Московский Физико-Технический Институт Факультет общей и

Московский Физико-Технический Институт
Факультет общей и прикладной физики
Кафедра физики и технологии наноструктур
Дёгтев Дмитрий Ильич
Сравнительный анализ метионин-γ-лиаз из Citrobacter freundii,
Clostridium tetani и Clostridium sporogenes, конструирование
штаммов-продуцентов
Выпускная квалификационная работа
на соискание степени бакалавра
научный руководитель:
доктор биологических наук
И. В. Манухов
Долгопрудный, 2014
1
Оглавление.
Введение .............................................................................................................. 3
Обзор литературы ................................................................................................ 4
Метиониновая зависимость раковых клеток ................................................... 4
Метионин-γ-лиаза ............................................................................................. 7
Материалы и методы ........................................................................................ 12
Бактериальные штаммы ................................................................................. 12
Плазмиды......................................................................................................... 12
Питательные среды и условия роста .............................................................. 12
Методы молекулярного клонирования ......................................................... 13
Биосинтез MGL ................................................................................................ 16
Хроматография ................................................................................................ 18
Определение кинетических и спектральных параметров фермента ........... 19
Результаты и обсуждение ................................................................................. 20
Конструирование гибридных плазмид .......................................................... 20
Сравнение аминокислотных последовательностей ферментов................... 22
Биосинтез MGL из С.freundii ............................................................................ 26
Биосинтез MGL из С. tetani с присоединенным HisTag .................................. 27
Биосинтез MGL из С. sporogenes с присоединенным HisTag ......................... 28
Выводы ............................................................................................................... 29
Список литературы ............................................................................................ 30
2
Введение.
Объектом настоящего исследования является фермент
метионин-γ-лиаза (MGL, КФ 4.4.1.11).
Метионин-γ-лиаза — пиридоксаль-5′-фосфат(PLP)-зависимым
ферментом, катализирующим реакцию γ-расщепления L-метионина.
Исследуемый фермент считается перспективным противораковым агентом.
Эффективность MGL показана in vitro, in vivo.
Целью настоящей работы является создание высокоэффективных
продуцентов фермента, для дальнейшего использования MGL в практике
лечения онкологических заболеваний. Для достижения этой цели были
сконструированы гибридные плазмиды, содержащие ген megL, кодирующий
фермент MGL, из микроорганизмов C. freundii, C. tetani, C. sporogenes.
Разработана эффективная технология биосинтеза фермента и процедура
очистки для дальнейшего проведения доклинических и клинических
испытаний. В ходе работы были получены кинетические параметры
ферментов. Проведено секвенирование, изучены структурные различия.
3
Обзор литературы.
Метиониновая зависимость раковых клеток.
Химиотерапия опухолей, за редким исключением, имеет ограниченную
эффективность. Злокачественные образования слабо реагируют на лечение
химическими агентами. Более того многие препараты являются
цитотоксичными и не селективными по отношению к опухолям. Поэтому
важно найти терапевтическую методику, воздействующую только на
злокачественные клетки.
Метиониновая зависимость - метаболический дефект, мешающий
клеткам расти в среде, в которой метионин заменен его непосредственным
предшественником, гомоцистеином (Met-Hcy+). Многие раковые клетки
имеют этот дефект. Метиониновое голодание блокирует клеточный цикл
многих злокачественных клеток [1-2].
Исследования метаболизма метионина в раковых штаммах показали,
что метионин-зависимые клетки могут синтезировать метионин из
гомоцистеина на нормальном для здоровых клеток уровне [3]. Аномально
высокая потребность в метионине у злокачественных образований
объясняется реакциями метилирования. Синтезируемого из гомоцистеина
метионина не достаточно для поддержания этого процесса при
метиониновом голодании.
Множество различных экспериментов по культивированию клеток
млекопитающих указывают на то, что здоровые клетки не являются
метионин зависимыми и могут пролиферировать в среде Met-Hcy+ [4].
(рисунок 1)
4
Рисунок 1. Метаболизм метионина млекопитающих. [5]
Многие клеточные культуры, выделенные из опухолевых тканей, не
растут вообще или очень медленно на этой среде. К примеру, клетки
костного мозга здорового пациента нуждаются в метионине меньше для
оптимального роста, чем клетки пациента больного лейкемией. [6]Такая
зависимость наблюдается во многих схожих экспериментах [1-5].
Аналогичная тенденция наблюдается in vivo. Животные, находящиеся на
диетах, в которых метионин заменен гомоцистеином, развиваются
нормально [7]. Диетарное отсутствие метионина вызывает регрессию
опухолей млекопитающих и ингибирует метастазы. Злокачественные клетки
более чувствительные к отсутствию метионина, чем нормальные клетки
различных тканей. В противоположность этому отсутствие других
аминокислот либо высокотоксично, либо не оказывает значимого эффекта
[7-8].
5
Различные препараты, мешающие делению раковых клеток, широко
используются в онкологии в комплексной химиотерапии. Эффективность
метионинового голодания в экспериментах in vivo и in vitro подтвердилась в
клинических испытаниях [9]. Кроме того была исследована комплексная
эффективность. Доклинические и клинические исследования показали
лучшую противораковую активность при одновременно использовании
5-фторурацила (5-FU) и метионинового голодания по сравнению с
отдельным использованием этих методик. Клинические испытания на
предоперационных больных раком желудка показало, что метиониновая
диета в комбинации с 5-FU дали лучший гистологический ответ, чем обычное
лечение 5-FU [10-11].
Текущий стандарт первой стадии лечения метастатического
колоректального рака включает в себя терапию FOLFOX. [12] Проведена
первая стадия клинических испытаний совместного использования
метиониновой диеты и FOLFOX на больных колоректальным раком. Такая
терапия оказала минимальную токсичность. Среди 4 больных, 3 испытали
частичный ответ терапии, и у одного наблюдалась стабилизация
заболевания. [13-14]
6
Метионин-γ-лиаза
Наиболее эффективным методом снижения концентрации аминокислот
является необратимая ферментативная деградация. Таким примером может
быть метионин-γ-лиаза.
MGL (КФ 4.4.1.11) является пиридоксаль-5′-фосфат-зависимым
ферментом, катализирующим реакцию γ-расщепления L-метионина с
образованием метилмеркаптана, иона аммония и a-кетобутирата:
O
NH3
H3C
O
S
CH3SH +
O
O + NH4
O
MGL также катализирует реакцию β-расщепления L-цистеина и его Sзамещенных производных, а также реакции α- и β-замещения в молекулах Lметионина, L-цистеина и их аналогов.[15]
Рисунок 2. Метаболизм метионина некоторых патогенных бактерий.*15]
7
Впервые метионин-γ-лиаза была выделена в 1973 году из Clostridium
sporogenes [16]. Очищенный MGL ингибировал карциносаркому Уолкера 256
в мышах и не проявил токсичности. Было сообщено, что фермент в
комбинации с гомоцистенином ингибировал рост клеток лейкемии с
абсолютной метиониновой зависимостью, но не повлиял на нормальные
фибробласты способные использовать гомоцистеин вместо метионина.
Выделенный из C. sporogenes MGL обладал высокой Km порядка 90 mM [16].
Позднее был проведен поиск MGL с меньшей Km. Фермент был найден в
Pseudomonas putida, его Km была ~1mM [5]. Выделение MGL из этой бактерии
было неэффективным, поэтому ген фермента был клонирован и
экспрессирован в Escherichia coli. Клонированный ген содержал открытую
рамку считывания, состоящую из 1194 пар нуклеотидов, кодирующую
полипептид из 398 аминокислот. Фермент имеет гомотетромерную
структуру, масса каждой субъединицы порядка 43 кДа. Рекомбинантный
MGL (rMGL) проявил аналогичные нативному биохимические свойства.
Очищенный rMGL селективно снижал концентрацию серосодержащих
аминокислот [5].
Ген megL был обнаружен у простейших эукариот Trichomonas vaginalis
[17]. Два однокопийных различных гена, кодирующих метионин-γ-лиазу,
были изолированы из T. vaginalis. Они имеют 69% гомологию друг c другом,
и 44% с P.putida. Оба гены были клонированы, экспрессированы в E.Coli,
очищены. Оба фермента проявили схожие с P. putida биохимические и
структурные свойства. Несмотря на это, удельные активности ферментов из
T. vaginalis сильно различались между собой с разными субстратами. Данные
приведены в таблице 1 [17].
8
Таблица 1. Удельные активности rMGL из T. vaginalis с различными субстратами.[17]
Субстрат
rMGL1, уд.ед.
rMGL2, уд.ед.
Гомоцистеин
370
128
Метионин
10.4
0.67
Цистеин
6.02
1.06
О-ацетилсерин
3.74
1.51
За удельную единицу активности принята масса фермента,
катализирующая элиминацию 1мкМ субстрата в минуту.
Позднее MGL был найден в семействе Enterobacteriaceae в геноме
Citrobacter freundii. В этой же работе было показано, что MGL из различных
микроорганизмов имеет гомологию ~50%. Ген был клонирован,
экспрессирован в E.coli, очищен [18]. Кроме того, фермент был
кристаллизован [19]. Исследования структуры подтвердили тетрамерную
организацию MGL. Несмотря на наличие кристаллических структур фермента
высокого разрешения, механизм работы все еще не ясен. Фермент из
Citrobacter freundii является одним из наиболее изученных и является
эталоном в данной работе.
MGL Citrobacter freundii имеет тетрамерную организацию в растворах и в
кристалле. Тетрамер состоит из двух каталитических димеров с осью
симметрии второго порядка. Каталитический димер состоит из двух
мономеров с осью симметрии второго порядка и содержит два активных
сайта. Каждый активный сайт состоит из аминокислот обеих субъединиц и
пиридоксаль-5’-фосфата. Расстояние между двумя PLP – 20 ангстрем [19].
9
Рисунок 3. Тетрамерная структура MGL из C. freundii. Мономеры выделены серым,
зеленым, оранжевым и голубым цветом. Красным обозначен PLP [19]
Каждый мономер состоит из трех структурных и функциональных
доменов: N-домен, С-домен, PLP-сайта. N-домен (1-62 аминокислотные
остатки) включает в себя короткую 310-спираль и две альфа-спирали (1 2),
соединенные длинной петлей 17-40. 310-спираль – характерный элемент MGL
из C. freundii. N- домен соединен с PLP-сайтом длинной петлей 50-62,
входящей в состав активного центра. Большой домен PLP-сайта (63-259
аминокислотные остатки) содержит большинство каталитически важных
остатков. Домен имеет α/β/α свертку из 7 почти параллельных β-листов (β1β7)и 8 α-спиралей (α3- α10). PLP ковалентно связывается c Lys210. Домен PLPсайта связан с С-доменом α-спиралью (α10). С- домен (260-398
аминокислотные остатки) содержит 5 β-листов (β8- β12) и 5 α-спиралей (α11α15). Спираль 14 находится между PLP-сайтом и С- доменом участвует в
образовании активного сайта, но не связывается напрямую с PLP. Позиция
10
этой спирали аналогична расположению в MGL из P. putida, в то время как
гомологичная спираль MGL из T. vaginalis расположена ближе к PLP-сайту
[19].
Мономеры, образующие каталитический димер, связываются друг с
другом большим преимущественно плоским регионом. Они оба имеют
гидрофобное ядро и плотно связываются водородными связями.
Протяженный регион (33-62) N- домена, включающий длинную петлю и
спираль α2, стабилизирует каталитический димер. Остатки Tyr58* и Arg60*
смежного мономера образуют сильные водородные связи с PLP [19].
Взаимодействие двух каталитических димеров приводит к образованию
тетрамера с 4 активными сайтами и симметрией типа 222. Вся эта структура
стабилизируется сетью межмолекулярных и водородных связей.
Консервативные домены, образующие эти связи, помогают мономерам
«узнавать» друг друга [19].
В MGL из C. freundii есть гидрофобное ядро, образованное остатками
аминокислот всех 4 мономеров. Остатки этого кластера не являются
консервативными и могут варьироваться до гидрофильных в MGL из
различных микроорганизмов [19].
MGL эффективно снижал уровень метионина в крови мышей, и этот
пониженный уровень поддерживался в течение длительного времени.
Лечение с помощью MGL ингибировало рост опухолей различных штаммов
опухолей, даже устойчивых к различным химиотерапийный агентам [20].
Также была исследована комплексная эффективность 5-FU с MGL.
Показано, что противоопухолевая эффективность 5-FU возрастает в разы при
комплексном применении с MGL по сравнению с раздельным [21].
11
Материалы и методы
Бактериальные штаммы
В работе использовали штамм E. coli :

MC1061 F- Δ(ara-leu)7697 [araD139]B/r Δ(codB-lacI)3 galK16 galE15 λ-
e14- mcrA0 relA1 rpsL150(strR) spoT1 mcrB1 hsdR2(r-m+)

Bl21 (DE3) F– ompT gal dcm lon hsdSB(rB- mB-) λ(DE3 [lacI lacUV5-T7
gene 1 ind1 sam7 nin5]);
Плазмиды
Таблица 2. Применяемые плазмиды.
Название плазмиды
pET-28a::megL_tetani_HT
pET-28a::megL_sporogenes
_HT
pET-15b::megL_freundii
Конструкция
Ген megL из C. tetani был вставлен в вектор pET-28a(+)
по сайтам NdeI и EcoRI. Исследуемый фермент
находится под контролем lac-оператора и
T7-промотора и продуцируется с присоединенным
полигистединовым хвостом (HisTag)
Ген megL из C. sporogenes был вставлен в вектор pET28a(+) по сайтам NdeI и EcoRI. Исследуемый фермент
находится под контролем lac-оператора и
T7-промотора и продуцируется с присоединенным
полигистединовым хвостом (HisTag)
Ген megL из C. freundii был вставлен в вектор pET-15b
по сайтам NcoI и BamHI. Исследуемый фермент
находится под контролем lac-оператора и
T7-промотора и продуцируется без HisTag
Источник
Получена от
наших коллег *22+
Получена от
наших коллег [22]
Сконструирована
в нашей
лаборатории [18]
Питательные среды и условия роста
При трансформации и культивировании клеток E.coli использовали
среду LB: бактотриптон 10 г/л, дрожжевой экстракт 5 г/л, NaCl 10 г/л, рН 7.5.
Для твёрдой среды добавляли агар до концентрации 1,5%.
Бактерии растили в LB-бульоне при постоянном перемешивании (100200 об/с) при 370С и на агаризованной среде. Трансформированные клетки
12
высевали на агаризованную среду с антибиотиком в требуемой
концентрации: ампициллина – 50 мкг/мл, канамицина – 50 мкг/мл.
Методы молекулярного клонирования
Трансформация клеток E. coli методом электропорации
Клетки растили в 200 мл LB в 2 л колбе до OD600=0.5-0.8. Все
дальнейшие манипуляции проводили на холоду. Центрифугировали 15 мин
при 4500 об/мин, удаляли супернатант. Промывали 200 мл H 2OmQ
(центрифугировали 15 мин при 4500 об/мин, удаляли супернатант).
Промывали 100 мл H2O mQ (центрифугировали 15 мин при 4500 об/мин,
удаляли супернатант). Промывали 20 мл H2OmQ (центрифугировали 15 мин
при 4500 об/мин, удаляли супернатант). К осаждённым клеткам добавляли
90% объёма воды и 10% ДМСО. Аликвотили (одна aликвота на
электропорацию 20 мкл), замораживали и хранили при -70oС. Раствор ДНК
вносили в объеме <1мкл в каждую аликвоту клеток (40 мкл), которую
переносили в ячейку электропоратора. Электропорацию проводили на 1700
V, 10 мсек, затем клетки инкубировали в LB на 370С 30 мин и высевали на
чашки Петри с агаризованной LB средой с соответствующими
антибиотиками.
Трансформация клеток E. coli кальциевым методом
Клетки растили в 5 мл LB в 25 мл пробирке до OD600=0.2-0.3. Все
дальнейшие манипуляции проводили на холоду. Центрифугировали 2 мин
при 14000 об/мин, удаляли супернатант. К осаждённым клеткам добавляли
1 мл холодного 0.1 мМ CaCl2 и тщательно суспендировали, снова
центрифугировали 2 мин при 14000 об/мин, удаляли супернатант. К
осаждённым клеткам добавляли 30мкл холодного 0.1 мМ CaCl2 и 0.1 мкг
ДНК, тщательно суспендировали. Далее выдерживали на льду в течерие
13
одного часа и подвергали тепловому шоку (420С) в течение 2 мин.
Инкубировали в питательной среде LB 30 минут при 370, концентрировали и
высевали на чашку Петри с агаризованной LB средой с соответствующими
антибиотиками.
Выделение плазмидной ДНК методом щелочной экстракции
Бактерии выращивали в пробирках 5 мл среды L, содержащей
соответствующий антибиотик, при 37С в течение ночи. Клетки осаждали при
8 000 об/мин в течение 2 мин и тщательно ресуспендировали в 0,1 мл
раствора I (0.025 М трис-HCI, рН 8.0; 0.01 М ЭДТА; 0.05 М глюкоза). После
выдерживания суспензий в течение 30 мин в ледяной бане к ним добавляли
по 0.2 мл раствора II (0.2 н NaOH, 1% SDS), после осторожного
перемешивания и выдерживания в течение 5 мин при 0С к суспензиям
добавляли по 0.15 мл раствора III (3 М ацетат натрия, рН 4.8). Вязкие смеси
осторожно перемешивали, инкубировали 10 мин. в ледяной бане, а затем
центрифугировали 15 мин при 14 000 об/мин. К 0.4 мл супернатанта,
перенесенного в новую пробирку, добавляли по 1 мл этанола, смеси
выдерживали 10 мин при -70С и центрифугировали 14 мин при 10 000
об/мин. Осадки растворяли в 0.1 мл Н2О и 0.3 М ацетата натрия, к растворам
добавляли по 0.3 мл этанола и центрифугировали, как описано выше. Осадки
промывали спиртом, сушили и растворяли в 20 мкл Н2О. Растворы ДНК
анализировали с помощью электрофореза в агарозном геле.
Электрофорез фрагментов ДНК в агарозном геле
Анализ фрагментов ДНК проводили в 1% агарозном геле (на буфере
TAE с содержанием 1 мкг/мл бромистого этидия). В работе использовались
маркеры длин фрагментов ДНК фирмы Fermentas. Фрагменты ДНК
14
детектировали в геле при его облучении УФ светом с длиной волны 280-340
нм.
Элюция фрагментов ДНК из агарозного геля
Элюцию фрагментов ДНК из агарозных гелей проводили с помощью
набора Silica powder фирмы Fermentas в соответствии с методикой
производителя. Метод основан на способности Silica powder адсорбировать
ДНК при высокой ионной силе. После электрофореза участок агарозного
геля, содержащий необходимый фрагмент ДНК, вырезался, к нему
добавлялся трехкратный объем 6М раствора йодида натрия. Инкубировали 5
мин при 550С до полного растворения геля. Добавляли 2-5 мкл Silica powder в
зависимости от количества ДНК. Центрифугировали 1 мин при 14 000 об/ мин
и трижды промывали “wash” буфером (500 мл wash буфера добавляли к
осадку Silica powder, связавшему ДНК, суспендировали на вортексе,
центрифугировали 5 сек при 14 000 об/мин.). Инкубировали Silica powder в
20 мл воды или буфера для элюции, Silica powder осаждалась
центрифугированием 30 сек при 14000 об/мин. Затем отбирали раствор ДНК
в воде.
Измерение оптической плотности.
Проводилось при 600 нм на фотоколориметре КФК-2МР.
Секвенирование.
Секвенирование ПЦР-продуктов проводилось по методу Сэнгера.
15
Биосинтез MGL
Биосинтез MGL в пробирках.
Биосинтез целевого белка после трансформации клеток E. coli
BL21(DE3) гибридными плазмидами проводили с помощью индукции T7
промотора слитого с lac оператором. Клетки растили в 5 мл LB до
OD600=0.5-0.8. После чего разделяли клетки на две порции по 2.5 мл. В одну
пробирку добавляли IPTG до концентрации 1mM. И растили в течение двух
часов. Клетки осаждали при 8 000 об/мин в течение 1 мин и тщательно
ресуспендировали в 0.4 мл 10 mM калий-фосфатном буфере (pH 8,0).
Разрушали ультразвуком с охлаждением. Лизат повторно центрифугировали
и анализировали супернатант с помощью электрофореза по Лемлли.
SDS-PAAGE по Леммли
Анализ белковых смесей проводили по стандартной методике Леммли
в 12.5% акриламидном разделяющем геле. [23] В работе использовались
белковые маркеры фирмы Fermentas. Гель окрашивали в Cumassi brilliant
blue 250.
Биосинтез MGL в большом объёме.
Белок MGL получали путём проведения аэробной периодической
ферментации полученного штамма в 3 л ферментере с использованием
среды, указанной в таблице 3.
Ферментацию проводили со стабилизацией рН раствором 12.5%
аммиака. Добавки глюкозы осуществляли в следующем порядке: №1 при
засеве, №2 при достижении OD = 10±3, №3 при достижении OD = 20±3.
Добавки лактозы: №1 при достижении OD = 28±3, №2 через 2 часа, №3 через
два часа. ИПТГ в концентрации 0.25 мМ добавляли вместе с добавкой
лактозы №1. Заканчивали ферментацию, когда полностью прекращается
16
рост OD или сильно падает потребление кислорода, но не позднее чем через
3 часа после последней добавки лактозы.
Таблица 3. Ферментационная среда для биосинтеза MGL для ферментации в объёме 3
литра.
Вещество
Навеска,
г
Объём SQ,
мл
Режим
автоклавирования
Среда
Триптон
17
Др. экстракт
8.5
NaCl
1.7
До 1.5
литров
Автоклавируется в
ферментёре
Добавки
КН2РО4
2.55
40
В индивидуальных
колбах, 0.8 атм, 40 мин
К2НРО4 * 3Н2О
1.02
30
(NH4)2SO4
5.1
40
MgSO4 * 7Н2О
0.425
7
Ампициллин
0.5
5
Разводится стерильной
водой
Глюкоза, моногидрат,
№1, №2 и №3
18.5
60
0.5 атм, 30 минут
Лактоза, моногидрат,
№1, №2 и №3
20
100
Аммиак, 12%
200
25% -ый, не стериллизуется,
разводится стерильной водой
Н2SO4, 10%
100
0.8 атм, 40 минут
17
Хроматография
Полученная биомасса осаждалась при 8000 об/мин в течение 15 мин.
Клетки тщательно суспендировались в 10 мМ калий-фосфатном буфере и
разрушались на French-press. Клеточный лизат осаждался при 8000 об/мин в
течение 15 мин. Полученный супернатант хранился при -700C. Очистка MGL
от суммарного белка проводилась с помощью хроматографа AKTA PRIME
plus.
MGL с присоединенным HisTag
Все буферные растворы содержали 0.05 mM PLP. Супернатант с добавлением
PLP (до концентрации 0.05 mM) и имидазола (до 30mM) наносили на колонку
Ni2+ NTA, уравновешенную 10 mM калий-фосфатным буфером (pH 8.0).
Колонку промывали этим же буфером, содержащим имидазол начальной
концентрации. Фермент элюировали в градиенте имидазола (30-250 mM)
тем же буфером, концентрировали и диализировали против 10 мМ калийфосфатного буфера (pH 8,0), используя «Centricon-30 ultrafiltration unit»,
(«Amicon», США). Полученные фракции анализировали методом SDS-PAAGE
по Лемлли.
MGL без HisTag
Все буферные растворы содержали 0,1 мМ пиридоксаль-5′-фосфат, 1
мМ ЭДТА и 5 мМ ДТТ. В супернатант добавляли 2%-ный (w/v) раствор
протаминсульфата до конечной концентрации 0,33%, выпавший осадок
отделяли центрифугированием (6400 g, 30 мин). Супернатант наносили на
колонку с ДЭАЭ-целлюлозой (3520 мм), уравновешенную 10 мМ калийфосфатным буфером (pH 8.0). Колонку промывали этим же буфером,
содержащим 0.1M KCl. Фермент элюировали буфером, содержащим 0.5M
KCl, концентрировали и диалировали против 10 мМ калий-фосфатного
буфера (pH 8.0), используя «Centricon-30 ultrafiltration unit», («Amicon», США).
Затем фермент очищали гель-фильтрацией на колонке с Sephacryl S-200 HR
(1.560 см), уравновешенной 10 мМ калий-фосфатным буфером, pH 8.0.
Полученные фракции анализировали методом SDS-PAAGE по Лемлли.
18
Определение кинетических и спектральных параметров фермента
Реактивация
Перед регистрацией спектров препараты ферментов инкубировали в
50mM калий-фосфатном буфере, pH 8.0, содержащем 0.5mМ дитиотретиол,
1мМ ЭДТА и 10mM PLP, при 250С в течение 12 часов. От избытка кофермента
освобождались диализом против 100 mM калий-фосфатного буфера pH 8.0,
содержащего 5 mМ дитиотретиол, 1мМ ЭДТА и 0.1 mM PLP.
Определение удельной активности
Активность препаратов в реакции гамма-элиминирования определяли
по скорости образования a-кетобутирата в сопряженной реакции с
D-2-гидроксиизокапроатдегидрогеназой (ГИК) по снижению поглощения
NADH при 340 нм (Δε=6220М-1см-1) при 300С. Реакционная смесь содержала
100 mM калий-фосфатный буфера pH 8.0, содержащий 5 mМ дитиотретиол,
1мМ ЭДТА и 0.1 mM PLP, 0.2 mM NADH, 10 ед ГИК и 2.5 mM L-метионина. За
единицу ферментативной активности принимали количество фермента,
катализирующее образование 1мкМ/мин a-кетобутирата. Концентрацию
очищенных препаратов фермента определяли по поглощению при 278 нм.
Коэффициент поглощения А1%, рассчитанный, исходя из определения
концентрации препаратов по методу Лоури [24], составил 0.8. Реакцию
инициировали добавлением 1-5 мкг фермента.
Кинетические параметры получали, обрабатывая данные согласно
уравнению Михаэлиса-Ментен в программе Enzfitter, варьируя
концентрацию субстрата. В расчетах использовали величину молекулярной
массы субъединицы фермента равную 43 кДа.
Определение спектральных характеристик
Спектры поглощения регистрировали на спектрофотометре Cary-50
(“Varian”, США).
19
Результаты и обсуждение.
Конструирование гибридных плазмид.
Были сконструированы плазмиды pET-28a::megL_tetani,
pET-28a::megL_sporogenes на основе плазмид pET-28a::megL_tetani_HT,
pET-28a::megL_sporogenes_HT. MGL в данных плазмидах также находится под
контролем lac-оперона и Т7-промотора, но продуцируется без HisTag ;
а)
б)
Рисунок 4.Схемы гибридных плазмид а) pET-28a::megL_tetani, б) pET-28a::megL_sporogenes.
Для создания данной конструкции был получен ампликон,
содержащий ген megL без HisTag, методом ПЦР. В качестве матрицы
использовали плазмиды pET-28a::megL_tetani_HT,
pET-28a::megL_sporogenes_HT. Температура отжига Tэ= 60С, время
элонгации t=80 секунд. В праймерах были предусмотрены сайты рестрикции
NcoI:
megL_tetani_dir - 5’-GCGGCAGCCCCATGGATATAAAAAAT-3’
megL_tetani_rev - 5’-CCGGATCTCAGTGGTGGTGGTG-3’
megL_sporogenes_dir - 5’-CGCGCGGCAGCCCCATGGAGAA-3’
megL_sporogenes_rev - 5’-CCGGATCTCAGTGGTGGTGGTG-3’
Плазмида pET-28a::megL_sporogenes_HT и ампликон megL_sporogenes
обрабатывались рестриктазами NcoI и EcoRI. Фрагменты ДНК разделяли в
20
агарозном геле, полосу размером ~1200 п.н. из продукта ПЦР и полосу ~6.5
т.п.н. элюировали из геля. Трансформированные лигазной смесью (методом
электропорации или кальциевым методом) клетки E.coli BL21(DE3) высевали
на агаризованную среду с добавлением канамицина.
Плазмида pET-28a::megL_tetani_HT и ампликон megL_tetani
обрабатывались рестриктазой NcoI. Фрагменты ДНК разделяли в агарозном
геле, полосу размером ~350 п.н. из продукта ПЦР и полосу ~6.5 т.п.н.
элюировали из геля и лигировали друг с другом. Трансформированные
лигазной смесью (методом электропорации или кальциевым методом)
клетки E.coli BL21(DE3) высевали на агаризованную среду с добавлением
канамицина. Отбирали колонии с правильно ориентированной вставкой с
помощью ПЦР по праймерам megL_tetani_dir и megL_tetani_rev.
Реакции рестрикции и лигирования проводили с использованием
ферментов фирмы “Promega” (США).
21
Сравнение аминокислотных последовательностей ферментов
Было проведено секвенирование генов MGL из C.sporogenes и C.tetani.
Последовательности выравнены по MGL из C.freundii [19]. В таблице 4
приведено сравнение аминокислот связывающихся с PLP. Найдена одна
незначащая замена.
Таблица 4. Аминокислоты, связывающиеся с кофактором.
№ аминокислоты
(по C. freundii)
C. freundii
C. tetani
C. sporogenes
49
F
F
F
57
I
I
I
58
Y
Y
Y
60
R
R
R
61
L
L
L
88
G
G
G
89
I
M
M
113
Y
Y
Y
115
C
C
C
185
D
D
D
207
S
S
S
209
T
T
T
210
K
K
K
338
V
V
V
340
L
L
L
22
Также было проведено сравнение аминокислотных оснований,
образующих водородные связи между субъединицами.
Таблица 5. Аминокислоты, образующие водородные связи между субъединицами.
Субъединица 1
№
Субъединица 2
C. freundii C. tetani C. sporogenes
№
C. freundii C. tetani C. sporogenes
33
Q
Q
Q
217
D
D
D
33
Q
Q
Q
250
N
D
L
34
T
T
T
216
G
G
G
35
S
S
S
216
G
G
G
36
T
T
T
339
S
S
S
36
T
T
T
342
D
D
D
39
F
F
F
336
L
L
L
42
A
A
A
329
N
D
N
58
Y
Y
Y
210
K
K
K
60
R
R
R
210
K
K
K
93
T
S
A
241
I
M
M
97
L
W
W
126
K
R
R
100
C
L
L
126
K
R
R
102
Q
A
S
126
K
R
R
Субъединица 1
Субъединица 3
8
G
G
G
384
D
D
D
9
F
F
F
381
D
N
D
10
N
G
A
381
D
N
D
11
T
T
T
381
D
N
D
11
T
T
T
381
D
N
D
11
T
T
T
384
D
D
D
253
L
L
L
256
R
R
R
256
R
R
R
217
D
D
D
256
R
R
R
217
D
D
D
256
R
R
R
213
N
N
N
256
R
R
R
253
L
L
L
259
K
K
K
344
E
E
E
Субъединица 1
Субъединица 4
25
G
G
G
38
V
I
I
27
L
L
L
36
T
T
T
21
D
D
D
31
I
I
I
В таблице цветом выделены замены. Зеленым – несущественные,
красным – замены, изменяющие силу водородной связи. Заметим, что
существенные изменены только водородные связи, образующие
каталитический димер.
23
Рассмотрим каждую из четырех замен подробно.
33-250: водородная связь в C. freundii образуется
электроотрицательным атомом N остатка глютамина и атомом O остатка
аспарагина. В C. tetani аспарагин заменен аспарагиновой кислотой, что не
влияет на образование связи. В C. sporogenes аспарагин заменен лейцином,
не имеющего в радикальной группе электроотрицательного атома.
Предположительно, водородная связь не образуется.
93-241: водородная связь в C. freundii образуется
электроотрицательным атомом O остатка треонина и атомом О главной
полипептидной цепи. В C. tetani треонин заменен серином, что не влияет на
образование связи. В C. sporogenes треонин заменен аланином, не
имеющего в радикальной группе электроотрицательного атома.
Предположительно, водородная связь не образуется.
97-126: водородная связь в C. freundii образуется
электроотрицательным атомом O главной полипептидной цепи и атомом N
остатка лизина. И в C. tetani, и в C. sporogenes лизин заменен аргинином,
имеющим 3 атома азота в радикальной группе. Водородная связь
образуется, но она может быть как слабее, так и сильнее.
100-126: аналогичная с предыдущим случаем ситуация.
Каталитический димер MGL из C. sporogenes связывается слабее, чем
MGL из C. tetani, C. freundii, что может влиять на четвертичную структуру, и,
как следствие, на активность фермента. Вероятно, найденные замены
объясняют различие в кинетических параметрах.
24
С помощью пакета PyMol были смоделированы структуры MGL из
C.tetani и C.sporogenes по известной структуре MGL C.freundii.
Рисунок 5. Смоделированные и
наложенные структуры MGL из
различных бактерий.
Синим цветом обозначен MGL из
C.freundii
Желтым – C.sporogenes
Красным – C.tetani
Полученные структуры обладают практически полной гомологией.
Имеется два структурных различия.
Спираль α2 (42-49 аминокислотное основание) у C. tetani и
C. sporogenes обладает положительным зарядом в отличие от незаряженной
у C.freundii. Данный элемент играет важную роль в стабилизации
каталитического димера и связывается с α13. Наличие положительного
заряда α2 позволяет образовывать сильные ионные связи с отрицательно
заряженной спиралью α13.
N-концевая спираль α15 положительно заряжена у C.freundii, C. tetani и
C. sporogenes. Но абсолютное значение разное, что влияет на относительное
расположение спирали.
Для более подробного анализа фермента требуется получиться
кристаллографическую структуру.
25
Биосинтез MGL из С.freundii
Гибридная плазмида pET-28a+MGL_freundii была трансформирована в
штамм E.coli BL21(DE3). Была проведена индукция лактозного оператора.
Индукцию анализировали, как описано выше. Результаты приведены на
рисунке.
Рисунок 6. SDS-PAAGE индукции
MGL из C.freundii
На дорожках нанесены:
1 – маркер
2 – контроль
3 – индукция №1
4 – индукция №2
5 – индукция №3
Стрелкой указана полоса,
соответствующая MGL
Наиболее эффективный продуцент был выбран для проведения
ферментации. Было получено ~36 грамм клеток с 0.5 литра питательной
среды. Было выделено 450мг фермента.
Удельная активность фермента 10.2 у.е. Кинетические параметры:
kcat=6.2 c-1, Km=0.7 мМ.
Рисунок 7. Спектр поглощения холофермента из C. freundii
26
Биосинтез MGL из С. tetani с присоединенным HisTag
Гибридная плазмида pET-28a+MGL_tetani_HT была трансформирована
в штамм E.coli BL21(DE3). Была проведена индукция лактозного оператора.
Индукцию анализировали, как описано выше. Результаты приведены на
рисунке.
Рисунок 8. SDS-PAAGE индукции
MGL из C.tetani
На дорожках нанесены:
1 – маркер
2 – индукция №1
3 – контроль
4 – индукция №2
5 – контроль
6 – индукция №3
Стрелкой указана полоса,
соответствующая MGL
Наиболее эффективный продуцент был выбран для проведения
периодической ферментации. Было получено ~95 грамм клеток с 1.5 литра
питательной среды.
Удельная активность фермента 5.8 у.е. Кинетические параметры:
kcat=4.3 c-1, Km=0.87 мМ.
Рисунок 9. Спектр поглощения холофермента из C. tetani
27
Биосинтез MGL из С.sporogenes с присоединенным HisTag
Гибридная плазмида pET-28a+MGL_sporogenes_HT была
трансформирована в штамм E.coli BL21(DE3). Была проведена индукция
лактозного оператора. Индукцию анализировали, как описано выше.
Результаты приведены на рисунке.
Рисунок 10. SDS-PAAGE индукции
MGL из C.sporogenes
На дорожках нанесены:
1 – контроль
2 – индукция №1
3 – контроль
4 – индукция №2
5 – контроль
6 – индукция №3
Стрелкой указана полоса,
соответствующая MGL
Ферментация не была проведена.
Удельная активность фермента 12.8 у.е. Кинетические параметры:
kcat=9.9 c-1, Km=0.43 мМ.
Рисунок 11. Спектр поглощения холофермента из C. sporogenes
28
Выводы
Сконструированы продуценты фермента метионин-γ-лиазы
микроорганизмов C. tetani и C. sporogenes в E. coli без HisTag для
дальнейшего изучения и получения кристалла.
Разработана технология биосинтеза и очистки метионин-γ-лиаз из
С. freundii, C.tetani в штамме E. сoli. Продуктивность MGL из C. tetani в штамме
E. coli – 0.5 г/л с удельной активностью ~6 единиц. Продуктивность MGL из
C. freundii в штамме E. coli – 0.9 г/л с удельной активностью ~10 единиц.
Проведено сравнение кинетических параметров трех ферментов из
С. freundii, C. tetani и C. sporogenes. Наиболее высокая удельная активность
MGL из C. sporogenes, 12.8 у.е., kcat=9.9 c-1, Km=0.43 мМ.
Проведён анализ аминокислотных последовательностей MGL из
С. freundii, C. tetani и C. sporogenes. Показано, что аминокислоты,
связывающиеся с кофактором фермента, консервативны. Показано, что
каталитический димер MGL C. sporogenes менее стабилен, чем
каталитические димеры MGL C. tetani и C. freundii.
Смоделированы 3D структуры ферментов C. tetani и C. sporogenes по
гомологии с С. freundii. Предполагается наличие сильных ионных связей,
стабилизирующих каталитический димер MGL из C. tetani и C. sporogenes.
29
Список литературы.
1. J. Mecham, D. Rowitch et al. «The metabolic defect of methionine dependence occurs
frequently in human tumor cell lines.» Biochemical and Biophysical Research Communications
117(2) (1983): 429-434.
2. H. Guo, V. Lishko et al. «Therapeutic Tumor-specific Cell Cycle Block Induced by Methionine
Starvation.» Cancer research 53 (1993): 5676-5679.
3. M.Tisdale. «Utilization of performed and endogenously synthesized methionine by cells in tissue
culture.» Br. J. Cancer 49 (1984): 315-320.
4. B. Halpern, B. Clark et al. «The Effect of Replacement of Methionine by Homocystine on Survival
of Malignant and Normal Adult Mammalian Cells in Culture.» Proc. Nat. Acad. Sci. USA 71 (4)
(1974): 1133-1136.
5. H. Hori, K. Takabayashi et al. «Gene Cloning and Characterization of Pseudomonas putida LMethionine-a-deamino-y-mercaptomethane-lyase.» Cancer Research 56 (1996): 2116-2122.
6. М. Tisdale, S. Eridani. «Methionine requirement of normal and leukaemic haemopoietic cells in
short term cultures.» Leukemia Resear 5 (1981): 385-394.
7. F. Breillout, F. Hadida et al. «Decreased rat rhabdomyosarcoma pulmonary metastases in
response to a low methionine diet.» Anticancer Research 7(4B) (1987): 861-867.
8. V. Lishko, O. Lishko and R. Hoffman. «Depletion of serum methionine by methioninase in mice.»
Anticancer Research 13(5A) (1993): 1465-1468.
9. N. Goseki, M. Endo. «Thiol deplition and chemosensitization on nimustine hydrochloride by
methionine-depliting total parential nutrition.» Tohoku J Exp Med 161 (1990): 227-239.
10. T. Hoshiya, T. Kubota et al. «Methionine-deplition modulates the efficacy of 5-fluorouracil on
human gastric cancer in nude mice.» Anticancer Research 17 (1997): 4371-4376.
11. N. Goseki, S. Yamazaki et al. «Synergistic effect of methionine-depliting total parential nutrition
with 5-fluorouracil on human gastric cancer: a randomized, prospective clinical trial.» Jpn J
Cancer Res 86 (1995): 484-489.
12. de Gramont, A. Figer et al. «Leucovorin and Fluorouracil With or Without Oxaliplatin as First-Line
Treatment in Advanced Colorectal Cancer.» Journal of Clinical Oncology 18(16) (2000): 29382947.
13. R. Goldberg, «Advances in the treatment of colorectal cancer.» Oncologist 10 (2005): 40-48.
14. X. Durando, M. Farges et al. «Dietary methionine restriction with FOLFOX regiment as first line
therapy of metastatic colorectal canser: a seasibility study.» Oncology 78 (2010): 205-209.
15. H. Tanaka, N. Esaki and K. Soda. «A versatile bacterial enzyme: L-methionine-y-lyase.» Enzyme
Microb. Technol. 7 (1985): 530-537.
16. Hession, W. Kreis. «Isolation and Purification of L-Methionine-a-deamino-y-mercaptomethaneLyase (L-Methioninase) from Cbs tridium sporo genes.» Cancer research 33 (1973): 1862-1865.
30
17. McKie, T. Edlind et al. «The Primitive Protozoon Trichomonas vaginalis Contains Two Methionine
g -Lyase Genes That Encode Members of the g -Family of Pyridoxal 5'-Phosphate-dependent
Enzymes.» The journal of biological chemestry 273(10) (1998): 5549–5556.
18. I.Manukhov, D. Mamaeva et al. «A gen encoding L-methionine-y-Lyase is present in
Enterobacteriaceae family genomes: Identification and characterization of Citrobacter freundii
L-methionine-y-Lyase.» Journal of bacteriology 187(11) (2005): 3889-3893.
19. Nikulin, S. Revtovich et al. «High-resolution structure of methionine-y-lyase from Citrobacter
Freundii.» Acta Cryst. D64 (2008): 211-218.
20. T. Yoshida, T. Wada et al. «Anticancer efficacy in vivo and in vitro, synergism with 5-fluorouracil,
and safety of recombinant methioninase.» Cancer Research 58 (1998): 2583-2587.
21. Machover, J. Zittoun et al. «Cytotosic synergism of methioninase in combinant with 5fluorouracil and folnic acid.» Biochem Pharmacology 61 (2001): 867-876.
22. С. Ревтович, Е. Морозова и др. «Идентификация Метионин-y-Лиазы в геномах некоторых
патогенных бактерий.» ДАН 445(2) (2012): 214-220.
23. U.Laemmli. «Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage
T4.» Nature 227 (1970): 680-685.
24. O. Lowry, N. Rosebrough et al. «Protein measurment with the folin phenol reagent.» J. Biol.
Chem. 193 (1951): 265-275.
31
Хотелось бы выразить благодарность за помощь в осуществлении данной
работы сотрудникам лаборатории генетики бактерий ФГУП ГОСНИИ
«ГЕНЕТИКА» и сотрудникам лаборатории химических основ биокатализа
ИМБ РАН.
32