Автореферат Авилова Е. А. - Российский онкологический

реклама
На правах рукописи
Авилова Екатерина Анатольевна
Роль протеинкиназы PAK1
в регуляции роста эстрогензависимого
и эстрогеннезависимого рака молочной железы
Специальность 14.01.12 – онкология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Москва – 2015
Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном научном учреждении
«Российский онкологический научный центр имени Н.Н.Блохина» (директор – д.м.н.,
проф., академик РАН М.И. Давыдов).
Научный руководитель:
Красильников Михаил Александрович, доктор биологических наук, профессор,
заведующий лабораторией молекулярной эндокринологии научно-исследовательского
института канцерогенеза, заместитель директора по научной работе – директор научноисследовательского института канцерогенеза федерального государственного бюджетного
научного учреждения «Российский онкологический научный центр имени Н.Н. Блохина».
Официальные оппоненты:
Сергеева Наталья Сергеевна, доктор биологических наук, профессор, руководитель
отделения "Прогноза эффективности консервативного лечения" Московского научноисследовательского онкологического института имени П.А. Герцена – филиала
федерального государственного бюджетного учреждения «Национальный медицинский
исследовательский радиологический центр» Министерства здравоохранения Российской
Федерации;
Боженко Владимир Константинович, доктор медицинских наук, профессор,
заслуженный врач России, заведующий отделом патоморфологии и лабораторной
диагностики федерального государственного бюджетного учреждения «Российский
научный центр рентгенорадиологии» Министерства здравоохранения Российской
Федерации.
Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научноисследовательский институт онкологии им. Н.Н. Петрова" Министерства здравоохранения
Российской Федерации.
Защита диссертации состоится «__» ____________2015 года в _____ часов на заседании
диссертационного совета Д 001.017.02 Федерального государственного бюджетного
научного учреждения «Российский онкологический научный центр имени Н.Н.Блохина»
по адресу: 115478, Москва, Каширское шоссе, д. 24.
С текстом диссертации можно ознакомиться в библиотеке ФГБНУ «РОНЦ им. Н.Н.
Блохина» (115478, Москва, Каширское шоссе, 23) и на сайте www.ronc.ru
Автореферат разослан «__» ________________________2015 года.
Ученый секретарь
диссертационного совета Д 001.017.02,
доктор медицинских наук, профессор
Барсуков Юрий Андреевич
2
Общая характеристика работы
Актуальность проблемы
На сегодняшний день содержание рецепторов эстрогенов (ER) относится к
основным критериям определения чувствительности больных раком молочной железы
(РМЖ) к гормональным противоопухолевым препаратам [М.А. Красильников, 2004, N.
Normanno et al., 2005, R. Clarke et al., 2003, V.C. Jordan, 2003, Е.С. Герштейн и др., 2005,
B.E. Henderson et al., 2003]. Основной причиной снижения эффективности гормональной
терапии
РМЖ
является
переход
опухолевых
клеток
от
эстрогензависимого
к
эстрогеннезависимому росту, что может быть обусловлено как уменьшением содержания
рецептора эстрогена, так и рядом других факторов, таких как нарушение баланса между
белками-активаторами и супрессорами ER, лиганд-независимая активация ER, а также
стимуляция митогенных сигнальных путей, идущих в обход ER и поддерживающих тем
самым рост РМЖ в отсутствие эстрогенов. Среди последних ведущее значение
принадлежит рецепторным тирозинкиназам. До сих пор остается неясным, какие из
эффекторов тирозинкиназ являются ключевыми для поддержания эстрогеннезависимого
роста и могут ли они играть самостоятельную роль в развитии гормональной
резистентности РМЖ.
Одним из важнейших эффекторов тирозинкиназных рецепторов является РАК (р21активированная
киназа)
1
–
серин-треониновая
протеинкиназа,
которая
путем
фософорилирования различных сигнальных белков участвует в регуляции ключевых
функций клетки: роста, выживаемости, организации цитоскелета, клеточной подвижности
[Z.S. Zhao, 2012]. Помимо этого, РАК1 фосфорилирует рецептор эстрогенов, причем
независимо от лиганда, приводя тем самым к снижению гормональной зависимости ERположительных клеток РМЖ [A. Ghosh et al., 2013, M. Kok et al., 2011, J. Bostner et al.,
2010]. Об участии PAK в регуляции роста ER-негативного РМЖ известно значительно
меньше, хотя о возможном включении PAK в эстрогеннезависимые сигнальные пути
косвенно свидельствует описываемая в литературе повышенная экспрессия PAK1 в ERнегативных опухолях молочной железы.
Основной темой диссертации явилось исследование внутриклеточных сигнальных
путей, ответственных за развитие гормональной резистентности злокачественных
опухолей, в частности – изучение роли PAK-сигнального пути в регуляции и поддержании
эстрогензависимого и эстрогеннезависимого роста опухолей молочной железы. Среди
главных задач работы: исследование значения PAK для активации эстрогеннезависимых
митогенных путей; изучение влияния гиперэкспресссии PAK на развитие гормональной
3
резистетности и анализ возможного механизма подавления PAK в эстрогеннезависимых
опухолях.
Цель исследования
Целью данной работы явилось изучение молекулярного механизма действия
протеинкиназы
PAK1
и
ее
роли
в
регуляции
роста
эстрогензависимого
и
эстрогеннезависимого рака молочной железы.
Задачи исследования
1. Сравнительный анализ экспрессии РАК1 в клетках эстрогензависимого и
эстрогеннезависимого рака молочной железы; изучение зависимости экспрессии
PAK-1 от стадии роста клеточной культуры;
2. Изучение роли РАК1 в регуляции роста клеток эстрогензависимого и
эстрогеннезависимого рака молочной железы: влияние РАК1 на рост клеток и
активность митогенных сигнальных путей: АР-1, бета-катенина и Snail1; роль α-Pix,
ко-активатора РАК1, в регуляции активности клеточных сигнальных белков; влияние
РАК1 на активность рецептора эстрогенов в клетках эстрогензависимого
рака
молочной железы MCF-7;
3. РАК1 и выживаемость клеток: изучение роли РАК1 в регуляции роста клеток в
условиях гипоксии;
4. Анализ метилирования РАК1 и его роли в регуляции дифференциальной
экспрессии РАК1 в клетках эстрогензависимого и эстрогеннезависимого рака
молочной железы.
Научная новизна
В настоящей работе был проведен сравнительный анализ изменений экспрессии
РАК1 в эстрогензависимых и эстрогеннезависимых опухолях; выявлены возможные
эпигенетические причины сниженной экспрессии РАК1 в ER-позитивных клетках рака
молочной железы; исследован механизм поддержания эстрогеннезависимого роста ERнегативных клеток, в том числе с участием ключевых транскрипционных факторов AP-1,
бета-катенина/TCF и Snail1; установлена роль Pix в регуляции эффектов РАК1; впервые
продемонстрировано участие РАК1 в поддержании роста клеток РМЖ в условиях
гипоксии. Полученные данные свидетельствуют, что РАК1 является важным фактором,
участвующим
в
поддержании
эстрогеннезависимого
4
роста
РМЖ,
и
позволяют
рассматривать РАК1 в качестве перспективного объекта таргетной терапии рака молочной
железы.
Практическая значимость работы
Были получены новые данные о роли РАК-сигнального пути в развитии и
поддержании гормональной резистентности клеток рака молочной железы, что позволяет
установить роль РАК1 и его эффекторов в регуляции эстрогеннезависимого роста клеток
РМЖ, а также оценить перспективность таргетной терапии РМЖ, направленной на
подавление РАК.
Апробация работы
Диссертация апробирована и рекомендована к защите 30 марта 2015 года на
объединенной научной конференции лабораторий молекулярной эндокринологии,
регуляции клеточных и вирусных онкогенов, механизмов гибели опухолевых клеток,
молекулярной
биологии
вирусов,
биохимии
опухолей,
цитогенетики
и
отдела
химического канцерогенеза НИИ Канцерогенеза ФГБНУ «РОНЦ им.Н.Н.Блохина».
Структура и объём диссертации
Диссертация изложена на 123 страницах машинописного текста, содержит 38
рисунков. Состоит из глав: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы»,
«Результаты и обсуждение», «Заключение», «Выводы», «Список литературы». Список
литературы содержит 286 источников.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ, в том числе 2 статьи
опубликованы в журналах, рекомендованных ВАК МОН РФ соискателям учёной степени
кандидата биологических наук.
Личный вклад автора
Автором самостоятельно проведен анализ отечественной и иностранной литературы
по изучаемой теме, разработаны протоколы и проведены эксперименты, осуществлены
анализ и интерпретация результатов исследования, статистическая обработка полученных
данных, формулирование выводов и оформление диссертационной работы.
Соответствие диссертации паспорту научной специальности
Научные положения диссертации соответствуют паспорту специальности 14.01.12. –
«онкология», конкретно пунктам 2,3.
5
Основное содержание работы
Обзор литературы
Первый раздел обзора литературы включает в себя современные данные о
механизмах действия стероидных гормонов. Вторая часть описывает возможные пути
развития гормональной резистентности РМЖ: потеря рецептора эстрогена, лиганднезависимая активация рецептора эстрогена, активация митогенных сигнальных путей,
поддерживающих рост РМЖ в отсутствие эстрогенов.
обзора
отражает
использующиеся
в
настоящее
Третий раздел литературного
время
подходы
в
терапии
эстрогензависимых и эстрогеннезависимых РМЖ. Заключительные части посвящены
современным представлениям о протеинкиназах семейства PAK: структуре, механизму
регуляции, выше- и нижележащим эффекторам PAK1, особенностям экспрессии PAK1 в
опухолях РМЖ, а также ее роли в регуляции гормональной чувствительности РМЖ.
Обзор дает представление о состоянии исследования затронутой проблемы, ее
актуальности и практической значимости.
Материалы и методы
В работе использовались клеточные линии рака молочной железы человека: ERпозитивная эстрогензависимая линия MCF-7 и ER-негативные эстрогеннезависимые
линии: MDA-MB-231, HBL-100, SKBR-3, а также устойчивая к гипоксии сублиния MCF7/H, полученная в результате длительного культивирования клеток MCF-7 в условиях
низкого содержания кислорода.
Методы исследования: транзиторная трансфекция экспрессионных и репортерных
плазмидных конструкций, а также коротких интерферирующих РНК;
определение
транскрипционной активности методом репортерного анализа; определение скорости
роста клеток МТТ-тестом; SDS-электрофорез белков в полиакриламидном геле с
последущим определением уровня экспрессии белков методом иммуноблоттинга,
определение метилирования гена в культуре клеток с помощью метилчувствительной
ПЦР и бисульфитного секвенирования, статистическая обработка полученных данных.
6
Результаты исследования и обсуждение
1. Сравнительный анализ экспрессии РАК1 в клетках эстрогензависимого и
эстрогеннезависимого рака молочной железы
1.1. Определение содержания РАК1 и ER методом иммуноблотинга
Целью первой части работы явилось исследование экспрессии PAK1 в различных
линиях рака молочной железы, выявление возможной корреляции с ER-положительным
или ER-отрицательным статусом и гормональной зависимостью РМЖ. Эксперименты
проводились in vitro на клетках эстрогензависимого ER-позитивного рака молочной
железы человека (линия MCF-7) и эстрогеннезависимого ER-негативного рака молочной
железы (линии HBL-100, MDA-MB-231, SKBR-3), культивируемых в стандартных
условиях, описанных выше.
Анализ содержания РАК1 и ER проводился методом
иммуноблотинга с использованием моноклональных антител к PAK1 и α-тубулину (рис.
1).
Рисунок 1. Экспрессия PAK1 в клетках MCF-7, HBL-100, MDA-MB-231, SKBR-3. Результаты
иммуноблоттинга и денситометрии, выполненной в программе ImageJ; за 1 принимали значение
показателя в линии MCF-7.
Определение
уровня
РAK1
выявило
его
высокое
содержание
в
эстрогеннезависимых ER-негативных клеточных линиях РМЖ (HBL-100, MDA-MB-231,
SKBR-3) по сравнению с клетками эстрогензависимой ER-позитивной линии MCF-7.
Полученные
результаты
согласуются
с
данными
других
исследователей,
демонстрировавших повышенный уровень PAK1 в ER-отрицательных клетках РМЖ, в то
время как в ER-положительных он практически отсутствовал [C. Holm et al., 2006], а
также с результатами исследования клинических образцов, показавших гиперэкспрессию
PAK1 более чем в 50% случаев РМЖ [S. Balasenthil et al., 2004].
1.2. Изучение зависимости экспрессии PAK1 от плотности клеточной
культуры
Для определения зависимости экспрессии PAK1 от стадии роста клеточной
культуры клетки MCF-7, HBL-100 и MDA-MB-231 рассеивали в 3-х исходных вариантах
7
таким образом, что к моменту снятия плотность клеток составляла 60, 80 и 100 % от
максимального монослоя. Иммуноблотинг образцов проводили с антителами к PAK1 и αтубулину (рис. 2).
Рисунок 2. Влияние плотности клеточной культуры на уровень РАК1 в клетках MCF-7, HBL-100,
MDA-MB-231. Результаты иммуноблоттинга.
Как видно из полученных данных, экспрессия PAK1 практически не изменялась в
зависимости от плотности клеточной культуры и, следовательно, различия в экспрессии
РАК1 между отдельными линиями сохранялись на любой стадии роста клеток (рис.2).
Для большинства последующих экспериментов были выбраны две линии клеток,
максимально различающиеся по степени экспрессии PAK1: с низким уровнем PAK1 (ERпозитивная линия клеток MCF-7) и с максимально высоким уровнем PAK1 (ERнегативная линия клеток HBL-100).
2. Роль РАК1 в регуляции роста клеток эстрогензависимого и
эстрогеннезависимого рака молочной железы
Для определения роли PAK1 в регуляции роста клеток рака молочной железы мы
исследовали особенности роста клеток РМЖ при подавлении PAK1, а также влияние
PAK1 на некоторые эффекторы, задействованные в передаче митогенного сигнала в
клетках РМЖ, в частности АР-1, бета-катенин и Snail.
2.1. Влияние РАК1 на рост клеток
Для изучения участия РAK1 в регуляции клеточного роста клетки MCF-7 и HBL-100
культивировали на 24-луночных планшетах в присутствии специфического ингибитора
PAK1  IPA-3 в концентрации 10 мкМ в течение 3 суток, с последующим определением
количества выживших клеток.
Результаты показали, что ингибитор PAK1 IPA-3 приводит к торможению роста
клеток, значительно более выраженному в ER-негативной линии HBL-100 по сравнению с
ER-позитивной линией MCF-7, что свидетельствует об активном участии РАК1 в
поддержании эстрогеннезависимого роста клеток (рис. 3) .
8
Рисунок 3. Влияние ингибитора РAK1 - IPA-3 в концентрации 10 мкМ на рост клеток MCF7 и HBL-100.
2.2. Влияние РАК1 на активность митогенных сигнальных путей
Для дальнейшего изучения механизма рост-стимулирующих эффектов РАК1
исследовалось его влияние на активность митогенных транскрипционных факторов: АР-1,
бета-катенина и Snail1. Был применен метод репортерного анализа, позволяющий оценить
транскрипционную активность факторов по их способности взаимодействовать со
специфическими участками связывания на ДНК и активировать экспрессию генарепортера люциферазы.
Для изучения роли РАК1 в регуляции активности АР-1 проводилась котрансфекция
эстрогензависимых ER-положительных клеток MCF-7 и эстрогеннезависимых ERотрицательных клеток HBL-100 плазмидными конструкциями, содержавшими дикий
вариант гена РАК1 (контроль – пустой вектор CMV6), ген люциферазы под контролем
AP-1-чувствительного промотора (AP1/Luc), а также плазмидой с геном β-галактозидазы
(для контроля эффективности трансфекции). Для исследования роли РАК1 в регуляции
бета-катенина были использованы клеточные линии: MCF/TCF и HBL/TCF (клеточные
линии MCF7 и HBL-100, стабильно экспрессирующие репортерную конструкцию,
содержащую ген люциферазы под контролем TCF/LEF- промотора, чувствительного к
бета-катенину), которые также были котрансфицированы плазмидами с диким вариантом
гена РAK и β-галактозидазой.
9
Рисунок 4. Влияние трансфекции РАК1 на транскрипционную активность АР-1 (а) и βкатенина (б). Результаты репортерного анализа.
Мы обнаружили, что гиперэкспрессия РАК1 приводит к выраженной стимуляции
транскрипционной активности АР-1 и бета-катенина, причем в обеих линиях клеток:
MCF-7 и HBL-100 (рис.4). Полученные результаты согласуются с литературными
данными о роли PAK1 в стимуляции клеточного цикла и пролиферации [L.E. AriasRomero et al., 2010, L.E. Arias-Romero et al., 2008, Z. Wang et al., 2013].
Последним из митогенных белков был исследован
транскрипционный фактор
Snail1, один из ключевых белков эпителиально-мезенхимального перехода [V. Stemmer et
al., 2008], повышенная экспрессия которого характерна для многих эстрогеннезависимых
опухолей молочной железы, в том числе – для клеток HBL-100 [A.M. Scherbakov et al.,
2013]. Примечательно, что фосфорилирование и активация
Snail1 регулируются с
участием PAK1-сигнального пути [Z. Yang et al., 2005].
Клетки MCF-7 и HBL-100 трансфицировали плазмидными конструкциями,
содержавшими дикий вариант гена РAK1, ген-репортер люциферазы под контролем
Snail1-чувствительного
промотора
(E-cad/Luc)
и
β-галактозидазу.
Результаты
репортерного анализа показали, что РАК1 стимулирует трансрепрессорную активность
Snail1, определяемую по степени подавления экспрессии репортерного гена E-cad/Luc [E.
Batlle et al., 2000], но только в ER-негативных клетках HBL-100, тогда как в клетках MCF7 активность Snail-1 практически не менялась (рис.5).
10
Рисунок 5. Влияние трансфекции РАК1 на транскрипционную активность Snail1.
Проведенный
нами
генетический
нокдаун
Snail1
в
присутствии
малых
интерферирующих РНК приводил к значительному, более чем в 2 раза, снижению
скорости роста ER-негативных клеток HBL-100, свидетельствуя о важной роли, которую
играет Snail1 в регуляции роста эстрогеннезависимых клеток (рис. 6).
Рисунок 6. Влияние si-Snail1 на скорость роста клеток HBL-100.
Таким образом, на этом этапе работы было продемонстрировано участие PAK1 в
регуляции эстрогеннезависимого роста клеток РМЖ, в том числе через активацию
митогенных сигнальных путей: AP-1, β-катенин и Snail1.
2.3. Роль α-Pix, ко-активатора РАК1, в регуляции активности клеточных
сигнальных белков
Мы исследовали роль ко-активатора PAK1 – PIX, в регуляции митогенных
сигнальных путей. Регуляция активности РAK1 происходит путем присоединения малых
Rho- ГТФаз: Rac1 и Cdc42, переведенных с помощью гуанин нуклеотид-обменных
факторов (GEF) в ГТФ-связанную активную форму; таким GEF-фактором для PAK1
является PIX, в частности, α-Pix. Ранее было показано, что PAK1, несмотря на то, что он
является «downstream» эффектором α-Pix-Rac1(Cdc42), в то же время фосфорилирует α11
Pix по серину в 488-м положении [U.E. Rennefahrt et al., 2007]. Значение такого
фосфорилирования для клетки до сих пор изучено не было. Мы предположили, что данное
фосфорилирование может определять митогенные эффекты PAK1, в том числе влияние
PAK1 на активность транскрипционных факторов АР-1, бета-катенина и Snail1.
Действительно, было обнаружено, что трансфекция α-Pix-содержащей плазмиды в клетки
MCF-7 и HBL-10 приводит к активации бета-катенина (рис. 7б), но никак не влияет на
транскрипционную активность АР-1 (рис. 7а).
Рисунок 7. Влияние трансфекции α-Pix на транскрипционную активность АР-1 –а; βкатенина –б. Результаты репортерного анализа.
С
помощью
репортерного
анализа
мы
показали,
что
α-Pix
стимулирует
трансрепрессорную активность Snail1, но только в ER-негативных клетках HBL-100 (рис.
8а), что согласуется с данными, полученными нами ранее в отношении PAK1. Для
исследования роли PAK1-зависимого фосфорилирования α-Pix в регуляции Snail была
использована мутантная форма α-Рix, в которой серин в 488-ом положении был заменен
на аланин (α-Рix-A), что препятствует фосфорилированию киназой PAK1. Оказалось, что,
если трансфекция α-Pix дикого типа приводит к повышению трансрепрессорной
активности Snail1, то замена 488-го серина на аланин блокирует этот эффект, возвращая
трансрепрессорную активность Snail1 практически к исходному уровню (рис. 8б).
12
Рисунок 8. Влияние трансфекции α-Pix на транскрипционную активность Snail1 - а; роль
PAK-зависимого фосфорилирования α-Pix по S488 в активации Snail - б. Результаты репортерного
анализа.
Полученные
данные
свидетельствуют
о
важной
роли
PAK1-зависимого
фосфорилирования α-Pix (S488) в стимуляции трансрепрессорной активности Snail1.
2.4. Влияние РАК1 на активность рецептора эстрогенов в клетках
эстрогензависимого рака молочной железы MCF-7
Мы изучали возможные изменения содержания ER при трансфекции в клетки MCF7 плазмиды PAK1 или при действии на клетки специфического ингибитора PAK1 – IPA-3.
Результаты иммуноблоттинга образцов показали, что трансфекция РAK1 приводит к
заметному увеличению экспрессии ER в клетках MCF-7; при добавлении IPA-3
экспрессия ERα возвращается к исходному уровню (рис. 9).
Рисунок 9. Экспрессия ERα в клетках MCF-7 при трансфекции PAK1+/- IPA-3. Результаты
иммуноблоттинга и денситометрии, выполненной в программе ImageJ; за 1 принимали значение
показателя в контроле.
13
Аналогичные
данные
были
получены
относительно
влияния
PAK1
на
транскрипционную активность ER, для определения которой применялся репортерный
анализ с использованием гена-репортера люциферазы под контролем эстрогенреспонсивного элемента (ERE) (ERE/Luc). Мы продемонстрировали, что гиперэкспрессия
РАК1 приводит к стимуляции активности ER, а подавление РАК1 в присутствии IPA-3
сопровождается ее снижением (рис. 10).
Рисунок 10. Анализ транскрипционной активности ER после трансфекции РАК1 или
действия ингибитора РАК1 IPA-3 в клетках MCF-7. Результаты репортерного анализа.
В целом, полученные данные показали, что рост-стимулирующее действие РАК1 на
клетки ER-позитивного РМЖ ассоциировано как со стимуляцией канонических
митогенных сигнальных путей: AP-1 и β-катенин, так и с активацией эстрогенового
сигналинга.
3. РАК1 и выживаемость клеток: роль РАК1 в регуляции роста клеток в
условиях гипоксии
Выше отмечалось, что ER-негативные клетки РМЖ характеризуются высоким
уровнем экспрессии PAK1 [C. Holm et al., 2006] и Snail1 [A.M. Scherbakov et al., 2013], в то
время как ER-позитивные клетки, напротив, имеют низкий уровень экспресии этих
белков. Вероятно,
причина низкого уровня экспрессии PAK1 и Snail1 в ER-
положительных клетках может быть связана с особенностями внутриклеточного
сигналинга, ответственного за негативный контроль этих белков. Одним из механизмов
такой негативной регуляции является подавление рецептором эстрогенов активности
Snail1 через ER-зависимую активацию специфического белка-супрессора Snail1 – MTA3
[A. Dhasarathy et al., 2007, N. Fujita et al., 2003].
14
В наших исследованиях мы продемонстрировали активацию рецептора эстрогенов
под действием РАК1, что можно рассматривать в качестве одного из факторов,
ограничивающих уровень Snail1 в ER-позитивных клетках РМЖ.
Участие РАК1 в поддержании роста клеток MCF-7 было продемонстрировано в
экспериментах с IPA-3, специфическим ингибитором РАК1: оказалось, что добавление
IPA-3 существенно снижает скорость роста клеток MCF-7. Для дальнейшего изучения
протективной роли РАК1 и путей его физиологической регуляции в клетках РМЖ мы
исследовали активность РАК1 в клетках MCF-7 в условиях гипоксии.
3.1. Сравнительный анализ чувствительности к гипоксии клеток MCF-7 и
HBL-100 (эксперименты выполнены совместно с В.А.Шатской)
Эксперименты проводились in vitro на клетках эстрогензависимого рака молочной
железы человека MCF-7 и эстрогеннезависимого ER-негативного рака молочной железы
линии HBL-100. Анализ скорости роста клеток после перевода в условия гипоксии (1%
О2) показал
резкое снижение роста клеток MCF-7 при сохранении относительно
устойчивой пролиферации ER-негативных клеток HBL-100 (рис. 11). Как уже отмечалось,
клетки HBL-100 отличаются высоким уровнем РАК1, что позволило предположить
количество клеток отн.ед.
участие последнего в регуляции чувствительности клеток к гипоксии.
контроль
гипоксия, 1%О2
MCF-7
HBL-100
Рисунок 11. Сравнительный анализ чувствительности к гипоксии клеток MCF-7 и HBL-100.
15
3.2. Роль РАК1 в адаптации клеток MCF-7 к гипоксии
Участие PAK1 в ответе клеток на гипоксию было подтверждено в экспериментах по
сравнительному
анализу содержания
РАК1,
показаших
выраженное
увеличение
экспрессии РАК1 в клетках MCF-7 в условиях острой гипоксии (1% О2, 18 час) (рис.12).
Рисунок 12. Влияние острой гипоксии на содержание РАК1 в клетках MCF-7. Результаты
иммуноблоттинга и денситометрии, выполненной в программе ImageJ; за 1 принимали значение
показателя в контроле.
В какой мере РАК1 участвует в поддержании роста клеток при гипоксии – для
ответа на этот вопрос следующая серия экспериментов была проведена на клетках MCF-7,
культивированных в условиях хронической гипоксии. Для моделирования условий
хронической гипоксии клетки эстрогензависимого рака молочной железы MCF-7
культивировали в атмосфере с пониженным (до 1%) содержанием кислорода в течение 30
сут. Ранее мы продемонстрировали, что если острая, в течение 3 сут, гипоксия вызывает
значительное торможение клеточной пролиферации, то на фоне хронической гипоксии
торможение роста оказывается существенно меньшим. Полученная в условиях
хронической гипоксии сублиния клеток получила название MCF-7/H; в предыдущих
работах мы показали, что подобная толерантность к гипоксии может сохраняться в
течение не менее 60 суток после возвращения клеток в среду с нормальным содержанием
кислорода [Д.В.Сорокин и др., 2015].
Было установлено, что базальный уровень РАК1 в клетках MCF-7/H значительно
выше, чем в MCF-7 (рис.13).
16
Рисунок 13. Сравнительный анализ содержания РАК1 в клетках MCF-7 и MCF-7/H.
Результаты иммуноблоттинга и денситометрии, выполненной в программе ImageJ; за 1 принимали
значение показателя в в линии MCF-7.
Подавление PAK1 в клетках MCF-7/H в присутствии IPA3 приводит к увеличению
50
100
контроль
гипоксия 1%
0
количество клеток отн.ед.
150
чувствительности клеток к гипоксии (рис. 14).
- IPA
+IPA
Рисунок 14. Влияние IPA-3 на чувствительность к гипоксии клеток MCF-7/Н. Результаты
МТТ теста.
Для дальнейшего изучения механизма протективного действия РАК1 в условиях
гипоксии был проведен анализ влияния РАК1 на активность HIF-1, одного из ключевых
факторов, индуцируемых в условиях гипоксии. С помощью репортерного анализа с
использованием плазмиды HRE/Luc, содержавшей ген люциферазы под контролем
гипоксия-респонсивного элемента (HRE), мы обнаружили, что трансфекция РАК1 в
клетки приводит к увеличению транскрипционной активности HIF-1 на фоне острой
гипоксии, демонстрируя непосредственное участие РАК1 в активации HIF-1-сигнальных
путей (рис. 15).
17
1500
500
1000
wPak1
0
активность люциферазы
(HRE/luc), усл.ед.
контроль
Норма
Гипоксия
Рисунок 15. Влияние трансфекции wPAK1 на транскрипционную активность HIF-1. Результаты
репортерного анализа.
Как уже отмечалось, подобный протективный эффект РАК1 характерен и для клеток
ER-негативного рака молочной железы: так, исследованные нами ER-негативные опухоли
молочной железы отличались повышенной конститутивной экспрессией РАК1 и высокой
чувствительностью
к
антипролиферативному
действию
IPA-3.
Таким
образом,
гиперэкспрессия РАК1, как приобретенная (в случае клеток MCF-7/H), так и
конститутивная (в случаях ER-негативных опухолей) может выступать в роли одного из
факторов, поддерживающих автономный рост и выживаемость клеток.
4. Метилирование РАК1 и его роль в регуляции дифференциальной экспрессии
РАК1 в клетках эстрогензависимого и эстрогеннезависимого рака молочной железы
В качестве одного из вероятных путей регуляции РАК1 в клетках опухолей
молочной
железы
мы
исследовали
специфических цитозин-гуанин
возможность
метилирования/деметилирования
богатых участков гена, располагающихся в 5’-
регуляторных регионах [X. Zhang et al., 2013, C. Yi et al., 2008, Н.П. Киселева и др., 2007]
и определяющих эффективность экспрессии РАК1.
Был проведен сравнительный анализ метилирования промотера гена РАК1 в клетках
MCF-7 и HBL-100 методом метичувствительной ПЦР, основанной на использовании
метилчувствительных рестриктаз, которые разрезают ДНК по определенным сайтам при
отсутствии в них метилированных цитозинов; в результате последующая ПЦР
соответствующего фрагмента ДНК будет приводить к образованию продукта только в
случае
метилирования
сайтов
метилчувствительных рестриктаз
рестрикции.
Применение
двух
независимых
(HpaII и HhaI) продемонстрировало наличие
метилирования гена РАК1 в клетках MCF-7 и его отсутствие в клетках HBL-100 (рис. 16).
18
Рисунок 16. Анализ метилирования промотора РАК1 методом метилчувствительной ПЦР. а) ПЦР
после рестрикции HpaII. Определяются два фрагмента, верхний соответствует промотору РАК1,
нижний - внутреннему контролю CUX1; б) ПЦР после рестрикции HhaI. Определяется один
фрагмент, соответствующий промотору РАК1. В клетках MCF-7 рестрикции ДНК не происходит
из-за метилирования цитозинов в СG-динуклеотидах, синтез фрагмента РАК1 сохраняется. В
клетках HBL-100 происходит рестрикция ДНК, фрагмент с промотора РАК1 не синтезируется.
Полученные
данные
были
подтверждены
с
помощью
бисульфитного
секвенирования, в основе которого лежит бисульфитная конверсия неметилированного
цитозина в тимин (рис. 17).
а
б
Рисунок 17. а) Нуклеотидная последовательность СpG-островка, расположенного в
промоторной области PAK1. Цветом выделены метилированные цитозины, которые не
изменяются в результате бисульфитной конверсии. б) Бисульфитное секвенирование промотора
РАК1 в клетках HBL-100 и MCF-7. Результаты метил-специфического секвенирования CpGостровка, расположенного в промоторе РАК1 в культурах клеток HBL-100 и MCF-7.
Метилированный цитозин обнаруживается только в промоторе РАК1 клеток MCF-7.
19
Вместе с тем, аналогичное исследование метилирования РАК1 в клетках MCF-7/H
не выявило существенных изменений в уровне метилирования РАК1 – несмотря на
увеличение содержания РАК1 в клетках MCF-7/H по сравнению с клетками MCF-7
(рис.18).
MCF-7/H
Рисунок 18. Бисульфитное секвенирование промотора РАК1 в клетках MCF-7/Н .
Каков механизм активации РАК1 в случае клеток MCF-7/H – остается до конца
непонятным, скорее всего подобная активация РАК1 может быть результатом действия
определенных сигнальных белков – позитивных регуляторов РАК1. Мы предполагаем,
что в качестве таких регуляторов могут выступать белки, ассоциированные с гипоксией, в
том числе – HIF-1. Учитывая описанную выше способность РАК1 стимулировать
активность HIF-1, можно предположить, что эти белки связаны положительными
регуляторными связями, которые и обеспечивают конститутивное повышение их уровня
при хронической гипоксии.
Заключение
На сегодняшний день основным критерием определения чувствительности к
гормональным
противоопухолевым
препаратам
является
содержание
рецепторов
эстрогенов [М. А. Красильников, 2004, N. Normanno et al., 2005, R. Clarke et al., 2003, V.C.
Jordan, 2003, Е.С. Герштейн и др., 2005, B.E. Henderson et al., 2003]. Однако, гормональная
резистентность может развиваться и при сохранении ER: в результате дисбаланса белковкорегуляторов ER, лиганд-независимой активации ER, стимуляция сигнальных путей,
независимых от ER и поддерживающих тем самым рост РМЖ в отсутствие эстрогенов.
Развитие гормональной резистентности рака молочной железы связано с переходом
опухолевых клеток от эстрогензависимого к эстрогеннезависимому росту.
В настоящей работе при исследовании факторов, регулирующих развитие
гормональной резистентности клеток рака молочной железы, мы продемонстрировали
участие серин-треониновой протеинкиназы РАК1 в поддержании эстрогеннезависимого
роста опухолевых клеток. Мы установили, что подобные митогенные эффекты РАК1
ассоциированы со стимуляцией ключевых сигнальных путей опухолевой клетки: MAPK/
AP-1 каскада, WNT-β-катенинового пути, Snail1-сигнального пути. Продемонстрировано,
что для реализации действия РАК1 ключевым фактором является фосфорилирование α20
Pix, ко-активатора РАК1, по серину в положении 488. Показано значение РАК1сигнальной системы в регуляции выживаемости опухолевых клеток, в том числе в
условиях гипоксии.
Полученные данные легли в основу предлагаемой схемы действия PAK1 с
участием его некоторых вышележащих и нижележащих эффекторов, а также значения
РАК1 в поддержании роста клеток РМЖ (рис. 19).
Рисунок 19. Роль PAK1 и его эффекторов в поддержании эстрогензависимого
и эстрогеннезависимого роста рака молочной железы.
В
целом,
полученные
результаты
свидетельствуют
о
перспективности
использования РАК1 в качестве маркера развития гормональной резистентности РМЖ и
потенциального объекта таргетной терапии опухолей молочной железы.
Выводы
1. Сравнительный анализ содержания серин-треониновой протеинкиназы РАК1 в клетках
культивируемых in vitro эстрогензависимой и эстрогеннезависимых линий рака молочной
железы показал значительное превышение уровня РАК1 в эстрогеннезависимых
сублиниях
2. Продемонстрировано, что РАК1 является одним из факторов, необходимых для
поддержания роста клеток рака молочной железы, в большей степени – для роста
эстрогеннезависимых опухолей молочной железы
3. Установлено, что митогенный эффект РАК1 ассоциирован со стимуляцией ключевых
сигнальных путей опухолевой клетки: MAPK/ AP-1 каскада, WNT-β-катенинового пути,
21
Snail1-сигнального пути.
Для реализации действия РАК1 необходимым фактором
является фосфорилирование α-Pix, ко-активатора РАК1, по серину в положении 488.
4. Продемонстрировано участие РАК1 в регуляции выживаемости клеток рака молочной
железы, в частности – в условиях хронической гипоксии. Одним из возможных
механизмов участия РАК1 в поддержании роста опухолевых клеток в условиях гипоксии
является обнаруженная нами способность РАК1 стимулировать транскрипционную
активность HIF-1, одного из основных гипоксия-зависимых протективных факторов
клетки.
5. При определении статуса метилирования промотора гена РАК1 установлено, что низкий
уровень РАК1 в эстрогензависимых линиях ассоциирован с высоким уровнем
метилирования, в то время как в эстрогеннезависимых линиях, отличающихся высоким
содержанием РАК1, его промотор полностью деметилирован.
6. В целом, полученные данные свидетельствуют, что эпигеномная регуляция РАК1, в
частности – метилирование ДНК, может являться одним из факторов, определяющим
повышение уровня РАК1 в эстрогеннезависимых клетках рака молочной железы.
Продемонстрированная нами протективная функция РАК1 позволяет рассматривать его в
качестве перспективной мишени для таргетной терапии рака молочной железы.
Список работ по теме диссертации в журналах, рекомендованных ВАК
1. Авилова, Е.А. Значение протеинкиназы PAK1 в регуляции эстрогеннезависимого
роста клеток рака молочной железы / Е.А. Авилова, О.Е. Андреева, В.А. Шатская,
М.А. Красильников // Биомедицинская химия – 2014. – Т. 60, №3 – C.322-331
(статья также опубликована в английском переводе в Biochemistry (Moscow)
Supplement Series B: Biomedical Chemistry (Avilova, E.A. The Role of Protein Kinase
PAK1 in the Regulation of Estrogen-Independent Growth of Breast Cancer Protein
Kinase Pak1 and Breast Cancer / E.A. Avilova, O.E. Andreeva, V.A. Shatskaya, M.A.
Krasil’nikov // Biochemistry (Moscow) Supplement Series B: Biomedical Chemistry –
2015. - Vol. 9 - No. 1 – P. 58-62).
2. Авилова, Е.А. Метилирование РАК1 в клетках опухолей молочной железы / Е.А.
Авилова, Е.Б. Кузнецова, М.В.Немцова, А.М.Щербаков, В.А. Шатская, М.А.
Красильников // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии
– 2015. – № 5 – С. 39-46.
22
Тезисы конференций:
1. Авилова, Е.А. Роль РАК1-α-Pix-сигнального пути в регуляции роста опухолевых
клеток/ Авилова Е.А. // Биология – наука ХХI века: 19-я Международная
Пущинская школа-конференция молодых ученых Сборник тезисов. Пущино, 2015.
– 2015. – С. 215.
2. Авилова,
Е.А.
Роль
РАК1-сигнального
пути
в
развитии
гормональной
резистентности клеток рака молочной железы / Е.А. Авилова, О.Е. Андреева, В.А.
Шатская, М.А. Красильников // 1-й Российский онкологический научнообразовательный форум с международным участием «Белые Ночи – 2015».
Сборник тезисов. М., 2015. – C. 418.
3. Авилова, Е.А. РАК1 и выживаемость клеток: роль РАК1 в регуляции роста клеток
в условиях гипоксии / Е.А. Авилова, В.А. Шатская, М.А. Красильников // 1-й
Российский онкологический научно-образовательный форум с международным
участием «Белые Ночи – 2015». Сборник тезисов. М., 2015. – C. 419.
4. Сорокин, Д.В. Молекулярные механизмы регуляции чувствительности клеток рака
молочной железы к противоопухолевым агентам в условиях гипоксии / Д.В.
Сорокин, С.Е. Семина, Е.А. Авилова, И.А. Якушина, М.А. Красильников //
Экспериментальная и фундаментальная онкология – 2014. – C. 123.
23
Скачать