УДК 575.28:[578.891:615.281] АНАЛИЗ МУТАЦИЙ ЛЕКАРСТВЕННОЙ РЕЗИСТЕНТНОСТИ К ПРОТИВОВИРУСНЫМ ПРЕПАРАТАМ ВИРУСА ГЕПАТИТА В НА ТЕРРИТОРИИ Г.АСТАНА 1 А.П. Кравченко , А.Б. Шевцов 2 , Л.С. Киянбекова3 1 ЕНУ им. Л.Н.Гумилева, 2 Национальный центр биотехнологии РК, 3 РГКП «Центр санитарно-эпидемиологической экспертизы г.Астана» Республика Казахстан, Астана alena.2989@yandex.kz Хронический гепатит В является глобальной проблемой общественного здравоохранения [1]. В мире около двух миллиардов человек в течение жизни были инфицированы вирусом гепатитом В, из них у более 350 миллионов человек инфекция перешла в хроническое течение [2]. Хроническое течение гепатита В является результатом неэффективной борьбы иммунного ответа с вирусом [3]. Вирус гепатита В (ВГВ) поражает печень как основную цель и может вызывать прогрессивные поражения печени, приводящие к повышенному риску развития цирроза печени, печеночной недостаточности и в конечном итоге может привести к гепатакарциноме. В настоящее время рекомендуется несколько препаратов для лечения пациентов с хроническим гепатитом В. Эти препараты можно разделить на две основные группы в зависимости от механизма их действия, а именно иммуномодулирующие препараты, как интерфероны-α, и противовирусные препараты (аналоги нуклеозидов и нуклеотидов) - ламивудин, адефовир, энтекавир, тенофовир и телбивудин [4]. Серьезной проблемой применения нуклеозидных и нуклеотидных аналогов является развитие к ним резистентности вследствие мутаций вируса, которое приводит к реактивации инфекции и обострению заболевания. Учитывая то, что нуклеозидные/тидные аналоги являются ингибиторами обратной транскриптазы вируса, развитие резистентности происходит при появлении мутаций в Р-гене. Например, лечение ламивудином приводит к изменению последовательности аминокислотных остатков в С регионе Р-гена (YMDD мотиф-тирозин[Y]-метионин[M]-аспартат[D]аспартат[D]). Этот участок является ключевым для фермента и отвечает за захват нуклеозидов. Чаще всего встречаются два типа мутаций: замена метионина на валин/изолейцин/серин в позиции rtM204V/I/S и лейцина на метионин в позиции rtL180M. Мутация rtM204V/I/S является основной и определяет резистентность вируса к ламивудину, а rtL180M – дополнительной, которая усиливает репликативную активность мутантного штамма [5]. При лечении адефовиром описаны две основные мутации, определяющие резистентность к адефовиру, – rtN236T и rtA181V. Кроме того, выделяют целый ряд других мутаций (rtL80V/I, rtV84M, rtV214A, rtS85A, rtQ215S, rtP237H и rtN238T/D), которые сочетаются с одной из основных, или, реже – встречаются изолированно . При лечении энтекавиром описано развитие ряда специфичных для препарата мутантных штаммов – rtT184S/A/I/L, rtS202G/C и rtM250I/V в регионах В, С и Е обратной транскриптазы вируса соответственно, а также мутаций, характерных для лечения ламивудином – rtM204V/I/S и rtL180M. При лечении телбивудином описано развитие мутаций, аналогичных при использовании ламивудина – rtM204I, rtL180M и rtL80V/I, поэтому между обоими препаратами существует перекрестная резистентность [6]. Определение лекарственной устойчивости обеспечивает правильную стратегию лечения, профилактику резистентности и своевременную модификацию схемы лечения с учетом резистентности. Нашей главной целью являлось определение лекарственной резистентности к противовирусным препаратам вируса гепатита В методом определения нуклеотидной последовательности полимеразного гена. Материалы и методы: Исследование было проведено на 111 образцах ДНК, выделенных из плазмы крови пациентов, обратившихся на диагностическое обследование в РГКП «Центр санитарноэпидемиологической экспертизы г.Астана». Для амплификации был использован вложенный (nested) ПЦР с праймерами, описанный D. Vincenti с соавторами [7]. Очистку ПЦР продуктов проводили ферментативным методом [8]. Определение нуклеотидной последовательности осуществляли с использованием автоматического генетического анализатора 3730xl DNA Analyzer, комплекта реагентов BigDye terminator cycle sequencing kit v 3.1 и внутренних праймеров. В анализ были включены референтные последовательности различных генотипов вируса гепатита В, взятые из Gene Bank http://www.ncbi.nih.gov. Результаты: При анализе аминокислотных последовательностей гена полимеразы ВГВ были обнаружены мутация rtS213T(1,8%;n=2), ассоциированная с развитием лекарственной устойчивости при терапии ламивудином[9], мутации rtQ215S(1,8%;n=2), rtQ215H(1,8%;n=2), rtQ215P(2,7%;n=3), описанные в литературе как вторичные мутации резистентности к ламивудину и адефовиру (рис.1). Как показывает исследование AminiBavil-Olyaee S. с соавторами[10], rtQ215 замены в полимеразном гене HBV часто возникают при хроническом гепатите, даже без экзогенных факторов, rtQ215 замены вероятнее всего представляют полиморфизмы, а не мутации резистентности с клиническими проявлениями. Рис.1. rtQ215 замены в полимеразном гене HBV В одном случае была установлена замена тирозина на серин в 184 позиции rtT184S(1,1%, n=1), которая является определяющей в развитии резистентности к энтекавиру, обнаружены полиморфизмы rtV214A(1,8%;n=2), rtL229M(1,8%;n=2) ассоциируемые с развитием резистентности к ламивудину; rtN238D(1,1%, n=1), rtV207L(1,1%, n=1) ассоциируемые с развитием резистентности к адефовиру. Выводы Результаты исследования показали, что распространенность мутаций, описанных в литературе и достоверно ассоциированных с развитием лекарственной резистентности, у исследуемых пациентов в РК составила 14%(1,1% значимые аминокислотные замены(n=1) и 12,9% потенциально значимые аминокислотные замены(n=15)). Полученные данные распространенности резистентности ВГВ к лекарственным препаратам указывают на необходимость скрининга пациентов на наличие мутаций, что обеспечит правильную стратегию лечения, профилактику резистентности и своевременную модификацию схемы лечения. Список использованной литературы: 1. Safioleas M, Lygidakis NJ, Manti C. Hepatitis B today. Hepatogastroenterology. 2007;54:545–548. 2. Poland GA, Jacobson RM. Clinical practice: prevention of hepatitis B with the hepatitis B vaccine. N Engl J Med. 2004;351:2832–2838. Doi: 10.1056/NEJMcp041507. 3. Ganem D, Prince. Hepatitis B virus infection–natural history and clinical consequences. N Engl J Med AM. 2004; 350 1118 1129 4. Bryant ML, Bridges EG, Placidi L, Faraj A, Loi AG, Pierra C, Dukhan D, Gosselin G, Imbach JL, Hernandez B. et al. Antiviral L-nucleosides specific for hepatitis B virus infection. Antimicrob Agents Chemother. 2001;45:229–235. Doi: 10.1128/AAC.45.1.229-235.2001. 5. Allen M.I., Deslauriers M., Andrews C.W. et al. Identification and characterization of mutations in hepatitis B virus resistant to lamivudine.Hepatology, 1998, 27, 1670-1677. 6. Locarnini S., Hatzakis A., Heathcote J. et al. Management of antiviral resistance in patients with chronic hepatitis B. Antivir Ther., 2004, 9, 679-693. 7. D. Vincenti, M. Solmone, A. R. Garbuglia, F. Iacomi, M. R. Capobianchi. A sensitive direct sequencing assay based on nested PCR for the detection of HBV polymerase and surface glycoprotein mutations // Journal of Virological Methods . – 2009. – Vol. 159. –P. 53–57. 8. Werle E., Schneider C., Renner M., Völker M., Fiehn W. Convenient single-step, one tube purification of PCR products for direct sequencing // Nucleic Acids Res. – 1994. – Vol. 22. - P. 4354-4355. 9. Chaudhuri V., Tayal R., Nayak B. et al. Occult hepatitis B virus infection in chronic liver disease: full- length genome and analysis of mutant surface promoter // Gastroenterol. 2004. V. 127. P. 1356 – 1371. 10. Amini- Bavil-Olyaee S, Herbers U, Mohebbi SR, Sabahi F, Zali MR, Luedde T, Trautwein C, Tacke F.// J Hepatol. 2009 Oct;51(4):647-54. Epub 2009 May 27.