НАЦИОНАЛЬНАЯ АКАДЕМИЯ НАУК УКРАИНЫ ИНСТИТУТ МИКРОБИОЛОГИИ И ВИРУСОЛОГИИ им. Д.К. ЗАБОЛОТНОГО Л.Д. ВАРБАНЕЦ, Г.М. ЗДОРОВЕНКО, Ю.А. КНИРЕЛЬ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЭНДОТОКСИНОВ ПРОЕКТ “НАУКОВА ДУМКА” КИЕВ НАУКОВА ДУМКА 2006 УДК 576. 8.098 В монографии изложены современные методы выделения и очистки эндотоксинов (липополисахаридов) грамотрицательных бактерий, получения отдельных структурных компонентов молекулы (О-специфического полисахарида, олигосахарида кора, липида А), описаны подходы к изучению их состава и структуры с использованием химических методов, масс-спектрометрии и ЯМРспектроскопии, включая разработанные в последние годы различные модификации этих методов. Отдельные главы посвящены методам иммунологического анализа и изучению некоторых видов биологической активности эндотоксинов. Для микробиологов, биохимиков, химиков, преподавателей, аспирантов и студентов, занимающихся изучением липополисахаридов грамотрицательных бактерий. Ответственный редактор академик НАН Украины, профессор В.С. ПОДГОРСКИЙ Рецензенты: д-р биол. наук, проф. Р.И. Гвоздяк д-р биол. наук, проф. А.М. Зайченко Рекомендовано к печати ученым советом Института микробиологии и вирусологии им. Д.К. Заболотного НАН Украины Научно-издательский отдел медико-биологической, химической и геологической литературы Редактор Ж.В. Загоруйко ISBN 966-00-0458-3 ПРЕДИСЛОВИЕ ___________________________________________________________________________ Известно, что эндотоксины – термостабильные биополимеры, которые вырабатываются грамотрицательными бактериями, обладают широким спектром биологической активности и способны оказывать токсическое действие на организм животных и человека. В настоящее время септический шок, вызванный эндотоксинами грамотрицательных бактерий, продолжает оставаться одной из актуальных проблем современной медицины в силу неуклонной тенденции к росту числа больных и стабильно высокой летальности. Это происходит в результате увеличения доли инфекций, вызываемых условно-патогенными, а также неферментирующими бактериями, такими, как Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter sp., Klebsiella pneumoniae, Enterobacter cloaceae и др. Неоправданное использование комбинированной антибиотикотерапии и ряда новых препаратов ультраширокого спектра действия обусловили появление в качестве возбудителей прежде крайне редко встречающихся при сепсисе микроорганизмов – Enterococcus faecium, Stenotrophomonas maltophilia, Flabobacterium sp. Вместе с тем эндотоксины способны оказывать и благотворное влияние, стимулируя неспецифическую устойчивость организма к бактериальным и вирусным инфекциям. По данным [27], эндотоксины важны для нормального развития и функционирования иммунной системы организма. Для того чтобы выяснить, каким образом эндотоксины осуществляют столь разнообразные функции, необходимо знать их химический состав, структуру, конформацию, топологию в клетке. В 1935 г. A. Boivin и J. Mesrobeanu [55, 56], используя метод экстракции клеток трихлоруксусной кислотой, показали, что эндотоксин представляет собой макромолекулярный комплекс из белка, липида и полисахарида. Спустя 20 лет O. Westphal и O. Luderitz [212] разработали водно-фенольный метод изолирования эндотоксина из грамотрицательных бактерий и провели классические исследования по биохимии эндотоксинов. Полученный ими полимер по своей биологической активности был подобен эндотоксину, экстрагируемому трихлоруксусной кислотой, однако в отличие от последнего состоял в основном из углеводов и жирных кислот. Таким образом, эндотоксины с химической точки зрения представляют собой липополисахариды (ЛПС) – основные компоненты внешней мембраны грамотрицательных бактерий, локализованные исключительно на наружной поверхности. Ее внутренняя поверхность содержит другой тип липидов – глицерофосфолипиды [166, 168]. В то время как монослой глицерофосфолипида текуч при нормальной температуре и в значительной степени напоминает термальное поведение глицерофосфолипидного бислоя в цитоплазматической мембране, монослой ЛПС имеет высокоупорядоченную квазикристаллическую структуру с очень низкой текучестью [167]; в нем молекулы ЛПС связаны посредством ионных мостиков из дивалентных катионов Mg2+, Ca2+. Такая структура слоя ЛПС во внешней мембране ограничивает поступление веществ, таких, как соли дивалентных катионов, литические ферменты, некоторые антибиотики. В то время как пориновые каналы позволяют диффундировать через внешнюю мембрану низкомолекулярным веществам (до 600 Да), например моно- и дисахариды, вещества с большей молекулярной массой и все гидрофобные соединения эффективно удерживаются внешней мембраной многих бактерий – представителей Enterobacteriaceae, Pseudomonas aeruginosa и др. [166]. Поэтому грамотрицательные бактерии гораздо менее чувствительны к гидрофобным антибиотикам, чем грамположительные. Минимальные концентрации многих гидрофобных ингибиторов для “дикого типа” штаммов Escherichia coli, Salmonella typhimurium в 10–1000 раз выше, чем для их мутантов, дефектных по структуре внешней мембраны, или грамположительных бактерий [167, 168]. ЛПС играют важную роль во взаимоотношениях бактериальной клетки с окружающей средой, а в случае патогенных микроорганизмов – с организмом хозяина, по отношению к которому он проявляет себя как эндотоксины и антигены. Поскольку ЛПС представляют собой основные термостабильные поверхностные антигены (их называют О-антигенами) бактериальной клетки, они имеют большое значение в серотипировании некоторых видов грамотрицательных бактерий. В настоящее время в зависимости от специфических свойств или функций, которые выполняют этим биополимеры, используют три названия: эндотоксины, ЛПС, О-антигены. ЛПС – это семейство структурно родственных амфифильных макромолекул, которые характеризуются общим строением. Полная макромолекула ЛПС состоит из полисахаридной части – О-специфической цепи и олигосахарида кора, ковалентно связанного с липидной частью, названной липидом А, с помощью которого молекула “заякоривается” в наружном слое внешней мембраны [215]. Липид А и олигосахарид кора считаются относительно консервативными в филогенетическом отношении структурами, в то время как О-специфические цепи характеризуется чрезвычайной вариабельностью. Такая структура ЛПС – S-форма – продуцируется гладкими бактериальными фенотипами, представителями Enterobacteriaceae и Pseudomonodaceae. Микроорганизмы, являющиеся искусственно полученными или природными R-мутантами (шероховатые фенотипы многих видов Acinetobacter, Bordetella, Campylobacter, Bacteroides, Neisseriae, Haemophylus, Chlamydia), синтезируют R-ЛПС, в молекуле которых отсутствует О-полисахаридный фрагмент. Химический анализ R-мутантов бактерий, представителей Enterobacteriaceae (E. coli, Salmonella enterica), дефектных по биосинтезу О-специфических полисахаридных цепей, позволил дифференцировать ряд хемотипов: Ra, Rb, Rc, Rd и Re [148]. Ra описывает ЛПС, содержащий полную структуру олигосахарида кора, в то время как Re представляет минимальную структуру ЛПС, состоящую только из липида А и дисахарида 2-кето-3дезоксиоктоновой кислоты. Большинство же штаммов «дикого типа» бактерий продуцирует S-, R-, а также переходные SR-формы ЛПС. В зависимости от того, в S- или R-форме ЛПС присутствует в клетках, применяют различные методы их выделения и очистки. В монографии, состоящей из 5 глав, изложены как классические, так и современные методы анализа эндотоксинов (ЛПС) грамотрицательных бактерий. Первая глава посвящена методам выделения и очистки липополисахаридов, получению их структурных компонентов (О-специфического полисахарида, олигосахарида кора и липида А), а также химически модифицированных форм (дефосфорилированных, дезацилированных). Во второй главе приведены методы изучения состава препаратов ЛПС: количественное определение общих сахаров, пентоз, гексоз, гептоз, аминосахаров, уроновых кислот, 4-амино4-дезокси-L-арабинозы, кетодезоксиоктоновой кислоты (КДО), глюкозы, галактозы, а также неуглеводных компонентов (пировиноградная кислота, ацетильные группы, фосфор) и примесей (белок, нуклеиновые кислоты); описаны методы бумажной, газожидкостной (ГЖХ), жидкостной, тонкослойной хроматографии, включая хроматографическое определение КДО и 4-амино-4-дезоксиL-арабинозы, абсолютных конфигураций моносахаридов и неуглеводных компонентов. В третьей главе рассмотрены методы структурного анализа ЛПС, включая химические (метилирование, парциальный гидролиз и сольволиз, дезаминирование, распад по Смиту) и физические методы, в том числе масс-спектрометрия с ионизацией бомбардировкой быстрыми атомами (FAB), лазерной десорбцией из матрицы (MALDI) и электрораспылением (ESI), а также одно- и двумерная спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР). Поскольку ЛПС – основные антигены бактериальной клетки, для изучения их иммунохимической специфичности используют традиционные методы (различные виды агглютинации, преципитации, двойной иммунодиффузии в агаре), иммуноэлектрофорез (включая ракетный), иммуноферментные методы анализа, а также электрофорез с иммуноблоттингом. Все указанные методы приведены в четвертой главе. Как известно, ЛПС характеризуются широким спектром биологической активности, включающей летальную токсичность, пирогенность, митогенную активность, способность индуцировать образование цитокинов (фактор некроза опухоли, оксид азота, гамма-интерферон, интерлейкины), оказывать протективное действие и т.д. Методы, используемые для изучения различных видов биологической активности, изложены в пятой, заключительной главе.