Влияние экзогенного пероксида водорода на липопероксидацию

УДК 581.1
ВЛИЯНИЕ ЭКЗОГЕННОГО ПЕРОКСИДА ВОДОРОДА
НА ЛИПОПЕРОКСИДАЦИЮ
И ФЕРМЕНТЫ АНТИОКСИДАНТНОЙ ЗАЩИТЫ
ИЗОЛИРОВАННЫХ ХЛОРОПЛАСТОВ ГОРОХА
А.П. Веселов, Е.А. Чуманкина, И.В. Маркина
Нижегородский госуниверситет
Исследовали действие экзогенного пероксида водорода в разных концентрацях на процесс перекисного окисления липидов. При экспозиции с
0.01%-ным пероксидом водорода отмечалась тенденция к увеличению содержания диеновых конъюгатов и малонового диальдегида, а также активности ферментов антиоксидантной защиты — супероксиддисмутазы и глутатионтрансферазы. Обработка 0.1%-ным Н2О2 приводила к существенному
повышению концентрации малонового диальдегида и активности антиоксидантных ферментов. Полученные данные позволяют предположить, что пероксид водорода активирует ферменты-протекторы и участвует в развитии
стрессорной реакции.
Роль пероксида водорода в растительной клетке представляет значительный
интерес. Эта активная форма кислорода способствует развитию многих биологических процессов, связанных с болезнестойкостью растений. Уровень Н2О2, генерирующегося на поверхности листа, влияет на иммунитет растений, вызывая синтез веществ, токсичных для микроорганизмов (Аверьянов, 1991; Запрометов,
1993). Кроме того, он стимулирует лигнификацию клеточных стенок в местах
проникновения инфекции (A. de Marco et al., 1996; Chen et al., 1993). Известно
также, что многие белки индуцируются под воздействием пероксида водорода
(Пескин,1997).
Целью настоящей работы являлось исследование влияния экзогенного пероксида водорода на липопероксидацию и динамику активности ферментов антиоксидантной защиты. Объектом исследования служили растения гороха Pisum sativum L. Анализы проводили на суспензии изолированных хлоропластов. Обработки пероксидом водорода осуществляли путем внесения 0.01 и 0.1%-ного растворов Н2О2 в суспензию изолированных хлоропластов. Время экспозиции — 10 минут. В качестве контроля использовали изолированные хлоропласты, не подвергавшиеся обработке пероксидом водорода.
Перекисное окисление липидов (ПОЛ) тестировали по содержанию промежуточных продуктов липопероксидации — диеновых конъюгатов и малонового диальдегида. Работу системы ферментативных протекторов оценивали по активности супероксиддисмутазы и глутатионтрансферазы.
В ходе исследования получили следующие результаты. Обработка 0.01%-ным
Н2О2 приводила к достоверному увеличению содержания промежуточных продуктов ПОЛ — диеновых конъюгатов (ДК) на 20% (рис. 1). Концентрация конечного продукта ПОЛ — малонового диальдегида (МДА) — увеличивалась незначительно (рис. 2). Динамика содержания изучаемых продуктов ПОЛ при увеличе164
нМоль конъюгатов на мг
белка
нии концентрации раствора пероксида водорода до 0.1% носила несколько иной
характер — наблюдали снижение количества ДК до контрольного уровня. Содержание МДА при обработке 0.1%-ным Н2О2 было максимальным и достигало 202%
от контроля (рис. 2).
1,6
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
к
0,01
0,1
Концентрация пероксида водорода, %
мкмоль МДА на мг белка
Рис. 1. Динамика содержания диеновых конъюгатов
при обработке изолированных хлоропластов пероксидом водорода
0,025
0,02
0,015
0,01
0,005
0
к
0,01
0,1
Концентрация пероксида водорода, %
Рис. 2. Динамика содержания малонового диальдегида при обработке
изолированных хлоропластов пероксидом водорода
Одним из ключевых ферментов, защищающих клетку от супероксиданионного радикала на самой ранней стадии процесса свободнорадикального
окисления, является супероксиддисмутаза (СОД). Согласно полученным результатам, динамика активности СОД повторяла изменение уровня МДА: при обработке 0.01%-ным Н2О2 наблюдали колебания активности фермента около контрольного уровня. Наибольший эффект отмечался при обработке 0.1%-ным пероксидом водорода — значения активности СОД превышали контрольный уровень на 83% (рис. 3). Согласно имеющимся литературным данным, многие воздействия, которые приводят к повышению в клетке концентрации АФК, вызывают активацию СОД (Калашников и др., 1994).
165
мкМоль НСТ на мг белка за
минуту
1
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
к
0,01
Концентрация пероксида водорода, %
Рис. 3. Динамика активности супероксиддисмутазы
при обработке изолированных хлоропластов пероксидом водорода
мкМоль конъюгата на мг белка
за минуту
Другой антиоксидантный фермент — глутатионтрансфераза (ГТ). ГТ ответственна за элиминацию промежуточных продуктов ПОЛ, в частности гидроперекисей, являющихся одним из звеньев, ведущих к образованию диеновых конъюгатов. Изменение активности ГТ также в целом было аналогично динамике уровня
СОД. При 0.01%-ном Н2О2 воздействии значения активности ГТ были приближены к контрольным (рис. 4). Возможно, невысокой активностью ГТ объясняется
максимальный уровень ДК при данном модифицирующем воздействии Н2О2.
Наибольшей активности фермент достигал при обработке 0.1%-ным Н2О2 —
141% от контроля, что, возможно, и является определяющим фактором в понижении значений диеновых конъюгатов до контрольного уровня.
1,6
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
к
0,01
0,1
Концентрация пероксида водорода, %
Рис. 4. Динамика активности глутатионтрансферазы
при обработке изолированных хлоропластов пероксидом водорода
В целом, воздействие 0.01%-ного Н2О2 вызывало увеличение лишь промежуточных продуктов ПОЛ, не влияя значительно на содержание его конечных метаболитов и не активируя систему ферментативных протекторов. Возможно, что это
166
воздействие лежит в пределах зоны толерантности растительной клетки. Предположительно, в данном случае элиминация экзогенного пероксида водорода осуществлялась низкомолекулярными протекторами, так как рядом авторов доказано, что именно таким антиоксидантам, как глутатион, аскорбат, каротиноиды
принадлежит ведущая роль в защите клетки на ранних стадиях окислительного
стресса (Кения и др., 1993; Бурлакова и др., 1985). Согласно литературным данным, пероксид водорода может являться вторичным посредником стрессорной
реакции и экспрессировать гены ферментов защиты (A. de Marco et al., 1996; Chen
et al., 1993). Таким образом, значительное увеличение активности защитных ферментов хлоропластов — глутатионтрансферазы и супероксиддисмутазы — и повышение концентрации конечного продукта (МДА) при обработке суспензии изолированных хлоропластов 0.1%-ным пероксидом водорода позволяет предположить, что 0.1%-ный Н2О2 уже является стрессирующим фактором, индуцирующим ферменты-протекторы и запускающим развитие стресс-реакции.
ЛИТЕРАТУРА
Аверьянов А.А. Активные формы кислорода и иммунитет растений // Успехи соврем.
биол. 1991. Вып. 5. С. 722–737.
Бурлакова Е.Б., Храпова Н.Г. Перекисное окисление липидов мембран и природные
антиоксиданты // Успехи химии. 1985. Т. 14, вып. 9. С. 1540–1557.
Запрометов М.Н. Специализированные функции фенольных соединений в растениях //
Физиол. раст. 1993. Т. 40, № 6. С. 921–932.
Калашников Ю.Е., Балахнина Т.И., Закржевский О.О. Действие почвенной гипоксии
на активацию кислорода и систему защиты от окислительной деструкции в корнях и листьях ячменя // Физиол. раст. 1994. Т. 41, № 4. С. 583–590.
Кения М.В., Лукаш А.И., Гуськов Е.П. Роль низкомолекулярных антиоксидантов при
окислительном стрессе // Успехи соврем. биол. 1993. Т. 113, вып. 4. С. 465–470.
Пескин А.В. Взаимодействие активного кислорода с ДНК // Биохимия. 1997. Т. 61,
вып. 1. С. 1571–1578.
Ario de Marco, Kalliopi A. Roubelakis-Angelakis. The complexity of enzymic control of hydrogen peroxide concentration may affect the regeneration potential of plant protoplasts // Plant
physiol. 1996. V. 110. P. 137–145.
Chen Z., Silva H., Klessig D.F. Active oxygen species in the induction of plant systemic acquired resistance by salicylic acid // Science. 1993. V. 262. P. 1883–1885.
167