Аминокислоты, пептиды, белки

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РФ
ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ
ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ
ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ
«НИЖЕГОРОДСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ТЕХНИЧЕСКИЙ
УНИВЕРСИТЕТ имени Р.Е. Алексеева»
Кафедра «Биотехнология, физическая и аналитическая химия»
АМИНОКИСЛОТЫ, ПЕПТИДЫ, БЕЛКИ
Методические указания к практическим занятиям
по дисциплине «Основы биохимии и молекулярной биологии»
для студентов,
обучающихся по направлению
«Биотехнология»
дневной формы обучения
Нижний Новгород
3
Составители: Т.Н. Соколова, Д.В. Белов, В.Р. Карташов
УДК 577.1
Аминокислоты, пептиды, белки: метод. указания к практическим занятиям по дисциплине «Основы биохимии молекулярной биологии» для студентов, обучающихся по направлению «Биотехнология» дневной формы
обучения/ НГТУ; сост.: Т.Н. Соколова и др., Н. Новгород, 2013. 24 с.
Методические указания предназначены для проведения практических
занятий по курсу биохимии. Представлены задачи по протолитическим равновесиям в водных растворах полипептидов, определению изоэлектрической
точки, химическим свойствам аминокислот и пептидов. Методические указания предназначены для самостоятельной и аудиторной работы студентов.
Редактор Э.Б. Абросимова
Подписано в печать
Печать офсетная. Усл. п. л.
. Формат 60801/16. Бумага газетная.
. Уч.-изд. л. . Тираж 80 экз. Заказ
.
Нижегородский государственный технический университет им. Р.Е. Алексеева.
Типография НГТУ. 603950, г. Нижний Новгород, ул. Минина, 24.
 Нижегородский государственный технический
университет им. Р.Е. Алексеева, 2013
4
ЗАДАЧИ
1. Написать реакции протолитических превращений аминокислот. Рассчитать изоэлектрическую точку аминокислоты. Определить, к какому полюсу при
электрофорезе на бумаге будет перемещаться аминокислота при рН=6 (использовать данные табл.1 приложения):
1.1. Асп, Ала, Лиз.
1.2. Глу, Арг, Асн.
1.3. Вал, Глу, Гис.
1.4. Гли, Лиз, Асп.
1.5. Иле, Цис, Арг.
1.6. Тир, Асп, Лей.
1.7. Фен, Асп, Лиз.
1.8. Три, Лиз, Глу.
1.9. Гли, Тир, Асп.
1.10. Ала, Гис, Глу.
2. Написать химическую формулу пептида, проанализировать изменение заряда пептида при постепенном увеличении рН от 1,5 до 13 (использовать данные
табл.1 приложения).
2.1. Ала-Тир-Цис-Тре-Лиз-Лиз-Гли-Про-Глу-Асн.
2.2. Арг-Асн-Сер-Цис-Сер-Глу-Гис-Лиз-Вал-Про.
2.3. Тре-Лиз-Глу-Арг-Глу-Асн-Асп-Асп-Мет-Лей.
2.4. Вал-Гис-Асп-Мет-Лей-Три-Арг-Глу-Асн-Асп.
2.5. Гли-Гис-Фен-Лиз-Гис-Арг-Про-Вал-Асп-Глу.
2.6. Про-Лиз-Асн-Вал-Сер-Асп-Тре-Лиз-Лиз-Гли.
2.7. Мет-Арг-Глу-Ала-Гли-Тир-Фен-Три-Мет-Арг.
2.8. Сер-Тир-Асп-Вал-Сер-Асп-Тре-Лиз-Лиз-Гли.
2.9. Иле-Арг-Глу-Глн-Глу-Лиз-Гис-Арг-Про-Вал.
2.10.Тир-Гис-Лиз-Тре-Три-Ала-Гис-Арг-Лиз-Гис.
2.11. Тир-Фен-Три-Мет-Арг-Глу-Тир-Тре-Три-Глн.
2.12. Тре-Тре-Цис-Цис-Ала-Асп-Глу-Глу-Лиз-Вал.
2.13. Глу-Цис-Про-Глу-Асн-Лиз-Глу-Глн-Асн-Асн.
2.14. Мет-Цис-Сер-Асп-Гис-Иле-Тир-Глу-Глу-Глн.
2.15. Арг-Асн-Асп-Глу-Лиз-Лиз-Тир-Гли-Вал-Три.
2.16. Лиз-Сер-Лиз-Асп-Глу-Цис-Гис-Гис-Арг-Сер.
2.17. Гли-Лиз-Арг-Арг-Гис-Гис-Лиз-Глу-Лиз-Арг.
2.18. Лей-Тир-Фен-Три-Мет-Арг-Лиз-Лиз-Лиз-Глу.
2.19. Глн-Асн-Асн-Гис-Гис-Арг-Лиз-Лиз-Вал-Арг.
2.20. Гис-Гис-Лиз-Глу-Лиз-Арг-Тир-Тре-Сер-Глу.
2.21. Гис-Вал-Гли-Лиз-Асп-Глу-Арг-Асн-Глу-Про.
2.22. Мет-Три-Ала-Гис-Лиз-Гис-Асн-Асн-Гли-Лей.
2.23. Арг-Глу-Асн-Тре-Лиз-Гис-Гис-Три-Про-Иле.
2.24. Три-Мет-Арг-Глу-Сер-Глу-Гис-Лиз-Вал-Цис.
2.25. Асн-Лиз-Глу-Тир-Фен-Три-Цис-Про-Глу-Глн.
3
3. Отобразить ионное состояние пептида в сильнокислой среде, определить
заряд. Как изменится заряд пептида при переходе в сильноосновную среду?
Oтобразить ионное состояние пептида при рН >> 7:
3.1. Вал-Сер-Асп-Тре-Лиз-Лиз-Гли-Про-Глу-Асн-Асн.
3.2. Арг-Фен-Гис-Лиз-Арг-Асп-Глн-Глу-Глу-Тир-Иле.
3.3. Мет-Лей-Три-Арг-Глу-Асн-Асп-Асп-Про-Гис-Тир.
3.4. Цис-Сер-Глу-Гис-Лиз-Вал-Про-Глн-Асн-Сер-Мет.
3.5. Гли-Тир-Тре-Три-Глн-Глу-Лиз-Гис-Арг-Про-Вал.
3.6. Иле-Асп-Глу-Асп-Асп-Про-Глн-Асн-Тре-Лиз-Лиз.
3.7. Про-Фен-Сер-Арг-Глу-Асн-Асп-Асп-Мет-Лей-Три.
3.8. Тре-Три-Ала-Гис-Арг-Лиз-Гис-Асн-Асп-Асп-Глу.
3.9. Сер-Арг-Глу-Асн-Тре-Лиз-Лиз-Гли-Про-Мет-Лей.
3.10. Глн-Глу-Лиз-Гис-Арг-Про-Вал-Асп-Глу-Асп-Асп.
3.11. Ала-Гли-Тир-Фен-Три-Мет-Арг-Глу-Асн-Асп-Гис.
3.12. Лиз-Лиз-Гли-Про-Глу-Асн-Тир-Тре-Три-Глн-Глу.
3.13. Глн-Асн-Сер-Мет-Три-Ала-Гис-Лиз-Гис-Арг-Про.
3.14. Асп-Арг-Цис-Лей-Иле-Сер-Глу-Гис-Лиз-Вал-Гли.
3.15. Три-Гис-Вал-Гли-Лиз-Асп-Глу-Арг-Асн-Глу-Глн.
3.16. Лей-Тир-Фен-Три-Мет-Арг-Глу-Асн-Асп-Лиз-Лиз.
3.17. Асн-Сер-Арг-Глу-Асн-Лиз-Гли-Про- Арг-Глу-Асп.
3.18. Глу-Глн-Асн-Асн-Гис-Гис-Арг-Лиз-Лиз-Вал-Арг.
3.19. Глн-Глу-Глу-Глу-Глу-Цис-Сер-Фен-Лиз-Асп-Асп.
3.20. Лиз-Гли-Лиз-Арг-Арг-Гис-Гис-Лиз-Глу-Лиз-Арг.
3.21. Гли-Лиз-Асп-Глу-Арг-Гли-Лиз-Арг-Арг-Гис-Ала.
3.22. Асн-Асн-Гис-Глу-Глу-Цис-Про-Глу-Асн-Лиз-Гис.
3.23. Сер-Арг-Глу-Глу-Асп-Асп-Про-Глн-Асн-Лиз-Вал.
3.24. Лиз-Вал-Гис-Гис-Арг-Лиз-Глу-Асн-Тре-Тре-Цис.
3.25. Ала-Гли-Тир-Цис-Ала-Асп-Глу-Глу-Асп-Глу-Глу.
4. Определить и схематично отобразить все типы межмолекулярных взаимодействий между указанными фрагментами пептидов в сильнокислой среде:
4.1.
Cер
Асп
4
Лиз
4.2.
Гли
Иле
Вал
4.3.
Лиз
Арг
Асн
4.4.
Глн
Арг
Асн
4.5.
Глн
Сер
Сер
4.6.
Глн
Гис
Лиз
5
4.7.
Глу
Тир
Гис
4.8.
Ала
Вал
Гли
4.9.
Тре
Тир
Сер
4.10.
Глу
Глу
Глн
5. Определить и схематично отобразить все типы межмолекулярных взаимодействий между указанными фрагментами пептидов в сильноосновной среде:
5.1.
Глу
Асп
6
Глу
5.2.
Глн
Глу
Гис
5.3.
Тир
Глу
Асп
5.4.
Гис
Сер
Лиз
5.5.
Асп
Асн
Асп
5.6.
Цис
Цис
Вал
7
5.7.
Тир
Тре
Глу
5.8.
Цис
Цис
Глу
5.9.
Цис
Мет
Сер
5.10.
Ала
Фен
Фен
6. Определить и схематично отобразить все типы межмолекулярных взаимодействий между указанными фрагментами пептидов в нейтральной среде:
6.1.
Лиз
Асп
8
Вал
6.2.
Арг
Глу
Асн
6.3.
Иле
Ала
Фен
6.4.
Сер
Тре
Арг
6.5.
Глу
Тре
Глу
6.6.
Лиз
Глу
Асн
9
7. Указать направление перемещения (к катоду, аноду, старт) пептидов в
процессе электрофореза на бумаге при рН = 1,6; 6,5; 11.
7.1. Арг-Гли-Ала-Ала.
7.2. Лиз-Ала-Гли-Асп.
7.3. Гис-Гли-Ала-Глу.
7.4. Асп-Гли-Ала-Глу.
7.5. Глн-Гли-Ала-Арг.
8. Методом электрофореза на бумаге в сыворотке крови человека было обнаружено 5 белковых компонентов: сывороточный альбумин, 1, 2,  и глобулины. Изоэлектрическая точка сывороточного альбумина равна 5,2, глобулина – 7,3. У трех остальных компонентов положение изоточек промежуточное. Электрофоретическое фракционирование белков сыворотки крови проводили при рН = 8,0. Указать направление перемещения указанных белков и степень их подвижности при данном значении рН. При каком значении рН возможно разделение смеси двух белков – сывороточного альбумина и -глобулина?
9. Указать направление перемещения при электрофорезе следующих белков:
9.1. Тропомиозина (рI = 5,1) в буферной системе с рН = 5,1; 8,0.
9.2. Гемоглобина (рI = 6,8) в буферной системе с рН = 4,8; 8,0.
9.3. Рибонуклеазы (рI = 9,45) в буферной системе с рН = 4,2; 11,0.
9.4. -Казеина (рI = 5,3) в буферной системе с рН = 4,0; 5,3.
9.5. -Лактальбумина (рI = 5,1) в буферной системе с рН = 8,0; 4,0.
9.6. -Глобулина ячменя (рI = 5,75) в буферной системе с рН = 9,0; 5,75.
9.7. Инсулина (рI = 5,35) в буферной системе с рН = 9,0; 4,0.
9.8. Пепсина (рI = 1,0) в буферной системе с рН = 2,0; 7,0.
9.9. Коллагена (рI = 6,6-6,8) в буферной системе с рН = 2,0; 10,0.
9.10. Цитохрома с (рI = 10,65) в буферной системе с рН = 10,0; 7,0.
10. При каких значениях рН наиболее целесообразно электрофоретическое
фракционирование белковых смесей?
10.1. Миозина и гемоглобина.
10.2. Уреазы и гемоглобина.
10.3. Щелочной фосфатазы, сывороточного альбумина и уреазы.
10.4. Цитохрома с и гемоглобина.
10.5. Коллагена и каталазы.
10.6. Родопсина и пепсина.
10.7. Миозина и цитохрома с.
10.8. Уреазы и каталазы.
10.9. Карбоксипептидазы и родопсина.
10.10. Миозина и миоглобина.
Изоэлектрическая точка миозина – 5,4; щелочной фосфатазы – 4,5; гемоглобина – 6,8; уреазы – 5,0; цитохрома с – 10,65, коллагена – 6,6-6,8; каталазы – 5,6;
родопсина – 4,47-4,57; пепсина – 1,0; карбоксипептидазы – 6,0; миоглобина – 7,0.
10
11. Как изменится электрофоретическая подвижность белка с рI = 6,8 при
фракционировании в среде с рН = 7,0, если в его молекуле: а) Глу заменен на
Вал; б) Лиз заменен на Глу; в) Глу заменен на Лиз; г) Вал заменен на Глу; д) Гис
заменен на Арг.
12. Пользуясь первичной структурой инсулина человека и значениями рКа
аминокислотных остатков,
S
S
Гли-Иле-Вал-Глу-Глн-Цис-Цис-Ала-Сер-Вал-Цис-Сер-Лей-Тир-Глн-Лей-Глу-Асн-Тир1
2 3
4 5
6
7
8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19
S
А-цепь
Асн -Цис
21
20
S
S
S
Фен-Вал-Асн-Глн-Гис-Лей-Цис-Гли-Сер-Гис-Лей-Вал-Глу-Ала-Лей-Тир-Лей-Вал-Цис-Гли1 2
3 4 5
6
7
8
9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
В-цепь
Ала-Лиз-Про-Тре-Тир-Фен-Фен-Гли-Арг-Глу,
30 29 28 27 26 25 24 23 22 21
а) оценить заряд инсулина при значениях рН, равных 3,0; 7,0; 10,0;
б) перечислить гидрофобные фрагменты в А- и В-цепях отдельно;
в) перечислить полярные неионогенные фрагменты аминокислот в А- и Вцепях отдельно;
г) написать уравнения реакции действия надмуравьиной кислоты на инсулин.
13. Гормон глюкагон, вызывающий повышение содержания глюкозы в крови
и распад гликогена в печени, представляет собой пептид:
Гис-Сер-Глу-Гли-Тре-Фен-Тре-Сер-Асп-Тир-Сер-Лиз-Тир-Иле-Асп-Сер-Арг1
2
3 4
5 6 7
8
9
10 11 12 13 14 15 16 17
Арг-Ала-Глу-Асп-Фен-Вал-Глу-Тир-Лей-Мет-Асн-Тре.
18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29
Пользуясь первичной структурой глюкагона и значениями рКа аминокислотных остатков,
а) написать фрагмент молекулы с десятого по семнадцатое звено;
б) перечислить гидрофобные аминокислоты;
в) перечислить полярные неионогенные аминокислоты;
г) оценить заряд глюкагона при значениях рН, равных 3,0; 7,0; 10,0.
14. Гормон окситоцин представляет собой пептид:
Цис-Тир-Иле-Глу-Асп-Цис-Про-Лей-Гли,
1
2
3
4
5 6
7
8 9
S
S
а) написать формулу этого пептида;
11
б) пользуясь первичной структурой окситоцина и значениями рКа аминокислотных остатков, оценить заряд окситоцина при значениях рН, равных 3,0;
7,0; 10,0;
в) перечислить гидрофобные аминокислоты;
г) перечислить полярные неионогенные аминокислоты;
д) написать уравнение реакции действия надмуравьиной кислоты на окситоцин.
15. Гормон брадикинин, являющийся активным сосудорасширяющим веществом, вызывающим также сокращение гладкой мускулатуры, представляет собой пептид:
Арг-Про-Про-Гли-Фен-Сер-Про-Фен-Арг,
а) написать формулу этого пептида;
б) пользуясь первичной структурой брадикинина и значениями рКа аминокислотных остатков, оценить заряд брадикинина при значениях рН, равных 3,0;
7,0; 13,0;
в) перечислить гидрофобные аминокислоты;
г) перечислить полярные неионогенные фрагменты аминокислот.
16. Гормон гастрин, стимулирующий секрецию желудочного сока и биосинтез пепсина, представляет собой пептид:
Фен-Асп-Мет-Три-Глу-Тир-Ала-Глу-Глу-Глу-Глу-Глу-Мет-Три-Про-Гли-Гли,
а) написать формулу этого пептида;
б) пользуясь первичной структурой гастрина и значениями рКа аминокислотных остатков, оценить заряд гастрина при значениях рН, равных 3,0; 7,0; 13,0;
в) перечислить гидрофобные аминокислоты;
г) перечислить полярные неионогенные аминокислоты.
17. Имеются две разновидности гастрина – гастрин-1 и гастрин-2. У гастрина-1 тирозин, в отличие от приведенного далее гастрина-2, этерифицирован серной кислотой:
Фен-Асп-Мет-Три-Глу-Тир-Ала-Глу-Глу-Глу-Глу-Глу-Мет-Три-Про-Гли-Гли.
Написать формулу гастрина-1. Определить заряд при рН 3,0; 7,0: 13,0.
Сравнить с зарядом гастрина-2. Оценить, как изменится при указанных значениях рН гидрофильность и электрофоретическая подвижность гастрина-1?
18. В состав белков плазмы крови входит белок, ответственный за транспорт водонерастворимых липидов. Фрагмент белка имеет следующую аминокислотную последовательность:
Вал-Сер-Глн-Тир-Фен-Глн-Тре-Вал-Тре-Асп-Тир-Глу-Лиз-Асп-Лей-Мет-Глу.
Найти участок, определяющий функцию белка, какую вторичную структуру
формирует этот участок? Изобразить эту структуру схематично с указанием распределения боковых фрагментов.
12
19. Пептид Ала-Вал-Ала-Ала-Ала-Вал-Ала-Вал-Лей-Ала-Ала-Вал
1 2
3 4
5
6 7
8
9 10 11 12
имеет структуру -спирали. Как изменится вторичная структура пептида, если
сделать следующие замены аминокислот:
а) Ала(3) на Лей, Вал(6) на Иле;
б) Ала(3) на Три;
в) Ала(3) на Три, Вал(6) на Три;
г) Вал(2) на Арг, Вал(6) на Лиз:
д) Вал(2) на Лиз, Вал(6) на Глу?
20. Написать формулу пептида и показать возможные варианты включения в
молекулу пептида фрагмента фосфорной кислоты. Оценить, как при этом будут
изменяться функциональные свойства пептида:
Вал-Сер-Иле-Сер-Глу-Лиз-Тре-Сер-Гли-Фен-Тир.
21. Написать формулу пептида и показать возможные варианты включения в
молекулу пептида глюкозы. Оценить, как при этом будут изменяться функциональные свойства пептида:
Ала-Гис-Иле-Сер-Глу-Тре-Лиз-Глн-Фен-Тре-Вал.
22. Написать формулу фрагмента казеиновой фракции α s2 с учетом того, что
фрагмент фосфорилирован по положениям Сер (8), Сер (9), Сер (10), показать
возможные варианты включения ионов кальция. Оценить, как при этом будут
изменяться функциональные свойства пептида и потребительские свойства казеинов молока:
Лиз-Асн-Тре-Мет-Глу-Гис-Вал-Сер-Сер-Сер-Глу-Глу-Сер-Иле.
1 2 3
4
5 6 7
8
9 10 11 12 13 14
23. Молоко за счет белковой составляющей используется для смягчения последствий отравления солями тяжелых металлов. Написать фрагмент -казеина и
показать схему нейтрализации ядовитого воздействия солей тяжелых металлов:
Глу-Глу-Глн-Глн-Гли-Глн-Тре-Глу-Асп-Глу-Лей-Глн-Асп-Лиз.
24. Трипептид глутатион (L--глутамилцистеинилглицин) за счет группы SH
образует с металлами комплексы, защищая организм от отравляющего воздействия солей тяжелых металлов. Написать формулу глутатиона, на примере взаимодействия с сулемой (HgCl2) пояснить его функциональные свойства.
25. Для полипептида написать:
а) уравнение реакции с надмуравьиной кислотой;
б) уравнение реакции с фенилизотиоцианатом с последующим гидролизом
раствором соляной кислоты;
в) уравнение реакции с 2,4-динитрофторбензолом с последующим гидролизом раствором соляной кислоты;
г) уравнение реакции с ферментом трипсином;
13
д) уравнение реакции с ферментом химотрипсином;
е) уравнение реакции с бромистым цианом CNBr;
ж) уравнение реакции с гидразином с последующим воздействием бензальдегида.
25.1. Фен-Асп-Мет-Три-Глу-Тир-Ала-Лиз-Глу-Глу-Мет-Цис-Глу-Цис-Сер.
S
S
25.2. Вал-Сер-Асп-Тре-Лиз-Цис-Гли-Мет-Глу-Цис-Асн-Фен-Глн-Асн-Сер.
S
S
25.3. Гли-Фен-Цис-Лиз-Иле-Асп-Глн-Глу-Цис-Тир-Иле-Мет-Цис-Лиз-Тре.
S
S
25.3. Мет-Лей-Три-Арг-Глу-Мет-Асп-Асп-Про-Гис-Тир-Цис-Цис-Сер-Гли.
S
S
25.4. Цис-Сер-Глу-Гис-Три-Вал-Про-Глн-Асн-Цис-Мет-Арг-Цис-Фен-Иле.
S
S
25.5. Гли-Тир-Лиз-Мет-Цис-Глу-Цис-Тир-Арг-Про-Вал-Гли-Три-Ала-Сер.
S
S
25.6. Иле-Асп-Лиз-Асп-Фен-Про-Глн-Мет-Тре-Лиз-Цис-Арг-Три-Цис-Вал.
S
S
25.7. Про-Фен-Сер-Арг-Глу-Асн-Асп-Асп-Мет-Лей-Три-Цис-Глу-Цис-Гис.
S
S
25.9. Лей-Три-Ала-Мет-Арг-Цис-Глу-Асн-Асп-Цис-Лиз-Тре-Вал-Глн-Асп.
S
S
25.10. Сер-Арг-Глу-Асн-Тре-Лиз-Мет-Гли-Про-Мет-Цис-Вал-Иле-Цис-Сер.
S
14
S
Примеры решения задач
Пример № 1. Написать ионные состояния пептида при постепенном переходе из среды с рН 1,5 к рН =13,0. Определить заряды пептида в соответствующей среде:
Вал-Глу-Лиз-Тир-Асн-Арг.
Решение:
Используя значения констант кислотности, представленные в табл.1, расположим аминокислоты в порядке возрастания значения рК а :
На С-конце пептида находится аминокислота аргинин, значение рК а группы СООН которой равно 1,82.
В состав пептида входит одна ионогенная кислота, имеющая кислотную
природу, – глутаминовая, значение рК а группы СООН, входящей в боковой
фрагмент, равно 4,07.
На N-конце находится аминокислота валин, величина рК а группы NH3+ которой равна 9,74.
Тирозин способен ионизироваться при рН >10, значение рК а фенольной
гидроксильной группы в тирозине равно 10,46.
В состав пептида входят две ионогенных аминокислоты, имеющих основную природу, – лизин и аргинин, значение рК а группы NH3+, входящей в боковой фрагмент лизина в положении , равно 10,54; рК а гуанидиновой группы аргинина – 12,48.
Аспарагин является нейтральной аминокислотой.
Таким образом, в сильнокислой среде при значении рН < 1,5 все ионогенные функциональные группы будут находиться в протонированной форме:
NH2
+
OH
C
COOH
O
NH3+ H
C
C
NH
(CH2)2
N
C
H
C
H
CH
H3C
CH3
H
NH2
O
H
C
N
(CH2)4
NH3+
O
C
H
CH2
N
H
C
H
C
O
H
C
N
O
C
CH2
C
(CH2)3
COOH
N
C
H
H
O
NH2
Заряд пептида в сильнокислой среде равен +3.
При достижении рН  1,82 ионизируется группа СООН аргинина на С-конце
пептида:
15
NH2
+
OH
C
COOH
O
NH3+ H
C
C
H3C
N
H
CH
NH
(CH2)2
H
C
NH2
C
H
H
C
N
O
C
(CH2)4
O
CH3
H
CH2
N
H
C
H
C
H
C
N
O
C
CH2
O
C
NH3+
(CH2)3
COO N
C
H
H
O
NH2
Заряд становится равным +2.
При рН  4,07 депротонируется группа СООН в боковом фрагменте глутаминовой кислоты:
NH2
+
OH
COO
O
NH3+ H
C
C
H3C
N
C
NH2
NH
(CH2)2
H
CH
C
-
H
C
H
H
C
N
O
C
(CH2)4
O
CH3
H
CH2
N
H
C
H
C
H
C
N
O
C
CH2
O
C
NH3+
N
H
(CH2)3
COO C
H
O
NH2
Заряд пептида равен +1.
В основной среде при достижении рН 9,74 депротонируется аминогруппа
валина на N-конце пептида:
NH2
+
OH
C
COOO
C
C
NH
(CH2)2
H
NH2
N
C
H
C
H
CH
H3C
CH3
H
O
H
C
N
(CH2)4
NH3+
O
C
H
CH2
N
H
C
H
C
O
H
C
N
O
C
CH2
C
NH2
Пептид становится, вплоть до рН=10,46, нейтральным.
16
NH2
N
H
O
(CH2)3
COO C
H
При достижении рН 10,46 ионизируется гидроксильная группа фенольного
кольца тирозина, а уже при рН = 10,54 депротонируется и аминогруппа в боковом фрагменте лизина:
NH2
+
O-
C
COOO
C
C
NH
(CH2)2
H
NH2
N
C
H
H
CH
H3C
H
H
C
NH2
O
C
C
N
(CH2)4
O
CH3
H
CH2
N
H
C
H
C
H
C
N
O
C
CH2
O
C
NH3+
(CH2)3
COO N
C
H
H
O
NH2
10,46  рН < 10,54 равен –1.
Заряд пептида в интервале
NH2
+
O-
C
COOO
NH2
C
C
NH
(CH2)2
H
N
H
C
C
H
H
CH
H3C
NH2
H
C
N
O
C
(CH2)4
O
CH3
H
CH2
N
H
C
H
C
H
C
N
O
C
CH2
O
C
NH2
(CH2)3
COO N
C
H
H
O
NH2
Заряд пептида –2.
Наконец, в сильноосновной среде при рН  12,48 депротонируется гуанидиновая группа аргинина, а заряд становится равным –3:
NH2
OCOO
O
NH2
C
N
C
H
C
H
CH
H3C
CH3
H
NH
NH
(CH2)2
H
C
C
-
O
H
C
N
(CH2)4
NH2
O
C
H
CH2
N
H
C
H
C
O
H
C
N
O
C
CH2
C
N
H
(CH2)3
COO C
H
O
NH2
17
При переходе из сильнокислой среды в сильноосновную пептид изменил
свой знак на противоположный. В нейтральной среде пептид несет положительный заряд, равный единице.
Пример № 2. Для пептида
Цепь А
Гли-Асп-Мет-Цис-Глу-Тир-Лиз-Цис-Вал
S
S
Цис-Арг-Гис-Вал-Три-Про-Ала
Цепь В
написать:
а) уравнение реакции с надмуравьиной кислотой;
б) для цепи А уравнение реакции с 2,4-динитрофторбензолом с последующим гидролизом раствором соляной кислоты ;
в) для цепи А уравнение реакции с ферментом трипсином;
г) для цепи А уравнение реакции с ферментом химотрипсином;
д) для цепи А уравнение реакции с бромистым цианом CNBr;
е) для цепи А уравнение реакции с гидразином с последующим воздействием бензальдегида.
а) при действии надмуравьиной кислоты на пептиды разрываются дисульфидные связи:
Гли-Асп-Мет-Цис-Глу-Тир-Лиз-Цис-Вал
O
S
+ 5HC
OOH + H2O
S
Цис-Арг-Гис-Вал-Три-Про-Ала
SO3H
Гли-Асп-Мет-Цис-Глу-Тир-Лиз-Цис-Вал + Цис-Арг-Гис-Вал-Три-Про-Ала +
SO3H
O
+ 5 HC
18
OH
б) 2,4-динитрофторбензол вступает во взаимодействие с N-концевой аминокислотой пептида:
F
O 2N
+ Гли-Асп-Мет-Цис-Глу-Тир-Лиз-Цис-Вал
NO 2
HF
O
NH CH2
O 2N
C
N
(Асп-Мет-Цис-Глу-Тир-Лиз-Цис-Вал
H
NO 2
Под воздействием водного раствора соляной кислоты гидролизуются практически все пептидные связи, при этом только N-концевая аминокислота остается в виде динитробензолпроизводного:
O
NH CH2
O 2N
N
(Асп-Мет-Цис-Глу-Тир-Лиз-Цис-Вал
+ HCl
H
NO2
O2N
C
NH CH2COOH +
смесь аминокислот, дипептидов, трипептидов
NO2
Выделив динитробензолпроизводное N-концевой аминокислоты из смеси
аминокислот, дипептидов, трипептидов, образующихся при гидролизе соляной
кислотой, можно определить, какая аминокислота находилась на N-конце пептида.
в) протеолитический фермент трипсин гидролизует пептидные связи
–Арг–Х и –Лиз–Х, где Х – любая аминокислота:
Гли-Асп-Мет-Цис-Глу-Тир-Лиз-Цис-Вал
+
H2O
19
OH
COO
O
NH3
+
C
H
SH
CH2
H
C
-
C
N
H
N
C
H
H
H
C
O
C
N
(CH2)2
O
H
CH2
H
C
N
C
C
C
H
NH3
O
+
+
C
N
O
H
C
COO
-
(CH2)4
NH3
+
-
CH3
CH
C
C
H
H
H
CH2
COO
H
C
N
CH2
O
SCH3
CH3
CH2
O
H
N
CH2
H
C
COO
-
H
SH
г) протеолитический фермент химотрипсин гидролизует пептидные связи
–Три–Х, –Тир–Х, –Фен–Х, где Х – любая аминокислота:
+
Гли-Асп-Мет-Цис-Глу-Тир-Лиз-Цис-Вал
COO
O
NH3
C
H
SH
CH2
+H
C
-
C
N
H
C
H
H
N
H
O
C
C
(CH2)2
O
H
CH2
C
N
H
C
N
H
H
+
+
NH3
C
C
(CH2)4
NH3
20
H
N
H
C
CH2
+
SH
CH3
COO
CH
O
C
C
N
H
C
COO
H
-
N
H
CH2
CH3
O
C
CH2
O
CH2
O
SCH3
H
OH
H2O
-
C
H
COO
-
+
д) бромистый циан расщепляет избирательно пептидную связь после остатка
метионина:
+ BrCN
Гли-Асп-Мет-Цис-Глу-Тир-Лиз-Цис-Вал
COO
O
NH3
C
H
SH
CH2
+H
C
-
C
N
H
H
H
N
C
O
H
C
C
CH2
O
CH2
C
N
H
H
N
C
C
O
CH2
CH2
-
S , Br
COO
O
+
NH3
C
C
H
-
CH2
H
N
H
C
H
N
CH2
H
C
CH2
O
+
C NH
C
O
H
N
C
C
C
H
O
O
CH2
NH3
C
H
-
CH2
H
C
C
N
H
H
C
O
-
SH
O
N
CH3SCN
CH2
COO
+H
-
Br , H2O
H
CH2
COO
-
SH
H
C
COO
CH3
C
N
C
H
H
CH2
+
O
CH2
H
O
C
CH2
C
+
C
O
CH2
NH2
H
C
N
O
H
C
C
+
HBr
H
O
CH2
CH2
COO
-
е) при действии на пептид гидразина все составляющие его аминокислоты,
за исключением С-концевой аминокислоты, образуют гидразиды аминокислот:
21
Гли-Асп-Мет-Цис-Глу-Тир-Лиз-Цис-Вал
COO
O
NH2
C
C
N
NH2
+
C
NH2
H
H
H
8 H2N
NH2
-
H
CH2
H
+
NH2
H
C N
NH2
+ ..... +
C
COOH
CH
CH3
O
CH3
Гидразиды аминокислот осаждают обычно бензальдегидом:
NH2
H
C
H
O
C
O
N
H
NH2
+ C6H5C
H
NH2
H
C
H
O
C
N
N
CHC6H5
+ H2O
H
Из фильтрата можно выделить и идентифицировать С-концевую аминокислоту.
22
Приложение
Таблица 1. Значения рКа кислотно-основных групп -аминокислот*
Аминокислота
-СООН
Аланин (Ала)
Аргинин (Арг)
Аспарагин (Асн)
Аспарагиновая (Асп)
Валин (Вал)
Глицин (Гли)
Глутамин (Глн)
Глутаминовая (Глу)
Гистидин (Гис)
Изолейцин (Иле)
Лейцин (Лей)
Лизин (Лиз)
Метионин (Мет)
Пролин (Про)
Серин (Сер)
Тирозин (Тир)
Треонин (Тре)
Триптофан (Три)
Фенилаланин (Фен)
Цистеин (Цис)
2,35
1,82
2,14
1,99
2,29
2,35
2,17
2,10
1,80
2,32
2,33
2,16
2,13
1,95
2,19
2,20
2,09
2,46
2,20
1,92
-NH3+
9,87
8,99
8,72
9,90
9,74
9,78
9,13
9,47
9,33
9,76
9,74
9,06
9,28
10,64
9,21
9,21
9,10
9,41
9,31
8,37
Функциональная
группа бокового
фрагмента
12,48
3,90
4,07
6,04
10,54
10,46
10,70
*
Досон, Р. Справочник биохимика/ Р. Досон, Д. Эллиот, У. Эллиот, К. Джонс. – М.: Мир,
1991. – 544 с.
23
СПИСОК РЕКОМЕНДУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
1. Соколова, Т.Н. Введение в биохимию. Ч.1: учеб. пособие / Т.Н. Соколова, В.Р. Карташов / Нижегород. гос. техн. ун-т; Н. Новгород, 2002. – 281 с.
2. Филиппович, Ю. Б. Основы биохимии / Ю.Б. Филиппович.– М.: Изд-во
«Агар», 1999. – 512 с.
3. Ленинджер, А. Биохимия / А. Ленинджер. – М.: Мир, 1985. Т. 1. – 367 с.;
т. 2. – 368 с.; т. 3. – 320 с.
4. Кнорре, Д. Г. Биологическая химия / Д.Г. Кнорре, С.Д. Мызина. – М.:
Высшая школа, 2000. – 279 с.
5. Комов, В.П. Биохимия / В.П. Комов, В.Н. Шведова. – М.: Дрофа, 2004. –
640 с.
6. Щербаков, В.Г. Биохимия / В.Г. Щербаков [и др.]. – СПб.: ГИОРД,
2003. – 440 с.
7. Тюкавкина, Н.А. Биоорганическая химия / Н.А. Тюкавкина, Ю.И. Бауков. – М.: Дрофа, 2005. – 542 с.
8. Кольман, Я. Наглядная биохимия / Я. Кольман, К.-Г. Рем. – М.: Мир,
2000. – 469 с.
9. Биохимия. Краткий курс с упражнениями и задачами; под ред. Е.С. Северина, А.Я. Николаева. – М.: ГЭОТАР-МЕД, 2002. – 448 с.
10. Досон, Р. Справочник биохимика / Р. Досон, Д. Эллиот, У. Эллиот,
К. Джонс. – М.: Мир, 1991. – 544 с.
24
2. Написать реакции протолитических равновесий трипептида при постепенном изменении рН от 1,5 до 13 , проанализировать изменения заряда трипептида:
2.1. Ала-Тир-Цис.
2.2. Арг-Асн-Сер.
2.3. Тре-Лиз-Глу.
2.4. Вал-Гис-Асп.
2.5. Гли-Гис-Фен.
2.6. Про-Лиз-Асн.
2.7. Мет-Арг-Глу.
2.8. Сер-Тир-Асп.
2.9. Иле-Арг-Глу.
2.10.Тир-Гис-Лиз.
3. Отобразить ионное состояние пептида в сильнокислой среде, определить
заряд. Как изменится заряд пептида при переходе в сильноосновную среду?
Oтобразить ионное состояние пептида при рН >> 7:
Вал-Сер-Асп-Тре-Лиз-Лиз-Гли-Про-Глу-Асн-Асн.
Арг-Фен-Гис-Лиз-Арг-Асп-Глн-Глу-Глу-Тир-Иле.
Мет-Лей-Три-Арг-Глу-Асн-Асп-Асп-Про-Гис-Тир.
Цис-Сер-Глу-Гис-Лиз-Вал-Про-Глн-Асн-Сер-Мет.
25
Гли-Тир-Тре-Три-Глн-Глу-Лиз-Гис-Арг-Про-Вал.
Иле-Асп-Глу-Асп-Асп-Про-Глн-Асн-Тре-Лиз-Лиз.
Про-Фен-Сер-Арг-Глу-Асн-Асп-Асп-Мет-Лей-Три.
Тре-Три-Ала-Гис-Арг-Лиз-Гис-Асн-Асп-Асп-Глу.
Сер-Арг-Глу-Асн-Тре-Лиз-Лиз-Гли-Про-Мет-Лей.
Глн-Глу-Лиз-Гис-Арг-Про-Вал-Асп-Глу-Асп-Асп.
26
Ала-Гли-Тир-Фен-Три-Мет-Арг-Глу-Асн-Асп-Гис.
Лиз-Лиз-Гли-Про-Глу-Асн-Тир-Тре-Три-Глн-Глу.
3.15. Глн-Асн-Сер-Мет-Три-Ала-Гис-Лиз-Гис-Арг-Про.
3.16. Асп-Арг-Цис-Лей-Иле-Сер-Глу-Гис-Лиз-Вал-Гли.
3.15. Три-Гис-Вал-Гли-Лиз-Асп-Глу-Арг-Асн-Глу-Глн.
27
3.18. Лей-Тир-Фен-Три-Мет-Арг-Глу-Асн-Асп-Лиз-Лиз.
3.19. Асн-Сер-Арг-Глу-Асн-Лиз-Гли-Про- Арг-Глу-Асп.
3.17. Глу-Глн-Асн-Асн-Гис-Гис-Арг-Лиз-Лиз-Вал-Арг.
3.26. Глн-Глу-Глу-Глу-Глу-Цис-Сер-Фен-Лиз-Асп-Асп.
3.27. Лиз-Гли-Лиз-Арг-Арг-Гис-Гис-Лиз-Глу-Лиз-Арг.
28
3.28. Гли-Лиз-Асп-Глу-Арг-Гли-Лиз-Арг-Арг-Гис-Ала.
3.29. Асн-Асн-Гис-Глу-Глу-Цис-Про-Глу-Асн-Лиз-Гис.
3.30. Сер-Арг-Глу-Глу-Асп-Асп-Про-Глн-Асн-Лиз-Вал.
3.31. Лиз-Вал-Гис-Гис-Арг-Лиз-Глу-Асн-Тре-Тре-Цис.
3.32. Ала-Гли-Тир-Цис-Ала-Асп-Глу-Глу-Асп-Глу-Глу.
29
30