Пробоподготовка. Методы выделения ДНК/РНК.

Пробоподготовка. Методы выделения
ДНК/РНК.
Кулмамабетова Г
Современные проблемы биологии,
ЕНУ, Астана, 2012
ДНК может быть выделена из любого образца
содержащего клетки
 Кровь
 Сигаретный
 Сперма
окурок
 Слюна
 Конверт и
 Моча
почтовые марки
 Волос
 Ноготь
 Зубы
 Жвачка
 Кость
 Фекалии
 Ткань
 Букальные
клетки
Современные проблемы биологии,
ЕНУ, Астана, 2012
Этап пробоподготовки:
Должны выполнятся общие требования предписанные для
взятия биологического материала и его транспортировки.
Соблюдение температурного режима.
Нужно помнить :
 Цельная кровь должна быть охлаждена, но не должна быть
заморожена.
 Если ДНК из образцов ткани не может быть экстрагирована
в ближайшие 48 часов, биологический образец должен быть
заморожен до температуры от - 20°С до - 80°С, либо криозаморозка.
 Повторение циклов замораживания-оттаивания
не рекомендуется из-за возможности разрушения ДНК.
 Исключить вероятность контаминации собранного
биологического материала.
 Пробирки с антикоагулянтами, такими как
ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота),
необходимо перемешать, чтобы не допустить
Современные проблемы биологии,
свертывания образца. НЕ
!!!
ЕНУ, ВСТРАХИВАТЬ
Астана, 2012
Необходимое оборудование
1. Микроцентрифуга (скорость вращения - не менее 9000
g).
2. Холодильник/морозильник ( + 2 — 8°С/ -20°С).
3. Термостат.
4. Ламинарный шкаф или ПЦР-бокс.
6. Вортекс (прибор для встряхивания и перемешивания) .
7. Дозаторы с меняющимся объемом: 0,5-10 мкл, 5-40 мкл,
40-200 мкл,
200-1000 мклг 1000-5000 мкл и наконечники к ним.
8. Пластиковые пробирки с крышками объемом 1,5 мл
типа Эппендорф
9. Штативы для пробирок и микропробирок.
10. Емкости для отходов.
11. Камера для горизонтального электрофореза.
12. УФ-трансиллюминатор
Современные проблемы биологии,
ЕНУ, Астана, 2012
Методы
выделения ДНК
Метод экстракции
на бумажных
фильтрах
Метод экстракции
с помощью
органических
растворителей
Ионообменная смола
(Chelex)
Метод экстракции
с помощью силики
(диоксид кремния)
Метод экстракции с
помощью гельфильтрации
Метод экстракции с
помощью магнитных
частиц
Метод экстракции на
микроцентрифужных
колонках
 Выбор методики выделения ДНК зависит от
поставленной задачи, время анализа и степени
очистки.
Современные проблемы биологии,
ЕНУ, Астана, 2012
Современные проблемы биологии,
ЕНУ, Астана, 2012
Основные этапы методов выделения ДНК
 лизис клеток,
 лизис ядра,
 удаления из полученного материала
ингибиторов, инактивация клеточных нуклеаз,
 отделение искомых нуклеиновых кислот от
клеточной массы,
 очистка и концентрирование ДНК
Современные проблемы биологии,
ЕНУ, Астана, 2012
Обычная процедура лизиса включает:
 механическое разрушение ( например, измельчение
с помощью пестика, применение
ультразвука, гипотонический лизис),
 химичиская обработка (например, лизис с помощью
детергентов, хаотропных агентов, или тиоловое
восстановление),
 ферментативное расщепление белков (например, с
помощью протеиназы К).
Современные проблемы биологии,
ЕНУ, Астана, 2012
Обычная процедура лизиса включает:
 химичиская обработка (например, лизис с помощью
детергентов, хаотропных агентов, или тиоловое
восстановление),
Что такое хаотропный агент – вещество, способствующее
нарушению трехмерной структуры макромолекул (ДНК, РНК,
белки) и их денатурации.
Примеры, хаотропных агентов:
Мочевина 6 - 8 моль / л,
Тиомочевина 2 моль / л,
Гуанидинхлорид 6 моль / л,
Гуанидинтиоционат 6 моль / л,
Перхлорат лития 4,5 моль / л.
Современные проблемы биологии,
ЕНУ, Астана, 2012
Получение клеточного экстракта
Химические методы

Обработка клеточной стенки: лизоцим, ЭДТА
(связывает ионы магния)

Обработка клеточной мембраны детергентом
(SDS) (удаляет липидные молекулы)
Современные проблемы биологии,
ЕНУ, Астана, 2012
После лизиса клеток и инактивации нуклеаз
клеточная масса может быть легко удалена с
помощью фильтрации или осаждения
Центрифугирование удаляет обломки клеточной стенки
Современные проблемы биологии,
ЕНУ, Астана, 2012
Очистка ДНК от белков и РНК


Органическая экстракция
Фенол или фенол/хлороформ (1:1)
Осаждение белков; образование белой
разграничительной пленки между фазой
органического растворителя и водной фазой
Нужно помнить: фенол и хлороформ – токсические
вещества, канцерогены.
Современные проблемы биологии,
ЕНУ, Астана, 2012
Спиртовое осаждение ДНК
 96-100 % этанол,
 изопропанол,
 очистка 70 % этанолом,
 ресуспендирование
в ТЕ-буфере



Осаждение ДНК из раствора возможно с помощью
этанола;
Центрифугирование преципитата;
Удаление супернатанта.
Современные проблемы биологии,
ЕНУ, Астана, 2012
Преимущества
растворителями:
метода
экстракции
органическими
-получение ДНК хорошего качества и высокой концентрации;
- подходит для разных объектов;
- хорошо работает со старым, разложившимся материалом,
костями;
- выделенная
ДНК очень стабильна и хорошо хранится в
замороженном состоянии.
Недостатки метода:
- высокая токсичность;
- занимает много времени:
- не всегда удаляет ингибиторы;
- возможна контаминация (большая смена наконечников и
пробирок);
- трудно автоматизировать.
Современные проблемы биологии,
ЕНУ, Астана, 2012
Экстракция с помощью силики
К клеточному экстракту добавляется
гуанидинтиоцианат.

Денатурируются все компоненты, за
исключением ДНК.

Связывание ДНК с частицами силикой.
Силика может вноситься прямо в образец; или
образец пропускают через колонку с силикой

Отмывка от клеточных компонентов.

ДНК элюируется в раствор.

Современные проблемы биологии,
ЕНУ, Астана, 2012
Преимущества метода экстракции с помощью
силики:
- быстрота выполнения,
- прост в исполнении;
- экономичный,
- исключает наличие ингибиторов;
- можно автоматизировать.
Недостатки метода:
- сложно выделять ДНК из объектов с малым
количеством биологического материала.
Современные проблемы биологии,
ЕНУ, Астана, 2012
Экстракция с помощью ионообменной смолы
Chelex 100
Chelex® 100:
 хелотобразующая смола, которая
имеет высокую аффинность к
поливалентным ионам металлов.
 Связывание c ионами металла
(магния).
 Удаление ионов магния из раствора
препятствует действию нуклеаз.
 Предотвращение деградации ДНК
1. Поместить
образец в
пробирку
2. Добавить
Chelex 5%
(вес/объем) .
Инкубация 56 С,
30 мин
3. Кипячение (
100 С)
4.Центрифугиро
вание.
Современные проблемы биологии,
ЕНУ, Астана, 2012
Супернатант
Преимущества данного метода:
-безопасность, простота и быстрота;
-возможность автоматизация процесса;
-дешевизна;
-смена 1 пробирки (используется минимум расходных
материалов); исключена контаминация;
- удаляет ПЦР-ингибиторы,
- можно использовать для всех типов объектов, кроме кости;
- пригодность для любой лаборатории.
Недостатки метода:
- получается очень грубая, неочищенная ДНК;
-непостоянство степени эффективности экстракции (т.е.
количество и качество ДНК варьирует от образца к образцу);
-высокая вероятность ингибирования самими смолами,
-потенциальная нестабильность ДНК и ее деградация со
временем;
- полученная ДНК одноцепочечная, нельзя использовать для
ПДРФ-анализа
Современные проблемы биологии,
ЕНУ, Астана, 2012
FTA™ - бумажные фильтры
В основе
целлюлозный фильтр (Ватман BFC180), пропитан
смесью сильных буферов, которые лизируют образцы и
связывают нуклеиновые кислоты, а белки денатурируются.
Нуклеиновые кислоты защищаются от действия нуклеаз и
ультрафиолета.Современные
Уничтожается
ДНК-аза, разрушающая
проблемыфермент
биологии,
ЕНУ, Астана, 2012
ДНК.
Преимущества данного метода:
-безопасное обращение с образцами (карта инактивирует
микробы, включая переносимые кровью патогены);
- быстрое выделение высококачественного образца ДНК;
-длительное хранение образцов при комнатной температуре
(карта препятствует росту бактерий и других
микроорганизмов);
-пригодность для большинства образцов жидкого вида (кровь,
слюна, сперма, свежий костный мозг);
-Возможность автоматизации (ДНК можно амплифицировать
непосредственно с бумажного перфората).
Недостатки метода:
-повышенная стоимость по сравнению с ручными методами;
-пригодность только для образца жидкого типа;
-количество ДНК, имеющееся на перфорате, невозможно
подвергнуть количественному анализу или скорректировать;
-может потребоваться изменение протокола амплификации с
целью введения поправки на объем ДНК на бумажном
перфорате.
Современные проблемы биологии,
ЕНУ, Астана, 2012
Метод экстракции с помощью магнитных
частиц
 к исследуемым
образцам добавляют
лизирующий раствор и
магнитные шарики;
 выделенная ДНК
связывается с
магнитными шариками;
 вымывание клеточных
элементов в процессе
отмывания;
 элюирование ДНК с
помощью низкосолевого
буфера.
Современные проблемы биологии,
ЕНУ, Астана, 2012
Преимущество метода:
- бόльшая емкость сорбента, позволяющая выделять
бόльшие количества РНК/ДНК
- минимизация потерь в ходе выделения (нет
необходимости разделения фаз как при "классическом"
способе выделения, не требуется осаждение
материала)
- уменьшение риска перекрестной контаминации за
счет того, что весь (или почти весь) нуклеиновый
материал связывается сорбентом
- возможность масштабирования методики выделения
-высокая чистота конечного продукта
Недостатки метода:
-дорогой.
Современные проблемы биологии,
ЕНУ, Астана, 2012
Выделение
бактериального
ДНК
Принцип
выделения
бактериальной
ДНК
Современные проблемы биологии,
ЕНУ, Астана, 2012
РНК
! Нужно помнить:
 РНК нестабильна,
 РНК-азы
Основными источниками РНаз являются руки, бактерии и грибы ,
которые могут распространяться с пылью.
 При работе с РНК должен быть отдельный бокс.
Правила соблюдения при работе с РНК !
 работа в перчатках,
 пробирки, наконечники, вода свободная от РНК-аз,
 предварительная обработка материалов нагреванием ( 180 С)
 обработка поверхностей (DEPC-водой, щелочью, перекисью
водорода)
Современные проблемы биологии,
ЕНУ, Астана, 2012
Автоматический диспенсер "Biomek 3000"
 Станция Biomek 3000 полностью
автоматизирована, обладает устройством для
переноса микропланшетов и пипетирования
образцов.
 Может работать с 96- и 384-луночными
микропланшетами, стрипами, микропробирками.
 Использует широко распространенные
стандартные и специальные наборы реагентов
известных производителей и стандартные
наконечники.
 Предусмотрены позиции термостатирования,
промывки планшетов и наконечников пипеток,
позиции резервуаров реагентов, встряхиватели,
позиций фильтрации, хранения отходов и
использованных наконечников.
 Станция Biomek 3000 применяется для
выделения и очистки геномной и плазмидной ДНК,
РНК, белков, сборки реакций секвенирования и
ПЦР, для очистки продуктов реакций
секвенирования и ПЦР, в областях генетического,
иммунологического, химического и биохимического
Современные проблемы
биологии,
анализа.
ЕНУ, Астана, 2012
Количественный и качественный анализ
ДНК/ РНК
Качественный:
 электрофорез - процесс при которой молекулы разделяются
на основе их подвижности в геле под действием электрического
поля.
Флуоресцентные
красители:
 этидиум бромид,
 Sybr Green
Современные проблемы биологии,
ЕНУ, Астана, 2012
Детекция ДНК в агарозном геле
Детекция ДНК
Электрофорез в агарозном геле
Современные проблемы биологии,
ЕНУ, Астана, 2012
Scanning Electron Micrograph
of Agarose Gel
Визуализация ДНК под действием
УФ-лучей
1
2
3
4
2.0
0.6
Современные проблемы биологии,
ЕНУ, Астана, 2012
КRКоличественный и качественный анализ ДНК
•Концентрацию нуклеиновых кислот в растворе можно рассчитать, измерив
его оптическую плотность при 260 нм.
•Одна единица оптической плотности примерно соответствует
концентрации двухцепочечной ДНК 50 мкг/мл и концентрации
одноцепочечной ДНК и РНК 40 мкг/мл.
•По оптической плотности растворов при 260 нм не возможно судить о
наличии одно — или двухцепочечных форм нуклеиновых кислот, а также о
белковых загрязнениях.
•Для оценки степени очистки образцов ДНК от белковых примесей можно
использовать отношение между оптической плотностью при 260 и 280 нм.
Для чистых препаратов ДНК и РНК оно должно быть равно соответственно
1,8 и 2. Если это отношение меньше, значит, препараты загрязнены
белками или фенолом, и оценка концентрации будет неверна. В этом
случае необходимо повторить обработку протеиназой К и экстракцию
фенолом/хлороформом.
Современные проблемы биологии,
ЕНУ, Астана, 2012
Современные проблемы биологии,
ЕНУ, Астана, 2012
Обработка помещений и посуды
В комнатах, в которых проводят работу с выделенными
нуклеиновыми кислотами, рабочие поверхности, штативы,
оборудование следует обеззараживать ежедневно ультрафиолетовым
излучением в течение 1 часа до начала работы и после нее, полы
подвергают ежедневной влажной уборке дезинфицирующими
средствами. Перед началом работы поверхность столов
дополнительно обрабатывают 70% этиловым спиртом.
Современные проблемы биологии,
ЕНУ, Астана, 2012
Эти занятия проводятся
для вас
ПОЖАЛУЙСТА, ЗАДАВАЙТЕ
ВОПРОСЫ!
Современные проблемы биологии,
ЕНУ, Астана, 2012