Пируват

Лекция 5.
Общий путь катаболизма как источник субстратов тканевого дыхания –
окислительное декарбоксилирование пирувата, цикл трикарбоновых кислот.
Подведение итога: образование АТФ методом субстратного и окислительного
фосфорилирования АДФ
Общий путь катаболизма включает: 1) окислительное декарбоксилирование
пирувата до ацетил-КоА; 2) окисление ацетильной группы ацетил-КоА (2 и 3
углеродные атомы пирувата) в цикле трикарбоновых кислот; 3) выделение и
аккумулирование энергии при дегидрировании метаболитов общего пути катаболизма
в митохондриальных цепях переноса электронов.
Пируват образуется из углеводов (глюкоза), глицерола, гликогенных
аминокислот и лактата. Ацетил-КоА занимает центральное место в общем пути
катаболизма и образуется в митохондриях: 1) при окислительном декарбоксилировании
пирувата; 2) при β-окислении жирных кислот; 3) из кетогенных аминокислот.
1. Окислительное декарбоксилирование пировиноградной кислоты
Пировиноградная кислота связывает гликолиз с циклом трикарбоновых кислот.
Пируват переносится из цитозоля в матрикс митохондрий с помощью переносчика по
механизму симпорта с протоном. В матриксе митохондрий пируват превращается в
ацетил-КоА. Этот процесс называется окислительное декарбоксилирование пирувата и
катализируется пируватдегидрогеназным комплексом (пируватдегидрогеназной
системой). Высокая концентрация пируватдегидрогеназного комплекса обнаружена в
сердечной мышце и почках.
Пируватдегидрогеназный комплекс является классическим мультиферментным
комплексом, в котором промежуточные продукты остаются связанными на поверхности
молекулы фермента до образования конечного продукта.
В состав пируватдегидрогеназного комплекса входит 3 фермента и
5
кофакторов.
I-й
фермент
–
пируватдегидрогеназа
содержит
кофактор
тиаминпирофосфат
(производное
витамина
В1);
II-й
фермент
–
дигидролипоилтрансацетилаза содержит кофакторы липоевую кислоту (ЛК, 6,8дитиооктановая кислота) и кофермент А (НS-КоА), причем остаток липоевой кислоты
присоединен к апоферменту путем образования амидной связи между карбоксильной
группой ЛК и ε-аминогруппой лизина белка (образуется длинная «рука», состоящая из
13 атомов углерода); III-й фермент - дигидролипоилдегидрогеназа содержит кофакторы
ФАД и НАД+.
1
NH2
N
H3C
СН2 N
C
C CH3
O
O
C СН2 СН2 О Р О Р ОS
О- ОТиаминпирофосфат (ТПФ)
N
Пантотеновая кислота
дигидрокси,
диметилмасляная
кислота
O CH2
O P OO
O P OO
CH2 O
3'
O
PO32-
аланин
CH3
O
O
C CHOH C NH CH2 CH2 C NH CH2 CH2 SH
CH3
Тиоэтаноламин
NH
2
N
N
N
N
OH
3'-фосфоаденозиндифосфат
Кофермент А
S
S
Н2С СН2 СН СН2 СН2 СН2 СН2 СОО-
S
S
ЛК
Липоевая кислота (ЛК)
2. Механизм окислительного декарбоксилирования пирувата
I этап. Пируват взаимодействует с кофактором пируватдегидрогеназы
тиаминпирофосфатом. Основную роль играет второй углеродный атом тиазольного
кольца ТПФ, который легко теряет протон, превращаясь в карбанион. Карбанион
атакует частично положительно заряженный α-углеродный атом пирувата с
возникновением связи С−С. Сильно электрофильный атом азота в карбоксиэтил-ТПФ
способствует его декарбоксилированию с образованием гидроксиэтил-ТПФ.
2
СН3
СОО-
R1 N C CH3
C C R2
S
H+
Пируват
ТПФ
 С O 
CH3
R2
~
СН3
+
С O
SКоА
АцетилКоА
HS
HS
ЛК + ФАД
ФАДН2 + НАД+
S
ЛК
Дигидролипоилтрансацетилаза
СН3
С O
S
ЛК
HS
ТПФ
Гидроксиэтилтиаминпирофосфат
HS
HS
СО2
Карбоксиэтилтиаминпирофосфат
S
+
R1 N C CH3
C C R2
HO
S
C
H3C
COO-
~
R1 N
C
C
C
НО
S
С
Н
Н3С
Пируватдегидрогеназа
Липоевая
кислота
+
HSKoA
Ацетил-липоевая
кислота
ЛК
Дигидролипоевая
кислота
Дигидролипоилдегидрогеназа
S
S
ЛК + ФАДН2
ФАД + НАДН+Н+
НАД+ + Н2О + 2,5 АТФ
II этап. В следующей реакции, катализируемой дигидролипоилтрансацетилазой,
гидроксиэтил-ТПФ взаимодействует с липоевой кислотой. Происходит перенос
гидроксиэтильной группы на один из атомов серы ЛК. При этом гидроксиэтильная
группа окисляется в ацетильную. В процессе окисления гидроксиэтильной группы и
восстановления SH-группы ЛК возникает макроэргическая связь. Затем ацетильный
остаток переносится на второй кофермент дигидролипоилтрансацетилазы – HS-KoA, а
ЛК полностью восстанавливается. Образованный ацетил-КоА отделяется от
полиферментного комплекса.
III этап. Восстановленная форма ЛК окисляется дигидролипоилдегидрогеназой.
3. Регуляция пируватдегидрогеназного комплекса. Превращение пирувата в
ацетил-КоА – процесс необратимый. Поэтому синтез глюкозы из ацетил-КоА
невозможен. Обычно ацетил-КоА далее превращается 2-мя путями: 1) ацетильная
3
группа ацетил-КоА окисляется до СО2 и Н2О через ЦТК и сопряженные цепи переноса
электронов с выделением и запасанием энергии в виде АТФ; 2) используется для
синтеза кетоновых тел, холестерола и жирных кислот.
Пируватдегидрогеназный комплекс регулируется методом фосфорилированиядефосфорилирования. Повышение величин отношений НАДН/НАД+, ацетил-КоА/КоА
или АТФ/АДФ способствует фосфорилированию фермента протеинкиназой и
дезактивации комплекса. Следовательно, пируватдегидрогеназный комплекс
инактивируется, если клетка богата энергией и биосинтетическими
предшественниками.
Пируват и АДФ, наоборот, активируют пируватдегидрогеназный комплекс
посредством ингибирования протеинкиназы.
Вазопрессин активирует пируватдегидрогеназный комплекс путем повышения
концентрации ионов кальция в митохондриях, которые активируют протеинфосфатазу
(дефосфорилирование фермента). Инсулин также усиливает превращение пирувата в
ацетил-КоА через дефосфорилирование пируватдегидрогеназного комплекса.
4. Цикл трикарбоновых кислот
Вторым компонентом общего пути катаболизма является ЦТК. Этот цикл был
открыт в 1937 г. Кребсом и Джонсоном. В 1948 г. Кеннеди и Ленинджер доказали, что
ферменты ЦТК локализованы в матриксе митохондрий.
4.1. Химизм цикла трикарбоновых кислот. Свободную уксусную кислоту
невозможно окислить путем дегидрирования. Поэтому она в активной форме (ацетилКоА) предварительно связывается с оксалоацетатом (ЩУК, щавелевоуксусной
кислотой), в результате чего образуется цитрат.
1. Ацетил-КоА соединяется с оксалоацетатом в реакции альдольной
конденсации, катализируемой цитратсинтазой. Образуется цитрил-КоА. Цитрил-КоА
при участии воды гидролизуется до цитрата и НS-КоА.
2. Аконитат-гидратаза (аконитаза) катализирует превращение цитрата в
изоцитрат через стадию цис-аконитовой кислоты. Аконитаза по механизму действия
одновременно гидратаза и изомераза.
3. Изоцитратдегидрогеназа катализирует дегидрирование изолимонной
кислоты в оксалосукцинат (щавелевоянтарную кислоту), которая затем
декарбоксилируется в 2-оксоглутарат (α-кетоглутарат). Коферментом является НАД+ (в
митохондриях) и НАДФ+ (в цитозоле и митохондриях).
4. 2-Оксоглутаратдегидрогеназный комплекс (α-кетоглутаратдегидрогеназный
комплекс) катализирует окислительное декарбоксилирование 2-оксоглутарата
в
сукцинил-КоА. Мультиферментный 2-оксоглутаратдегидрогеназный комплекс похож
на пируватдегидрогеназный комплекс и процесс протекает аналогично окислительному
декарбоксилированию пирувата.
5. Сукцинилтиокиназа катализирует расщепление сукцинил-КоА на янтарную
кислоту и кофермент А. Энергия расщепления сукцинил-КоА накапливается в виде
гуанозинтрифосфата (ГТФ). В сопряженной реакции перефосфорилирования АДФ
фосфорилируется в АТФ, а освобождающиеся молекулы ГДФ могут вновь
фосфорилироваться (субстратное фосфорилирование). У растений фермент
специфичен к АДФ и АТФ.
6. Сукцинатдегидрогеназа катализирует превращение сукцината в фумаровую
кислоту. Фермент стереоспецифичен, является интегральным белком, так как
вмонтирован во внутреннюю мембрану митохондрий и в качестве простетических
групп содержит ФАД и железосерные белки. ФАДН2 не отделяется от фермента, а два
электрона далее передаются на кофермент Q цепи переноса электронов внутренней
4
мембраны митохондрий.
7. Фумарат-гидратаза (фумараза) катализирует превращение фумаровой
кислоты в яблочную (малат) с участием воды. Фермент стереоспецифичен, образует
только L-малат.
8. Малатдегидрогеназа катализирует окисление яблочной кислоты в
оксалоацетат. Кофермент малатдегидрогеназы - НАД+. Далее оксалоацетат вновь
конденсируется с ацетил-КоА и цикл повторяется.
5
СООС O
СН2
СОО-
+
Оксалоацетат
СООСН2
С СООСН
СОО-
СН3
С~ O
SКоА
Цитратсинтаза
+H2O
HS-KoA
Ацетил-КоА
Аконитаза
+Н2О
Цис-аконитат
СООСН2
НО С СООСН2
СООЦитрат
Аконитаза
-Н2О
Изоцитратдегидрогеназа
СОО(декарбоксилирующая)
СН2
Mg2+
Н С СООН
СН ОН
СООНАД+ НАДН+Н+
Изоцитрат
НАД++Н2О+2,5 АТФ
СООСН2
С СООС O
СОООксалосукцинат
СООСОО- Сукцинилтиокиназа
СН2 2-оксоглутаратдегидрогеназа
СН2
Mg2+
СН2
СН2
С O
- СО2
С~
СОО- СО2 НАД+ НАДН+Н+ O
SКоА HS-KoA ГДФ ГТФ+АДФ
Рн
2-оксоглутарат
Сукцинил-КоА
Нуклеозиддифосфаткиназа
НАД++Н2О+2,5 АТФ
СукцинатСООСООдегидрогеназа
НС
СН2
СН
СН2
СООСОО- ФАД ФАДН
2
Сукцинат
Фумарат
ФАД+Н2О+1,5 АТФ
Фумараза
+Н2О
ГДФ + АТФ
СООНО С Н
СН2
СОО-
Малатдегидрогеназа
НАД+ НАДН+Н+
Малат
НАД++Н2О+2,5 АТФ
СООС O
СН2
СОООксалоацетат
4.2. Биологическое значение и регуляция цикла трикарбоновых кислот.
Цикл трикарбоновых кислот – компонент общего пути катаболизма, в котором
происходит окисление топливных молекул углеводов, жирных кислот и аминокислот.
Большинство топливных молекул поступают в ЦТК в виде ацетил-КоА (рис. 1). Все
6
реакции ЦТК протекают согласованно в одном направлении. Суммарная величина G0
= -40 кДж/моль.
В среде врачей давно бытует крылатая фраза «Жиры горят в пламени
углеводов». Ее надо понимать как окисление ацетил-КоА, основным источником
которого является β-окисление жирных кислот, после конденсации с оксалоацетатом,
образуемой, главным образом, из углеводов (при карбоксилировании пирувата). При
нарушениях обмена углеводов или голодании создается дефицит оксалоацетата,
ведущий к уменьшению окисления ацетил-КоА в ЦТК.
Рис.1. Роль ЦТК в клеточном дыхании. 1 стадия (ЦТК) извлечение из молекулы
ацетил-КоА 8 электронов; 2 стадия (цепи переноса электронов) восстановление двух
молекул кислорода и формирование протонного градиента (~36 Н+); 3 стадия (АТФсинтаза) использование энергии протонного градиента для образования АТФ (~9 АТФ)
(Berg J.M., Tymoczko J.L., Stryer L. Biochemistry. N-Y: W.H.Freeman and Company,
2002).
Основная метаболическая роль ЦТК может быть представлена в виде двух
процессов: 1) серия окислительно-восстановительных реакций, в результате которых
ацетильная группа окисляется до двух молекул СО2; 2) четырехкратное
дегидрирование, ведущее к образованию 3 молекул НАДН+Н+ и 1 молекулы ФАДН2.
Кислород необходим для функционирования ЦТК опосредованно как акцептор
электронов в конце цепей переноса электронов и для регенерации НАД+ и ФАД.
Основное значение для регуляции ЦТК имеет синтез и гидролиз АТФ.
1. Изоцитратдегидрогеназа аллостерически активируется АДФ путем
повышения сродства фермента к субстрату. НАДН ингибирует этот фермент, замещая
НАД+. АТФ также ингибирует изоцитратдегидрогеназу. Важно, что превращения
метаболитов в ЦТК требуют на нескольких стадиях НАД+ и ФАД, количество которых
достаточно только в условиях низкого энергетического заряда.
2.
Активность
2-оксоглутаратдегидрогеназного
(αкетоглутаратдегидрогеназного) комплекса регулируется аналогично регуляции
пируватдегидрогеназного комплекса. Этот комплекс ингибируется сукцинил-КоА и
НАДН
(конечными
продуктами
превращений,
катализируемых
2оксоглутаратдегидрогеназным
комплексом).
Кроме
того,
2оксоглуттаратдегидрогеназный комплекс ингибируется высоким энергетическим
зарядом клетки. Итак, скорость превращений в ЦТК уменьшается при достаточной
обеспеченности клетки АТФ (рис. 11.2). У ряда бактерий цитратсинтаза
аллостерически ингибируется АТФ посредством повышения Км для ацетил-КоА.
Схема регуляции общего пути катаболизма представлена на рисунке 2.
7
Рис. 2.
Регуляция общего пути катаболизма. Основными молекулами,
регулирующими функционирование ЦТК являются АТФ и НАДН. Основными
пунктами
регуляции
являются
изоцитратдегидрогеназа
и
2оксоглутаратдегидрогеназный комплекс.
4.3. Энергетическая роль общего пути катаболизма
В общем пути катаболизма из 1 молекулы пировиноградной кислоты образуется
3 молекулы СО2 в следующих реакциях: при окислительном декарбоксилировании
пировиноградной кислоты, при декарбоксилировании изолимонной кислоты и при
декарбоксилировании 2-оксоглутаровой кислоты. Всего при окислении 1 молекулы
пировиноградной кислоты отнимается пять пар атомов водорода, из них одна пара – от
сукцината и поступает на ФАД с образованием ФАДН2, а четыре пары – на 4 молекулы
НАД+ с образованием 4 молекул НАДН+Н+ при окислительном декарбоксилировании
пировиноградной, 2-оксоглутаровой кислот, дегидрировании изоцитрата и малата. В
конечном итоге атомы водорода переносятся на кислород с образованием 5 молекул
Н2О, а выделившаяся энергия аккумулируется в реакциях окислительного
фосфорилирования в виде молекул АТФ.
Общий итог:
1. Окислительное декарбоксилирование пирувата ~ 2,5 АТФ.
2. В ЦТК и сопряженных дыхательных цепях ~ 9 АТФ.
3. В реакции субстратного фосфорилирования ЦТК ~ 1 АТФ.
В ЦТК и сопряженных реакциях окислительного фосфорилирования образуется
примерно10 АТФ при окислении ацетильной группы одной молекулы ацетил-КоА
Итого в общем пути катаболизма в результате превращений 1 молекулы
пировиноградной кислоты выделяется примерно 12,5 молекул АТФ.
5 Амфиболическая функция цикла трикарбоновых кислот включает
катаболические и анаболические реакции.
Катаболические реакции – это окисление ацетил-КоА с выделением и
запасанием энергии.
Анаболические реакции (рис. 3):
1. Ацетил-КоА является исходным соединением для синтеза жирных кислот и,
8
следовательно, жиров, изопреноидов (включая стероиды), кетоновых тел. Ацетил-КоА
служит донором ацетильной группы в синтезе различных эфиров (ацетилхолин,
ацетилглюкозамин и др.).
2. Соединения, участвующие в ЦТК, образуют фонд промежуточных веществ,
дающих начало ряду биосинтетических процессов. Например: 2-оксоглутарат
является важнейшим акцептором аминогрупп в реакциях трансаминирования:
превращается в глутаминовую кислоту, которая затем превращается в глутамин,
пролин, орнитин, цитруллин, аргинин и другие метаболиты. Оксалоацетат является
ключевым соединением для глюконеогенеза (синтеза углеводов). Путем
трансаминирования из оксалоацетата образуются аспарагиновая кислота, аспарагин.
Аспарагиновая кислота необходима для получения пиримидиновых нуклеотидов и
некоторых аминокислот. Сукцинил-КоА может образовывать с глицином аминолевулиновую кислоту, которая конденсируется в порфобилиноген; последний
далее используется в синтезе гема, цитохромов. Фумарат является одним из продуктов
разложения ароматических аминокислот, он также образуется из аспарагиновой
кислоты в цикле мочевины.
Рис. 11.3. Биосинтетическая роль цикла трикарбоновых кислот.
Подписи по стрелкам: Пируват; Ацетил-КоА; Цитрат; Жирные кислоты,
стероиды; α-Кетоглутарат; Глутамат; Другие аминокислоты; Пурины; СукцинилКоА;
Порфирины, гем; Оксалоацетат; Аспартат; Пиримидины, пурины, аминокислоты
Главной задачей ЦТК является бесперебойное обеспечение субстратами
процесса продукции энергии в митохондриях. Поэтому особое значение имеет так
называемая анаплеротическая реакция, заключающаяся в синтезе оксалоацетата из
пирувата, сопряженном с гидролизом АТФ:
Пируват + АТФ + НСО3- → оксалоацетат + АДФ + Рн + Н+
Эту реакцию катализирует пируваткарбоксилаза, кофактором которой является
биотин.
Итак, общий путь катаболизма обеспечивает: 1) продукцию энергии в
дыхательных цепях, поставляя в нее протоны и электроны; 2) ряд биосинтетических
процессов, начинающихся от ацетил-КоА и метаболитов ЦТК.
6. Роль витаминов в регуляции общего пути катаболизма
Семь витаминов выполняют функции кофакторов ферментов общего пути
катаболизма.
9
1) Пируват- и 2-оксоглутаратдегидрогеназные комплексы: В1 - необходим для
синтеза ТПФ; липоевая кислота (витаминоподобное вещество); пантотеновая кислота необходима для синтеза HS-КоА; В2 - необходим для синтеза ФАД; РР - необходим для
синтеза НАД.
2) Биотин катализирует реакцию карбоксилирования пирувата с образованием
оксалоацетата.
3) В6 необходим для синтеза пиридоксальфосфата, являющегося кофактором
аспартат- и аланинаминотрансфераз, катализирующих превращение аспарата в
оксалоацетат и аланина в пируват, соответственно. Перечисленные выше витамины
должны составлять основу сбалансированных поливитаминных препаратов.
7. Глиоксилатный цикл.
В клетках высших растений, плесневых грибов, ряда бактерий обнаружен
глиоксилатный цикл (Г.Кребс, 1957), который служит механизмом пополнения
промежуточных продуктов ЦТК. Глиоксилатный цикл – это видоизмененный ЦТК, в
котором изоцитратдегидрогеназа и 2-оксоглутаратдегидрогеназный комплекс заменены
изоцитрат-лиазой, которая расщепляет изолимонную кислоту до янтарной и
глиоксиловой кислот. Другой ключевой фермент цикла – малат-синтаза, которая
катализирует реакцию конденсации ацетил-КоА с глиоксиловой кислотой с
образованием L-малата и HS-КоА. Итак, в глиоксилатном цикле идут следующие
превращения: Оксалоацетат + ацетил-КоА → лимонная кислота → цис-аконитовая
кислота → изолимонная кислота (выделяется сукцинат) → глиоксиловая кислота +
ацетил-КоА→ яблочная кислота (выделяются 2Н) → оксалоацетат. Таким образом, при
каждом обороте цикла в него включаются две молекулы ацетил-КоА и выделяется одна
молекула янтарной кислоты. На последнем этапе цикла в малатдегидрогеназной
реакции выделяются 2 атома водорода, которые в цепях переноса электронов дадут
~2,5 молекулы АТФ.
Глиоксилатный цикл найден у микроорганизмов и дрожжей, использующих в
качестве энергетического и пластического материала двухуглеродные соединения,
например глицин или гликолевая кислота. Если уксусная кислота и этанол включаются
в ЦТК в виде ацетил-КоА, то глицин и гликолевая кислота окисляются до
глиоксиловой кислоты. В тканях растений с помощью глиоксилатного цикла протекает
превращение жиров в углеводы. Особенно активно этот процесс реализуется в
прорастающих семенах масличных растений. Резервные триацилглицеролы
расщепляются до жирных кислот, окисление последних ведет к образованию ацетилКоА, который в реакциях глиоксилатного цикла дает янтарную кислоту. Последняя
превращается в углеводы через реакции ЦТК и глюконеогенеза. Глиоксилатный цикл
локализуется в микротельцах растений, называемых глиоксисомами. Глиоксилатный
цикл найден у беспозвоночных нематод и трематод (Fasciola hepatica). Появляются
отдельные сообщения о выявлении ключевых ферментов глиоксилатного цикла в
тканях позвоночных на стадии эмбриогенеза и в печени голодавших крыс.
10