗ РАЦЕМИЧЕСКИХ АМИДОВ ФЕРМЕНТАМИ ПОЧВЕННЫХ АКТИНОБАКТЕРИЙ 03.02.03. Микробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Подписано в печать Формат 60×90/16. Усл. печ. л. 1. Тираж 120 экз. Заказ Набор компьютерный. Отпечатано в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения Российской академии наук 614081, г. Пермь, ул. Голева, 13 28
