Диссертация Остапчук Е.О

Казахский национальный университет им. аль – Фараби
УДК 577.27; 612.017.1:616-006
На правах рукописи
ОСТАПЧУК ЕКАТЕРИНА ОЛЕГОВНА
Функциональные и фенотипические особенности NK- и Т-регуляторных
клеток при раке молочной железы
6D060700- Биология
Диссертация на соискание ученой степени
доктора философии (PhD)
Научные консультанты
Беляев Н.Н. д.б.н., профессор
Deniz G. PhD, профессор
Республика Казахстан
Алматы 2015
СОДЕРЖАНИЕ
ОПРЕДЕЛЕНИЯ, ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ
ВВЕДЕНИЕ
1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1 Т-регуляторные клетки и их роль в иммунной системе
1.1.1 Общие положения о Т-регуляторных клетках
1.1.2 Естественные Т-регуляторные клетки
1.1.3 Индуцированные Т-регуляторные клетки
1.2 Иммунорегуляторные субпопуляции натуральных киллерных
клеток
1.2.1 Натуральные киллерные клетки
1.2.2 Иммунорегуляторные функции натуральных киллерных клеток
1.2.3 Иммунорегуляторные субпопуляции натуральных киллерных
клеток
1.3 NK- и Т-регуляторные клетки при раке молочной железы
2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1 Материалы исследования
2.1.1 Исследуемый материал
2.1.2 Реагенты и материалы
2.1.3 Оборудование
2.2 Методы исследования
2.2.1 Приготовление перколла
2.2.2 Приготовление полной культуральной среды
2.2.3 Культивирование клеток
2.2.4 Выделение клеток
2.2.5 Оценка супрессорной активности субпопуляций Treg-клеток2.2.6 Оценка супрессорной активности HLA-G+ NK-клеток
2.2.7 Проточная цитофлуориметрия
2.2.8 ELISPOT анализ
2.2.9 ПЦР анализ
2.2.10 Статистическая обработка данных
3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1 Изучение Т-регуляторных клеток в норме и при раке молочной
железы
3.1.1 Анализ естественных Т-регуляторных клеток здоровых доноров
и больных раком молочной железы
3.1.2 Tr1-, Th3- и Treg-17-клетки в норме и при раке молочной
железы
3.1.3 Изучение CD3+HLA-G+ регуляторной популяции клеток
периферической крови здоровых доноров и больных РМЖ
3.1.4 Изучение гиалуронан-связывающих и -несвязывающих Tрегуляторных клеток здоровых доноров и больных раком молочной
железы
3.2 Изучение регуляторных субпопуляций NK-клеток в норме и при
2
4
7
12
12
12
17
29
38
38
42
45
48
54
54
54
54
55
56
56
56
56
57
58
58
59
60
60
60
61
61
61
68
79
83
97
раке молочной железы
3.2.1 Изучение экспрессии IL-10 и TGF-β NK-клетками здоровых
доноров и больных РМЖ
3.2.2 Изучение HLA-G+ NK-клеток здоровых доноров и больных
РМЖ
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ
3
97
106
120
123
ОПРЕДЕЛЕНИЯ, ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ
В настоящей диссертации применяют следующие термины с
соответствующими определениями:
Иммунологическая толерантность (лат. tolerantia - терпение) – это
распознавание и специфическая терпимость иммунной системы к
определенным антигенам. Иммунологическую толерантность подразделяют на
физиологическую, патологическую и искусственную.
Иммуносупрессия — угнетение иммунитета по той или иной причине.
Иммуносупрессия бывает физиологической (необходимой в определѐнных
ситуациях для организма), патологической (при различных заболеваниях и
патологических состояниях) и искусственной, вызываемой воздействием ряда
иммуносупрессорных препаратов и/или ионизирующим излучением.
Мононуклеары – клетки лимфоидного и миелоидного происхождения с
круглым или овальным ядром и ясно очерченными контурами цитоплазмы,
лишенной специфической зернистости.
Также в работе используются следующие сокращения:
APC – antigen-presenting cells (антиген-презентирующие клетки)
ATP – adenosine triphosphate (аденозинтрифосфат)
BSA – bovine serum albumin (бычий сывороточный альбумин)
CD – cluster of differentiation (фенотипический маркер клеток)
CFSE – 5(6)-Carboxyfluorescein diacetate N-succinimidyl ester
CTL – сytotoxic T-Lymphocytes (цитотоксические Т-лимфоциты)
CTLA4 – сytotoxic T-Lymphocyte Antigen 4 (антиген-4 цитолитических Тлимфоцитов CD152)
DC – dendritic cells (дендритные клетки)
EBI3 – Epstein-Barr virus induced gene 3 (ген-3, индуцированный вирусом
Эпштейна-Барра)
EDTA – ethylenediaminetetraacetic acid (этилендиаминотетраацетат)
ELISPOT – Enzyme-linked immunosorbent spot (иммуноферментный пятенный
анализ)
FBS – fetal bovine serum (фетальная бычья сыворотка)
FMO – fluorescence minus one (контроль флуоресценции минус один)
FoxP3 – forkhead box 3 (транскрипционный фактор)
GITR – glucocorticoid induced tumor necrosis factor receptor (индуцируемый
глюкокортикоидами TNF-подобный рецептор)
GVHD – graft versus host disease (болезнь "трансплантат против хозяина")
НА – hyaluronan (гиалуронан)
HLA – human leucocyte antigens (лейкоцитарные антигены главного комплекса
гистосовместимости человека)
HNSCC – head and neck squamous cell carcenoma (плоскоклеточная карцинома
головы и шеи)
i – intracellular (внутриклеточный)
IBD – inflammatory bowel disease (воспалительная болезнь кишечника)
iDC – immature dendritic cells (незрелые дендритные клетки)
4
IDO – indoleamine-pyrrole 2,3-dioxygenase (энзим-индолеамин-2,3дезоксигеназа)
IFN-γ – interferon-gamma (интерферон-γ)
IKDC – interferon-producing killer dendritic cells (производящие интерферон
дендритные киллерные клетки)
IL – interleukin (интерлейкин)
ILT – receptors of immunoglobulin-like transcripts (рецепторы иммуноглобулинподобных транскриптов)
ITIM – immunoreceptor tyrosin-based inhibition motif (ингибирующий тирозинсодержащий мотив иммунорецепторов)
iTreg – induced T regulatory cells (индуцированные Т-регуляторные клетки)
ITSM – immunoreceptor tyrosine-based switch motif (иммунорецептор тирозинзависимых мотивов выключения)
KIR – killer-cell immunoglobulin-like receptor (иммуноглобулин-подобный
рецептор киллерных клеток)
LAP – latency-associated peptide (пептид латентности)
LFA-1 – lykocyte functional antigen 1 (лейкоцитарный функциональный антиген1)
LTBP – latent TGF-β-binding protein (латентный TGF-β-связывающий белок)
mb – membrane-bound (мембран-связанный)
mDC – mature dendritic cells (зрелые дендритные клетки)
MDSC – myeloid-derived suppressor cells (миелоидные супрессорные клетки)
MHC
–
major
histocompatibility
complex
(главный
комплекс
гистосовместимости)
NК – natural killer cells (натуральные киллерные клетки)
nTreg – natural T regulatory cells (натуральные Т-регуляторные клетки)
PBS – phosphate buffered saline (фосфатно-солевой буферный раствор)
PD-1 – programmed death-1 receptor (рецептор программируемой клеточной
гибели-1)
PD-L – programmed death-1 ligand (лиганд программируемой клеточной гибели1)
PGE2 – prostaglandin E2 (простагландин Е2)
PHA – phytohemagglutinin (фитогемагглютинин)
PI – propidium iodide (пропидиум иодит)
SCID – severe combined immunodeficiency (тяжелая комбинированная иммунная
недостаточность)
SD – standart deviation (стандартное отклонение)
STAT – signal transducer and activator of transcription molecules (трансдуктор
сигналов и активатор транскрипции)
Tcon – T conventional cells (субпопуляция наивных CD4+CD25--Т-лимфоцитов)
TCR – T cell receptor (Т-клеточный рецептор)
TGF-β – transforming growth factor-beta (трансформирующий фактор роста-β)
Th – T helper cells (Т-хелперы)
TLR – toll-like receptors (толл-подобные рецепторы)
TNF-α – tumor necrosis factor (фактор некроза опухоли-альфа)
5
Tr1 – T regulatory cells type 1 (Т-регуляторные клетки 1 типа)
Treg-17 – IL-17-producing T regulatory cells (IL-17-продуцирующие Трегуляторные клетки)
Treg – T regulatory cells (Т-регуляторные клетки)
TSI – T suppression inspector (Т-супрессорный инспектор)
VEGF – vascular endothelial growth factor (фактора роста васкулярного
эндотелия)
АГ – антиген
АТ – антитело
ВИЧ – вирус иммунодефицита человека
ГМ-КСФ – гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор
M – средняя арифметическая величина
МКСФ – макрофагальный колониестимулирующий фактор
МНПК – мононуклеары периферической крови
ПК – периферическая кровь
ПКС – полная культуральная среда
РАК – рецепторы для активаторов киллерных клеток
РИК – рецепторы для ингибиторов
РМЖ – рак молочной железы
6
ВВЕДЕНИЕ
Поддержание иммунного гомеостаза обеспечивает защиту организма от
различных проявлений биологической агрессии, как экзогенного, так и
эндогенного характера. Данную функцию выполняет комплекс иммунной
регуляторной системы, к которой относится сеть иммунорегуляторных клеток.
В мировой литературе в последнее время активно обсуждается вопрос о роли
иммунорегуляторных клеток в развитии патологических состояний, таких как
онкологические и аутоиммунные заболевания, аллергия, нарушение
нормального течения беременности и невынашивание плода и т.д.
Согласно современной парадигме, ускользание опухоли от иммунного
надзора и несостоятельность иммунного ответа при раке обусловлены
различными механизмами, обеспечивающими общий иммуносупрессорный
фон в опухолевом микроокружении. В последнее время стало ясным, что
опухолевые клетки сами способны создавать толерогенное микроокружение и
использовать иммуносупрессорные механизмы для защиты от иммуного ответа.
В этом же контексте в последние годы активно обсуждается роль регуляторных
клеток, обладающих супрессорной активностью [1].
Одним из основных звеньев супрессорного пула иммуноцитов являются Трегуляторные клетки (Treg-клетки). Treg-клетки играют одну из ключевых
регулирующих ролей в иммуной системе и аккумулирование таких клеток в
опухолевом микроокружение вносит значительный вклад в подавление
противоопухолевого иммунного ответа. Согласно результатам многих
исследований у пациентов со злокачественными новообразованиями, в том
числе и у больных раком молочной железы (РМЖ), содержание
CD4+CD25+Foxp3+-лимфоцитов увеличено как в периферической крови, так и в
опухолевой ткани [2]. Инфильтрация Treg-клеток опухоли и количество данных
клеток практически при всех типах рака и при РМЖ коррелирует со стадией
заболевания и низкой выживаемостью пациентов, что может указывать на
важное прогностическое значение этих клеток. Возрастание численности Tregклеток рассматривается в качестве одной из причин неэффективности
иммунной защиты при опухолевом росте. А при их элиминации, как было
показано в экспериментах на мышах, происходит отторжение или уменьшение
размеров опухоли [3].
Не смотря на то, что негативный вклад Treg-клеток в развитие
онкологических заболеваний считается доказанным, до сих пор существует
много вопросов по поводу функциональной активности и фенотипических
характеристик различных субпопуляций Treg-клеток и их роли при развитие
РМЖ. Известно, что как образованные в тимусе, естественные T-регуляторные
клетки (nTreg), так и индуцированные на периферии (iTreg), обладают сильной
супрессорной ативностью по отношению к функциям эффекторных Тлимфоцитов и других иммунных клеток, вызывая значительную
иммунодепрессию в микроокружении опухоли. Однако роль некоторых
субпопуляций Treg-клеток остается не изученной при онкологических
заболеваниях. В частности представляет значительный интерес вопрос о
7
выявлении их субпопуляций, за счет которых повышается общий пул Tregклеток в опухоли. Этот вопрос важен для разработки эффективных методов их
удаления из организма в ходе противоопухолевой терапии. Известно, что в
опухолевом микроокружении и в циркулирующей крови при раке содержатся
молекулы, способные активировать Treg-клетки и индуцировать образование
многих субпопуляций iTreg-клеток. Количественный состав и функциональная
активность основных субпопуляций Treg-клеток периферической крови (ПК)
больных РМЖ до сих пор не изучены [4]. Также, важное значение имеет
изучение механизмов активной миграции Treg-клеток в область опухоли,
значительную
роль
в
которых
отводят
способности
связывать
высокомелекулярный гиалуронан (НА) [5]. По этой причине, комплексный
анализ основных субпопуляций Treg-клеток ПК больных РМЖ является
наиболее
перспективным
для
раскрытия
механизмов
супрессии
противоопухолевого иммунитета и развития РМЖ.
Натуральные киллерные клетки (NК) являются одним из главных звеньев
противоопухолевого иммунитета. Помимо общепринятой киллерной функции,
к настоящему времени накоплено большое количество данных,
свидетельствующих о наличии у NК-клеток регуляторных свойств и активно
обсуждается вопрос о существование регуляторной субпопуляция NК-клеток
[6]. Иммунорегуляторную функцию традиционно связывают с цитокинпродуцирующей CD56bright субпопуляции NK-клеток, в то время как CD56dim NK
в основном обладают цитолитическими свойствами [7]. Тем не менее, в обеих
субпопуляциях NК-клеток были обнаружены клетки, продуцирующие
потенциально иммуносупрессорные цитокины [8]. В децидуальной оболочке
были обнаружены супрессорные NK-клетки, экспрессирующие человеческий
лейкоцитарный антиген главного комплекса гистосовместимости класса G
(HLA-G) и IL-10. Клетки с таким же фенотипом были генерированы in vitro из
гемопоэтических клеток человека [9]. На сегодняшний день, в мировой
литературе существует единственная работа, достоверно показывающая
существование регуляторных NК-клеток в ПК людей. Выделение таких клеток
было основанно на секреции интерлейкина-10 (IL-10). IL-10-секретирующие
NК-клетки экспрессировали трансформирующий фактор роста-β (TGF-β) и IL13, и значительно подавляли активность T-лимфоцитов in vitro [10]. Однако
данная субпопуляция не была полностью охарактеризована.
Многочисленные исследования выявили значительное снижение
противоопухолевой активности NK-клеток и общее снижение количества таких
клеток в ПК и опухолевой ткани при различных типах рака, в том числе и при
РМЖ [11, 12]. Не смотря на это, иммунорегуляторные NK-клетки, которые
могут регулировать активность иммунноцитов, в том числе и эффекторных NKклеток, и тем самым, участвовать в развитие онкологических заболеваний, до
сих пор не были изучены при онкологических заболеваниях.
Учитывая вышесказанное, на сегодняшний день является важным
изучение NK- и Т-регуляторных субпопуляций, их фенотипа и происхождения,
анализ их функциональных характеристик, содержания таких клеток и причин
нарушения их гомеостаза и активности при различных заболеваниях, в том
8
числе и при раке. Анализ функциональной активности субпопуляций NK- и Трегуляторных клеток безусловно будет способствовать разработке новых
подходов к таргетной терапии и ранней диагностике РМЖ, следовательно,
выполнение данного исследования является актуальным.
Целью данного исследования является изучение функциональных и
фенотипических характеристик субпопуляций NK- и T-регуляторных клеток
ПК больных раком молочной железы, как потенциальных маркеров подавления
противоопухолевого иммунитета.
Объект исследования - NK- и Т-регуляторные клетки ПК здоровых и
больных раком молочной железы женщин, предметом исследования являются
функциональные и фенотипические характеристики данных клеток.
Исходя из цели исследования, решались следующие задачи:
1. Изучить особенности субпопуляций nTreg- и iTreg-клеток ПК здоровых
доноров и больных РМЖ;
2. Провести анализ содержания и продукции супрессорных цитокинов
HLA-G-экспрессирующими Т-клетками в ПК здоровых доноров и больных
РМЖ;
3. Изучить функциональные и фенотипические характеристики НАсвязывающей субпопуляции Treg-клеток в ПК здоровых доноров и больных
РМЖ;
4. Провести сравнительный анализ содержания и фенотипа IL-10- и TGF-βпродуцирующих NK-клеток ПК здоровых доноров и больных РМЖ;
5. Изучить функциональные и фенотипические характеристики HLA-Gэкспрессирующих NK-клеток ПК здоровых доноров и больных РМЖ.
Работа выполнена на базе лаборатории молекулярной иммунологии и
иммунобиотехнологии Института молекулярной биологии и биохимии им.
М.А. Айтхожина» КН МОН РК, г.Алматы, Казахстан и лаборатории
иммунологии Института экспериментальной медицины Стамбульского
Университета, г.Стамбул, Турция. Все результаты диссертационной работы
были получены с использованием современных методов иммунологии и
методик обработки и интерпретации данных с применением компьютерных
программ. Полученные в ходе исследования данные изложены в 15 научных
публикациях, включающих 4 статьи в журналах, рекомендованных ККСОН
МОН РК и 3 статьи в зарубежных журналах, 2 из которых имеют импактфактор по версии Scopus, а 1 журнал выпускается издательством РАМН
Российской Федерации. Одна статья, принятая в печать зарубежным журналом,
имеющим импакт фактор 1,98 по версии Thomson Reuters. Также, полученные в
ходе исследования данные были представлены и опубликованы в материалах 5
международных научных конференциях в дальнем зарубежье.
Основой методологической базы исследования был эксперимент и
сравнительный анализ групп доноров. Методы исследования включали
иммуномагнитную
сепарацию,
проточную
цитофлуориметрию,
иммунофлуоресцентный сортинг, изопикническое центрифугирование в
градиенте плотности, микроскопию, культивирование клеток, полимеразную
цепную реакцию и иммуноферментный пятенный анализ (ELISPOT).
9
В результате проведенных исследований получены новые данные о
содержании и функциональной активности субпопуляций nTreg-клеток при
РМЖ. Впервые изучена функциональная активность субпопуляций iTregклеток ПК в норме и при РМЖ. Выявленные супрессорные молекулы,
экспрессирующиеся клетками различных субпопуляций iTreg-клеток,
расширяют представления о механизмах их супрессорной активности. Впервые
показано, что уровень HLA-G-экспрессирующих Т-клеток в ПК при РМЖ
повышен по сравнению со здоровыми донорами.
Проведенные нами исследования показали увеличение доли большинства
субпопуляций Treg-клеток и их функциональной активности при РМЖ и
раскрыли некоторые механизмы, вероятнее всего влияющие на
иммуносупрессию при этом заболевании, в том числе и опосредованные Tregклетками.
В ходе выполнения работы разработан метод выделения и оценки Tregклеток, связывающих молекулу высокомолекулярного гиалуронана (НА),
главного компонента внеклеточного матрикса. Впервые установлено, что
способность связывать НА дискриминирует Treg-клетки преимущественно с
фенотипом CD4+CD25+FoxP3+ и обладающих повышенной супрессорной
активностью. Впервые установлено, что в ПК больных РМЖ соотношение
Treg-клеток, связывающих и не связывающих НА, выше, чем у здоровых
доноров. Причем при РМЖ в НА-связывающей фракции Treg-клеток
наблюдается увеличение доли клеток, несущих CD39, маркер супрессорной
активности, что свидетельствует о повышенной тропности Treg-клеток с
высокой супрессорной активностью к ткани опухоли, содержащей высокий
уровень свободного высокомолекулярного НА.
Впервые показано, что уровень циркулирующих в ПК NK-клеток,
экспрессирующих супрессорные цитокины (IL-10 и TGF-β), повышен у
больных РМЖ по сравнению со здоровыми донорами. Впервые обнаружена и
описана иммуносупрессорная субпопуляция NK-клеток, экспрессирующих
супрессорную молекулу HLA-G, уровень которых повышен у больных РМЖ.
Установлено
супрессорное
влияние
регуляторных
NK-клеток
на
функциональную активность важнейших факторов противоопухолевого
иммунного ответа.
Данная работа вносит вклад в развитие фундаментальных аспектов
клеточной
и
молекулярной
онкоиммунологии.
Так,
обнаружение
иммунорегуляторной субпопуляции NK-клеток человека позволяет по-новому
посмотреть на природу NK-клеточного иммунитета, в том числе при
онкологическом процессе. Полученные данные позволяют предположить, что
важной причиной неэффективности противоопухолевого иммунного ответа при
РМЖ является повышенное содержание и функциональная активность NK- и
Тreg-клеток.
Прикладной потенциал исследования заключается в возможности
использования результатов данного исследования в разработке новых подходов
к ранней диагностике и иммунотерапии РМЖ.
10
В ходе выполнения исследования был разработан и внедрен в лабораторию
молекулярной иммунологии и иммунобиотехнологии Института молекулярной
биологии и биохимии им.М.А.Айтхожина ряд новых методов, в том числе
метод физического разделения клеток периферической крови на фракции,
связывающие и не связывающие молекулу высокомолекулярного НА, а также
метод проточной цитофлуориметрии применительно к оценке супрессорной
активности Treg-клеток и цитотоксичности NK-клеток с использованием
флуоресцентного красителя CFSE.
Положения, выносимые на защиту
1 Впервые выявлено, что циркулирующая в ПК здоровых людей
субпопуляция наивных nTreg-клеток отличается большей экспрессией маркера
функциональной активности LAP от субпопуляций эффекторных nTreg-клеток
и клеток памяти, в то время как nTreg эффекторы/клетки памяти отличаются от
наивных nTreg-клеток большей экспрессией CTLA-4. РМЖ характеризуется
увеличением доли всех циркулирующих субпопуляций nTreg-клеток и
повышенным уровнем экспрессии маркеров функциональной активности
(GITR, LAP, CD39, IL-35);
2 Впервые
IL-17-продуцирующие
iTreg-клетки
(iTreg-17),
экспрессирующие маркеры функциональной активности LAP и GITR,
обнаружены в ПК здоровых людей. У больных РМЖ содержание CD25+ iTreg17-клеток повышено в два раза, причем данные клетки дополнительно
приобретают экспрессию CTLA-4, CD39 и IL-35.
3 Впервые показано, что в ПК здоровых людей циркулируют Tr1-клетки,
экспрессирующие CD25, FoxP3, GITR, CTLA-4, LAP, CD39 и IL-35. При РМЖ
повышена доля циркулирующих Tr1-клеток, экспрессирующих CD25, FoxP3,
CD39 и IL-35;
4 Впервые обнаружено повышение доли циркулирующих HLA-G+ Тклеток, продуцирующих IL-10 при РМЖ;
5 Впервые выявлено, что фракция Т-клеток ПК здоровых людей,
связывающих высокомолекулярный НА содержит больше Treg-клеток с
фенотипом CD4+CD25+FoxP3+ и обладает повышенной супрессорной
активностью, чем не связывающая НА. Также обнаружено, что РМЖ
характеризуется повышенным содержанием НА-связывающих Treg-клеток,
экспрессирующих маркер функциональной активности CD39;
6 Впервые обнаружена экспрессия супрессорной молекулы HLA-G
минорной субпопуляцией NK-клеток ПК здоровых людей. HLA-G+ NK-клетки
обладают регуляторными свойствами, выражающимися в подавление
цитолитической активности NK. В ПК больных РМЖ увеличено содержание
регуляторных NK-клеток, экспрессирующих HLA-G, IL-10 и TGF-β.
11
1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1
Т-регуляторные клетки и их роль в иммунной системе
1.1.1 Общие положения о Т-регуляторных клетках
Иммунная система обеспечивает защиту от атаки инфекционных агентов,
распознавая собственные и чужеродные антигены (АГ), и предотвращает
развитие аутоиммунных заболеваний через толерантность к аутоантигенам.
Неадекватный иммунный ответ (например, иммунный ответ к аутоантигенам,
иммунная толерантность или чрезмерный иммунный ответ к чужеродным АГ)
может привести к повреждению собственных тканей [13, 14]. Поддержание
иммунного гомеостаза обеспечивает комплекс иммунной регуляторной
системы, например, сеть цитокинов, идиотипическая и антиидиотипическая
сеть, а также регулирующая сеть среди иммуноцитов, развившаяся в ходе
филогенеза иммунной системы [15-18]. Нарушение процессов иммунной
регуляции ведет к развитию различных патологических состояний [17, p. 498].
Одной из основных популяций клеток, регулирующих иммунный ответ,
является группа Treg-клеток, представляющая собой гетерогенную популяцию
Т-лимфоцитов, доминантный пул которых относится к CD4+-клеткам, несущим
на своей поверхности α-цепь рецептора к интерлейкину-2 (IL-2) – CD25.
Содержание СD25+-клеток в популяции зрелых СD4+-Т-клеток взрослых
здоровых людей составляет 2-10% [19]. Регуляторная, т.е. супрессорная,
функция Treg-клеток является единственной их функцией, что отличает их от
всех других видов иммунорегуляторных клеток. Было показано, что уровень
CD4+CD25+-клеток в крови несколько повышается с возрастом без
существенных изменений их функциональной активности [20]. Численность и
активность CD4+CD25+-клеток контролируется генетически, к примеру,
показано, что у мышей линии ВАLВ/с их больше, чем у мышей С57ВL/6 [21].
Впервые Treg-клетки были описаны в середине 90-х годов, когда Sakaguchi
S. и соавт. установили, что субпопуляция СD4+СD25+-Т-лимфоцитов
предотвращает развитие аутоиммунных заболеваний у мышей [22-24].
Pегуляторная функция CD4+CD25+-клеток была показана в опытах с их
удалением или переносом in vivo и in vitro. Перенос бестимусным мышам nude
популяции сингенных Т-клеток, из которой путем обработки моноклональными
антителами (АТ) были удалены СD25+-лимфоциты, приводил не только к
восстановлению иммунной реактивности, но и к сопутствующему развитию
аутоиммунного поражения ряда органов. Добавление к вводимой суспензии
CD4+CD25+-клеток предотвращало формирование аутоиммунного процесса
[23]. Введение CD4+CD25+-клеток в культуру СD4+СD25--лимфоцитов,
стимулированных смесью АТ к CD3 и CD28 или митогенными лектинами,
ослабляло их пролиферацию и секрецию цитокинов [25].
Было получено много противоречивых данных о природе этих клеток.
Помимо гетерогенности в экспрессии маркеров и цитоплазматических белков,
были опубликованы работы, показывающие различные пути образования Tregклеток. Сначала общепринято было считать, что образование Treg-клеток
происходит в тимусе, о чем свидетельствовало много данных, полученных в
12
экспериментах на мышах и с использованием человеческого материала. Затем
Т-лимфоциты, обладающие супрессорными свойствами, были получены в
условиях in vitro из зрелых активированных CD4+ T-клеток. Далее было
опубликовано много работ по получению Treg-клеток из Tcon-клеток при их
культивировании в особых условиях. Также вызывали споры различия в
механизмах супрессии in vitro и in vivo и их зависимости от условий инкубации
и микроокружения, а также относительно вклада в ингибиторную активность
Treg-клеток растворимых цитокинов и межклеточного взаимодействия [26].
Таким образом, был сделан вывод о существовании нескольких субпопуляций
Treg-клеток, классификация и природа которых до сих пор остаются мало
изученными [27].
На сегодняшний день, наиболее обоснованной считается классификация
Treg-клеток, основанная на различиях в дифференцировке, специфичности и
механизмах супрессии, разделяющая пул Treg-клеток на: nTreg-клетки и iTregклетки.
Основная часть Т-супрессоров – это nTreg-клетки, созревающие в тимусе в
ходе нормального биогенеза Т-лимфоцитов и имеющие основной фенотип –
CD4+CD25+FoxP3+. Данная субпопуляция образуется в нормальных
физиологических условиях для предотвращения потенциально патологических
аутоиммунных реакций, может быть также найдена в ПК и вторичных
лимфоидных органах и относится к долгоживущим субпопуляциям. Также, к Трегуляторным лимфоцитам, имеющим тимусное происхождение, относят
CD8+CD122+-клетки [28] и, частично к натуральным, частично к iTreg-клеткам,
относят CD4+ и CD8+ Т-лимфоциты, экспрессирующие молекулу HLA-G [29,
30]. Остальные субпопуляции Treg-клеток индуцируются на периферии в ходе
иммунного ответа из наивных Т-лимфоцитов или nTreg-клеток под влиянием
стимуляции и/или ко-стимуляции активирующими агентами, в частности при
ответе на оптимальные концентрации АГ, и эти клетки обозначают как iTregклетки. Считается, что основным условием образования iTreg-клетокявляется
присутствие супрессорных цитокинов [31-33]. К таким субпопуляциям
относятся Т-регуляторные клетки 1-го типа (Tr1) и Т-хелперы (Th) 3-го типа.
Супрессорная активность показана также для индуцированных на периферии
СD8+СD28–-, γδ Т-, NКТ- и СD4+СD8+-клеток [34-38]. В последнее время
активно обсуждается функция IL-17-продуцирующих CD4+-клеток (Treg- -17клетки) в подавлении пролиферации эффекторных Т-лимфоцитов и их участия
в воспалительных процессах. Так как экспрессия IL-17 не была обнаружена
среди тимоцитов, считается, что данная субпопуляция Treg-клеток
индуцируется на периферии из CD4+CD25+FoxP3+ в ходе стимуляции Тклеточного рецептора (TCR) [39].
Поскольку вся история изучения Treg-клеток укладывается в последние
три десятилетия, изучение их роли в патологии иммунной системы делает лишь
первые шаги. Тем не менее, установлены многочисленные факты,
свидетельствующие о важной роли этих клеток в развитии или предупреждении
иммунопатологии, а также инфекционных и опухолевых заболеваний [40].
Необходимо отметить, что сообщения о существовании различных
13
субпопуляций Treg-клеток стали публиковаться сравнительно недавно. До сих
пор фенотип, образование и механизмы супрессии различных субпопуляций
Treg-клеток остаются малоизученными. Наиболее хорошо изучена
регуляторная активность СD4+СD25+FoxР3+-клеток без уточнения их
принадлежности к известным субпопуляциям Treg-клеток, поэтому в данной
главе мы рассмотрим участие именно таких клеток в развитии различных
патологических состояний.
В настоящее время принято считать, что основное предназначение Tregклеток состоит в поддержании иммунологической толерантности к
собственным АГ и предотвращении аутоиммунных процессов. Несмотря на то,
что в тимусе происходит элиминация аутоспецифических клонов в процессе
отрицательной селекции, часть клонов попадает в периферический отдел
иммунной системы в составе пула зрелых Т-лимфоцитов, вероятно, в силу
отсутствия экспрессии в тимусе некоторых органоспецифических АГ,
присутствующих на периферии. Аутоагрессия предотвращается путем блокады
аутореактивных клонов nТreg-клетками, распознающими те же аутоантигены
[41, 42]. Эти представления основываются в первую очередь на последствиях
отключения гена foxp3, удаления nTreg-клеток или предотвращения их
активной пролиферации в условиях дефицита IL-2. Во всех этих случаях
развивается полиспецифическая аутоиммунная патология с воспалительным
поражением кишечника (IBD) [41, p. 531; 43]. С другой стороны,
иммунологическая толерантность к определенным аутоантигенам может быть
индуцирована путем переноса Treg-клеток, специфичных в отношении этих АГ.
Так, перенос самкам мышей CD4+CD25- Т-клеток, в которые были введены
гены foxp3 и TCR, специфичных к АГ самца H-Y, обеспечивает развитие
иммунологической толерантности к трансплантату кожи сингенных самцов
[44]. Удаление nTreg -клеток приводит к развитию IBD именно вследствие
срыва толерантности к АГ симбиотических микроорганизмов кишечника [45,
46].
Активация Treg-клеток регистрируется также при иммунном ответе на
чужеродные АГ. При этом спектр специфичности CD4+CD25+-клеток,
участвующих в иммунном ответе, не отличается от такового эффекторных Тклеток [47]. Содержание активных CD4+CD25+FoxP3+-клеток возрастает in vitro
в смешанной культуре лейкоцитов с максимумом на 5 сутки и in vivo при
отторжении аллотрансплантата [48], препятствуя его отторжению [49].
Условием активации Treg-клеток при аллотрансплантации служит поступление
АГ в региональные лимфатические узлы в составе дендритных клеток (DC), что
отражает обязательность процесса презентации АГ для активации Treg-клеток.
Снижение уровня CD4+CD25+-клеток может приводить к усилению реакции на
аллотрансплантат [50, 51] и способствовать развитию реакции «трансплантат
против хозяина» [52].
В некоторых случаях (особенно при генетически обусловленном усилении
их активности), участие Treg-клеток может сыграть отрицательную роль,
ослабляя эффективность иммунной защиты. Так, при лейшманиозе
сдерживающая функция Treg-клеток может приводить к ослаблению иммунной
14
защиты и хронизации процесса. В качестве действующего фактора при этом
выступает TGF-β1 [53]. При вирусных инфекциях CD4+CD25+-клетки,
активируемые возбудителем, могут быть причиной развития иммунодефицита,
способствовать генерализации инфекции, повышения чувствительности
организма к инфицированию другими патогенами и к развитию опухолей. В
опытах с избыточной трансфекцией гена foxp3 установлено, что ее следствием
является подавление функциональной активности Т-клеток. Treg-клеткам
принадлежит важная роль в формировании поствирусного Т-клеточного
иммунодефицита [54].
Накапливаются
сведения
об
особенностях
субпопуляции
+
+
+
+
+
CD4 CD25 FOXP3 -клеток при ВИЧ-инфекции. CD4 CD25 FOXP3+ Tregклетки высокочувствительны к инфицированию ВИЧ. Степень снижения их
содержания может служить показателем прогрессирования ВИЧ-инфекции [55].
В то же время сообщалось, что повышение уровня вирусной РНК в циркуляции
сопровождается нарастанием содержания таких клеток при низкой численности
CD4+-лимфоцитов [56]. Введение IL-2 ВИЧ-инфицированным пациентам
вызывает экспансию CD4+CD25+CD45RО+-клеток с высоким уровнем
экспрессии FoxP3, но слабой супрессорной активностью; предполагается, что
эти клетки ответственны за замедление оборота CD4+- лимфоцитов [57].
Treg-клетки контролируют реакции не только адаптивного, но и
врожденного иммунитета. Благодаря наличию на их поверхности толлподобных рецепторов (TLR) они активируются теми же факторами, которые
включают эффекторные клетки врожденного иммунитета. Так, действие
соответствующих лигандов (например, бактериальных липополисахаридов,
распознаваемых ТLR4-рецептором) повышает выживаемость CD4+CD25+клеток, усиливает экспрессию ряда их маркеров, десятикратно усиливает
супрессорную активность. Полагают, что усиление активности Treg-клеток в
результате повторной стимуляции патогенами обусловлено не только
формированием клеток памяти, но и экспансией регуляторных клеток под
влиянием активации через TLR [58].
Показано повышение содержания CD4+CD25+FoxP3+- CD4+HLA-G+-клеток
[30, p. 3] в циркуляции и в децидуальной оболочке плаценты, а также связь
спонтанных выкидышей с дефицитом этих клеток [59], что позволяет
предположить их роль в предотвращении отторжения несовместимого плода.
Нарушение содержания Treg-клеток и их соотношения с Т-эффекторами
может быть обусловлено генетическими нарушениями (дефекты генов FoxРЗ,
антигенa-4 цитолитических Т-лимфоцитов (CTLA4 или CD152), СD40, IL-2,
TGF-β, СD25, СD122) и действием экзогенных повреждающих агентов. Так,
CD4+CD25+-клетки высокочувствительны к действию многих физических
факторов, например, к фракционированному рентгеновскому облучению,
которое повреждает их в большей степени, чем другие Т-лимфоциты [60]. Они
повреждаются также при действии ряда химических (например, циклоспорин
А) факторов [41, p. 348].
Поскольку основная функция Тregs состоит в предотвращении проявлений
активности аутоспецифических Т-клеток, развитие аутоиммунных процессов в
15
той или иной степени должно быть сопряжено с недостаточностью этих клеток
[61]. Аутоиммунная патология проявляется, в максимальной степени при
генетических дефектах, затрагивающих развитие nТreg-клеток, прежде всего
при IРЕХ-синдроме. У человека, как и у мыши, IРЕХ-синдром, развивается
вследствие мутаций гена FoxР3 [41, p. 346; 62, 63]. Сформулирована
концепция, согласно которой FoxРЗ служит своеобразным иммунологическим
реостатом: его недостаточная экспрессия сопряжена с развитием
аутоиммунных процессов, а избыточная — с формированием иммунодефицита
[64].
При генетически обусловленном дефиците IL-2 наблюдаются сходные
поражения
–
IBD,
аутоиммунное
поражение
ряда
органов,
лимфопролиферативные проявления; установлена связь этой патологии с
дефицитом CD4+CD25+-клеток [61, p. 925]. Существуют и другие, менее
радикальные дефекты nTreg-клеток, например, вызванные нарушением
экспрессии функционально значимых молекул nTreg-клеток, таких как CTLA-4
и индуцируемый глюкокортикоидами TNF-подобный рецептор (GITR),
обусловливающие поражение отдельных органов.
Снижение содержания FoxР3+-Т-клеток описано при рассеянном склерозе
[65], при ревматоидном артрите [66]. Снижение содержания CD4+CD25+-клеток
приводит к возникновению тяжелого IBD, вызванного условно-патогенной
микрофлорой [67]. При болезни Крона описано несколько типов мутаций,
затрагивающих ген foxp3 [68]. В литературе имеются данные о защитной роли
Treg-клеток при аутоиммунной патологии: тиреоидите, гастрите, оофорите,
орхите [23, p. 1152], болезни Крона и язвенном колите [56, p. 169].
Высказано мнение, что важнейшим патогенетическим фактором
аллергических заболеваний является дисбаланс Тh2-клеток и различных
субпопуляций Treg-клеток [69]. Основой представлений об участии nTregклеток в ограничении аллергических процессов, явился факт наличия
аллергических проявлений у носителей мутаций гена FoxP3 – детей с IPEXсиндромом. У них наблюдается экзематозное поражение кожи, пищевая
аллергия с эозинофилией и повышенным уровнем IgE [70].
Treg-клетки рассматриваются в настоящее время как участники реакции
организма на опухоль, способствующие формированию иммунологической
толерантности на опухолевые АГ [71]. Кроме этого, обнаружены две формы
лимфопролиферативных процессов, при которых малигнизированные клетки
представляют собой Treg-клетки. Одно из этих заболеваний — Т-клеточный
лимфолейкоз взрослых, вызываемый вирусом HTLV-1. Лейкозные клетки при
этом заболевании имеют мембранный фенотип nTreg-клеток и экспрессируют
FoxP3. Они супрессируют пролиферацию нормальных Т-клеток. Экспрессия
мембранной молекулы GITR индуцируется вирусным трансактиватором Tax и
связана
с
прогрессией
лейкозного
процесса
[72].
Другой
лимфопролиферативный процесс, затрагивающий Treg-клетки – это кожная Тклеточная лимфома [73]. Клетки лимфомы несут на поверхности типичные
маркеры nTreg-клеток, секретируют IL-10 и TGF-β, подавляют митогениндуцированную пролиферацию Т-клеток и секрецию ими IL-2 и интерферона16
γ (IFN-γ). При этом заболевании пролиферация злокачественных Тreg-клеток
индуцируется незрелыми дендритными клетками (iDC), презентирующими
аутоантигены, которые поступают в них из аутологичных апоптотических
клеток.
При хроническом В-клеточном лимфолейкозе также повышено
содержание
трансформированных
супрессорных
СD4+СD25+СТLА4+GITR+FoxРЗ+-Т-клеток, что коррелирует с неблагоприятным течением
лейкоза. Эти клетки подавляют пролиферативный ответ Т-лимфоцитов
больного на аллогенные и собственные лейкозные В-клетки; подавление
отменяется при обработке Тreg-клеток АТ к СТLА-4. Лечение больных Вклеточным лимфолейкозом циклофосфамидом и флударабином приводит к
снижению содержания Тreg-клеток [74].
Таким образом, Treg-клетки играют важную роль в поддержании
иммунного гомеастаза, и поэтому раскрытие признаков, механизмов индукции
и супрессии различных субпопуляций Treg-клеток даст возможность
разработать эффективные подходы в терапии многих заболеваний.
1.1.2 Натуральные Т-регуляторные клетки
nTreg-клетки являются неотъемлемыми участниками иммунной системы.
nTreg-клетки начинают развиваться в тимусе с самого начала его активности на
ранних стадиях неонатального периода жизни. Данная субпопуляция
называется натуральной, так как она постоянно присутствует у здоровых
индивидуумов и осуществляет свою регуляторную функцию по надзору за
аутоантигенами в норме и при различных патологиях.
Основываясь на разнообразии собственных и чужеродных АГ, которые
способны связывать nTreg-клетки, данные клетки являются поликлональными и
их TCR способны связывать широкий спектр аутоантигенов, но до сих пор
неизвестно предназначены ли они для распознавания определенного
типа/группы или же всех аутоантигенов. В то время как компоненты TCR
являются одинаковыми для nTreg-клеток и Т-эффекторных клеток, их набор
резко отличается. TCR на nTreg -клетках обладают большей аффиностью к
молекуле главного комплекса гистосовместимости (MHC) II класса, чем набор
TCR на Т-эффекторах [75]. nTreg-клетки отличаются от эффекторных Тлимфоцитов и по экспрессии мембранных маркеров [76]. В отличие от Тэффекторных клеток, экспрессия CD25 в которых является кратковременной
после их активации, nTreg-клетки экспрессируют CD25 постоянно, скорее
всего, в ответ на непрерывное лигирование их TCR аутоантигенами на
периферии, даже в отсутствии воспалительных реакций [77]. Было показано,
что nТreg-клетки сильно экспрессируют СD25 (у человека — СD4+СD25high) и
гетерогенны по экспрессии СD38 [41, p. 347]. Считается, что в норме у человека
регуляторные функции выполняют не все СD4+СD25+-лимфоциты, а только их
фракция с высоким уровнем экспрессии СD25 (СD4+СD25high-клетки); на их
долю приходится 2-10% от общего содержания периферических СD4+-клеток
[76, p. 12]. Содержание СD4+СD25+ Тreg-клеток в тимусе составляет около 5%
[78].
17
Относительно экспрессии на nТreg-клетках ряда других молекул (изоформ
СD45R, рецепторов для хемокинов, молекул адгезии) была показана высокая
гетерогенность данной субпопуляции, что было связанно, скорее всего, с
активационным статусом изучаемых клеток [79-81]. Действительно, часть
nТreg-клеток экспрессирует набор молекул, свойственный наивным Т-клеткам
– СD45RА (у мышей – СD45RВ), L-селектина (СD62L), хемокинового
рецептора ССR7, другие клетки несут фенотип комплекса мембранных
молекул, характерных для активированных Т-клеток и клеток памяти –
СD45RО, СD69, IСАМ-1 (СD54), молекул МНС класса II (у человека – НLАDR), αEβ7-интегрина (СD 103), хемокиновых рецепторов ССR5 и ССR6 и
маркеров адгезии, например СD38. Однако из контекста статей не всегда ясно,
действительно ли эти особенности фенотипа nТreg-клеток зависят от «опыта»
их взаимодействия с АГ. Также было показано, что на поверхности nТregклеток отсутствует α-цепь рецептора для IL-7 (СD127) [82], что отличает их,
по-видимому, от всех других Т-клеток и заставляет предположить, что их
гомеостаз определяется иными факторами, чем IL-7.
Также от появляющихся в ходе иммунного ответа активированных
эффекторных СD4+ Т-клеток nТreg-клетки отличают не только по фенотипу, но
и по их функции (супрессорная, а не хелперная). Функционально nТreg-клетки
отличаются от других Т-лимфоцитов тем, что почти не пролиферируют в ответ
на их стимуляцию TCR/анти-CD3, что может быть предотвращено добавлением
высоких доз IL-2 или сильным костимуляторным сигналом [25, p. 289]. В
отличие от Т-эффекторных клеток, nTreg -клетки практически не секретируют
IL-2, также как и Th-специфичные цитокины, такие как IFN-γ, IL-4, IL-5, IL-13
и IL-17 [83].
Ингибитор костимуляции CTLA4 был предложен как основной маркер
nTreg-клеток [84], поскольку эта молекула наиболее ассоциирована с
реализацией супрессорной функции nTreg-клеток. Так, было показано, что
среди CD4+CD25high-клеток наибольшей супрессорной активностью обладали
клетки, экспрессирующие CTLA-4 [85]. В качестве маркера nTreg-клетки
рассматривали и GITR [86]. Также было показано, что Treg-клетки несут на
поверхности целый ряд TLR. Такие рецепторы как TLR4, TLR5, TLR7 и TLR8
экспрессируются на nTreg-клетках селективно, а TLR1, TLR2 и TLR6
определяются и на других разновидностях CD4+-T-клеток [87].
Активные изоформы молекулы клеточной адгезии CD44 были предложены
в качестве маркера, дискриминирующего nTreg-клетки. В функциональных
тестах на мышах было показано, что CD4+CD25+CD44act-клетки обладают
наибольшей регуляторной активностью, и экспрессия CD44 достоверно
коррелирует с экспрессией FoxP3 [88]. Но на сегодняшний день остается
открытым вопрос о происхождении и природе таких Treg-клеток. Также неясно
обладают ли такой же активностью и человеческие CD4+CD25+CD44act -клетки.
Позже наиболее вероятная связь с супрессорной активностью nTreg-клеток
была показана для молекулы FoxР3, локализующейся внутриклеточно [89].
FoxP3 (foxp3 у мышей) – это ген, кодирующий транскрипционный фактор,
который обладает ДНК-связывающим доменом winged helix, или forkhead box
18
("Fox"). Впервые ген этого семейства был описан у Drosophila melanogaster, у
которой была обнаружена мутация fkh (fork head; в переводе с английского это
означает «вильчатая шпинделевая головка», что отражает морфологическое
проявление мутации у дрозофилы), проявляющаяся в нарушении формирования
концевого паттерна у эмбрионов дрозофилы [90].
У человека ген FoxP3 располагается в сегменте pll.23-q13.3 X-хромосомы.
Помимо этого гена, в семейство FOX-генов человека входит еще 42 члена, из
которых 15 причастно к развитию или регуляции иммунной системы. Ген
FoxP3 имеет 11 экзонов [91] и экспрессируется в клетках тимуса, селезенки и
лимфатических узлов. Его белковый продукт – скурфин содержит 431
аминокислотный остаток. В его составе содержатся (от N- к С-концу) домен,
богатый пролином, домен цинковых пальцев, домен лейциновой «застежки» и
специфичный для этой молекулы forkhead-домен [87, p. 430]. Последний домен,
содержащий 110 остатков, определяет функцию скурфина в качестве
транскрипционного фактора, поскольку обладает способностью связываться с
ДНК в промоторных участках некоторых генов. Функционально продукт гена
FoxP3 связан с компонентом Rel транскрипционного фактора NF-kB [92].
Исследование связи FохP3 с развитием и функционированием nТregклеток мышей позволило авторам прийти к выводу, что экспрессия FoxР3
связана с реализацией иммунорегулирующей функции nТreg-клеток [93]. У
человека экспрессия FoxР3 была обнаружена в T-лимфоцитах тимуса и на
периферии [94]. Наличие продукта гена FoxP3 было сопряжено
преимущественно с высоким уровнем экспрессии СD25: FoxР3
экспрессировался практически на всех СD25high клетках и лишь на половине
СD25low клеток [95]. Однако экспрессия FoxР3 в большей степени
коррелировала с наличием супрессорной активности, чем с присутствием
молекулы CD25 на поверхности клетки. Мутации гена foxp3 сопровождались
утратой nTreg-клетками фенотипа CD4+CD25+ и супрессорной активности [96].
Наоборот, трансдукция гена foxp3 в Т-клетки (в том числе в СD25--клетки),
приводила к экспрессии CD25, CTLA-4, GITR, CD103 и проявлению
супрессорной активности, определяемой по подавлению пролиферации Тклеток, а также in vivo по индукции толерантности к несингенному
трансплантату [44, p. 1315].
FoxР3 экспрессия была показана не только в СD4+СD25+-клетках, но и в
небольшой фракции CD25--клеток человека, в связи с этим численность FoxР3клеток несколько выше, чем CD4+CD25+ субпопуляции. Экспрессия FoxР3 была
обнаружена также на части CD8+-клеток, в том числе на супрессорных клетках
с фенотипом CD8+CD28- [46, p. 9]. Обнаружены клетки с мембранным
фенотипом CD8+CD25+CD69+CTLA-4+FoxР3+, обладающие регуляторной
активностью. В связи с отсутствием однозначного соответствия между
экспрессией FoxР3 и фенотипом CD4+CD25+ ставится под сомнение
исключительность FoxP3 в качестве, маркера nTreg-клеток [97]. Однако
недавно проведенный молекулярный анализ показал, что в nTreg -клетках локус
FoxР3 постоянно находится в гипометилированном состояние, в то время как в
iTreg -клетках, генерированных in vitro или in vivo, данный ген неустойчив и
19
представлен непостоянной экспрессией FoxР3, наравне с гипометилированным
состоянием [98]. Таким образом экспрессия FoxР3 также не всегда
ассоциирована с iTreg -клетками [32, p. 123] и, важно подчеркнуть, что FoxР3
не экспрессируется в активированных СD4+СD25+-хелперах – клетках,
фенотипически сходных с nTreg-клетками, но функционально отличных от них
[89, p. 1647].
Так как активированные in vivo наивные CD4+CD25– Т-лимфоциты (Tcon)
могут экспрессировать все основные маркеры Treg-клеток, такие как CD25,
CTLA-4, GITR, активные изоформы CD44 и терять экспрессию CD127 [99], ни
одна из перечисленных молекул не может служить абсолютным маркером этой
функциональной субпопуляции Т-клеток, поэтому для фенотипирования nTregклеток принято использовать комплексный подход и обязательно учитывать
экспрессию FoxР3.
Общепринятым является деление nTreg-клеток на две функционально и
фенотипически различные субпопуляции: СD4+СD25+Foxp3+CD45RA+-наивные
nTreg-клетки и СD4+СD25+Foxp3+CD45RA–, объединяющие эффекторные
nTreg-клетки
(CCR7-CD45RA-CD45RO-)
и
nTreg
-клетки
памяти
+
+
(CCR7 CD45RA CD45RO ), при этом обе субпопуляции обладают
супрессорной активностью in vitro и in vivo [100].
Известно, что после позитивной селекции в тимусе, Т-клетки начинают
экспрессировать лейкоцитарный маркер изотипа CD45RO на своей
поверхности. Затем, во время миграции из тимуса, такие клетки теряют
экспрессию CD45RO и становятся CD45RA+-клетками, и далее, опять
приобретают CD45RO+ фенотип после встречи с АГ на периферии [101 ]. Такой
же сценарий дифференцировки был предложен и для nTreg-клеток. Ранее было
показано, что CD45RO+ nTreg-клетки очень пластичны и восприимчивы к
апоптозу и репликативному старению, что является признаком их
лимитированной способности к самообновлению. В условиях in vitro, CD45RA+
nTreg-клетки очень быстро начинают делиться и дают гомогенную Treg клеточную популяцию, в то время как часть CD45RO+ nTreg-клеток теряет
экспрессию FoxР3 и супрессорную активность. Эти данные предполагают, что
наивные nTreg-клетки играют основную роль в поддержание количества Treg клеточного пула. Недавние исследования также показали, что nTreg-клетки,
экспрессирующие CD45RA могут быть далее классифицированы на
субпопуляции, основываясь на экспрессии молекулы CD31, указывающей на
предварительную активацию и/или пролиферацию клетки на периферии.
CD45RO+
nTreg-клетки
обладают
высокой
пролиферативной
+
способностью, в то время как в CD45RA субпопуляции nTreg-клетки
обнаруживается только около 2% клеток, вошедших в цикл деления. Это
объясняется сменой фенотипа CD45RA+ nTreg-клеток при их пролиферации на
CD45RO+. Тем не менее, CD45RA+ и CD45RO+ nTreg-клетки обладают
различной экспрессией генов, экспрессируют различные тканеспецефичные
хемокиновые рецепторы и локализуются в различных тканях [102]. Таким
образом, nTreg -клетки являются гетерогенной субпопуляцией и CD45RA+ и
CD45RО+ nTreg-клетки представляют собой отличные друг от друга
.
20
субпопуляции, находящиеся на разных стадиях созревания и выполняющие
разные функции.
Особенности дифференцировки nTreg-клеток по сравнению с другими
субпопуляциями Т-клеток до сих пор до конца не выяснены. В то же время
установлено своеобразие селекции клонов этих клеток в тимусе [103]. Оно
состоит в том, что при отрицательной селекции допустимый порог аффинности
TCR рецептора nTreg-клеток к аутологичному пептиду, презентируемому
клетками тимусного микроокружения, выше, чем для других тимоцитов.
Поскольку этот порог определяет элиминацию аутоспецифических клонов в
процессе их отрицательной селекции, его повышение создает возможность
выживания и последующего выхода на периферию nTreg -клеток с достаточно
высоким сродством к аутоантигенам. Однако в связи с особенностями функции
таких клеток (супрессорная, а не эффекторная) это не только не приводит к
аутоагрессии, но гарантирует подавление активности аутоагрессивных
эффекторных клеток, если они по той или иной причине появляются.
Таким образом, распознавание комплекса пептида с MHC II необходимо не
для индукции дифференцировки nTreg-клеток, а для осуществления селекции
клонов [104]. Развитие nTreg-клеток из CD4+CD8+-тимоцитов требует участия
костимулирующей молекулы CD28, точнее ее мотива, с которым связывается
протеинкиназа Lck [105]. Показано, что во внутритимусной индукции nTregклеток участвует также IL-2, но не TGF-β [97, p. 1063]. nTreg-клетки
определяются в медуллярной зоне тимуса в непосредственной связи с DC и
тельцами Гассаля.
Недавно были получены данные, свидетельствующие о возможности
превращении CD4+CD8-CD25--тимоцитов в nTreg-клетки под влиянием
названных клеток микроокружения: в опытах in vitro показано, что под
влиянием CD11с+ DC тимуса в медуллярных CD4+-тимоцитах индуцируется
экспрессия CD25 и FoxP3. Условием реализации этого эффекта является
высокая экспрессия DC костимулирующих молекул CD80 и CD86,
индуцируемая под влиянием цитокина TSLP (Thymic stromal lymphopoietin),
который вырабатывают эпителиальные клетки телец Гассаля [106]. Таким
образом, в тимусе возможна не только дифференцировка nTreg-клеток из
незрелых CD4+CD8+-тимоцитов, но и превращение медуллярных CD4+CD8CD25--тимоцитов, считающихся практически зрелыми клетками, в
регуляторные СD4+СD25+-клетки.
После тимуса nTreg-клетки отправляются на периферию, где участвуют в
защите организма от возможных атак активированных аутореактивных Тлимфоцитов. Стабильность пула nTreg-клеток на периферии обеспечивается
костимуляцией CD28, индуцирующей самообновление данных клеток за счет
механизмов их гомеостатической пролиферации и повышения их устойчивости
к проапоптотическим сигналам. Так, отсутствие CD80/CD86 или CD28 ведет к
резкому снижению количества nTreg-клеток в периферических лимфоидных
органах и развитию аутоиммунных реакций. Для инкубации nTreg-клеток в
условиях in vitro, также необходима сильная стимуляция CD28. Следует
отметить, что эффект, опосредованный CD28 не связан с влиянием IL-2, IL-15,
21
их рецептора (IL-15R) или противоапоптотических молекул Bcl-xL и OX40.
Возможно, что сигналы, опосредованные молекулой CD28, индуцируют
продукцию пока еще не известного цитокина, который действует как фактор
роста и выживания nTreg-клеток [107].
Супрессорное
действие
nTreg-клеток
проявляется
быстро:
свежевыделенные nTreg-клетки под влиянием активации проявляют
супрессорный эффект in vitro уже в первые сутки. Главными клеткамимишенями регуляторного действия nTreg-клеток являются CD4+CD25- и СD8+клетки, отвечающие на аутоантиген, то есть активированные. Наивные Тклетки более чувствительны к действию nTreg-клеток, чем Thl и Тh2 и Т-клетки
памяти [108]. В тимус-зависимых зонах nTreg-клетки обнаруживаются в
прямом контакте с Т-клетками обоих субклассов [109]. При кокультивирование
с Tcon, nTreg-клетки подавляют их пролиферацию и продукцию цитокинов,
прежде всего IFN-γ [82, p. 1248]. nTreg-клетки подавляют дифференцировку
цитотоксических СD8+-лимфоцитов мышей в первые часы ее индукции, но не
проявление функциональной активности; при этом уменьшаются размеры
клеток и ослабляется экспрессия CD25 данными клетками. Хотя стимуляция
nTreg-клеток АГ-специфична, для реализации их супрессорного эффекта не
требуется совпадения их специфичности со специфичностью Т-клетокмишеней, каковыми являются и CD4+, и CD8+Т-лимфоциты [110]. Эту
особенность действия nTreg-клеток предлагается использовать для подавления
нежелательных форм иммунного ответа путем иммунизации посторонним АГ.
Также недавно было показано, что прямыми мишенями nTreg-клеток могут
быть и антигенпрезентирующие клетки (АРС): DC, моноциты/макрофаги, Bлимфоциты [71, p. 4181], а также NK- и NKT-клетки, тучные клетки, базофилы,
эозинофилы и остеобласты [111]. Супрессорный эффект в основном связан с
ингибированием в клетках-мишенях сигнального пути, запускаемого с
участием РI3-киназы и приводящего к формированию фактора Akt; при этом
уровни активации ZAP-70 и Stat-5 не изменяются [112].
Для реализации супрессорного эффекта in vitro требуется активация Tregклеток, что обычно достигается в результате сигнализации через TCR
(активацию CD4+CD25+-клеток следует отличать от рассмотренной ниже
дифференцировки CD4+CD25-- в CD4+CD25+-клетки). nTreg-клетки могут быть
активированы дозами АГ пептида, в 10-100 раз меньшими, чем АГ
необходимого для активации эффекторных Т-клеток, что рассматривается как
свидетельство более высокого сродства TCR nTreg-клеток к АГ, чем у других
Т- клеток [41, p. 349].
Согласно основной парадигме иммунологии, зрелые DC (mDC) являются
основными индукторами иммунного ответа, интегрируя множество
поступающих сигналов и решая необходимо ли запустить защитные или
толерогенные механизмы. Аутоантиген-зависимая активация nTreg-клеток
происходит при условии презентации АГ DC [61, p. 106]: об этом
свидетельствует обнаружение nTreg-клеток в Т-зонах лимфоидных органов в
прямом контакте с DC [95, p. 642], а также разнообразные свидетельства
участия DC в активации nTreg-клеток и других субпопуляций Treg-клеток.
22
Индукторами активации nTreg-клеток являются толерогенные, в частности iDC,
тогда как иммуногенные mDC предотвращают проявление супрессии,
опосредованной Treg-клетками. iDC образуются в отсутствии воспаления, когда
их созревание блокируется. Данные клетки характеризуются экспрессией MHC
II, высокой фагацитарной активностью, низкой экспрессией CD80/CD86; такие
клетки секретируют IL-10, но не IL-12 или фактор некроза опухоли-α (TNF-α).
Кстати, DC стимулированные ЛПС, позволяют обойти зависимость от действии
IL-2 при активации nTreg-клеток [35, p. 1212].
Условием активации и пролиферации nTreg-клеток также является
действие IL-2, этим объясняют дефицит этих клеток у мышей с нокаутом гена
IL-2 [35, p. 1211]. Развитие nTreg-клеток нарушается также при мутациях генов,
детерминирующих α- и β-цепи рецептора IL-2, а также тирозинкиназы Jak-3 и
транскрипционного фактора Stat-5, ответственных за передачу сигнала с
рецептора IL-2 (IL-2R) [113]. Нейтрализация IL-2 АТ или его дефицит,
обусловленный генетически, приводит к снижению содержания CD4 +CD25+
nTreg-клеток,
подавляя
их
пролиферацию,
вызванную
действием
аутоантигенов, но не при гомеостатических процессах [35, p. 1211]. Тем не
менее, данные литературы относительно действия IL-2 на nTreg-клетки
противоречивы. Сообщалось, что действие IL-2 (как и костимуляция через
молекулу CD2), усиливая пролиферацию самих CD4+CD25+-клеток, подавляет
их супрессорную активность in vitro; в то же время и костимуляция, и действие
IL-2 необходимы для реализации регуляторного действия этих клеток in vivo.
Этот факт затем уточняется: митогенный эффект IL-2 в отношении nTregклетои достигается лишь при использовании высоких концентраций цитокина;
пролиферирующие клетки утрачивают супрессорную активность, но после
завершения экспансии супрессорная активность клеток оказывается выше, чем
до действия IL-2. При действии IL-2 на этапе индукции дифференцировки или
активации nTreg-клеток совместно с фиксированными на магнитных бусах АТ
к CD3 и к CD28 может быть достигнута 200-кратная экспансия супрессорных
клеток фенотипа CD4+CD25+CD62L+MHC-II+CCR6+, экспрессирующих FoxP3
[80, p. 5]. В то же время имеются сведения иного характера: действуя на
активированные nTreg-клетки IL-2 не только не вызывает их пролиферации, но
задерживает их в фазе G1, в то же время повышая выживаемость и увеличивая
их объем. Вероятно, указанные разногласия обусловлены особенностями
действия IL-2 на разные этапы развития и активации nTreg-клеток и эффектами
разных доз цитокина. Механизм действия IL-2 на nTreg-клетки иной, чем на
обычные Т-клетки: в них задействован Jak/Stat-путь, но не PI3-киназный путь
сигнализации [114]. IL-2, продуцируемый эффекторными, главным образом
Tcon-клетками, и способствующий стимуляции и экспансии nTreg-клеток,
выступает в качестве инструмента регуляции иммунного ответа по механизму
отрицательной обратной связи.
Имеются данные о действии на nTreg-клетки ряда других цитокинов.
Способность индуцировать активность nTreg-клеток показана для TGF-β [115].
Также, IL-4 предотвращает апоптоз nTreg-клеток (развивающийся
преимущественно по Fas- зависимому, а не TNF-зависимому механизму [116],
23
усиливает их пролиферацию и повышает супрессорную активность, но
ослабляет экспрессию FoxP3 и супрессорную активность изолированных nTregклеток, хотя не влияет на их активность в кокультуре nTreg-клеток, СD4+СD25Т-клеток-мишеней и APC [117].
Механизмы внутриклеточной сигнализации, приводящей к активации
nTreg-клеток, детально не изучены. Показано, что при активации CD4+CD25+клеток эффективно срабатывает путь, связанный с активацией Rap-1 и Akt, но
включения путей, связанных с Ras, МЕК1/2 и Erk1/2, не происходит. В
результате прогрессия клеточного цикла оказывается блокированной, что
сопровождается снижением содержания циклинов А и Е и повышением
содержания фактора p27(kip1). Эти изменения устраняются IL-2, который
выводит nTreg-клетки из состояния анергии и отменяет высокий риск развития
их апоптоза (основой этого служит повышение экспрессии Bcl-xL и активация
Erk1/2). Конвергенция сигналов, поступающих в nTreg-клетки через TCR и IL2R, происходит на уровне MEK-Erk. Белку Rap-1, обладающему активностью
ГТФазы, принадлежит ключевая роль в формировании функционального
статуса nTreg-клеток. Так у мышей, трансгенных по этому фактору,
численность и активность nTreg-клеток резко повышены [118].
Для осуществления супрессорных функций nTreg-клетки нуждаются в
наличие межклеточных взаимодействий с клетками-мишенями, что было
доказано в ряде экспериментов, где после разделения nTreg-клеток и Tcon
полупроницаемой мембраной или при воздействии супернатантами nTregклеток, супрессия клеток-мишеней не наблюдалась. Необходимость наличия
прямого контакта nTreg-клеток с клетками-мишенями служит важным
отличием nTreg-клеток от адаптивных супрессоров – iTreg-клеток, действие
которых опосредуется секретируемыми цитокинами.
При контактных взаимодействиях nТreg и их мишеней важную роль играет
подавление костимуляторных сигналов при активации эффекторных клеток
[119]. «Двухсигнальная» модель активации Т-лимфоцитов является
общепризнанной, и встреча Tcon с АГ в отсутствии вторичной
костимуляторной молекулы приводит к их анергии или, так называемой АГспецифической гипореактивности. Костимуляторный путь не только участвует
в регуляции наивных Tcon, но также контролирует активность Т-эффекторных,
Т-клеток памяти и nTreg-клеток [120]. К костимуляторному механизму Тклеток относятся 2 пути: CD80/CD86-CD28, опосредующий активацию клеток
и взаимодействия между рецептором программируемой клеточной гибели-1
(PD-1) и его лигандов: PD-L1 (B7-H1) и PD-L2 (B7-DC). PD-1:PD-L путь
передают ингибиторные сигналы в клетку и регулируют баланс между Тклеточной активацией и толерантностью.
Поскольку для осуществления эффекта nТreg-клеток необходима
экспрессия молекул В7 на поверхности клеток-мишеней, можно предполагать,
что роль СТLА-4 в реализации супрессорного эффекта nTreg-клеток является
основополагающей и состоит в передаче сигнала именно через его
естественные лиганды. CTLA-4 является структурным гомологом
костимуляторного рецептора – CD28. Существует два молекулярных
24
механизма ингибиторного влияния CTLA-4. Один из них заключается в его
конкурентном связывание с CD80 (B7-1) и CD86 (B7-2), также являющихся
активирующими лигандами молекулы CD28, костимуляция которой, совместно
с TCR, необходима для T-клеточной активации [121]. Второй путь заключается
в непрямой супрессии Т-клеточного ответа через изменение активности АРС.
Так, CTLA-4 подавляет созревание DC, снижает экспрессию CD80/CD86 на DC
и индуцирует продукцию иммунорегуляторной энзим-индолеамин-2,3дезоксигеназы (IDO) DC [122]. Ранее были опубликованы данные о том, что у
мышей, с нокаутом гена CTLA-4 развивались аутоиммунные процессы во
многих органах. Также, блокада CTLA-4 АТ отменяла супрессорный эффект
nTreg-клеток и повышала противоопухолевый иммунитет. А у трансгенных
мышей с отсутствием экспрессии CTLA-4 nTreg -клетками наблюдалось
увеличение общего количества и значительная аберрантная активация Tconклеток. При этом проявлялась конкуренция СТLА-4 с молекулой СD28 за
связывание с источником сигналов, ослабляющих эффект регуляторных клеток
[58, p. 398].
Помимо CTLA-4, контроль над множественными «проверочными
точками» («check-points») толерантности осуществляется и молекулой PD-1,
что предотвращает развитие аутоиммунных заболеваний и играет важную роль
в условиях стойкой АГ стимуляции, например, при реактивности против
собственных АГ, хронических воспалениях или наличии злокачественных
опухолей. PD-1 является членом суперсемейства иммуноглобулинов (Ig),
состоящий из внеклеточного участка, N-терминального IgV-подобного домена,
равного около 20 аминокислотным остаткам, трансмембранного участка и
цитоплазматического домена, содержащего ингибирующий тирозинсодержащий мотив иммунорецепторов (ITIM) и иммунорецептор тирозинзависимых мотивов выключения (ITSM). Эксперименты с применением
мутагенеза показали, что именно взаимодействие тирозина с ITSM
обеспечивает эффективность PD-1 в T- и B-клетках. ITSM связан с тирозиновой
протеинфосфатазой SHP-1 и SHP-2 и до сих пор неизвестно осуществляется ли
передача сигнала от PD-1 внутрь клетки через SHP-1 и/или SHP-2. Следует
отметить, что PD-1 является мономером и не способен формировать
ковалентные гомодимеры на поверхности клетки как другие рецепторы данного
костимуляторного семейства, CTLA-4 и CD28. Лиганды PD-1 отличаются по
своей аффинности: PD-L2 обладает в три раза большей аффинностью к PD-1,
чем PD-L1. PD-L2 экспрессируется на активированных DC, макрофагах,
перитонеальных B1 B-клетках, B-клетках памяти и тучных клетках костного
мозга. В отличие от PD-L2, PD-L1 экспрессируется констуитивно на тех же
клетках, а также на некоторых клетках не гемопоэтического происхождения и
Т-лимфоцитах, в том числе и на nTreg-клетках, экспрессия данных лигандов
повышается при стимуляции. Таким образом, подобно CTLA-4, PD-L1,
представленный на поверхности nTreg-клеток подавляет иммунный ответ
напрямую, непосредственно взаимодействуя с PD-1 на Т-клетках, при этом
ограничивая
инициаторную
стадию
активации,
пролиферацию,
дифференцировку и эффекторные свойства Т-клеток. Также, PD-L1 на nTreg 25
клетках супрессирует Т-клеточный ответ косвенно, снижая экспрессию
костимуляторных молекул CD80 и CD86 на DC [120, p. 5].
Еще одним рассматриваемым участником реализации супрессорного
действия nTreg-клеток является молекула GITR. Ранее было показано, что
блокада GITR приводит к полной отмене супрессорного эффекта в кокультуре
CD4+CD25+- и CD4+CD25--клеток. In vivo введение анти-GITR АТ молодым
мышам приводит к развитию аутоиммунного гастрита [123], а при введение
мышам с привитой опухолью, значительного снижает количество
CD4+CD25+FoxР3+-клеток в опухолевом микроокружении [124]. Данный
эффект связан более вероятно с блокадой передачи активирующего сигнала
через GITR в CD4+CD25+-клетках, чем с нарушением связывания с, до сих пор
мало изученным, GITRL [123, p. 15292]. Помимо этого, блокада GITR
агонистическими АТ приводит к снижению экспрессии данными клетками
FoxР3 и других транскрипционных факторов и цитокинов, влияющих на
супрессорную активность nTreg-клеток, таких как Helios и IL-10, и наоборот,
увеличивает экспрессию T-bet, Eomes и IFN-γ. Следует отметить, что введение
таких АТ было предложено в качестве иммунотерапии прогрессирующих
злокачественных новообразований и сейчас проходит предклинические
испытания [124, p. 10].
Известно, что в иммунной системе аденозинтрифосфат (ATP),
находящийся на мембране клеток служит индикатором деструктивных
процессов в ткани для DC и ведет к повышению экспрессии CD86. CD39
является доминантным эктоэнзимом, катализирующим превращение
внеклеточного ATP в аденозин. CD39 гидролизирует как аденозинтрифосфат,
так и аденозиндифосфат до монофосфата. Связывание аденозина с его А2Арецептором, который находится на эффекторных Т-клетках, приводит к
увеличению внутриклеточного циклического аденозинмонофосфата и
подавлению функции этих клеток. Существуют экспериментальные данные о
том, что супрессия пролиферации Т-клеток мышей, накаутных по A2A гену,
намного ниже, чем у диких мышей. Каталитический гидролиз поверхностного
ATP молекулой CD39 считается еще одним противовоспалительным
механизмом, через который nTreg-клетки могут регулировать иммунный ответ.
Так, трансдукция гена foxp3 в мышиные CD25- T-клетки индуцировала
экспрессию ими CD39, а предварительная инкубация nTreg-клеток в АТРсодержащей среде снижала АТР-зависимое созревание DC при дальнейшей их
коинкубации. Помимо прямого супрессорного эффекта, удаление ATP с
цитоплазматической мембраны клеток молекулой CD39 позволяет nTreg клеткам проникать в области воспаления и подавлять ATP-индуцированные
воспалительные реакции. Иммунорегуляторный эффект CD39 может быть
усилен повышением образования аденозина. Так, образование аденозина под
влиянием молекулы CD39 может повышаться 50-эктонуклеозид – CD73,
который дефосфорилирует промежуточный продукт активности CD39,
аденозинмонофосфат. Аденозин в свою очередь связывается со своим
рецептором A2A и подавляет активность как DC, так и активированных Тклеток [111, p. 640].
26
В качестве одного из механизмов реализации супрессорного эффекта
nTreg-клеток рассматривается их конкуренция с наивными Т-клетками той же
АГ специфичности за контакт с АРС [41, p. 348]. Ранее было доказано
преференциальное связывание с комплексом МНС:белок на DC nTreg -клеток,
что обеспечивается молекулой лейкоцитарного функционального антигена-1
(LFA-1). Таким образом, Т-эффекторные клетки не способны связать
стимулирующий сигнал и остаются в неактивном состояние, что доказывается
экспериментами in vitro [122, p. 10116] и in vivo [125].
Рассматривается также роль апоптоза в супрессорной активности nTregклеток. Хотя экспрессия Fas- и TNFR1-рецепторов на nTreg -клетках не
существенна для проявления их действия, показано, что апоптоз клетокмишеней вносит определенный вклад в реализацию супрессорного эффекта;
так, выявлена зависимость регуляторного действия nTreg -клеток от гранзима В
и перфорина [126].
Как уже было отмечено выше, регуляторная функция nTreg -клеток
распространяется и на APC. Некоторые супрессорные механизмы nTreg-клеток
участвуют в подавление экспрессии стимулирующих молекул, таких как MHC
и CD80, удерживая APC в толерогенном состояние. Помимо этого, nTregклетки индуцируют образование IDO в DC, что также способствует иммунной
толерантности. Более того, СТLА-4 на мембране, как и секретируемая форма
этой молекулы nТreg-клетками, при участии ферментов кинуренинового пути,
ключевую роль в котором играет IDO, участвует в превращении триптофана в
формилкинуренин в DC. В свою очередь формилкинуренин действует как
иммуносупрессорная молекула, не только подавляя DC и Т-эффекторные
клетки, но и стимулируя Treg-клетки [127 ]. Экспериментально было доказано,
что супрессорная активность nТreg-клеток проявляется при уменьшении
концентрации триптофана и что кинуренины предотвращают развитие диабета
у мышей [128].
Таким образом, в осуществлении супрессорного эффекта nTreg -клеток
может участвовать несколько механизмов, хотя наиболее специфичным именно
для nTreg-клеток субпопуляции считается супрессия через молекулу CTLA-4
[41, p. 347]. Следует отметить, что IL-2 и IL-15 не участвуют в реализации
регуляторного действия Treg-клеток [129]. Но имеются данные об
антагонистических отношениях между nTreg-клетками и Тh17-клетками,
участвующими в развитие аутоиммунных процессов [130].
При выходе на периферию nTreg -клетки выполняют две функции.
Основной, как уже было отмечено, является обеспечение иммунологической
толерантности путем контроля аутореактивных Т-клеток, которые могут
появляться в тканях даже здоровых индивидуумов. Второй функцией nTreg клеток является контроль численности пула самих Treg-клеток. nTreg-клетки
способны как сами активно пролиферировать расширяя пул Treg-клеток, так и
индуцировать образование iTreg -субпопуляций из Tcon-клеток, как правило
после контакта с чужеродным АГ или в условиях воспаления. Образованные
таким образом клетки, повышают эффективность регуляторной сети и
подавление иммунного ответа. Развитие iTreg -субпопуляций запускается
.
27
внешними регуляторными сигналами, как правило супрессорными цитокинами,
неадекватной презентацией АГ (например, в отсутствие костимуляторных
сигналов) или межклеточного взаимодействия Tcon-клеток с nTreg-клетками
[131].
Раньше считалось, что супрессорные цитокины, IL-10 и TGF-β, не только
индуцируют активность nTreg -клеток, но и опосредуют их действие. Однако в
вопросах о роли названных цитокинов в активации и функционировании nTregклеток появились определенные разногласия, и секреция данных цитокинов
считается теперь более специфичной для iTreg -клеток [127, p. 2259]. Было
сделано несколько сообщений о том, что человеческие nTreg-клетки не
секретируют IL-10 и TGF-β и блокада данных цитокинов не влияет на их
супрессорную активность. Дополнительным доказательством также является
отсутствие супрессорного эффекта при кокультивировании nTreg-клеток и
клеток-мишеней в разных частях системы Transwell [132]. При этом мембрансвязанный TGF-β, а также латентные формы TGF-β участвуют в регуляторной
активности nTreg-клеток [133, 134].
Плейотропный эффект на широкий спектр клеток был описан для трех
участников семейства TGF-β (TGF-β1, TGF-β2 и TGF-β3). TGF-β синтезируется
в виде пре- и пробелковых предшественников. В ходе процессинга в комплексе
Гольджи, от про-TGF-β отщепляется N-терминальный конец, в результате чего
образуется гомодимер, ассоциированный с пептидом латентности (LAP). После
«созревания» TGF-β нековалентно связывается с LAP, что способствует
высвобождению TGF-β в экстраклеточный матрикс или его связыванию с
латентным TGF-β-связывающим белком (LTBP). LAP сохраняет молекулу TGFβ в неактивном состоянии и для связывания со своим рецептором, TGF-β
должен быть диссоциирован с молекулой LAP и/или LTBP протеолизом или
изменением его конформации [135]. Andersson с соавт. показали, что латентные
формы TGF-β, представленные на цитоплазматической мембране CD4+CD25+клеток при стимуляции TCR вызывают конверсию FoxР3-- в FoxР3+-клетки и
появления супрессорных свойств у данных клеток [136]. Также,
иммуносупрессия в условиях in vitro выше у LAP+ CD4+CD25+-клеток, чем у
субпопуляции LAP- [137]. Следует отметить, что IL-10 [138] и активные формы
TGF-β [137, p. 2] также способны вызывать конверсию iTreg-клеток. Таким
образом, LAP считается маркером супрессорной активности nTreg-клеток и
других субпопуляций Treg-клеток и, совместно с IL-10 и TGF-β, способен
индуцировать образование iTreg -клеток.
Еще один цитокин, играющий важную роль в функционировании nTregклеток был открыт совсем недавно и был назван IL-35. IL-35 входит в
семейство IL-12-подобных цитокинов и является гетеродимером, состоящим из
субъединиц p35 и геном-3, индуцированным вирусом Эпштейна-Барра (EBI3),
также входящих в структуру IL-12 и IL-27, соответственно. Как у мышей, так и
у человека была обнаружена конститутивная продукция IL-35 nTreg -клетками
и ее полное отсутствие у Т-эффекторов. Отключение гена IL-12p35 или Ebi3
резко снижало регуляторную активность nTreg-клеток in vitro и in vivo, в то
время как при их чрезмерной экспрессии регуляторные свойства приобретали
28
наивные Тcon-клетки [139]. IL-35 активирует CD4+FOXP3--клетки с IL-35зависимой регуляторной активностью. В экспериментах на мышах и
человеческих клетках было продемонстрированно, что экзогенный IL-35 не
только подавляет эффекторные свойства Т-клеток, но и индуцирует конверсию
Тcon в iTreg-клетки, в так называемую iTr35 субпопуляцию Treg-клеток. iTr35клетки обладают сильным супрессорным эффектом против пролиферации Тэффекторных клеток, имеют фенотип CD4+CD25+, секретируют IL-35, но не
экспрессируют FoxP3, данные клетки сохраняются стабильными в условиях in
vitro и in vivo. [140, 141]. Более того, было показано, что nTreg-клетки также
индуцируют образование iTr35-клеток IL-35- и IL-10-зависимым механизмом in
vitro, при их активации коктейлем АТ к CD3 и CD28, и in vivo, при воспаление
кишечника Trichuris muris и в опухолевом микроокружении при меланоме и
колоректальной аденокарциноме [140, p. 7].
Таким образом цитокины (IL-10, TGF-β и IL-35), продуцируемые nTreg клетками рассматриваются не только как супрессорные агенты, но и как
основные факторы, регулирующие гомеостаз Treg-клеток на периферии.
Подробнее механизмы индукции образования iTreg-клетки описаны в
следующей главе.
1.1.3 Индуцированные Т-регуляторные клетки
Как уже было отмечено, iTreg-клетки образуются на периферии из зрелых
+
CD4 T-клеточных субпопуляций или непосредственно из nTreg-клеток, при
определенных условиях АГ-стимуляции, и могут быть индуцированными в
условиях in vitro путем инкубации в присутствии АГ или поликлональных
стимулов и иммуносупрессорных цитокинов. На сегодняшний день получено
много противоречивых данных, касающихся различных субпопуляций iTregклеток, которые пока плохо классифицированы. Так, уровень экспрессии CD25,
FoxP3 и экспрессия генов, так называемая генетическая сигнатура, iTreg-клеток
сильно варьируют в зависимости от того, каким механизмом были
индуцированны клетки, а также в зависимости от микроокружения, где
осуществляется регуляторная функция iTreg-клеток. Фенотип и механизмы
супрессии субпопуляций iTreg-клеток до сих пор мало изучены.
Раньше не вызывало сомнений происхождение всех Treg-клеток из тимуса.
Предположения о существование иных Treg-клеточных субпопуляций,
дифференцирующихся на периферии из СD4+СD25--клеток возникли после
опубликования результатов исследования Liang S. и соавт. Было показано, что
через 1 неделю после переноса конгенных CD4+CD25--клеток нормальным (без
лимфопении) мышам выявлялись донорские клетки фенотипа CD4 +CD25+.
Через 6 недель они составляли уже 5-12% от общего числа
трансплантированных клеток. В них экспрессировался FoxP3 и они подавляли
пролиферацию активированных Т-клеток. Появление этих Treg-клеток
наблюдалось и при переносе CD4+CD25--T-клеток тимэктомированным мышам,
но не происходило при переносе клеток мышам, нокаутированным по генам В7.
Об отсутствии участия тимуса в судьбе периферических iTreg-клеток
свидетельствует и повышение их числа у мышей, тимэктомированных в 329
суточном возрасте [142]. Таким образом, был сделан вывод о том, что
генерация iTreg-клеток на периферии иммунной системы de novo не зависит от
тимуса, но, очевидно, нуждается в межклеточных взаимодействиях с участием
костимулирующих молекул.
Станет ли Tcon-клетка специфической Т-хелперной или Т-регуляторной,
зависит от аффинности ее TCR к АГ, силы костимуляторного сигнала,
предоставляемого APC, и цитокинового микроокружения. В связи с ролью
распознавания аутоантигена в индукции iТreg-клеток на периферии иммунной
системы возникает вопрос об участии в этом процессе DC (единственного типа
АРС, способных активировать наивные Т-лимфоциты). Имеющиеся данные
позволяют заключить, что развитию iТreg-клеток в наибольшей степени
способствуют iDC [143]. Показано, что определенные воздействия на DC
усиливают их способность индуцировать развитие iТreg-клеток. К таким
воздействиям относятся обработка клеток супрессорными цитокинами (IL-10,
ТGF-β) [144], ингибиторами протеасом, блокада сигнального пути,
приводящего к формированию транскрипционного фактора Nf-κВ [145]. Весьма
активны в индукции iТreg-клеток толерогенные плазмацитоидные DC,
активированные микробной ДНК, содержащей последовательности СрG.
Вероятно, с индукцией толерогенного фенотипа DC можно связать повышение
содержания iТreg-клеток под влиянием введения мышам апоптотических
клеток [146].
Значительную роль в индукции iTreg-клеток на периферии играет
костимулирующая молекула CD28. Введение АТ к CD28, обладающего
активностью агониста костимуляции, приводит к индукции образования iTregклеток в условиях in vivo. С другой стороны, лигандом В7 служит также
молекула CTLA-4, маркирующая nTreg-клетки, однако было заключено, что
взаимодействие этих молекул имеет значение скорее только для
функционирования nTreg-клеток. Была показана индукция экспрессии FoxР3
CD4+CD25--T-клетками при стимуляции CD28, вне зависимости от TCR. Другая
же группа наоборот, показала контроль над экспрессией FoxР3 только суммой
сигналов от CD28 и TCR. При этом увеличение экспрессии FoxР3 зависело от
ядерных транслокаций транскрипционных факторов RelA/NF-κB [147]. Позже
группа исследователей во главе с Blazar В., опровергла эти данные, доказав, что
образование и функционирование iTreg-клеток, в отличие от nTreg-клеток, не
зависит от костимуляции через CD28. было показано, что аллоантигенспецифичные iTreg-клетки были получены in vitro и блокировали иммунный
ответ против трансплантата в отсутствие CD28 [148]. Наоборот, участие IL-2 в
индукции дифференцировки и активности как nTreg-клеток, так и iTreg-клеток,
было засвидетельствовано в исследованиях, в которых было отмечено полное
отсутствие данных клеток у мышей с отсутствием IL-2R [149].
К развитию на периферии iTreg-клеток вне явной связи с иммунным
ответом можно отнести повышение их содержания в процессе
гомеостатической пролиферации CD4+СD25- Т-клеток, перенесенных в
сингенный организм с индуцированной лимфопенией [150]. Источником
CD4+CD25+-клеток
при
этом
являются
CD4+FoxP3+CD25--клетки,
30
формирующиеся в тимусе и образующие резервный пул для генерации новых
CD25+-Treg-клеток [97, p. 1065]. После завершения гомеостатической
пролиферации «новые» CD4+CD25+-клетки могут утратить экспрессию CD25,
т.е. вернуться в резервный пул. Формирование новых CD4+CD25+ Treg-клеток
при гомеостатической пролиферации зависит (в отличие от генерации iTregклеток при иммунном ответе на аллоантигены) от IL-2. Образующиеся iTregклетки подавляют пролиферацию СD4+СD25--клеток in vitro [150, p. 7263], но
не установлено, ингибируют ли они гомеостатическую пролиферацию.
Среди факторов, причастных к генерации и поддержанию уровня Tregклеток, прежде всего должны быть названы супрессорные цитокины (IL-10,
TGF-β и IL-35) [151]. В in vivo моделях различных заболеваний была показана
важная роль в регуляции иммунного ответа T-клеток, продуцирующих TGF-β.
TGF-β влияет на функциональную активность различных типов клеток, но
основной функцией данного цитокина все же считается регуляция гомеостаза
Т-клеток. Так, у мышей с нокаутом гена TGF-β1 наблюдаются воспалительные
процессы во многих органах и резкое снижение содержания СD4+СD25+FохP3+клеток, обладающих супрессорной активностью, в периферическом отделе
иммунной системы, но не в тимусе [97, p. 1063], а блокирование сигнального
пути TGF-β в Т-лимфоцитах ведет к спонтанной дифференцировки Тэффекторов и развитию аутоиммунных заболеваний. TGF-β запускает
формирование iTreg-клеток в мышиных моделях и повышает экспрессию FoxP3
в человеческих Т-клетках [152]. Следует отметить, что сходным действием
(индукция супрессорной активности, экспрессии СD25, FoxР3) обладает
простагландин Е2 (PGE2) [153].
Рецептор TGF-β состоит из двух различных белков, TGF-βRI и TGF-βRII.
Активные формы TGF-β1 связываются с субъединицей TGF-βRII, которая в
свою очередь, передает сигнал на серин/треониновый киназный домен,
фосфорилирующий транскрипционный фактор SMAD. Точнее, TGF-β1
индуцирует сборку активированного рецептор-лиганд гетеродимерного
комплекса, вызывающего фосфорилирование рецептора, регулирующего
SMAD (R-SMAD). Фосфорилированный R-SMAD формирует гомоолигомерные
и гетероолигомерные комплексы с комедиатором SMAD (Co-SMAD). Такие
комплексы транслоцируются в ядро, где, ассоциируясь с ДНК-связанными
кофакторами, транскрипционными коактиваторами и корепрессорами,
регулируют транскрипционную активность генов-мишеней. Таким путем, к
примеру, TGF-β1 предотвращает чрезмерную активацию T-клеток через
модулирование сигнального пути Ca2+-кальциневрина SMAD3- и SMAD4независимым путем. Существуют также SMAD-независимые сигнальные пути
влияния TGF-β, включающие быструю активацию Ras-ERK, TAK-MKK4-JNK,
TAK-MKK3/6-P38, Rho-Rac-cdc4 MAPK и PI3-K-Akt пути [154].
Субпопуляция iTreg-клеток, продуцирующая высокий уровень TGF-β, Th3,
была впервые описана у мышей, которым орально вводили основной белок
миелина. Данные клетки несли набор TCR, идентичный Th1 и Th2, и
секретировали высокий уровень TGF-β, низкий уровень IL-4 или IL-10, были
абсолютно негативны по продукции IFN-γ и IL-2 и резко подавляли
31
аутоиммунный энцефаломиелит TGF-β-зависимым путем [155], причем данный
цитокин считался долгое время основным фактором дифференцировки таких
клеток. Далее стало известно, что оральная толерантность усиливается IL-4, IL10, анти-IL-12 АТ, B-субъединицей токсина холеры и лигандами Flt-3 и антиCD40. Исходя из этих данных, Th3-клетки были получены in vitro из Tconклеток мышей, трансгенных по TCR, путем их культивации с добавление TGFβ, IL-4, IL-10, и анти-IL-12 АТ. В экспериментах in vivo было показано, что
анти-CD86, но не анти-CD80, АТ подавляют дифференцировку Th3-клеток,
ассоциированную с оральной толерантностью [152, p. 209], также описано
активирующие действие и других костимуляторных молекул [156]. В то же
время, ТGF-β2, при одновременном связывании ТСR и действии IL-2,
индуцирует экспрессию СD25 и FoxP3 СD4+СD25--клетками и приобретение
ими супрессорной активности. Сильная костимуляция через СD28, а также
действие IL-4 предотвращали реализацию указанного эффекта. Таким образом,
ТGF-β-зависимая индукция Th3 может быть трактована как участие этого
цитокина в АГ-зависимой дифференцировке регуляторных клеток, в частности
при контакте части Tcon-клеток с аутоантигенами на периферии [153, p. 543].
Несмотря на то, что дифференцировка Th3 регуляторных клеток индуцируется
АГ-зависимым путем, их супрессорная функция является АГ-неспецифичной.
Th3 не нуждаются в межклеточных взаимодействиях для подавления
иммунных реакций и в основном действуют через секрецию TGF-β [152, p.
210].
Th3-клетки экспрессируют рецептор CTLA-4, индукция которого ведет к
секреции ТGF-β и экспрессии молекулы хоуминга αEβ7. Хемокиновые
рецепторы на Th3-клетках до сих пор не были изучены. Известно только то, что
часть Th3-клеток экспрессирует CCR9, a CCR4+ Т-клетки отличаются высокой
продукцией ТGF-β. Известно, что пищевые АГ индуцируют Th2-, Th3-, nTregклетки, а также LAP+ T-клетки. Th3 субпопуляция обогащена LAP+-клетками,
но до сих пор не известен супрессорный механизм LAP на таких клеткам
(действует ли LAP через секрецию активных форм ТGF-β или же через
презентацию ТGF-β на мембране) [152, p. 212]. Считается, что все клетки Th3
субпопуляции содержат транскрипционный фактор FoxP3 [157], таким образом,
для изучения Th3 применяют фенотип CD4+FoxP3+TGF-β+CD25+/-.
Следует отметить, что, так как Th3 экспрессируют молекулы, характерные
для nTreg-клеток, такие как CD25, FoxP3 и CTLA-4, раньше считалось, что
данные клетки являются активированными nTreg-клетками, а не отдельной
субпопуляцией. Данное предположение было опровергнуто экспериментами, в
ходе которых Th3 были индуцированны у мышей с полным отсутствием nTregклеток при введении им рекомбинантного TGF-β [158].
Недавно опубликованные работы показывают, что TGF-β участвует в
индукции еще одной субпопуляции iTreg-клеток. В опытах на мышах in vivo
[159, 160], а также in vitro [130, p. 237] показали, что экзогенный TGF-β, в
комбинации с IL-6, индуцирует продукцию IL-17 в nTreg-клетках и
образование Treg-17-клеток из Tcon-клеток. При этом комбинация IL-6 с IL-23
индуцирует дифференцировку эффекторных IL-17-продуцирующих Th1732
клеток. Не смотря на то, что IL-17 обладает провоспалительными свойствами и
участвует во многих воспалительных процессах, аутоиммунных заболеваниях и
в оторжении трансплантата [161 ], Treg-17-клетки обладают супрессорными
свойствами, подавляют активацию и пролиферацию Т-эффекторных клеток.
Более того, было показано, что активированные nTreg-клетки индуцируют
конверсию Tcon-клеток в Treg-17-клетки при их кокультивировании и
добавление в среду IL-6, при этом часть nTreg-клеток также начинала
продуцировать IL-17. Было заключено, что основным индуктором данной
конверсии был TGF-β, продуцированный nTreg-клетками [162]. Миелоидные
APC и IL-2 также способствуют влиянию TGF-β на образование CD4+Foxp3+IL17+-клеток из CCR6+ T-лимфоцитов или непосредственно из CD4+CD25+клеток.
Кроме того, что Treg-17-клетки могут быть дифференцированы как из
Tcon-клеток, так и из nTreg-клеток, фенотип и цитокиновый профиль Treg-17клеток такие же как у Th17 и Treg-клеток. Treg-17-клетки отличаются высокой
активностью генов, кодирующих транскрипционные факторы RORγt и FoxР3, а
также цитокины IL-17A, IL-17F, IL-21, IL-10. Данные клетки также
экспрессируют высокий уровень CD25 и CCR4 и, по некоторым данным,
продуцируют IFN-γ в небольших количествах [163]. Таким образом, остается не
понятным, представляют ли Treg-17-клетки отдельную субпопуляцию iTregклеток или определенную стадию активации nTreg-клеток. Тем не менее, тот
факт, что Treg-17-клетки экспрессируют одновременно и RORγt, и FoxР3, а
также обладают иммуносупрессорными свойствами, свидетельствует против
того, что данные клетки являются переходной стадией дифференцировки iTregклеток или Th17-клеток.
Ранее было показано, что метаболиты симбиотической микробиоты могут
участвовать в индукции образования Treg-17-клеток [164], а введение
микобактерий в составе полного адъюванта Фрейнда или вакцины БЦЖ мышам
с диабетом I типа повышают этот процесс [165]. Также вклад Treg-17-клеток
был описан при развитие экспериментального колита и рака толстого
кишечника [163, p. 4389].
Другим цитокином, участвующим в образовании iTreg-клеток является IL10. IL-10 это плейотропный цитокин, главным механизмом супрессии которого
считается активация STAT3-опосредаванной передачи сигналов, ведущей к
подавлению активности многих генов. IL-10 напрямую подавляет Т-клеточный
иммунный ответ, делает CD4+ T-клетки не способными реагировать на АГ,
снижает их хемотаксис, пролиферацию и продукцию провоспалительных
цитокинов, предположительно, активируя белки-супрессоры цитокиновой
сигнализации (SOCS-1 и SOCS-3). Механизм супрессорного действия IL-10
также включает в себя снижение АГ-презентирующей способности APC,
нагружая молекулу MHC II и тем самым, блокируя пептид и предотвращая
непосредственное увеличение экспрессии MHC II, а также снижая экспрессию
костимуляторных молекул CD80/CD86 и дестабилизируя мРНК цитокинов в
APC. Кроме этого, IL-10 участвует в поддержании иммунной толерантности,
.
33
выступая основной молекулой образования и функциональной активности
одной из субпопуляций iTreg-клеток –Tr1 [166].
Впервые Tr1-клетки были описаны у пациентов с тяжелой
комбинированной иммунной недостаточностью (SCID) после трансплантации
гемопоэтических стволовых клеток, несущих несоответствующие HLA [167].
Несмотря на несовместимость HLA АГ, у пациентов не развивалась болезнь
"трансплантат против хозяина" (GVHD) даже в отсутствии приема
иммуносупрессорных препаратов, что связывали с одновременным
увеличением уровня IL-10 в сыворотке. Позже было обнаружено, что
основными продуцентами IL-10 у таких пациентов были Т-клетки, полученные
от доноров, обладающие иммунорегуляторными свойствами, опосредуемыми
IL-10. Затем, Tr1 клоны, ингибирующие пролиферацию наивных и АГспецифичных CD4+ T-клеток IL-10/TGF-β-зависимым путем были получены и
от здоровых доноров [138, p. 695].
Из-за интереса исследователей к методам терапии различных
иммунопатологий, основанным на использовании Treg-клеток, было
разработано много подходов к индукции Tr1-клеток человека in vitro. Т-клетки
активировали
рекомбинантным
IL-10
и
IFN-α,
комбинацией
иммуносупрессорных препаратов (витамин D3 и дексаметазон), анти-CD3 и
анти-CD46 АТ или комбинацией TGF-β и IL-27 или прямой трансфекцией гена
IL-10. Кроме этого, было показано, что активированные вирусами
плазмацитоидные DC могут индуцировать образование Tr1-клеток in vitro. Tr1клетки также могут быть получены повторной стимуляцией Tcon-клеток
аллогенными iDC или одноразовой стимуляцией IL-10-обработанными
толерогенными DC, которые также называют DC-10. Совсем недавно была
опубликована работа, показывающая, что образование Tr1-клеток в
присутствие DC-10 является IL-10-зависимым процессом, для которого
необходимо взаимодействие между HLA-G, высоко экспрессированного DC-10клетками и рецепторов иммуноглобулин-подобных транскриптов (ILT) – ILT4,
экспрессированных на Tcon-клетках [168]. Основным же условием образования
Tr1-клеток in vivo считается встреча с АГ в толерогенном микроокружении,
содержащим достаточный уровень IL-10. CD4+CD25+ nTreg-клетки также
запускают конверсию Tr1 из Tcon, хотя существует много работ,
показывающих что Tr1-клетки могут быть получены in vitro без участия nTregклеток. Тем не менее, присутствие nTreg-клеток или FoxР3+ iTreg-клеток
повышает образование Tr1-подобных клеток IL-27- и TGF-β-зависимым
способом [169].
Механизм индукции IL-10 задействует сигнальный путь Notch. Так, у
трансгенных мышей с конститутивно активным внутриклеточным доменом
Notch3 в тимоцитах и T-лимфоцитах не развивался экспериментальный
аутоиммунный диабет. Отсутствие патологии было связано с увеличением
количества CD4+CD25+ Treg-клеток в лимфоидных органах и поджелудочной
железе, что сопровождалось увеличенной экспрессией IL-10 данными
клетками. Более того, стимуляция выделенных мышиных CD4+ T-клеток АГили
АТ анти-CD3 и анти-CD28 доказала предполагаемую индукцию временного
34
увеличения экспрессии лиганда и рецептора Notch. Скорее всего, Notch играет
наиболее важную роль в поддержании дифференцировки и функционирования
Tr1-клеток. С другой стороны, Notch запускает продукцию IL-10 через
молекулу трансдуктора сигналов и активатора транскрипции 4 (STAT4) Тклеток [170]. Таким образом, IL-10 может действовать как позитивный
аутокринный фактор, участвующий в образовании IL-10-продуцирующих
iTreg-клеток и Tr1-клеток.
Фенотип Tr1-клеток в основном определяется по продукции цитокинов.
Так, Tr1-клетки это Т-лимфоциты, продуцирующие IL-10, частично TGF-β и IL2 и негативные по IL-4. Как и большая часть Treg-клеток, Tr1-клетки слабо
пролиферируют в ответ на поликлональную или АГ-специфичную стимуляцию,
но их пролиферативная способность резко повышается при действии на них
экзогенного IL-2 и/или IL-15 [171]. Несмотря на низкую пролиферацию, Tr1клетки экспрессируют нормальный уровень маркеров Т-клеточной активации,
таких как CD25, CD40L, CD69, HLA-DR и CTLA-4. В неактивном состояние
Tr1-клеточные клоны конститутивно экспрессируют высокий уровень
рецептора IL-2/-15Rβ и их общую γ-цепь [172] и широкий спектр хемокиновых
рецепторов, включая и ассоциированные с фенотипами Th1 (CXCR3 и CCR5) и
Th2 (CCR3, CCR4 и CCR8) [173]. Также имеются работы, свидетельствующие о
высокой степени экспрессии GITR и αEβ7 интегрина (CD103) на мембране Tr1клеток [174].
Таким образом, на сегодняшний день необходимо более детальное
изучение и выявление маркеров, строго специфичных не только для Tr1-клеток,
но и для субпопуляций Th3 и Treg-17-клеток. Пока основными маркерами этих
клеток являются секретируемые определенные цитокины. в то время как
фенотипирование таких клеток является сложным и затратным процессом, что
ограничивает изучение данной субпопуляции с применением современных
методов иммунологии и не позволяет изучить биологию данных клеток в in
vitro тестах, так как выделение таких клеток невозможно.
Анализируя все экспериментальные данные по изучению Tr1-клеток
человека и мышей, можно заключить, что их основной функцией является
контроль иммунного гомеостаза на периферии при ответе на чужеродные АГ.
Также, Tr1-клетки способны распознавать собственные и опухолевые АГ, и
большая часть публикаций посвящена IL-10-зависимой регуляции иммунного
ответа на аллергены, патогены и аллоантигены. Интересно, что образование
Tr1-клеток происходит очень быстро в слизистых оболочках, и что многие
бактерии, паразиты и вирусы активно вызывают генерирование данной
субпопуляции. Tr1-клетки оказывают регуляторное влияние на широкий спектр
иммунных клеток через секрецию супрессорных цитокинов. К примеру,
супернатанты, полученные от активированных Tr1-клеток значительно
подавляют способность DC индуцировать аллоантиген-специфическую
пролиферацию. Tr1-клеточные клоны также супрессируют продукцию
иммуноглобулинов B-клетками. Более того, через локальную секрецию IL-10,
Tr1-клетки вызывают дифференцировку Tcon в Tr1. Учитывая то, что TGF-β
также
секретируется
Tr1-клетками
и
является
фактором
35
дифференцировки/роста CD4+CD25+-клеток, можно предположить, что Tr1клетки участвуют в индукции других субпопуляций Treg-клеток [175].
Обобщая вышесказанное, следует признать, что IL-10-продуцирующие
Tr1-клетки являются отдельной субпопуляцией Treg-клеток, участвуют в
регуляции иммунного ответа на широкий спектр АГ и присутствуют in vivo у
мышей и человека.
Считается, что к de novo образованию Tr1 субпопуляции также ведет
индукция Tcon-клеток высоким уровнем молекул CD40, CD86 и PD-L1,
представленных на APC [166, p. 224]. Относительно недавно были
опубликованы похожие результаты, согласно которым в присутствии анти-CD3
и TGF-β PD-L1, экпрессированный на APC, индуцирует образование
CD4+Foxp3+ Treg-клеток de novo из Tcon-клеток за счет ослабления передачи
сигнала по пути Akt-mTOR и сопутствующей стимуляции PTEN мессенджера
[120, p. 227]. Интересно, что соответствующий механизм подавления
Akt/mTOR был описан и для конверсии iTreg-клеток, запускаемой другими
супрессорными молекулами nTreg-клеток [176]. Также, дальнейшее влияние
PD-L1 увеличивало экспрессию FoxР3 и супрессорную активность уже
дифференцированных iTreg-клеток. При этом для предотвращения
безграничного образования iTreg-клеток и поддержания адекватного
соотношения субпопуляций Т-клеток, необходимого для быстрого иммунного
ответа на внезапно возникшую угрозу, существует обратный механизм
регуляции данного процесса. Так, увеличение экспрессии PTEN под влиянием
PD-1 приводит к снижению экспрессии PD-L1, что служит и негативным
сигналом для дифференцировки и стимуляции активности iTreg-клеток.
Индуцированные в мышиных моделях PD-L1 iTreg-клетки сами
экспрессировали данный лиганд и ограничивали увеличение количества АГспецифичных Т-эффекторных клеток, тем самым предотвращая развитие
аутоиммунного гастрита. Перенос таких iTreg-клеток ограничивал
представление АГ DC Т-эффекторным клеткам in vivo и резко снижал
экспрессию CD80 и CD86 на DC [120, p. 227].
Ранее были описаны супрессорные CD4+ и CD8+ субпопуляции Тregклеток, экспрессирующие HLA-G. HLA-G+ Т-клетки подавляют активацию и
пролиферацию Т-эффекторов и играют важную роль в регуляции иммунного
ответа [177].
HLA-G – это неклассическая молекула МНС класса Ib, закодированная в
кластере с генами остальных HLA на теламерном конце хромосомы 6p21, в
самом конце региона HLA. Гены, кодирующие HLA-G, в отличие от остальных
локусов МНС, представлены всего несколькими аллелями и являются наименее
полиморфными.
HLA-G
молекулы
представляют
собой
результат
посттранскрипционного сплайсинга первичных транскриптов, в результате
которого могут образовываться 4 мембран-связанные (HLA-G1, -G2, -G3 и -G4)
и 3 растворимые (HLA-G5, -G6 и -G7) изоформы, но все они действуют
одинаково. Наиболее изучена молекула HLA-G1, имеющая структуру,
идентичную
классической
HLA-I,
и
представляющая
собой
мембраносвязанную форму. Генетическая структура, кодирующая HLA-G1
36
также схожа с генами остальных молекул HLA-I, за исключением укороченного
цитоплазматического участка.
Сначала считали, что HLA-G является эволюционным артефактом среди
остальных лейкоцитарных АГ, затем обнаружили, что эта молекула может
регулировать активность всех основных эффекторных иммунных клеток и
является
неотъемлемым
участником
в
обеспечение
иммунной
неприкосновенности плода. HLA-G обнаруживается в ограниченном
количестве тканей. Так, наибольшая экспрессия представлена на трофобластах,
где и обеспечивает защиту от материнского аллогенного распознавания [178].
Также было отмечено участие HLA-G в развитии патологических состояний,
таких как вирусные инфекции, аллотрансплантация, заболевания, вызванные
хроническим воспалением, а также молекула HLA-G была обнаружена в
малигнизированных клетках различных типов рака [179]. HLA-G регулируют
активность клеток, связываясь с рецепторами, ингибирующими активирующие
сигналы. HLA-G в основном распознается молекулами ILT2 и ILT4, которые
экспрессируются мононуклеарными фагоцитами, T-, B-, а также NK-клетками.
Сигнальный путь ILT2/ILT4 до конца не изучен, но известно, что при
связывании с HLA-G происходит тирозинфосфорилирование ILT2/ILT4,
ассоциация с фосфотазой SHP-1 и изменение содержания кальция в клетке.
Также HLA-G может лигировать и другие рецепторы, такие как
иммуноглобулин-подобный рецептор киллерных клеток (KIR) – KIR2DL4,
CD94/NKG2A, CD160 и CD8αα.
HLA-G снижает пролиферацию Тh и их продукцию провоспалительных
цитокинов, подавляет цитотоксичность NK- и CD8+ цитотоксических Tлимфоцитов (CTL) и их продукцию IFN-γ и способен вызывать апоптоз CTL
через FasL. Прямое действие HLA-G на В-лимфоциты еще не изучено, но
известно, что 91% женщин, которые когда-либо были беременны, и около 100%
мужчин не имеют АТ против HLA-G в сыворотке. Интересно, что у оставшихся
9% женщин, циркулирующие анти-HLA-G имели сходство с АТ к другим
молекулам семейства HLA и не обладали способностью навредить
развивающемуся плоду. Основным регуляторным механизмом HLA-G
считается его влияние на АРС. HLA-G вызывает продукцию TGF-β1 и
приобретение данными клетками иммуносупрессорного профиля, образование
iDC. К тому же, АРС в активированном состоянии сами экспрессируют HLA-G,
подавляют иммунный ответ и вызывают приобретение CD4+ T-клетками
иммуносупрессорного фенотипа [178, p. 689]. Кроме этого, молекулы HLA-G
увеличивают количество миелоидных супрессорных клеток (MDSC) и
активируют Treg-клетки и опухоль-ассоциированные макрофаги, индуцируют
образование Tr1-клеток [180].
Относительно происхождения HLA-G+ Т-клеток, имеются определенные
разногласия. Сначала Feger U. с соавт. выделили HLA-G+ Т-клетки из
периферической крови здоровых доноров, показали в них конститутивную
экспрессию м-РНК HLA-G и показали, что такие клетки обладают низкой
пролиферативной активностью, не экспрессируют CD25 и FoxP3, чем
отличаются от классических nТreg-клеток, и супрессируют пролиферацию
37
аллогенных Т-лимфоцитов HLA-G-зависимым путем. Интересно, что такие
клетки были обнаружены в человеческом тимусе, что предполагает их
естественное присутствие в организме [29, p. 572]. Позднее, было показано, что
APC децидуальной оболочки увеличивают экспрессию HLA-G Tcon-клетками
in vitro [181]. Другие исследователи обнаружили увеличенное количество HLAG+ DC-10 и CD4+HLA-G+ Т-клеток в слизистой матки [30, p. 408]. Как уже
отмечалось выше, DC-10-клетки участвуют в образовании Tr1 субпопуляции и
в этом процессе задействован HLA-G [168, p. 552]. При этом полученная in vitro
гомогенная популяция Tr1-клеток, путем трансдукции в человеческие CD4+ Tклетки двунаправленным лентивирусным вектором гена, кодирующего
человеческий IL-10, имела все характерные для Tr1-клеток черты и
экспрессировала высокий уровень HLA-G на своей мембране [182]. Интересно,
что в экспериментах in vitro, активированные анти-CD3 анти-CD28 HLA-G+Тклетки подавляли пролиферацию аллогенных Т-лимфоцитов IL-10-зависимым
путем [179, p. 278]. Таким образом, описанные выше данные предполагают
конверсию HLA-G+ iTreg-клеток на границе между стенкой матки и плодом для
предотвращения иммунного ответа против плода и не исключают возможность
образования таких клеток на периферии при других иммунных реакциях. Мы
можем предположить, что субпопуляция HLA-G+ Т-клеток состоит как из
естественных регуляторных CD4+- и CD8+-клеток, имеющих тимусное
происхождение, так и из индуцированных CD4+-клеток, предпочтительно
являющихся Tr1 или Tr1-подобными клетками.
Пока не вполне ясно, как регулируется гомеостаз численности различных
субпопуляций Treg-клеток, но очевидно, что субпопуляции iTreg-клеток
участвуют в поддержании иммунологической толерантности. Очевидно, что
изучение молекулярных механизмов супрессии, путей регулирования их
индукции, роли и функции iTreg-клеток при различных заболеваниях, в том
числе и при онкологии, а также их фенотипическое маркирование могут быть
использованы в терапии многих заболеваний. В данной работе были изучены
основные субпопуляции iTreg-клеток (Tr1, Th3, Treg -IL-17-клетки, HLA-G+
Тreg-клетки), так как супрессорная активность данных клеток была
неоднократно показана.
1.2
Иммунорегуляторные субпопуляции натуральных киллерных
клеток
1.2.1 Натуральные киллерные клетки
NК-клетки представляют собой большие гранулярные лимфоциты с
характерной морфологией: основная часть обильной цитоплазмы содержит
несколько митохондрий, свободные рибосомы с отдельными элементами
шероховатого эндоплазматического ретикулума, аппарат Гольджи и
характерные электроноплотные гранулы, связанные с мембраной. NК-клетки
имеют гаметное (неперестроенное) расположение генов. В норме, натуральные
киллеры у человека составляют примерно 5-15% лимфоцитов ПК, 1-5%
лимфоцитов селезенки и широко распространены по лифоидным и
нелимфоидным тканям организма. У взрослого человека в крови циркулирует
38
около 2 млрд NК-клеток, которые полностью обновляются примерно за 2
недели. Традиционно фенотип NК-клеток определяет присутствие маркера
CD56, который является молекулой адгезии нервных клеток, принадлежит к
суперсемейству иммуноглобулинов и имеет молекулярную массу 140 кДа, и
отсутствие Т-клеточного маркера CD3. Кроме того, NК-клетки определяют по
присутствию на их поверхности CD16 и CD94. CD16 является рецептором для
Fc-фрагмента иммуноглобулина G, CD94 относится к семейству С-лектинов и
способен связывать молекулы MHC I. Таким образом, фенотип NК-клеток
выглядит следующим образом CD3-CD56+CD16+CD94+. Следует отметить, что
не один из вышеперечисленных маркеров не является строго специфичным для
NК, так как может встречаться среди некоторого числа моноцитов, Т- и Влимфоцитов, макрофагов, нейтрофилов и других типов клеток. На поверхности
киллерных клеток присутствует множество рецепторных молекул, влияющих
на активность NК-клеток. Их можно условно подразделить на 2 типа –
модуляторы активности: рецепторы для активаторов киллерных клеток (РАК) и
ингибиторы активности – рецепторы для ингибиторов (РИК).
Эти молекулы и осуществляют распознавание потенциально опасных
сигналов от клеток и тканей организма. Баланс активирующих и ингибиторных
сигналов и определяет поведение NК-клеток. NК-клетки не способны
распознавать и реагировать на АГ как это делают Т- и В-лимфоциты и поэтому
не формируют иммунологическую память. Несмотря на это, NК распознают Fc
участок АТ своим рецептором CD16 и таким образом атакуют захваченную АТ
мишень.
Распознавание NК-клетками их мишеней осуществляется при помощи
РАК. NKG2D, один из рецепторов, активирующих NК, распознает лиганды,
которые экспрессируются на поверхности клеток, испытывающих клеточный
стресс, вызывая активацию NК в итоге приводящую к гибели таких клеток, к
которым относятся генетически чужеродные и малигнизированные клетки.
Другие рецепторы распознают лиганды вирус-инфицированных клеток.
Взаимодействие РИК с молекулами MHC I, экспрессирующимися на
поверхности большинства клеток организма, приводит к их инактивации и
таким образом защищает здоровые клетки от лизиса. Одним из таких
рецепторов является NKG2A-CD94 гетеродимер, распознающий молекулы
MHC I и передающий сигнал через свои цитоплазматические домены [183].
В настоящее время известно, что NК-клетки происходят от CD34+
гемопоэтических предшественников костного мозга. IL-15 способствует
дифференциации гемопоэтических стволовых клеток в NК. Процессы
дальнейшей дифференцировки NК до конца не изучены. Однако последние
исследования показали присутствие незрелых субпопуляций NК клеток во
вторичных лимфоидных органах, например, в лимфатических узлах. Показано,
что NК-клетки созревают в лимфатических узлах, где имеется большое
количество DC и APC, экспрессирующих мембран-связанную форму IL-15 (mbIL-15), который, как уже было сказано, является жизненно важным цитокином
в процессах развития NК.
39
В модели созревания человеческих NК-клеток, предложенной Caligiuri M.,
учитываются все последние исследования в этой области, поэтому данная
модель видится наиболее полной. По этой модели, CD34+CD45RA+
гемопоэтические предшественники из костного мозга циркулируют по крови,
проходя через венулы с высоким эндотелием в парафолликулярное
пространство лимфатического узла. Здесь про-NК-клетки активируются и
проходят через несколько стадий развития и дают начало субпопуляциям
CD56bright и CD56dim. Созревающие CD56dim клетки возвращаются в кровоток
через эфферентные лимфатические сосуды, в то время как CD56bright остаются и
взаимодействуют с DC, тем самым, выполняя регуляторные функции [184].
NК-клетки выполняют разнообразные функции в организме человека, так
как являются ключевой составляющей врожденного иммунитета. Согласно
современной концепции NK-клетки человека обладают противовирусной,
антибактериальной, противопаразитарной, противоопухолевой и регуляторной
функциями. NК-клетки признаны самыми «агрессивными» лимфоцитами. NКклетки способны к очень быстрому ответу, который чрезвычайно важен при
неспецифическом иммунном ответе. Свои цитотоксические функции эти
клетки-киллеры осуществляют по двум механизмам. Первый известен как
гранзим-перфорин зависимый, в ходе которого, при распознавании мишени
NК-клетка секретирует цитотоксические гранулы путем направленного
экзоцитоза. Эти гранулы содержат перфорин, гранзимы и различные
протеолитические ферменты. Другие способы уничтожения клеток основаны на
взаимодействии лигандов рецепторов клеточной гибели FasL, TRAIL, TNF-α,
которые экспрессируются на поверхности NК со своими рецепторами на
клетках-мишенях. Активация этих рецепторов приводит к апоптозу. Такой
механизм реализуется по отношению ко многим злокачественно
трансформированным клеткам [185].
NК-клетки считаются важными регуляторами противовирусного
иммунитета. NК-клетки могут активироваться IFN-α и -β, IL-15, IL-12 и IL-18,
что в ответ резко увеличивает продукцию IFN-γ. В опытах на мышах показано,
что удаление NК-клеток, а также дефекты активности NК и снижение
продукции IFN-γ, делало опытных мышей менее устойчивыми к
цитомегаловирусу [186]. В редких случаях NК-клеточной недостаточности у
людей зафиксирована важная роль NК при защите от вируса герпеса человека.
Однако люди с острым NК-иммунодефицитом не проявляли повышенной
чувствительности к вирусам. Это не означает, что NК-клетки не проявляют
противовирусной активности, а может свидетельствовать о возможной
адаптации человеческого организма. Другое свидетельство важной роли NКклеток в регуляции противовирусного иммунитета – это контроль
иммунопатологии. NК-клетки регулируют активацию макрофагов в процессе
развития иммунного ответа против вирусов, уничтожая гиперактивные клетки,
которые в ряде случаев вызывают тяжелые воспалительные синдромы [187].
Таким образом, NК снижают риск развития воспалительных заболеваний, с
одной стороны контролируя развитие инфекционного агента, с другой –
сдерживая чрезмерную активность активированных макрофагов.
40
Исследования, проводившиеся на NК-клетках человека и других видов
млекопитающих, показали, что раковые клетки распознаются ими как мишени.
NК-клетки
распознают
молекулы
MHC-I
на
поверхности
нетрансформированных клеток, что предотвращает уничтожение собственных
клеток организма даже в присутствии активирующих NК-клетки сигналов.
Снижение экспрессии молекул MHC-I на трансформированных клетках ведет к
их лизису NК-клетками при наличии активирующего сигнала [188]. В
экспериментах на мышах было продемонстрировано, что снижение экспрессии
молекул MHC-I и повышение экспрессии лигандов NKG2D или CD27
способствовали восприимчивости раковых клеток к NК-опосредованному
лизису. В некоторых моделях уничтожение NК-клетками опухолевых клеток в
последующем индуцировало развитие Т-клеточного противоракового ответа
[189 ]. Роль NК-клеток в осуществлении противоопухолевого надзора была
показана при моделях спонтанных и индуцированных метилхолантреном
опухолей. При этом NК реагировали через NKG2D, защищая организм от
опухоли. Кроме непосредственной защитной роли, NК-клетки выступают как
медиаторы противоопухолевых эффектов некоторых цитокинов, таких как IL-2,
IL-12, IL-18 и IL-21 [190].
Мыши, у которых были удалены NК-клетки из циркуляции, были
подвержены развитию метилхолантрен-индуцированной саркоме. В то же
время у мышей, дефицитных по Т-клеткам, но с нормальным количеством NКклеток, не отмечалось повышенной частоты развития спонтанных опухолей
[184]. Стареющие мыши с генетическими дефектами NК-клеточной активности
(обработанные Corynebacterium parvum или IFN-γ) показывали устойчивость к
развитию метастазов [191 ]. Адаптивный перенос спленоцитов от мышей с
высокой
активностью
NК-клеток
частично
восстанавливал
антиметастатическую способность мышей, обработанных антиасиало GM1 и
циклофосфамидом [192].
Большое количество данных свидетельствует об участие NК-клеток в
иммунобиологическом надзоре над развитием онкологических заболеваний у
человека. Эпидемиологическое исследование показало связь между степенью
активности NК-клеток и риском развития раковых опухолей: низкая активность
NК ассоциируется с повышенным риском развития злокачественных
новообразований. У пациентов, получавших иммунодепресанты, высокий риск
развития онкопатологий сопровождался низкой NК-клеточной активности
[193].
Часть исследований показала, что у онкологических больных значительно
снижена цитотоксическая активность NК-клеток ПК [194, 195]. Другие
исследователи показали, что уровень активности NК-клеток периферической
крови позитивно коррелирует с прогнозом онкологического заболевания. При
РМЖ, у пациентов с нормальной цитолитической активностью NК-клеток
периферической крови после терапии метастазирование встречалось реже, чем
у пациентов с низкой цитолитической активностью [196].
Все возрастающее число исследований, раскрывающих тонкие механизмы
распознавания мишеней и применения NК-клетками их цитотоксического
.
.
41
арсенала, дают многообещающие результаты использования NК-клеток в
терапии рака. Однако, клиническая эффективность таких терапевтических
стратегий на практике оказалась невысокой, что, возможно, вызвано
подавлением функций NК-клеток развивающейся опухолью и опухольассоциированными супрессорами. NК-клетки показали себя клинически
эффективными лишь в тех случаях, когда проводилась блокада РИК АТ (при
острой лейкемии) или когда активированные NК уничтожали раковые клетки
через TRAIL-зависимый путь. Для продолжения разработок в этой области
необходимы дальнейшие исследования [197].
1.2.2 Иммунорегуляторные функции натуральных киллерных клеток
Кроме противовирусной и противоопухолевой функций NК могут
выступать в качестве регуляторных клеток, воздействуя на другие клетки
иммунной системы – DC, Т- и В-лимфоциты, клетки эндотелия. NК-клетки
могут оказывать как положительные, так и негативные регулирующие
эффекты. К положительным относится влияние NК-клеток на DC, CTL, Th1клеток и Treg-клетки.
Клетки NК и DC – два типа специализированных клеток врожденной
иммунной системы, взаимное взаимодействие которых может потенциально
влиять на созревание друг друга и в результате формировать мощный,
активизирующий перекрестный диалог [187, p. 48]. DC действуют во время
начальной фазы клеточной активации NК и индуцируют врожденный
иммунный ответ, модулируя цитолитический эффект NК-клеток на опухоли
или вирус-, бактерии- или паразит-инфицированные клетки. NК-клетки могут
предоставлять сигналы, которые вызывают созревание DC и производство ими
цитокинов. In vivo, взаимодействия NК и DC могут встречаться в лимфоидных
органах так же как и в зонах воспаления или в тканях опухоли и на различных
стадиях врожденных и адаптивных иммунных реакций. NК-клетки,
активированные опухолевыми клетками, могут косвенно вызывать
противоопухолевые реакции Т-лимфоцитов, стимулируя DC.
Взаимодействие NК- и DC-клеток играет значительную роль при
противоопухолевом иммунном ответе, вызывая индукцию опухольспецифичных CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов. Активированные NК-клетки
вызывают созревание DC и их дифференцировку в поляризованные DC-1,
характеризующиеся 100-кратным увеличением продукции IL-12. Этот процесс
зависит от IFN-γ, TNF-α и NKG2D, экспрессируемых NК-клетками [198]. DC-1
продуцируют
высокий
уровень
IL-12p70
даже
при
наличии
иммуносупрессорных
факторов,
которые
блокируют
способность
продуцировать IL-12p70 как mDC, так и iDC [199].
Сначала считали, что для дифференциации CTL из наивных CD8+ Тлимфоцитов необходимо влияние CD4+ Т-клеток, включая секрецию цитокинов
и взаимодействие CD40/CD40L, что приводит к увеличению экспрессии
костимуляторных молекул на DC и индукцию продукции IL-12 [200]. Известно,
что DC, полученные из костного мозга, вызывают отторжение лимфомы A20 и
опухоль-специфическую долгосрочную память, даже если они не
42
взаимодействовали с опухолевым АГ. В экспериментах с использованием
мышей с нокаутом CD40 было показано, что этот эффект не требует
взаимодействия с CD4+ Т-лимфоцитами [201]. Вместо этого перекрестный
диалог между NК и DC играл ключевую роль во время этого процесса.
Активированные
NК-клетки,
стимулированные
NKG2D-лигандами,
экспрессируемыми на опухолевых клетках, продуцировали IFN-γ, который в
свою очередь вызывал созревание DC. IL-12, продуцируемый DC, активировал
реакции CTL.
NК-клетки выполняют важную функцию в индукции АГ-специфичных
CTL-клеток. Так, было показано, что в отсутствии NК-клеток не происходила
индукция АГ-специфических CTL in vitro и in vivo. На основе NKG2D-лигандпозитивной модели опухоли также были получены результаты, указывающие
на то, что регулирующая и цитолитическая активности NК играют главную
роль в инициации и сохранении активности CTL. CD8 +-T-клеточное
отторжение опухоли требует влияния NК-клеток в естественных условиях, т.к.
в экспериментах опухоль прогрессировала как в отсутствии NК-клеток, так и
при нарушении активности NК. Данная функция NК-клеток зависела от
перекрестного диалога с DC. Взаимодействие CD27 на NК и CD70 на
опухолевых клетках вызывало отторжение опухолей CD8+ Т-лимфоцитами, что
зависело от продукции IFN-γ [202]. Wilcox R. и его коллеги обнаружили, что
IL-2 и IL-15 индуцируют экспрессию CD137 NК-клетками и блокада CD137
стимулирует пролиферацию NK и секрецию ими IFN-γ. CD137стимулированные NК-клетки вызывали увеличение активированных CD8+ Tклеток in vitro, что свидетельствовало об иммунорегуляторной активности или
хелперной активности по отношению к CTL [203].
Ранее предполагалось, что NК-клетки, косвенно участвуют в реакциях
адаптивного иммунного ответа, который вовлекает секрецию данными
клетками цитокинов (таких как IFN-γ, ГМ-КСФ и TNF-α) и хемокинов (MIP-1α,
MIP-1β, RANTES, и т.д.). Недавно, были получены данные, указывающие на то,
что прямые межклеточные контакты между NК-клетками и Т-лимфоцитами
также имеют важное значение. Philips D. и его коллеги впервые обнаружили,
что активированные NК-клетки человека, экспрессируют молекулы МНС II
[204]. Позже, Roncarolo М. и его коллеги также продемонстрировали, что NКклетки положительно регулируют экспрессию MHC II молекул и способны
презентировать АГ CD4+-T-клеткам [205]. Позже, Zingoni А. и др. показали, что
NК-клетки человека, активированные IL-12 и IL-15, экспрессируют CD86 (член
семейства B7 и костимуляторный лиганд рецептора CD28). Блокада
формирования РАК (например, CD16, NKG2D), вызывает экспрессию лиганда
OX40 (OX40L) на активированных NК-клетках, в то время как OX40
индуцируется TCR/CD3 сигналами и присутствует главным образом на
активированных CD4+ Т-лимфоцитах. Далее авторы продемонстрировали, что
рецептор-активированные
NК-клетки
могут
костимулировать
TCRиндуцированную пролиферацию и продукцию цитокинов аутологичными CD4+
Т-клетками и что этот процесс требует OX40-OX40L и CD28-B7
взаимодействия [206].
43
Кроме этого, совместное культивирование активированных NК-клеток
показало дозозависимое повышение пролиферации CD4+ Т-клеток и секреции
ими IL-2 и IFN-γ. Блокада формирования рецепторов (NKp30, NKp46, NKG2D и
CD16) на NК-клетках и их лигандов приводит к лизису клеток-мишеней и затем
NК-клетки активируются и стимулируют CD4+ Т-лимфоциты. Также было
показано, что NК-клетки, выделенные из воспаленных миндалин,
экспрессируют значительные уровни молекул HLA-DR, DP, DQ, CD86, CD70, и
OX40L, что указывает на приобретение NК-клетками фенотипа подобного APC
в естественных условиях в воспаленных лимфоидных органах [207].
Таким образом, была предложена новая модель связи между врожденным
и приобретенным иммунитетом, обеспечиваемая перекрестным диалогом
между CD4+ Т-лимфоцитами и рецептор-активированными NК-клетками.
Также былы показаны новые свойства NК-клеток, подобные APC.
Активированные NК-клетки могут повышать приобретенный иммунный
ответ, продуцируя IFN-γ, который вызывает созревание Th1. IL-12 имеет
важную роль в увеличении продукции цитокинов Th1-клетками и подавлении
продукции цитокинов Th2-типа. Активированные NК-клетки производят IFN-γ,
который в свою очередь активирует секрецию IL-12 макрофагами. Отметим,
что и IFN-γ, и IL-12 могут вызвать дифференциацию Th1-клеток [208]. У
людей, NК-клетки, находящиеся во вторичных лимфоидных тканях
поддерживают поляризацию Th1 более эффективно, чем NК ПК, т.к. их
способность продуцировать IFN-γ выше за счет влияния DC. Иммунный ответ
Th1-поляризованных лимфоцитов более эффективен против опухоли и
вирусных инфекций [209]. Интересно, NK-клетки, находящиеся в лимфоидных
органах, экспрессируют достаточно высокий уровень CD4, намного
превышающий таковой среди NK-клеток ПК, что объединяет их с Th1клетками. CD4+ NK-клетки обладают высокой цитолитической активностью и
высокой способностью продуцировать IFN-γ и TNF-α, по сравнению с CD4+
NK-клетками. При этом лигирование CD4 увеличивает количество NK-клеток,
секретирующих данные цитокины [210], что может приводить к
дифференциации Th1-клеток.
NК-клетки
проявляют
отрицательные
регулирующие
эффекты,
поддерживая иммунный гомеостаз при некоторых физиологических и
патологических
состояниях.
Например,
они
могут
убивать
гиперактивированные макрофаги, DC, а также активированные T и Влимфоциты. Известно, что DC индуцируют пролиферацию NK, которые, в свою
очередь, приобретают способность убивать iDC и также индуцировать
созревание DC. NK-опосредованный киллинг iDC на периферии является
примером негативной регуляции функции DC, позволяющей иммунной системе
сохранять только необходимые для иммунного ответа DC, способные к
созреванию и процессированию АГ в воспаленных тканях. Созревание DC
ведет не только к изменению их способности захватывать АГ, но и к
изменению
экспрессии
хемокинов
и
приобретению
экспрессии
костимуляторных молекул, необходимых для индукции наивных Т-клеток.
Ранее сообщалось, что mDC, в отличие от iDC, в целом резистентны к NK44
клеточной цитотоксичности. Различная восприимчивость iDC и mDC NKопосредованному киллингу в основном зависит от экспрессии ими молекул
HLA-I, которые экспрессированны обоими субпопуляциями DC, но уровень
намного выше на mDC-клеткам. Перекрестный диалог между активированными
NK-клетками и iDC действует как регулятор/выключатель для иммунной
системы. В низком соотношение NК:DC (1:5), при межклеточном
взаимодействие между DC и NК, резко увеличивается продукция цитокинов DC
(IL-12, TNF-α), а также созревание DC, которое зависит от эндогенного TNF-α.
При более высоком соотношении NК:DC (5:1) происходит ингибирование
функций DC из-за прямого NК-клеточного убийства iDC [211]. Следует
отметить, что способность убивать iDC свойственна не всем NK-клеткам, а
только их субпопуляции, имеющей фенотип CD94/NKG2A+KIR– [212].
NК-клетки могут также играть важную роль в поддержании иммунного
гомеостаза, непосредственно регулируя рост активированных эффекторных Тклеток. Ранее было показано, что NК-клетки тормозят изогенную
пролиферацию Т-клеток через положительную регуляцию ингибитора
клеточного цикла p21, задерживая клеточный цикл на стадии G0/G1. Данное
торможение – зависит от межклеточных контактов, является обратимым и АГнеспецифичным [213]. В моделях по пересадке кожи NК-клетки хозяина могли
разрушать полученные из трансплантата APC, ингибируя аллореактивные Тклетки и, таким образом вызывая толерантность к трансплантату [214].
Суммируя вышесказанное, можно сказать, что на сегодняшний день
получено много данных, указывающих на то, что NK-клетки являются не
только простыми «киллерами» опухолевых и инфицированных вирусами
клеток, но и иммунорегуляторами других иммунных клеток. NK-клетки влияют
на адаптивный иммунитет и участвуют в поддержании иммунного гомеостаза.
Широкий спектр действия NK-клеток может быть объяснен разнообразием
субпопуляций NK-клеток, различной тканевой средой, и перекрестной связью с
другими иммуноцитами. Дисфункция или потеря NК-клеток влечет за собой
развитие различных патологических состояний (например, онкологические
заболевания, аутоиммунные и инфекционные болезни, бесплодие, и
рецидивный самопроизвольный аборт). Эти результаты предполагают
существование иммнорегуляторной субпопуляции NK-клеток, подобной Tregклеткам.
1.2.3 Иммунорегуляторные субпопуляции натуральных киллерных клеток
Иммунорегуляторная функция NК-клеток традиционно связывается с
цитокин-продуцирующей субпопуляцией. Первоначально было предложено
разделение NК-клеток периферической крови на две субпопуляции,
различающиеся по экспрессии CD56 и CD16. Большинство (приблизительно
90%) NК-клеток человека является CD56dim и экспрессирует высокий уровень
FcγRIII (CD16), тогда как меньшая часть (приблизительно 10%) имеют фенотип
CD56bright и CD16dim/- [215]. CD56brightCD16--NК-клетки экспрессируют
рецепторы с высоким и средним сродством к IL-2 и их количество
увеличивается in vitro и in vivo в ответ на низкие дозы IL-2. Напротив,
45
CD56dimCD16+-NК-клетки экспрессируют только рецепторы к IL-2, имеющие
среднее сродство, и пролиферируют слабо в ответ на большие дозы IL-2 in vitro,
даже после индукции рецептора с высокой аффиностью к IL-2. CD56brightCD16-клетки экспрессируют значительно больший уровень IFN-γ, TNF-α, ГМ-КСФ,
IL-10 и IL-13 в ответ на стимуляцию, чем CD56dimCD16+-клетки, которые
продуцируют незначительное количество данных цитокинов. В покое,
CD56dimCD16+-клетки являются более цитотоксичными против NКчувствительных клеток-мишеней, чем CD56brightCD16-. Все CD56brightCD16-клетки экспрессируют высокий уровень ингибиторного комплекса
CD94/NKG2A, опознаваемого HLA-E, но они не экспрессируют MHC-I аллельспецифичного KIR, который экспрессируется CD56dimCD16+-клетками. Обе
субпопуляции периферической крови человека экспрессируют активирующие
рецепторы NKG2D и NKp30, так же, как и NKp46. CD56brightCD16--клетки
экспрессируют функциональный CC-хемокиновый рецептор 7 (CCR7), CD62L,
имеют высокий уровень экспрессии CXC-хемокинового рецептора 3 (CXCR3) и
сильные хемотаксические реакции на лиганды для этих рецепторов. Напротив,
CD56dimCD16+-клетки экспрессируют низкие уровни CCR7, но имеют высокий
уровень экспрессии CXCR1 и CX3C-хемокинового рецептора 1 (CX3CR1), и
проявляют функциональные реакции на IL-8 и CX3CL1. У пациентов, больных
СПИДом и у некоторых больных раком, было продемонстрировано наличие
более низкой доли CD56dim-NК-клеток со сниженной натуральной
цитотоксичностью [216]. В то время как в матке, печени, лимфатических узлах
и зонах воспаления NК-клетки главным образом представлены субпопуляцией
CD56bright с относительно меньшим количеством CD56dim [217, 218]. Эти
результаты указывают на то, что CD56bright-NК-клетки более вероятно обладают
иммунорегуляторной функцией, тогда как CD56dim играют ключевую роль во
врожденном иммунитете против вирусов и рака.
Развитие взаимоотношений между CD56bright и CD56dim NК-клетками до сих
пор не ясно. Считается, что CD56bright-клетки могут быть индуцированы IL-15,
продуцируемым предшественниками NК-клеток и после этого могут
дифференцироваться в CD56dim-клетки на периферии [219]. Однаконе
исключено существование собственного клеточного предшественника CD56 dim
или дополнительного сигнала, который мог бы вызывать их дифференцировку
от общего предшественника NК-клеток. Сравнительно недавно было найдено,
что и IL-2, и IL-15 поддерживают дифференциацию NК-клеток, полученных из
мононуклеарных клеток пуповинной крови. IL-15 увеличивает пролиферацию и
активацию
CD56dim-клеток
при
долговременном
культивировании
мононуклеаров пуповинной крови, но IL-2 только поддерживает выживание
CD56bright-клеток. IL-15 играет важную роль в поддержании длительных
функций CD56dim- клеток, в то время как Bcl-xL связан с антиапоптотическим
эффектом [220]. Данные результаты показывают, что IL-15, но не IL-2,
поддерживает дифференциацию и выживание CD56dim-NК-клеток от
промежуточных NК или клеток предшественников.
Как уже говорилось, важную роль во взаиморегуляции NК- и DC-клеток
играет субпопуляции NK-клеток, имеющая фенотип CD94/NKG2A+KIR–.
46
Фенотип CD94/NKG2A+KIR- NК-клеток одинаков для большинства CD56bright
NК-клеток, но гетерогенность в способности убивать iDC имеет место даже
среди субпопуляции CD94/NKG2A+KIR- NK-клеток и данная активность
коррелирует с интенсивностью экспрессии рецептора NKG2A. NK клоны,
экспрессирующие низкий уровень NKG2A лизируют как iDC, так и mDC, в то
время как высокая степень экспрессии NKG2A ассоциируется с киллингом
только iDC [212, p. 1659]. Механизм киллинга аутологичных АPC NК-клетками
основан на доставке PI-3K/Akt-зависимых активирующих сигналов в NКклетках через связывание их NKp30 и NKp46 рецепторов. При этом экспрессия
лигандов NKp30 и NKp46 на АPC активируется TNF-α [221].
Подобно субпопуляциям Th1 и Th2, NК также предлагалось
классифицировать на субпопуляции NК1 и NК2 согласно секретируемым
цитокинам. Субпопуляция NК1 секретирует цитокины с типичной структурой с
преобладающей экспрессией IFN-γ, но почти не экспрессирует IL-4, IL-5 и IL13. Напротив, субпопуляция NК2 экспрессирует IL-4, IL-5 и IL-13, но не IFN-γ.
Результаты экспериментов показали, что цитокины 2 типа, продуцируемые
NК2-клетками, являются доминирующими при астме и опухолях, и вовлечены
в патогенез данных заболеваний [222]. Также, в отдельные группы выделялись
IL-10-секретирующие (NК3) и TGF-β-секретирующие (NКr1) клетки, играющие
важную роль в иммунорегуляции и обеспечение толерантности при
беременности и пересадке органов [214, p. 1855; 223].
B220+CD11c+NK1.1+ субпопуляция клеток, способная к секреции более
высоких уровней IFN-γ была обнаружена во вторичных лимфоидных тканях.
Эта субпопуляция обладает и литическим потенциалом NК-клеток и АГпрезентирующей способностью DC и таким образом эта субпопуляция клеток
была названа производящими интерферон дендритными киллерными клетками
(IKDC). Дальнейшие исследования показали, что IKDC эффективно убивают
клетки-мишени NК и интенсивно пролиферируют в ответ на стимуляцию IL-15
и IL-18, но вызывают незначительную или не вызывают пролиферацию Тклеток относительно обычного воздействию белкового АГ или MHC-II [224].
В модельных опытах на мышах, Maroof А. и коллеги идентифицировали
NKp46+CD49b+CD3- субпопуляцию NK-клеток, обладающую супрессорной
активностью. В ходе хронического воспалительного процесса, вызванного
простейшими Leishmania donovani, NK-клетки поступали в селезенку и
гранулемы печени и подавляли иммунный ответ через IL-10-зависимый
механизм. Ингибиторная функция данных клеток коррелировала с накоплением
мРНК IL-10 на начальных этапах воспаления и затем, увеличением секреции
IL-10 данными клетками на более поздних стадиях [225].
Deniz G. и ее коллеги охарактеризовали IL-10-секретируюшую
субпопуляцию NK-клеток ПК, выделенных с помощью АТ против IL-10/CD45
и вторичного мечения секретированного и связавшегося IL-10. Данная
субпопуляция NK-клеток экспрессировала повышенный уровень мРНК IL-10,
низкий уровень мРНК TGF-β и FoxP3 и не экспрессировала IFN-γ. Блокируя
рецепторы IL-10, они показали, что IL-10, секретируемый IL-10+-NK-клетками,
47
значительно подавляет пролиферацию аллерген- и АГ-индуцированных CD4+
Т-клеток, а также их секрецию IL-13 и IFN-γ [10, p. 856].
Позже, в условиях in vitro из CD34+ предшественников ПК была получена
новая нецитолитическая субпопуляция NК-клеток, имеющая зрелый фенотип и
уникальные иммунорегуляторные функции. Эти регуляторные NК-клетки
имели фенотип CD56+CD16+NKp30+NKp44+NKp46+CD94+CD69+CCR7+HLA-G+
и секретировали иммунорегуляторные факторы IL-10, IL-21 и HLA-G, при этом
супрессорная функция осуществлялась в основном молекулой HLA-G. Они
осуществляли низкоуровневую регуляцию иммунного ответа, подавляя mDC,
блокируя цитолитические функции NK-клеток и индуцируя экспрессию
мембранного HLA-G на моноцитах ПК. Супрессорный эффект данных клеток
зависел от взаимной транспрезентации mb-IL-15, экспрессируемого CD34+
гемопоэтическими предшественниками периферической крови человека [9, p.
15].
NK-клеточный механизм супрессии, осуществляемый за счет мембрансвязанных форм HLA-G1, были подтверждены другой группой исследователей.
Так, был показан трогоцитоз HLA-G1 IL-2-активированными NK-клетками ПК
и NK-клеточной линией, в результате их инкубации в присутствие клеток
линии меланомы, трансфектных по гену HLA-G1. После приобретения HLA-G1,
NK-клетки прекращали пролиферировать, теряли цитолитическую активность и
начинали функционировать как иммуносупрессоры, подавляя цитолитические
свойства аутологичных NK в супрессор:эффектор-зависимом соотношение.
Нейтрализация как молекул HLA-G1, так и их основного рецептора ILT2,
подавляли ингибирующий эффект и восстанавливала цитолиз опухолевой
линии [226].
Суммируя вышесказанное, на сегодняшний день получено много данных,
указывающих на существование регуляторных NK-клеток и их участия в
осуществлении положительных и отрицательных регулирующих функций и
поддержании иммунного гомеостаза NК-клетками через секрецию различных
цитокинов или посредством межклеточных контактов, но точный фенотип
данной субпопуляции до сих пор не известен, а методы выделения и
последующего изучения цитокин-продуцирующих NK являются не только
трудоемкими, но и ограничивают возможности изучения данных клеток in vitro.
Учитывая важность супрессорного пула в развитии многих заболеваний, в том
числе и рака молочной железы, изучение регуляторных NK-клеток является
актуальным направлением современной иммунологии.
1.3
NK- и Т-регуляторные клетки при раке молочной железы
По данным Всемирной Организации Здравоохранения РМЖ – это
наиболее распространѐнный вид рака у женщин, который к тому же занимает
первое место по числу смертности от злокачественных новообразований среди
женского населения во всем мире, включая Казахстан. В последние десятилетия
заболеваемость РМЖ в развитых странах постоянно растет [227]. Несмотря на
многочисленные исследования и впечатляющий прогресс в диагностике и
лечение РМЖ, традиционная терапия (хирургическое вмешательство,
48
химиотерапия и/или лучевая терапия) не всегда являются эффективными для
значительной части женщин, у которых наблюдаются рецидивы РМЖ и, в
конечном счете, смерть [228]. Выявление факторов риска развития рака и
маркеров для ранней диагностики позволят снизить смертность от
онкологических заболеваний. Также, согласно данным Американской
Ассоциации исследования рака, возможным решением проблемы является
применение иммунотерапии, имеющей большой потенциал в лечении рака,
исключающей рецидивы в течение более длительного срока, практически не
имеющей побочных эффектов и отличающейся возможностью ее применения
для лечения многих типов рака. Иммунотерапия рака основана на
использовании уникальных свойств иммунной системы пациента бороться
против злокачественных образований. Наиболее успешные результаты
иммунотерапии были получены и разрешены к применению в лечение
меланомы через так называемые «проверочные точки» (―check points‖),
основанные на введение пациентам АТ, блокирующих CTLA-4 или PD-1.
Успешность данных подходов основана на одновременной активации Тэффекторных клеток и подавления супрессоров иммунитета, в частности, Tregклеток [229]. Таким образом, на сегодняшний день нахождение специфических
маркеров супрессии противоопухолевого иммунитета и разработки подходов
терапии для их элиминации является наиболее перспективным направлением
разработки новой иммунотерапии.
Широко известен негативный вклад Treg-клеток в развитие и
прогрессирование злокачественных новообразований за счет их способности
индуцировать иммунную толерантность к опухолевым АГ [19, p. 295].
Экспериментально
показана
роль
Treg-клеток
в
ослаблении
противоопухолевого иммунитета и их содействию развития опухолей, в том
числе и РМЖ [230]. Удаление натуральных CD4+CD25+-клеток приводит к
отмене иммунологической толерантности к опухолевым клеткам и развитию
противоопухолевых эффекторных механизмов. Количество CD4+CD25+-клеток
увеличено в ПК, в опухолевом микроокружение и среди опухольинфильтрирующих лимфоцитов у пациентов с различными типами рака,
включая РМЖ. При росте опухоли содержание CD4+CD25+-клеток повышается
в Т-зависимых зонах региональных лимфоузлов в прямом контакте с CD11c +
миелоидными DC и активированными CD4+- или CD8+-лимфоцитами [63, p.
436]. Количество CD4+CD25+ Treg-клеток коррелирует со стадиями РМЖ и
резко повышено на IV стадии заболевания [19, p. 299]. Также, процент Tregклеток коррелирует с тяжестью заболевания и низким противоопухолевым
иммунным ответом [2, p. 2758]. Высокий риск развития РМЖ, особенно
рецидивы РМЖ, также ассоциирован с повышенным количеством CD4+CD25+клеток. [231].
Общепринятым маркером Treg-клеток, ассоциированным с развитием
онкологических заболеваний, является FoxP3. Сначала было показано, что
присутствие транскриптов FoxP3 в опухолевой ткани коррелирует с инвазией,
ростом и васкуляризацией опухолей. Позднее Treg-клетки были
идентифицированы как основные клетки, экспрессирующие FoxP3 в
49
опухолевом микроокружение [232]. Аккумулирование CD4+CD25+FoxP3+клеток в опухоли ассоциировано со снижением выживаемости пациентов [233].
Недавние исследования показывают, что успешная химиотерапия карциномы
молочной железы, приводящая к полному устранению патологии,
характеризуется исчезновением FoxP3+ T-клеток в ткани [234], в то время как
высокий уровень таких клеток является достоверным маркером отдаленных
рецидивов заболевания [235]. Таким образом, Treg-клетки были признаны
основным параметром прогнозирования течения РМЖ, как инвазивного, так и
неинвазивного характера; также, иммуногистохимический тест на выявление
FoxP3+ T-клеток в препаратах ткани молочных желез широко применяется в
клинике.
До сих пор мало изучена причина увеличения Treg-клеток в опухоли и ПК
больных раком. Предполагается, что данные клетки состоят как из nTregклеток, мигрировавших и активно делящихся в области опухоли, так и
включают в себя пул iTreg-клеток, образовавшихся из Tcon и/или nTreg-клеток
[236]. Эта гипотеза подтверждается работами, показывающими присутствие
nTreg-клеток c определенным набором TCR [237] и наличие CD4+CD25+ Tregклеток в опухолевом микроокружении у тимэктомированных мышей и после
введения мышам анти-CD25 АТ [238]. Возникает вопрос: насколько
необходимо присутствие iTreg-клеток, помимо nTreg-клеток, для роста
опухоли? Две работы, выполненные на модели колита мышей, дефектных по
гену FoxР3 и страдающих аутоиммунным лимфопролиферативным
заболеванием, показали, что только совместное присутствие nTreg-клеток и
iTreg-клеток обеспечивает полное устранение симптомов заболевания [239],
что предполагает комплементарность всех субпопуляций Treg-клеток. Более
того, удаление Treg-клеток считается очень перспективным направлением в
лечение онкологических заболеваний, но применение экспериментального
препарата даклизумаб, представляющего собой раствор блокирующих CD25
АТ, не дало предполагаемых результатов. Отсутствие регрессии опухоли как в
мышиных моделях, так и в клинический испытаниях на людях [240] можно
объяснить тем, что помимо Treg-клеток с фенотипом CD4+CD25+ в супрессии
противоопухолевого иммунитета задействованы и другие клетки, кроме того,
активированные Т-эффекторы также экспрессируют CD25 и удаляются данным
препаратом.
На сегодняшний день механизмы увеличения количества Treg-клеток при
онкологических заболеваниях до конца не раскрыты, предполагается, что это
может быть результатом их индукции и дифференцировки как на периферии,
так и в опухолевом микроокружении. В норме, mDC, активированные in vivo,
стимулируют увеличение количества Treg-клеток, специфичных против
собственных АГ [19, p. 300]. Аналогично, nTreg-клетки могут давать клоны и
пролиферировать в опухолевом микроокружение в ходе их стимуляции
опухоль-ассоциированными DC. Так, в ПК, опухолевом микроокружении и
среди опухоль-инфильтрирующих лимфоцитов при РМЖ повышено
содержание клеток с фенотипом CD4+CD25+TGF-β+CTLA-4+CD45RA- и
CD4+CD25+FoxP3+ [241].
50
Помимо этого, при онкологических заболеваниях зафиксирована
повышенная миграция супрессорных Т-клеток в опухолевое микроокружение.
Перемещение Treg-клеток (натуральных или индуцированных) в опухоль
включает в себя комплексный, многошаговый процесс, затрагивающий
различные механизмы адгезии и хоуминга. Treg-клетки экспрессируют
различные хемокиновые рецепторы, включающие CCR2, CCR4, CCR5, CCR6,
CCR7, CCR8, CCR10, CXCR3, CXCR4 и CXCR5. В свою очередь хемокины,
лиганды данных рецепторов, секретируются опухолевыми клетками, опухольассоциированными макрофагами, iDC и MDSC. При различных типах рака, в
инфильтрировании опухолей Treg-клетками участвуют различные хемокиновые
рецепторы. При РМЖ наблюдается миграция CCR4+ Treg-клеток в опухолевое
микроокружение и сами опухолевые клетки экспрессируют повышенный
уровень лигандов к CCR4, CCR5 и CXCR3. В опухоли РМЖ, наблюдается
аккумулирование CCR6+ Treg-клеток, что коррелирует с плохой
выживаемостью пациентов. Также, было показано, что нейропилин 1 (Nrp-1),
высоко экпрессированный на nTreg-клетках и слабо представленный на in vivo
индуцированных iTreg-клетках, вызывает миграцию данных клеток в опухоль
по градиенту фактора роста васкулярного эндотелия (VEGF) [242].
В дополнение к nTreg-клеткам, в опухоли может присутствовать
увеличенное количество iTreg-клеток, как результат повышенной их конверсии
из Tcon и/или nTreg-клеток. iTreg-клетки, усиливая супрессорное действие
nTreg-клеток, могут подавлять противоопухолевый иммунный ответ при РМЖ.
Точный механизм конверсии iTreg-клеток при раке до конца не изучен.
Наиболее вероятным является влияние факторов опухолевого микроокружения.
Например, секретируемые в большом количестве опухолевыми клетками TGF-β
и IL-10, могут напрямую индуцировать дифференцировку Th3 [152, p. 207], Tr1
[243] и Treg-17-клеток [160, p. 3146], а также способствовать образованию
других
субпопуляций
Treg-клеток.
Ранее
показали,
что
TGF-β,
продуцированный опухолевыми клетками рака простаты у мышей, вызывал
образование CD4+CD25+FoxP3+ iTreg-клеток из CD4+CD25--клеток [19, p. 300].
Снижение продукции TGF-β клетками B16-меланомы, используя малые
интерферирующие РНК, останавливало рост опухоли за счет снижения
количества опухоль-инфильтрирующих Treg-клеток, что приводило к
восстановлению противоопухолевой активности эффекторных иммунных
клеток [244]. При этом помимо супрессии иммунного ответа и индукции
образования iTreg-клеток TGF-β, продуцированный Treg-клетками, участвует в
стимуляции экспрессии VEGF опухолевыми клетками, что повышает
васкуляризацию и развитие опухоли [245]. Такие же выводы, как в отношение
TGF-β, были сделаны и о роли IL-10 в опухолевом микроокружении РМЖ [1, p.
298]. Отметим, что при РМЖ, в опухолевой ткани обнаружено повышение
экспрессии мРНК IL-10 и TGF-β1 [242, p. 573].
Также было показано, что клетки глиомы, через PGE2, вызывают
увеличенную секрецию IL-10 mDC, что индуцирует образование Tr1-клеток, а
также увеличение ими секреции IL-10 и TGF-β [243, p. 4355]. Такие же
результаты были получены при коинкубации CD4+ T-клеток с клетками
51
плоскоклеточной карциномы головы и шеи (HNSCC) [246]. В процессе
повышения iTreg-клетки в опухоли могут участвовать и другие факторы,
продуцируемые опухолевыми клетками. Например, ГМ-КCФ и VEGF могут
повышать аккумулирование и пролиферацию в опухоли MDSC, которые в свою
очередь секретируют цитокины, индуцирующие образование iTreg-клеток
[247]. Следует подчеркнуть, что уровень ГМ-КCФ также повышен в
опухолевой ткани, а уровень VEGF позитивно коррелирует с плохим прогнозом
течения РМЖ. Еще одна молекула, продуцируемая опухолевыми клетками,
IDO, моделирует активность DC, делая их толерогенными и, тем самым,
участвует в индукции Treg-клеток [1, p. 266]. Таким образом, при РМЖ
опухоль-ассоциированные макрофаги и DC могут участвовать в активации,
конверсии и миграции в опухоль различных субпопуляций Treg-клеток.
Факторы, продуцируемые опухолевыми клетками, помимо прямого подавления
эффекторных клеток, активно участвуют в генерировании супрессорных iTreg клеток из опухоль-инфильтрирующих CD4+ T-лимфоцитов [248] и тем самым
защищают себя от иммунного надзора.
Несмотря на то, что негативная роль Treg-клеток в развитии рака, в том
числе РМЖ, в значительной степени доказана, остается много вопросов в
отношении функциональной и фенотипической гетерогенности данных клеток,
а также причин их увеличения при данном заболевании.
В отличие от Treg-клеток, NK-клетки являются первой линией защиты
организма от злокачественных новообразований. На сегодняшний день имеется
много данных, указывающих на изменение фенотипа и эффекторной
активности опухоль-ассоциированных и циркулирующих NK-клеток в
сравнение с NK здоровых доноров при различных типах рака, в том числе и при
РМЖ [249]. Ранее было показано, что в сравнении со здоровой тканью и NKклетками ПК, NK инфильтрирующие опухоль при РМЖ, содержали больший
процент CD56bright клеток. Также, NK, находящиеся в опухолевой ткани
обладали повышенной экспрессией NKp44, CD69, NKG2A, CD27 и
одновременным снижением экспрессии активационных рецепторов (NKp30,
NKG2D, DNAM-1, CD16) и связанных с цитотоксичностью молекул (CD57,
PRF1, GZMB, TRAIL). Низкий процент опухоль-инфильтрирующих NK-клеток
ограничивает более детальное изучение их функциональной активности.
Несмотря
на
это,
имеются
данные
характеризующие
опухольинфильтрирующие NK-клетки инвазивных форм РМЖ на поздних стадиях. Так,
показано снижение потенциала дегрануляции и продукции IFN-γ и TNF-α, и
неспособность выполнять АТ-зависимый лизис трансформированных клеток
NK-клетками, выделенными из опухолевой ткани больных РМЖ с инвазивной
формой и имеющих метастазы.
Отличия в фенотипе и сниженная цитолитическая активность были
обнаружены не только в популяции NK-клеток, инфильтрирующих опухоль, но
и в ПК больных РМЖ. Процент CD56brightCD16-/+ NK-клеток, характеризуемых
как незрелые и нецитолитические клетки, резко увеличен в ПК и опухолевой
ткани больных РМЖ и медуллярной карциномой щитовидной железы.
Количество клеток данной субпопуляции также коррелировало с тяжестью
52
заболевания. Степень экспрессии рецепторов NK-клеток ПК, таких как CD16,
NKp30, NKG2D, DNAM-1 и 2B4 была снижена у больных с инвазивной формой
РМЖ по сравнению с больными неинвазивной формой и здоровыми донорами
и. В то же время, исследователи обнаружили индукцию экспрессии
ингибиторных рецепторов (NKG2A и CD85j) на NK в группе больных РМЖ,
имеющих метастазы, по сравнению с больными с неинвазивной формой
заболевания. Фенотипические изменения NK-клеток коррелировали со
снижением эффективности киллинга клеток опухолевой линии, дегрануляции и
секреции IFN-γ и TNF-α NK-клетками ПК больных с более развитыми формами
заболевания, в условиях in vitro [195, p. 2431].
Была выдвинута гипотеза о том, что активность NK-клеток изменяется под
влиянием
факторов
опухолевого
микроокружения
и
молекулами,
экспрессирующимися раковыми клетками. На поверхности опухолевых клеток
РМЖ были обнаружены лиганды NK-клеточных рецепторов, таких как NKp30L, DNAM-1–L и NKG2D-L. Супернатанты опухолевых клеток РМЖ влияли на
экспрессию гранзима B, NKG2D и NKG2A, а также снижали цитолитическую
активность и секрецию IFN-γ NK-клетками в цитолитическом тесте. NKклеточный фенотип пациентов через 5 лет после удаления опухоли и не
имеющих рецидивов заболевания соответствовал NK ПК здоровых доноров.
Эти данные подтверждают гипотезу о том, что опухоль-индуцированные
изменения экспрессии рецепторов и цитолитической активности NK-клеток
могут снижать иммунный ответ и способствовать развитию опухоли. Более
того, была показана достоверная корреляция между снижением показателей
цитотоксичности NK-клеток и уровнем TGF-β1 и PGE2 в микроокружение
РМЖ [194, p. 3616].
Таким образом, при РМЖ увеличивается пул незрелых, цитокинпродуцирующих NK-клеток с низкой цитолитической активностью, что может
быть результатом блокирования или нарушения финальных стадий созревания
NK в опухолевой ткани под влиянием факторов, продуцируемых опухолевыми
клетками или иного происхождения или подавлением эффекторной активности
данных клеток иммуносупрессорными молекулами.
На сегодняшний день нет данных о субпопуляциях NK-клеток,
обладающих регуляторными свойствами при онкологических заболеваниях. Но
исходя из вышеописанных данных можно предположить, что при развитии
РМЖ имеет место расширение супрессорного пула NK, что может вносить
вклад с общее снижение цитолитической активности NK-клеток при РМЖ.
Таким образом, негативный эффект NK- и Т-регуляторных субпопуляций в
подавление противоопухолевого иммунитета и актуальность изучения данных
клеток при онкологическом процессе не оставляет сомнений. Детальное
изучение механизмов расширения таких субпопуляций может быть
использовано в терапии рака, в том числе и при лечение РМЖ.
53
2МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1 Материалы исследования
2.1.1 Исследуемый материал
В работе использованы образцы ПК здоровых доноров и первичных
больных операбельным РМЖ на I, II и III стадиях заболевания, не имеющих
метастазов, поступивших на лечение в НИИ онкологии и радиологии МЗ РК за
2013, 2014 и 2015 годы (Таблица 1). Диагноз заболевания устанавливали на
основании характерных признаков клинической картины и лабораторных
исследований по общепринятым критериям, согласно 6-му изданию
клинической
классификации
злокачественных
опухолей
(TNM),
Международного противоракового союза. Доноры контрольной группы не
имели признаков РМЖ или других явных заболеваний. В экспериментах по
сравнению групп здоровых доноров с больными РМЖ, участвовали только
женщины.
Исследование проводилось согласно этическим принципам Хельсинской
Декларации и было одобрено этическим комитетом НИИ онкологии и
радиологии МЗ РК. Забор крови осуществлял квалифицированный
медицинский персонал с информированного согласия доноров. ПК собирали
натощак из локтевой вены в объеме 10-25 мл в стерильные пробирки с
антикоагулянтом EDTA (1,5 мг/мл крови) или в BD Vacutainer с объемом
вакуума 10 мл, содержащие антикоагулянт (K3EDTA в концентрации 2 мг/мл).
Таблица 1 - Характеристика доноров
Доноры
Мужчины
Женщины
Средний
возраст±стандартное
отклонение (диапазон)
мужчины
женщины
Стадия I
Стадия II
Стадия III
Стадия IV
Обьекты исследования (n)
Здоровые доноры
Больные РМЖ
11
45
80
38,2±10,1 (25-60)
41,7±15,5 (22-65)
52,8±12,1 (23-74)
-
10
58
12
-
2.1.2 Реагенты и материалы
В ходе постановки экспериментов использовали следующие реактивы:
культуральная
среда
RPMI-1640,
L-глутамин
(L-glutamine),
стрептомицин/пенициллин (Streptomycin/penicillin), фетальная бычья сыворотка
(Fetal Bovine Serum, FBS), бычий сывороточный альбумин (Bovine Serum
Albumin, BSA), трипановый синий (Trypan Blue), перколл (Percoll), фосфатносолевой буферный раствор (Phosphate Buffer Saline, PBS), гистопак-1077
(Hystopaque-1077), отмывочный буферный раствор (PBS + 10% FBS), буферный
раствор для колонок (PBS + 0,5% BSA + 2Mm EDTA), трипсин, трипановый
54
синий (Sigma-Aldrich, США), MS+ и CS+ колонки для иммуномагнитной
сепарации клеток (Miltenyi Biotech, США), набор реагентов для ELISPOT
анализа IL-10 (BD Biosciences, США), для определения секреции TGF-β в
ELISPOT системе использовали АТ для иммуноферментного анализа TGF-β
(BD Biosciences, США), Transwell система (Corning, США), набор реагентов для
выделения NK-клеток «NK Isolation Kit, human» и CD4+ клеток «CD4+ T Cell
Isolation Kit, human» и CD8+ лимфоцитов «CD8 MicroBeads» (Miltenyi Biotec,
США), флуоресцентно-меченные АТ к CD25-PE, CD4-PerCP, FoxP3-PE, FoxP3APC, CD39-PE, CD39-FITC, CD39-APC, CTLA4-APC, IL17А-FITC, CD44-РЕ,
CD3-FITC, CD57-APC, перфорин-APC (рerforin), CD107a-APC, гранзим В-FITC
(granzyme B), CD45RA-FITC, GITR-APC, CD73-APC, LAP(TGFβ1)-APC
(Miltenyi Biotech, США), Simultest IMK Plus* CD3/CD19, CD4/CD8, Simultest
LeucoGATE CD45/CD14, CD4-APC-Cy7, CD25-PerCP-Cy5.5, IL-4-PE-Cy7,
CD25-PerCP-Cy5.5, CD25-FITC, FoxP3-PE, CD39-PE, CD4-FITC, IL-4-PE, CD56PerCP-Cy5.5, IL-15-biotin, CD14-PE (BD Biosciences, США), TGFβ-FITC, TGF-βPE, IL10-PE, IL10-FITC, IL35-APC, IL-15-APC, Avidin-FITC (R&D Systems,
США), CD3-FITC, CD56-PerCP-Cy5.5, CD56-PerCP, HLA-G-PE, HLA-G-APC,
CD14-PerCP (Biolegend, США), IFN-γ-FITC (Beckman Coulter, США); наборы
реагентов CytoFix/CytoPerm, Cytofix Fixation buffer, FACS Lysing Solution (BD
Biosciences, США), PI (propidium iodide), FOXP3 Staining Buffer Set (Miltenyi
Biotec, США), этилендиаминотетраацетат (EDTA) (Serva, Германия),
карбоксифлуоресцеин диацетат суксимидил эфир (CFSE) (Sigma-Aldrich,
США), натриевая соль биотинилированного гиалуронана (Hyaluronan biotin
sodium salt, НА), фитогемагглютинин-М (PHA) (Sigma-Aldrich, США),
рекомбинантный человеческий IL-2 и α-рецептор IL-15 (IL-15Rα) (R&D
Systems, США), Treg Suppressor Inspector (TSI) (Miltenyi Biotech, США), АнтиBiotin MACSiBead Particles (Miltenyi Biotech, США), Brefeldin A Solution
(Biolegend, США), RTI реагент (Sigma-Aldrich, США), DNase I, обратная
транскриптаза Maxima, Taq полимераза (ThermoScientific, США).
2.1.3 Оборудование
В ходе постановки экспериментов, использовалось следующее
оборудование: ламинарный стерильный бокс Airstream AC2-3EI (ESCO,
Сингапур), СО2-инкубатор (Binder, Германия), инвертированный микроскоп
(Leica, Германия), центрифуга SIGMA-ALDRICH, USA-ALDRICH, USA 3k30,
центрифуга SIGMA-ALDRICH, USA-ALDRICH, USA 2-16k (Sigma-Aldrich,
USA-Aldrich, США, Германия), деионизатор воды (Elgastat, Англия), рН-метр
(Sartorius, Германия), аквадистиллятор 2008 (GFL, Германия), магнитная
мешалка ММ2А (Чехия), сушильный шкаф КС-65 (Германия), стерилизатор
воздушный ГП-80 (Россия), водяная баня Multitemp 2209 (LKB, Швеция),
электронные весы ТЕ601 (Sartorius, Германия), электронные аналитические
весы Libor AEL-160, (Shimadzu, Япония), перистальтический насос (Millipore,
США), термостат воздушный (Binder, Германия), шейкер для встряхивания
пробирок micro-shaker 327m (Польша), микроцентрифуга MiniSpin (Eppendorf,
Германия), морозильный шкаф на -80оС MDF (Sanyo, Япония),
55
биомедицинский замораживатель на -30оС MDF-U537D (Sanyo, Япония),
проточный цитофлуориметр FACS Calibur (BD, США), сортер клеток FACS
Aria II (BD, США), магнитный сепаратор клеток Mini MACS (Miltenyi Biotech,
Германия), магнитный сепаратор клеток Vario MACS (Myltenyi Biotech,
Германия), магнитный сепаратор клеток BD IMagnet (BD, США), pH-метр PB11
(Sartorius, Германия), ПЦРатор 2720 Thermal Cycler (Applied Biosystems, США).
2.2 Методы исследования
2.2.1 Приготовление перколла
Для приготовления перколла заданной плотности использовали
стерильную деионизированную воду и стерильный 1,5M раствор NaCl.
Исходная плотность перколла составляет 1,13г/мл. Чтобы получить
необходимую плотность, к исходному перколлу добавляли 10% стерильного
1,5М раствора NaCl и затем доводили стерильной деионизированной водой до
необходимого объема. Объем перколла рассчитывали по следующей формуле:
Vo = V (ρ – 0,1ρ10 – 0,9) / (ρo - 1), где Vo – объем необходимого для разведения
перколла (мл), V – объем конечного рабочего раствора изо-осмотического
перколла (мл), ρ – плотность получаемого изо-осмотического перколла (г/мл),
ρo – плотность исходного раствора перколла (г/мл), ρ10 – плотность раствора 1,5
М раствора NaCl (г/мл).
2.2.2 Приготовление полной культуральной среды
Для приготовления полной культуральной среды (ПКС), жидкую
культуральную среду RPMI-1640 готовили из сухого препарата, растворяя его в
деионизированной воде и доводя pH до 7,4, согласно прописи фирмыпроизводителя, стерилизуя конечный продукт путем ультрафильтрации через
мембранный фильтр с диаметром пор 0,22 мкм и добавляли 10% FBS, 2 мМ
глутамина, 100 U/мл пенициллина и 100 мг/мл стрептомицина.
2.2.3 Культивирование клеток
Во всех экспериментах клетки культивировали в концентрации, не
превышающей 2×106кл/мл в ПКС при 37оС и 5% СО2 в СО2-инкубаторе.
В экспериментах по изучению стимуляции экспрессии маркеров и
цитокинов, клетки активировали в течение 18 ч. с использованием следующих
активаторов: PHA (10 µg/ml), IL-2 (20 ng/ml), IL-15Rα (20 ng/ml), для
стимуляции Treg -клеток использовали TSI, представляющий собой
моноклональные АТ против CD3, CD28 и CD2, сорбированные на
парамагнитных бусах. TSI предварительно отмывали ПКС и использовали в
соотношение 1:1 клетки:парамагнитные частицы. В некоторых экспериментах,
в качестве контроля использовали клетки, инкубированные также в течение 18
ч., но без стимуляции.
Во всех экспериментах по оценке внутриклеточных цитокинов через час
после начала инкубации добавляли брефелдин А (1мкл/мл), блокирующий
эксфлюкс белков из цитоплазмы наружу.
56
2.2.4 Выделение клеток
Для получения мононуклеаров периферической крови (МНПК), цельную
кровь наслаивали на гистопак-1077 или перколл с плавучей плотностью 1,077
г/мл, в соотношение 1×1, центрифугировали в течение 20 мин. при 1400g и
20оС. Мононуклеарные клетки интерфазного кольца отмывали 20-кратным
объемом среды RPMI-1640 при 200g в течение 15 мин. и 20оС.
Выделение NK-клеток из МНПК проводили с помощью набора «NK
Isolation Kit» согласно прописи фирмы-производителя, используя колонки типа
CS+ и магнитный сепаратор VarioMACS. C помощью негативной
иммуномагнитной селекции из мононуклеарной фракции удаляли все не-СD56+
и -CD16+ клетки с помощью коктейля моноклональных биотинилированных АТ
против маркеров CD3, CD19, CD36, CD123 и CD235a и железосодержащих
парамагнитных бус, конъюгированных с моноклональными АТ против
биотина. При иммуномагнитной сепарации использовали буферный раствор
для колонок. Чистота полученной популяции CD3-CD56+ оценивалась
проточной цитофлуориметрией и составляла не менее 98%.
Выделение CD4+ T-клеток проводили позитивной иммуномагнитной
селекцией с помощью набора «CD4+ T Cell Isolation Kit, human», CS+ колонок и
сепаратора VarioMACS, согласно прописи фирмы-производителя. Чистота
выделеных клеток составляла более чем 98%.
В некоторых экспериментах Treg-клетки, NK- и Tcon-клетки также
выделяли на FACS Aria II сортере. При этом, МНПК инкубировали в течение 20
мин. при 4оС, в присутствии АТ (20 мкл/100мкл клеточной суспензии): CD3FITC, CD56-PerCP-Cy5.5 для выделения NK-клеток и CD4-PerCP, CD25-PE для
выделения Treg-клеток и Tcon-клеток. Далее, к клеткам добавляли по 3 мл PBS
и проводили сортинг с использованием следующих стратегий гейтирования:
CD3-CD56+, CD4+CD25+ и CD4+CD25- для выделения NK, Treg-клеток и Tconклеток, соответственно.
Для разделения NK-клеток на HLA-G-позитивную (HLA-G+) и HLA-Gнегативную (HLA-G-) фракции, отсортированные NK-клетки активировали в
течение 18 ч. в ПКС, в концентрации 2×106 кл/мл в 24-ячеечных планшетах, в
присутствие PHA (10мкг/мл). Далее клетки, меченные HLA-G-PE или HLA-GАРС АТ разделяли на клеточном сортере FACS Aria II.
Для разделения клеток ПК человека на НА-связывающие и НАнесвязывающие клетки (НА+ и НА-) суспензию полученных CD4+ клеток или
МНПК инкубировали с предварительно подготовленным конъюгатом
биотинилированного гиалуронана и анти-биотиновых АТ, сорбированных на
парамагнитных бусах (Анти-Biotin MACSiBead Particles, Miltenyi Biotec). Для
разделения 107 клеток, смешивали 15 мкг биотинилированного НА с 50 мкл
Анти-Biotin MACSBead Particles и 50 мкл буферного раствора, инкубировали 2
ч. при 4-8оС, при постоянном помешивании, после этого, конъюгат отмывали от
не связавшегося НА центрифугированием в 2 мл PBS при 300g в течение 5 мин.
Далее клетки инкубировали c конъюгатом в течение 30 мин. при 4-80С (в
соотношении клетки:парамагнитные бусы, 1:1). НА- и НА+ фракции получали с
57
помощью соответственно негативной и позитивной магнитной селекции на
магнитном сепараторе BD Imagnet.
Для получения позитивных контролей экспрессии мРНК HLA-G1 в ПЦР
анализе, были выделены В- и CD8+ T-клетки, а также моноциты 4 здоровых
доноров. CD8+ T-клетки выделяли позитивной иммуномагнитной сепарацией с
использованием парамагнитных бус «CD8 MicroBeads» и MS+ колонок,
согласно прилагаемым инструкциям. Моноциты получали методом адгезии на
пластике. Для этого, МНПК инкубировали в течение 3 ч., в ПКС, во
фторированных этилен-пропиленовых флаконах с концентрацией клеток 2х106
кл/мл. По истечению инкубации, неадгезированные клетки были смыты PBS, а
адгезированные моноциты сняты с применением 0,25% трипсина и отмыты
RPMI-1640. В-, CD8+ T-клетки и моноциты ПК также выделяли на клеточном
сортере, с применением готовых наборов АТ – BD Simultest Plus.
2.2.5 Оценка супрессорной активности Treg -субпопуляций
Супрессорную активность НА+ и НА- Treg-клеток оценивали по их
способности ингибировать пролиферацию аутологичных CD4+CD25- Тconклеток, меченых CFSE. Для этого, полученные в результате сортинга Тconклетки отмывали PBS, затем ресуспензировали в ПКС, в концентрации до 7х106
кл/мл. 5 мМ раствор CFSE в PBS добавляли к клеточной суспензии и
инкубировали в течение 9 мин при 4-8oС, далее клетки отмывали 2 раза 20кратным объемом PBS и производили подсчет клеток с трипановым синим.
Отсортированные CD4+CD25+ Тregs разделяли на НА+ и НА- фракции согласно
описанной выше методики и инкубировали с CFSE-мечеными Тcon-клетками в
96-луночных круглодонных планшетах в соотношении супрессор:мишень 5:1,
3:1 и 1:1, с добавлением PHA (10мкг/мл) в течение 72 ч. О степени супрессии
судили по изменению пролиферации CD4+CD25- клеток, т.е. негативных по
CFSE, на проточном цитофлуориметре.
О функциональной активности Treg-клеток также судили по экспрессии
маркеров супрессорной активности Treg-клеток (CTLA-4, LAP, GITR, СD39,
CD73) и по продукции супрессорных цитокинов (TGFβ, IL-35, IL-10), также
аназированных методом проточной цитофлуориметрии.
2.2.6 Оценка супрессорной активности HLA-G+ NK клеток
Супрессорную активность HLA-G+ NK-клеток оценивали по способности
HLA-G+ субпопуляции подавлять цитолитическую активность аутологичных
HLA-G- NK-клеток против клеточной линии человеческой эритролейкемии
К562, не экспрессирующей молекул HLA-G, и предварительно меченой CFSE.
Мечение К562-клеток проводили методом, описанным в разделе 1.4.5.
Отсортированные HLA-G+ и HLA-G- NK-клетки здоровых доноров
инкубировали течение 48 ч с клетками К562, в соотношении 25:5:1
супрессор:эффектор:мишень, в присутствии или без добавления блокирующих
АТ против HLA-G (87G clone) или IL-10 (10 мкг/мл) в круглодонных 96ячеечных планшетах. Также инкубировали HLA-G+ или HLA-G- фракции NKклеток с К562 линией в соотношении 5:1 (эффектор:мишень). Для проверки
58
влияния растворимых факторов, секретируемых HLA-G+ NK-клетками, данную
фракцию инкубировали в течение 18 ч. в верхней части Transwell системы, в
нижнюю часть помещали аутологичные HLA-G- NK-клетки (в соотношение 5:1,
супрессор:эффектор), после чего, HLA-G- NK-клетки перемещали в
круглодонные 96-ячеечные плашки и инкубировали дополнительно 2 дня с
К562-клетками в соотношение 5:1, соответственно. Супрессорный тест в
Transwell системе также проводили, внося все клетки единовременно (в
верхнюю часть помещали HLA-G+ NK, в нижнюю HLA-G- NK и К562, в
соотношении 25:5:1, супрессор:эффектор:мишень) и инкубировали в течение 2х суток. Контролем служили кокультуры HLA-G- NK- и К562-клеток (5:1,
эффектор:мишень). Цитолитическую активность оценивали на проточном
цитофлуориметре по одновременному включению CFSE и PI в гейте К562клеток.
Также, супрессорную активность HLA-G+ NK-клеток оценивали по их
влиянию на уровень гранзима B, перфорина, IFN-γ и CD107a в гейте HLA-GNK-клеток в цитолитическом тесте, описанном выше. Для этого к ко-культурам
добавляли брефелдин А по истечению 1 ч инкубации.
2.2.7 Проточная цитофлуориметрия
Фенотип клеток, экспрессию маркеров и цитокинов оценивали методом
проточной цитофлуориметрии. Мечение клеток проводили путем их инкубации
в присутствии АТ, меченных флуоресцентными метками, связывающимися с
поверхностными маркерами (5 мкл АТ на 100 мкл клеточной суспензии) в
течение 15 мин при 4-8°C, в темноте. В экспериментах по оценке экспрессии
только поверхностных маркеров, клеточную суспензию отмывали от
несвязавшихся АТ 20-кратным объемом PBS и центрифугировали при 300g, 5
мин, 20°C. Далее проводили фиксацию клеточной мембраны добавлением 300
мкл раствора Cytofix и инкубацией в течение 30 мин при 4-8°C в темноте. В
некоторых экспериментах по анализу свежевыделенных МНПК мечение
поверхностных маркеров проводили в цельной крови вышеописанным
методом, после чего лизировали эритроциты, добавляя FACS Lysing Solution,
разбавленный 10-кратным объемом дистиллированной воды, в объеме 300
мкл/проба и инкубировали 30 мин при 20°C в темноте, затем отмывали PBS.
Далее клетки анализировали на проточном цитофлуориметре.
В экспериментах, требующих оценки внутриклеточных маркеров и
цитокинов, клеточную суспензию после мечения поверхностных маркеров
фиксировали и пермеабилизировали добавлением раствора CytoFix/CetoPerm
или FохP3 Staining Buffer Set в экспериментах, требующих анализа экспрессии
FохP3, в объеме 300 мкл на количество клеток, не превышающее 10⁷. Затем
клеточную суспензию перемешивали и инкубировали в течение 30 мин, при 48°C в темноте. После этого клетки отмывали буферным раствором Perm/Wash
или промывочным раствором из набора FохP3 Staining Buffer Set и метили АТ
против внутриклеточных маркеров или цитокинов, после чего клетки опять
отмывали, ресуспендировали в проточной жидкости и анализировали на
59
FACSCalibur или на FACSAria II, с применением программных обеспечений
CellQuest Pro или FACSDiva (BD Biosciences, США), соответственно.
2.2.8 ELISPOT анализ
Количество NК-клеток, секретирующих IL-10 и TGF-β, определяли с
помощью ELISPOT анализа. Вначале сорбировали первые АТ к IL-10 или TGFβ на дне лунок в течение 18 ч. при 40С. Выделенные NК-клетки, в количестве
106 кл/мл, инкубировали в 96-луночном планшете для ELISPOT анализа 18 ч в
ПКС, в СО2-инкубаторе при 370С, 5% CO2 в объеме 200 мкл/лунка. После
лизиса клеток деионизорованной водой ячейки промывали раствором Wash
Buffer I, вносили биотинилированные вторые АТ, затем пероксидазу (HRP),
связанную со стрептавидином (в концентрации 0,01% от объема Deluction
Buffer). В качестве субстрата использовали аминоэтилкарбазол (AEC).
Окрашенные пятна (споты) подсчитывали вручную под световым
микроскопом.
2.2.9 ПЦР анализ
Для анализа экспрессии гена HLA-G1 NK-клетками, использовали метод
ПЦР. Тотальную РНК выделяли из нестимулированных NK-клеток, используя
TRI реагент, согласно прилагаемой инструкции производителя и обрабатывали
DNase-I. Для получения кДНК проводили обратную транскрипцию тотальной
РНК, используя случайные праймеры и обратную транскриптазу Maxima. ПЦР
проводили с использованием Taq полимеразы. Для амплификации HLA-G1
изоформы,
использовали
следующие
праймеры:
прямой:
5‘GCTGCAGCGCGCGGAC-3‘; обратный: 5‘-TGGTGGGCAGGGAAGACTGCTT3‘) [250]. Праймеры были синтезированы в лаборатории генома Института
молекулярной биологии и биохимии им.М.А. Айтхожина (Алматы, Казахстан).
В-лимфоциты были использованы в качестве негативного контроля [251],
+
CD8 T-клетки [29, p. 569] и моноциты ПК [252] использовали как позитивный
контроль экспрессии HLA-G1.
2.2.10 Статистическая обработка данных
Полученные данные обрабатывали методами математической статистики
на персональном компьютере с использованием прикладных программ
Microsoft Excel, «STATISTICA 6.0» и GraphPad Prism 6. Графики и рисунки
содержат информацию в виде средних арифметических величин
(M)±стандартное отклонение (SD), представляют каждое индивидуальное
значение с медианным значением группы или медианы с размахом (максимум,
минимум) и квартильным размахом (25%, 75% процентили). Достоверность
различия р рассчитывали по критерию Стъюдента (Ттест) для
параметрического анализа данных и критерию Уилкоксона для связанных
выборок. Различие двух сравниваемых выборок считали достоверным при
уровне значимости р≤0,05.
60
3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1 Изучение Т-регуляторных клеток в норме и при раке молочной
железы
3.1.1 Анализ натуральных Т-регуляторных клеток здоровых доноров и
больных раком молочной железы
Участие nTreg-клеток в подавлении противоопухолевого иммунитета
считается доказанным. Однако субпопуляции nTreg-клеток до сих пор не были
исследованы при РМЖ.
Человеческие nTreg-клетки были разделены на три функционально и
фенотипически различные субпопуляции, согласно экспрессии различных
изоформ общего лейкоцитарного АГ: СD4+СD25+Foxp3+CD45RA+ - наивные
nTreg-клетки, СD4+СD25+Foxp3+CCR7-CD45RA-CD45RO- - эффекторные nTregклетки и СD4+СD25+Foxp3+CCR7+CD45RA-CD45RO+ - nTreg -клетки памяти,
при этом все три субпопуляции обладают супрессорной активностью. В
литературе имеются разногласия по соотношению субпопуляций nTreg-клеток.
Сначала был сделан вывод о том, что в ПК здоровых людей циркулируют
nTreg-клетки, имеющие исключительно фенотип Т-клеток памяти, то есть
экспрессирующих CD45RO и не несущих на своей поверхности CD45RA.
Позже было показано присутствие наивных nTreg-клеток [253, 254]. В работе
Cesana G. и соавт. показано, что наивные nTreg -клетки составляют не менее
половины всех циркулирующих Treg-клеток [255]. Также, малоизученной
остается супрессорная активность данных субпопуляций в норме и при
онкологических процессах.
Первостепенной нашей задачей было изучение основных субпопуляций
nTreg-клеток в норме и при РМЖ, как участников первой линии супрессорных
механизмов. Для этого мы определяли содержание циркулирующих
субпопуляций наивных nTreg-клеток и nTreg-клеток эффекторов/клеток
памяти, согласно их экспрессии CD4, CD25, FoxР3 и CD45RA, среди клеток
цельной, свежеотобранной ПК здоровых доноров и больных РМЖ после лизиса
эритроцитов.
Мы обнаружили, что количество клеток с фенотипом CD4+CD25+,
CD4+FoxP3+ и CD4+CD25+FoxP3+ в ПК больных РМЖ выше, чем у здоровых
женщин (таблица 2), что соответствует ранее опубликованным данным [2, p.
2758]. Затем нами было проанализировано содержание циркулирующих
субпопуляций наивных nTreg-клеток и nTreg-клеток эффекторов/клеток
памяти, стратегия гейтирования которых представлена на рисунке 1. Мы
обнаружили, что в группе здоровых доноров процент CD45RA+- и
FoxP3+CD45RA+-клеток, проанализированных в гейте CD4+CD25+, был
значительно ниже в сравнение с соответствующими субпопуляциями, не
экспрессирующими CD45RA маркер (Tаблица 2, рисунок 1).
Такое же соотношение данных субпопуляций было выявлено и в ПК
больных
РМЖ.
Количество
циркулирующих
FoxP3+CD45RA+
и
+
+
+
FoxP3 CD45RA nTreg-клеток из гейта CD4 CD25 -клеток в группе больных
РМЖ достоверно превышало количество клеток, соответствующих
61
субпопуляций у здоровых женщин, в то время как мы не обнаружили различий
в количестве клеток с общим фенотипом СD4+СD25+CD45RA+ и
СD4+СD25+CD45RA- между двумя группами доноров (таблица 2, рисунок 1).
Таким образом, в норме около одной трети всех циркулирующих СD4+СD25+клеток являются наивными nTreg-клетками. Однако соотношение FoxP3экспрессирующих клеток среди субпопуляций СD4+СD25+CD45RA+ и
СD4+СD25+CD45RA- в группе здоровых доноров примерно одинаково,
аналогичное соотношение наблюдается и в группе больных РМЖ.
Таблица 2 – Процент субпопуляций Treg-клеток среди МНПК здоровых
доноров и больных РМЖ
Субпопуляции Treg-клеток
CD4+CD25+
Здоровые женщины
M±SD
(n=10)
7,9±2,0
РМЖ
M±SD
(n=17)
19,2±4,2
≤0,0001
CD4+FoxP3+
4,6±2,3
7,4±4,3
0,01
CD4+CD25+FoxP3+
2,3±0,8
8,9±2,0
≤0,0001
CD4+CD25+CD45RA+
2,0±0,6
4,8±3,0
0,002
CD4+CD25+CD45RA-
5,8±1,6
14,3±3,4
≤0,0001
CD4+CD25+FoxP3+CD45RA+
0,7±0,3
2,7±1,5
≤0,0001
CD4+CD25+FoxP3+CD45RA-
1,9±0,7
7,0±2,0
≤0,0001
CD4+IL-4-IL-10+
p
2,8±1,1
2,9±1,2
н.з.
+
CD4 IL-4 IL-10 CD25
0,6±0,3
1,2±0,4
0,01
CD4+IL-4-IL-10+CD25-
1,2±0,5
1,4±0,6
н.з.
CD4+FoxP3+TGF-β+
0,8±0,3
1,5±1,4
н.з.
CD4+FoxP3+TGF-β+CD25+
0,31±0,2
0,57±0,4
н.з.
CD4+FoxP3+TGF-β+CD25-
0,32±0,1
0,41±0,3
н.з.
CD4+FoxP3+IL-17+
0,33±0,1
0,54±0,3
н.з.
CD4+FoxP3+IL-17+CD25+
0,12±0,07
0,24±0,09
0,01
0,17±0,09
н.з.
+
-
+
CD4+FoxP3+IL-17+CD25-
0,08±0,06
Примечание – н.з. – незначимый уровень различия.
Несмотря на интенсивное изучение nTreg-клеток, до сих пор до конца не
изучены фенотипические различия между субпопуляциями nTreg-клеток в
норме и не совсем ясен вклад различных субпопуляций nTreg-клеток в развитие
злокачественных новообразований [58, p. 400].
62
А - репрезентативные данные
Б - обобщенные данные с медианными значениями, каждая точка отражает
каждое индивидуальное значение, достоверность различий между
FoxP3+CD45RA+ и FoxP3+CD45RA- субпопуляциями представленна как
×р˂0,0001 (по критерию Уилкоксона) и между группами здоровых доноров и
больных РМЖ*р≤0,0001 и **р=0,006 (по критерию Стьюдента).
Рисунок 1 – Содержание nTreg-клеток эффекторов/клеток памяти (гейт R3)
и наивных nTreg-клеток (гейт R4) в ПК здоровых доноров и больных РМЖ
(РМЖ)
Для
сравнения
супрессорной
активности
между
+
+
+
+
+
+
СD4 СD25 Foxp3 CD45RA и СD4 СD25 Foxp3 CD45RA nTreg-клеток мы
проанализировали экспрессию данными клетками молекул, супрессорный
эффект которых был ранее показан [111, p. 636-642]. В ходе исследования было
обнаружено, что в группе здоровых доноров (n=10) среди CD45RA- nTregклеток содержится больше CTLA-4+-, меньше LAP+-клеток (р=0,004 и р=0,0005
соответственно) и отсутствуют различия в экспрессии GITR, CD73, CD39 и IL35 по сравнению с CD45RA+ nTreg-клеток (рисунок 2). В группе больных РМЖ
+
63
(n=17) доля клеток, экспрессирующих LAP (р=0,002), CD39 (р˂0,0001) и IL-35
(р=0,04), была достоверно выше в субпопуляции CD45RA+ nTreg-клеток по
отношению к CD45RA- nTreg-клеток, различий в экспрессии остальных
маркеров не было выявлено (рисунок 2).
Известно, что молекула CTLA-4 является не только маркером
супрессорной активности, но и маркером активации nTreg-клеток [111, p. 639].
Ранее было показано, что в ПК здоровых доноров CTLA-4 и CD39 в большей
степени экспрессирован на CD45RO+ nTreg-клетках памяти по сравнению с
наивными nTreg-клетками [102, p. 4322]. Учитывая то, что в анализируемую
нами субпопуляцию СD4+СD25+Foxp3+CD45RA- nTreg-клеток помимо клеток
памяти входят и активированные эффекторные nTreg-клетки, процент клеток,
позитивных по CTLA-4 присутствовал в большей степени в данной
субпопуляции здоровых доноров, чем среди наивных nTreg-клеток, что
подтверждает ранее опубликованное исследование. Мы можем предположить,
что CD45RA-CD45RO+ эффекторные nTreg-клетки здоровых доноров
экспрессируют значительно меньший уровень CD39, что в сумме элиминирует
разницу между изучаемыми нами CD45RA+ и CD45RA- субпопуляциями nTregклеток. Интересно, что в группе больных РМЖ различие в проценте CTLA-4экспрессирующих клеток между двумя изучаемыми нами субпопуляциями
nTreg-клеток не было обнаружено. Процент CTLA-4+-клеток был повышен как
среди наивных, так и среди nTreg-клеток эффекторов/клеток памяти у больных
РМЖ по сравнению со здоровыми женщинами. Также, в отличие от группы
здоровых доноров у больных РМЖ было обнаружено достоверно большее
количество CD39+-клеток среди наивных nTreg-клеток, по сравнению с
CD45RA- nTreg-клетки, что говорит о большем уровне активации и
супрессорного потенциала наивных nTreg-клеток ПК больных РМЖ (рисунок
2).
Несмотря на то, что GITR также коррелирует с активацией nТreg-клеток
[256], мы не обнаружили достоверной связи экспрессии данного маркера с
фенотипом nTreg-клеток эффекторных/клеток памяти в обеих исследуемых
группах. Отсутствие разницы в экспрессии CD73 между субпопуляциями
наивных nTreg-клеток и nTreg-клеток памяти здоровых доноров, описанное
ранее [102, p. 4322], подтвердилось в нашем исследовании как в группе
здоровых женщин, так и больных РМЖ (рисунок 2).
64
А - репрезентативные данные
Б - медианные значения, квартильный размах (25%, 75% процентили),
размах (минимум, максимум), достоверность различий между наивными nTregклетками и nTreg эффекторами/клетками памяти (nTreg Э/П): ×р≤0,0001,
××р≤0,01 и ×××р≤0,05 (по критерию Уилкоксона); между группами здоровых
доноров и больных РМЖ: *р≤0,0001, **р=0,006 и ***р=0,006 (по критерию
Стьюдента).
Рисунок 2 – Экспрессия супрессорных молекул наивными nTreg-клетками
(гейт R5) и nTreg эффекторами/клетками памяти (гейт R6) ПК здоровых
доноров и больных РМЖ
65
По нашим данным CD45RA+ nTreg-клетки здоровых женщин отличаются
от CD45RA- nTreg-клеток большей экспрессией LAP. При этом в группе
больных РМЖ, помимо большей экспрессии LAP, субпопуляция CD45RA+
nTreg-клеток также содержала больший процент клеток, продуцирующих IL-35
по сравнению с CD45RA- nTreg-клетками (рисунок 2). Согласно ранее
опубликованным данным, активированные nTreg-клетки индуцируют
конверсию Tcon-клеток при их кокультивировании в субпопуляции iTregклеток, а именно в Treg-17-клетки, и основным индуктором данной конверсии
является TGF-β, продуцируемый nTreg-клетками [162, p. 45]. Присутствие
nTreg-клеток повышает образование Tr1-подобных клеток IL-27- и TGF-βзависимым способом [169, p. 1381]. Также, учитывая то, что молекула LAP
участвует в созревание и презентации TGF-β, мы можем заключить, что
наивные nTreg-клетки, помимо большей супрессорной активности LAPзависимым путем, обладают большей способностью к индукции iTreg-клеток на
периферии по сравнению с эффекторными nTreg-клетками или nTreg-клетками
памяти. Кроме этого, IL-35 также обладает как супрессорной активностью, так
и способностью индуцировать IL-35-продуцирующие iTreg-клетки, и такая
конверсия была зафиксирована in vivo при воспалении кишечника Trichuris
muris и в опухолевом микроокружении в моделях меланомы и колоректальной
аденокарциномы [140, p. 7]. Так как в группе больных наивные nTreg-клетки
содержали больший процент как LAP+, так и IL-35+, мы можем предположить
причастность данной субпопуляции к положительной регуляции гомеостаза и
увеличения Treg-клеток при РМЖ.
Далее нами был проведен сравнительный анализ экспрессии супрессорных
маркеров субпопуляциями nTreg-клеток между исследуемыми группами
доноров. В группе больных РМЖ наблюдалось увеличение количества клеток,
экспрессирующих большую часть исследуемых супрессорных маркеров. Так,
среди субпопуляции CD45RA- nTreg-клеток больных РМЖ (n=17), в сравнении
с группой здоровых женщин (n=10), содержался больший процент клеток,
экспрессирующих GITR (20,0±8,2%, 8,9±4,7%; р=0,0006), CTLA-4 (15,1±3,4%,
10,3±4%; р=0,01), LAP (10,6±2,9%, 4,8±3,0%; р=0,0006), IL-35 (16,2±10,1%,
9,1±4,3%; р=0,02), тогда как разницы в экспрессии CD39 и CD73 обнаружено не
было (рисунок 2). При сравнении наивных nTreg-клеток было обнаружено, что
в группе больных РМЖ было увеличено количество GITR+ (18,3±10,1%,
8,9±4,6%; р=0,003), CTLA-4+ (16,6±10,2%, 4,5±2,1%; р=0,0002), IL-35+
(23,8±10,0%, 11,9±8,4%; р=0,004) и CD39+-клеток (25,9±7,7%, 13,4±4,9%;
р=0,0007), в то время как количество LAP+- и CD73+-клеток была одинаковой в
обеих группах (рисунок 2).
Мы можем предполагать идентичность механизмов увеличения
супрессорной активности nTreg-клеток при развитие большинства типов рака,
так как полученные нами результаты соответствуют ранее опубликованным
работам, которые показали увеличение количества GITR+ [257], LAP+ [137, p. 2]
и CD39+ [258, 259] среди nTreg-клеток при других типах рака (не РМЖ) и
прямую корреляцию данного феномена с прогрессированием онкологических
заболеваний. Более того, последние исследования показали особую роль IL-35 в
66
онкогенезе [140, p. 8]. В отношении экспрессии CTLA-4 nTreg-клеткам при
РМЖ существовали разногласия в литературе. Сначала было сделано
заявление, что экспрессия CTLA-4 CD4+CD25+FoxP3+ nTreg-клетками не
отличается между здоровыми донорами и больными РМЖ на различных
стадиях РМЖ [260]. Затем был показан увеличенный процент циркулирующих
CTLA-4+ nTreg-клеток при данном заболевание [261]. Кроме того, уровень мРНК CTLA-4 и FoxP3 транскриптов был повышен в опухолевой ткани и ПК при
РМЖ даже на ранних стадиях заболевания и активность транскрипции данных
генов коррелировала со стадией заболевания [242, p. 572]. При изучении
HNSCC, было выявлено, что CD4+FoxP3+-клетки, инфильтрирующие опухоль,
преимущественно экспрессируют CD39, LAP и CTLA-4 [262]. В наших
экспериментах была сделана более полная оценка и выявлено положительное
регулирование экспрессии большинства маркеров супрессии, в том числе и
CTLA-4, не только активированными эффекторными nTreg-клетками или
nTreg-клетками памяти, но и наивными nTreg-клетками, что говорит об общем
феномене стимуляции nTreg-клеток и повышения супрессорной активности
данных клеток.
Ранее уже было описано увеличение наивных nTreg-клеток с фенотипом
+
CD4 CD127lowFoxP3+CD45RA+CCR7+, при одновременном увеличении доли
клеток памяти и эффекторных nTreg-клеток ПК больных хроническим
лейкозом и множественной миеломой [263]. Также, в опухолевом
микроокружении рака почек и глиомы мозга было обнаружено увеличеное
количество nTreg-клеток, имеющих именно тимусное происхождение [264]. Так
же, как и в указанных выше работах, в нашем исследовании расширение пула
nTreg-клеток было ассоциировано с общим увеличением CD4+CD25+-клеток ПК
больных РМЖ по отношению к здоровым донорам. Данный феномен может
быть объяснен двумя механизмами: 1) физиологическим расширением пула
nTreg-клеток за счет стимуляции и активной пролиферации наивных nTregклеток и nTreg-клеток-предшественников в тимусе; 2) индукцией
пролиферации и образования Treg-клеток факторами, продуцируемыми
опухолевыми и/или опухоль-конвертированными клетками. На сегодняшний
день нет экспериментальных данных, подтверждающих преобладание того или
другого механизма при развитии онкологических заболеваний.
Известно, что наивные nTreg-клетки при стимуляции дают гомогенную
популяцию СD4+СD25+Foxp3+ in vivo и in vitro в ходе их активной
пролиферации и дифференцировки, при этом nTreg-клетки эффекторы/клетки
памяти не способны к самообновлению и при TCR стимуляции теряют
экспрессию FoxP3 и в большей степени подвержены апоптозу [102, p. 4321].
Закономерно предположить, что увеличение пула циркулирующих зрелых
эффекторных nTreg-клеток и nTreg-клеток памяти в группе больных РМЖ
является результатом активной пролиферации и дифференцировки наивных
nTreg-клеток в ходе развития опухоли. Повышенная экспрессия маркеров
активации наивными nTreg-клетками больных РМЖ подтверждает данное
предположение.
67
Также, увеличение пула наивных nTreg-клеток и их супрессорной
активности при РМЖ говорит о позитивной регуляции образования таких
клеток в тимусе. Согласно ранее опубликованным данным о том, что доля
наивных nTreg-клеток увеличивается уже при предопухолевых состояниях,
например, при предопухолевой моноклональной гаммапатии неопределенной
значимости (MGUS) [263, p. 5], можно предположить, что дисрегуляция пула
наивных nTreg-клеток запускается факторами, ассоциированными с развитием
предопухолевых состояний и может защищать развивающуюся опухоль с
ранних этапов ее развития. Тот факт, что мы не обнаружили зависимости
экспрессии супрессорных молекул или количества циркулирующих
субпопуляций nTreg-клеток со стадиями заболевания, косвенно подтверждает
то, что нарушения в активации и дифференцировке nTreg-клеток запускаются
до озлокачествления опухолей. В то же время, в опытах на мышах было
показано, что уровень nTreg-клеток в тимусе резко увеличивался к третьей
недели жизни после введения клеточной линии глиомы и развития рака мозга
[265]. Учитывая отсутствие данных о процессах, происходящих в тимусе при
развитие РМЖ, мы можем спекулировать, что факторы, ассоциированные с
опухолью или процессами, запускающими развитие опухоли, могут позитивно
влиять на сигналинг глюкокортикоидов или увеличения лимфопоэтина и/или
фактора роста кератиноцитов (фактора роста фибробластов-7) в строме тимуса,
которые активируют развитие nTreg-клеток в тимусе [266, 267].
Помимо расширения субпопуляции nTreg-клеток за счет стимуляции и
активной пролиферации наивных nTreg-клеток при РМЖ, мы также
предполагаем прямое влияние опухолевых факторов/АГ, молекул,
продуцируемых супрессорными клетками опухолевого окружения на
увеличение общего пула СD4+СD25+- и СD4+СD25+Foxp3+-клеток и повышения
экспрессии данными клетками супрессорных молекул при РМЖ. Из
литературных данных наиболее обоснованным в таком процессе считается
участие TGF-β, PGE2, IDO [4, p. 5908], IL-10 [268], IL-35 [140, p. 8], микроРНК-214 [269].
Из полученных в ходе исследования результатов следует, что увеличенный
пул наивных nTreg-клеток и nTreg-клеток эффекторов/клеток памяти,
обладающих повышенной супрессорной активностью и способностью
индуцировать образование iTreg-клеток вносит вклад в подавление
противоопухолевого иммунного ответа и способствует развитию РМЖ.
3.1.2 Tr1-, Th3- и Treg-17-клетки в норме и при раке молочной железы
Предполагается, что iTreg-клетки играют важную роль в развитие
онкологических заболеваний, внося вклад в подавление эффекторных клеток. В
области опухоли создается толерогенное микроокружение, способствующее
конверсии Т-клеток в iTreg-клетки. При различных типах рака, в том числе и
при РМЖ, как в опухолевой ткани, так и в сыворотке повышено содержание
молекул и активность опухоль-конвертированных клеток, участвующих в
индукции субпопуляций iTreg-клеток [270]. Исходя из этого, мы
предположили, что при РМЖ количество iTreg-клеток повышено, при этом
68
конверсия Tcon в основные субпопуляции iTreg-клеток имеет место не только в
опухолевом микроокружение, но и в ПК. Таким образом, следующей нашей
задачей было изучение циркулирующих Tr1-, Th3- и Treg-17-клеток здоровых
доноров и больных РМЖ для лучшего понимания их влияния на
противоопухолевый иммунитет.
Следует отметить, что во всех имеющихся работах изучение
функциональной активности iTreg-клеток в норме или при онкологических
заболеваниях проводилось после стимуляции клеток in vitro iTregиндуцирующими цитокинами и в присутствии или в отсутствии опухолевых
АГ. Мы анализировали содержание и экспрессию супрессорных молекул iTregклетками ПК без всякой стимуляции для изучения порогового уровня
функциональной активности iTreg-клеток и сравнения данных показателей
между группами доноров.
На первом этапе мы исследовали Treg-17-клетки в ПК здоровых женщин и
больных РМЖ. IL-17 участвует в поддержании гомеостаза в слизистых
оболочках, но также вовлечен в патологические процессы. Роль IL-17 при раке
не известна. Опыты на животных свидетельствуют о тесной взаимосвязи между
продукцией IL-17 опухоль-инфильтрирующими Th17 и активации Th1- и CTLиммунного ответа, приводящего к гибели опухолевых клеток [271]. Тем не
менее, Treg- 17-клетки, индуцированые TGF-β и IL-6, обладают негативным
эффектом при онкологических заболеваниях. CD4+Foxp3+IL-17+-клетки,
подавляющие Т-клеточную активность, были обнаружены в опухолевой ткани
рака толстого кишечника и некоторых других типах рака и колита. Считается,
что Treg-17-клетки являются «воспалительными» Treg-клетками, так как они
повышают секрецию провоспалительных цитокинов и одновременно
подавляют локальный Т-клеточный иммунный ответ при язвенном колите и,
тем самым, индуцируют развитие опухоли на фоне хронического
воспалительного процесса [163, p. 4394]. CD4+FoxР3+IL-17+-клетки вызывают
экспрессию маркеров, ассоциированных с опухолевыми клетками рака толстого
кишечника на мононуклеарных клетках костного мозга и при участии
секретируемого ими TGF-β способствуют переходу таких клеток в опухолевые
стволовые клетки [245, p. 1493]. Увеличенное количество IL-17продуцирующих CD4+-клеток было обнаружено у курящих людей, больных
аденокарциномой легких [272] и при раке яичников [273]. Кроме этого,
сообщалось, о содержание Th17-клеток в ткани РМЖ и, что количество данных
клеток не ассоциировано с показателями прогрессирования заболевания и
количества Treg-клеток. Однако данное исследование проводилось с
применением не полного фенотипического скрининга клеток, Th17 и Tregклетки определялись по экспрессии только IL-17 или FoxP3 соответственно
[274]. Также известно, что активированные форбол 12,13-дибутиратом и
иономицином МНПК больных с прогрессирующими формами РМЖ содержат
больший процент CD4+Foxp3+IL-17+-клеток [261, p. 12]. Таким образом, мы
предположили, что при развитие РМЖ происходит индукция Treg- 17-клеток,
которые участвуют в подавление Т-клеточного противоопухолевого ответа.
69
До сих пор до конца не ясно, при каких условиях Treg-17-клетки
образуются in vivo, но небольшое количество CD4+Foxp3+IL-17+-клеток было
ранее обнаружено среди CD4+-клеток, выделенных из ПК здоровых людей и
активированных форбол-12-миристат-13-ацетатом и иономицином [39, p. 4794],
и в нашем исследовании при анализе клеток свежей крови (Таблица 2). В ходе
анализа также было выявлено, что около 40% таких клеток (39,9±8,2%)
экспрессируют маркер CD25, при этом, достоверной разницы между процентом
CD4+Foxp3+IL-17+CD25+- и CD4+Foxp3+IL-17+CD25--клеток не наблюдалось как
у здоровых доноров, так и у больных РМЖ (данные не представлены).
Сравнивая исследуемые группы доноров, нами не было обнаружено
достоверных различий в количестве клеток с фенотипами IL-17+, IL-17+CD25+
или IL-17+CD25- среди CD4+Foxp3+-субпопуляции. Однако общий процент
CD4+Foxp3+IL-17+CD25+-клеток, в пересчете на все клетки ПК, был выше в
группе РМЖ по сравнению со здоровыми женщинами (рисунок 3).
А - репрезентативные данные
Б - медианные значения, квартильный размах (25%, 75% процентили),
размах (минимум, максимум), достоверность отличий расчитана по критерию
Стьюдента.
70
Рисунок 3 – Содержание CD25+ (гейт R3) и CD25- (гейт R4) Treg -17клеток в ПК здоровых доноров и больных РМЖ (РМЖ)
Механизм супрессии Treg-17-клеток до сих пор не известен. В ходе
анализа супрессорных молекул нами было установлено, что CD4+Foxp3+IL-17+клетки ПК в норме не экспрессируют такие молекулы, как CTLA-4, CD39,
CD73 и IL-35 (таблица 3). GITR экспрессируют клетки с фенотипом
CD4+Foxp3+IL-17+CD25+, но не CD4+Foxp3+IL-17+CD25- (19,9±24,1%; 0%;
р=0,09, соответственно), а LAP экспрессирован как в CD25+, так и CD25- Treg17-субпопуляциях (45,0±7,0%; 55,0±45,9%, соответственно) (данные не
представлены). Интересно, что в отличие от здоровых людей, при РМЖ Treg17-клетки экспрессируют CTLA-4, GITR и IL-35 (таблица 3), причем как
совместно с CD25 (17,3±4,8%; 25,9±19,2%; 40,5±33,8%, соответственно), так
без данного маркера (17,6±7,5%; 41,7±34,6%; 23,6±11,9%, соответственно).
Экспрессия CD39 в группе пациентов наблюдалась только среди
CD4+Foxp3+IL-17+CD25+-клеток, а маркер CD73 также отсутствовал (данные не
представлены).
Таблица 3 – Экспрессия супрессорных молекул CD4+Foxp3+IL-17+-клетками ПК
здоровых доноров и больных РМЖ
Супрессорные
молекулы
GITR
Здоровые женщины
M±SD
(n=10)
19,9±24,1
РМЖ
M±SD
(n=17)
40,9±28,1
о.р.
CTLA-4
0
17,4±14,2
0,002
LAP
66,0±16,3
64,0±19,3
н.з.
CD39
0
15,5±10,8
0,001
CD73
0,8±1,5
1,0±1,4
н.з.
IL-35
0,7±1,1
43,3±44,7
0,008
p
Примечание – в таблице использовано сокращение н.з. – различие не значимо.
Ранее были опубликованы результаты опытов по изучению механизмов
супрессии пролиферации Tcon-клеток IL-17+FOXP3+-клетками, выделенными
из поликлонально активированной in vitro субпопуляции CD4+-лимфоцитов
здоровых доноров. Так, Treg-17-клетки подавляли пролиферацию клетокмишеней при совместном культивирование клеток и блокада IL-10, IL-10Rα,
TGF-β1,2,3, CTLA-4 или PD-1 АТ не влияла на данный эффект, в то время как
при кокультивирование клеток в системе Transwell супрессорный эффект
полностью отсутствовал [39, p. 4795]. Учитывая эти данные и результаты,
полученные нами, мы можем заключить, что в норме Treg-17-клетки подавляют
Т-клеточный ответ за счет представленного на мембране супрессорного
рецептора GITR или других, не исследованных нами мембран-связанных
молекул. Высокая экспрессия LAP дает нам возможность предположить, что в
71
ПК Treg-17-клетки несут латентные формы TGF-β, которые непосредственно в
области воспаления также могут участвовать в супрессии иммунных реакций.
Наличие экспрессии CTLA-4, GITR, CD39 и IL-35 Treg-17-клетками при РМЖ
может также свидетельствовать об участии данных молекул и расширении
путей супрессии при развитии заболевания.
Таким образом, мы впервые показали присутствие Treg-17-клеток в ПК
здоровых доноров. Согласно литературным данным, мы можем предположить,
что данные клетки образуются из CD4+CD25+CD45RA- или Tcon-клеток при
влиянии Treg-17-индуцирующих цитокинов. Предположительно, основной
функцией данных клеток в физиологических условиях является поддержание
иммунного гомеостаза в слизистых оболочках. Сначала было показано, что
конверсию Treg-17-клеток вызывает комбинация цитокинов IL-6 и TGF-β,
затем было показано, что IL-2 также обладает такой способностью, а
цитокиновые коктейли на основе сочетания IL-2, IL-1, IL-6, TGF-β или IL-2, IL21, IL-23, TGF-β существенно усиливают данный процесс [275]. Известно, что
уровень провоспалительных цитокинов (IL-6, IL-1, IL-2) увеличен в опухолевой
ткани и сыворотке больных РМЖ. Многие исследования выявили корреляцию
между содержанием данных цитокинов и прогрессией РМЖ [276]. Такое же
заключение было сделано по поводу содержания TGF-β при РМЖ [277].
Учитывая эти данные, мы можем заключить, что образование Treg-17-клеток и
экспрессия данными клетками супрессорных молекул повышены при РМЖ за
счет увеличения Treg-17-индуцирующих цитокинов.
Следующей задачей было изучение субпопуляции Th3. Как уже
отмечалось, Th3-клетки обладают супрессорной активностью, опосредованной
в основном секретируемым TGF-β. Данная субпопуляция ранее не изучалась
при онкологических заболеваниях. Однако известно, что TGF-β, представлен в
высоких дозах в опухолевом микроокружении РМЖ и уровень TGF-β
коррелирует с малигнизацией и прогрессированием данного заболевания [277,
p. 2]. Также с развитием опухоли связано увеличение TGF-β+ Treg-клеток в
опухолевой ткани [278]. При этом, помимо супрессии иммунного ответа и
индукции образования iTreg-клеток, TGF-β, продуцированный Treg-клетками,
участвует в стимуляции экспрессии VEGF опухолевыми клетками, что
повышает васкуляризацию и развитие опухоли [245, p. 1493].
В ходе анализа TGF-β-продуцирующих Treg-клеток, нами не было
обнаружено статистически значимых изменений как в количестве
CD4+FoxP3+TGF-β+- и CD4+FoxP3+TGF-β+CD25+/--субпопуляций, так и в уровне
экспрессии данными клетками GITR, CTLA-4, CD39, CD73 или IL-35 между
здоровыми донорами и больными РМЖ (таблица 4).
72
Таблица 4 – Экспрессия супрессорных молекул CD4+FoxP3+TGF-β+-клетками
ПК здоровых доноров и больных РМЖ
Супрессорные
молекулы
GITR
Здоровые женщины
M±SD
(n=5)
28,5±17,0
РМЖ
M±SD
(n=10)
44,5±25,6
CTLA-4
22,1±11,0
30,1±23,2
CD39
17,6±0,5
50,0±35,8
CD73
25,8±19,4
34,1±22,0
IL-35
43,9±33,0
64,9±38,1
В ходе исследования у здоровых доноров среди МНПК были обнаружены
следовые значения (около 2%) CD4+IL-4-IL-10+CD25+-клеток, процент таких
клеток был достоверно ниже, чем CD4+IL-4-IL-10+CD25--клеток (4,2%) в этой
же группе доноров. У больных РМЖ количество CD4+IL-4-IL-10+CD25+-клеток
превышало в 2 раза долю соответствующей субпопуляции ПК здоровых
женщин, при этом различий в содержании CD4+IL-4-IL-10+CD25--клеток между
группами доноров и между CD4+IL-4-IL-10+CD25+ и CD4+IL-4-IL-10+CD25субпопуляциями среди больных РМЖ, не было выявлено (рисунок 4). Процент
общего пула CD4+IL-4-- и CD4+IL-4-IL-10+-клеток не различались между
образцами здоровых женщин и больных РМЖ (таблица 2), в то время как
процент CD4+IL-4-CD25+-клеток был значительно выше у пациентов с РМЖ
(данные не представлены), что подтверждает данные, описанные в пункте 3.1.1.
Среди iTreg-клеток, наиболее хорошо изучена субпопуляция Tr1, и
супрессия противоопухолевого иммунитета данными клетками считается
доказанной. На первом этапе мы исследовали содержание Tr1-клеток с
фенотипом CD4+IL-4-FoxP3+IL-10+CD25+/- в ПК здоровых женщин и больных
РМЖ. Так как в литературе имеются разногласия по поводу экспрессии Tr1клетками CD25 [246, p. 8870; 279], мы анализировали события как в CD25+ так
и в CD25- гейтах. Стратегия гейтирования Tr1-клеток представлена на рисунке
4.
73
А - репрезентативные данные
Б - обобщенные данные с медианными значениями, каждая точка отражает
каждое индивидуальное значение, достоверность отличий между CD25+ и
CD25- Tr1-клетками при ×р=0,02 (по критерию Уилкоксона) и между группами
здоровых доноров и больных РМЖ при *р≤0,003 (по критерию Стьюдента).
Рисунок 4 – Содержание CD25+ (гейт R3) и CD25- (гейт R4) Tr1-клеток в
ПК здоровых доноров и больных РМЖ (РМЖ)
Некоторые исследователи считают, что клетки, входящие в состав Tr1,
экспрессируют различный уровень FoxP3 [246, p. 8870; 280], другие описывают
их как FoxP3- или не учитывают экспрессию FoxP3 при их фенотипировании
[243, p. 429; 281]. В некоторых работах анализ проводили как FoxP3позитивных, так и негативных клеток Tr1 субпопуляции [50, p. 122]. Учитывая
то, что экспрессия FoxP3 может быть индуцирована в Т-клетках при активации
[282], эти разногласия могут быть вызваны различиями в дизайне
экспериментов и стимулов, применяемых для получения Tr1-клеток in vitro. В
нашем исследование было обнаружено, что в ПК здоровых доноров около 70%
CD4+IL-4-IL-10+CD25+/--клеток экспрессируют FoxP3 без всякой стимуляции.
74
При этом, количество таких клеток в группе РМЖ оказалось достоверно выше
и в среднем составляло около 95% (р≤0,001) (рисунок 5А). Повышение доли
FoxP3+-клеток наблюдалось как среди CD25+, так и среди CD25- Tr1-клеток
больных РМЖ (рисунок 5Б).
А - репрезентативные данные экспрессии FoxP3 в гейтированной CD4+IL4-IL-10+CD25+/--субпопуляции
Б - медианнные значения, квартильный размах (25%, 75% процентили),
размах (минимум, максимум), достоверность отличий между группами:
*р=0,001 и **р=0,01 (по критерию Стьюдента).
Рисунок 5 – Экспрессия FoxP3 Tr1-клетками ПК здоровых доноров и
больных РМЖ (РМЖ)
При
сравнении
CD4+IL-4-IL-10+CD25+
и
CD4+IL-4-IL-10+CD25субпопуляций мы не выявили различий в экспрессии FoxP3, GITR, CTLA-4,
LAP, CD39, CD73 или IL-35 как в группе здоровых доноров, так и больных
РМЖ. Сравнивая же здоровых доноров с больными РМЖ, мы установили
повышенное содержание IL-35-экспрессирующих CD4+IL-4-IL-10+CD25+- и
CD4+IL-4-IL-10+CD25--клеток
и
CD39-экспрессирующих
CD4+IL-4-IL10+CD25+-клеток в ПК пациентов (рисунок 6). Различий в экспрессии
остальных исследуемых маркеров выявлено не было.
75
А - репрезентативные данные
Б - медианные значения, квартильный размах (25%, 75% процентили),
размах (минимум, максимум), достоверность отличий между группами:
*р˂0,0001, **р=0,01 и ***р˂0,05 (по критерию Стьюдента).
Рисунок 6 – Экспрессия IL-35 и CD39 СD25+ (гейт R5) и СD25- (гейт R6)
Tr1-клетками ПК здоровых доноров и больных РМЖ (РМЖ)
Сначала основным механизмом супрессии Tr1-клеток считалась секреция
IL-10 и TGF-β. Затем было показано, что, как и nTreg-клетки Tr1-клетки
способны генерировать аденозин. При этом введение молекул-антагонистов
CD39 и CD73 резко снижало супрессорный эффект Tr1 не только по
отношению к пролиферации Т-клеток, но и к секреции ими провоспалительных
цитокинов [283]. Увеличение доли CD39+ Tr1-клеток при РМЖ говорит о
повышенной супрессорной активности данных клеток. Повышение количества
таких клеток было ранее обнаружено в области HNSCC, что может говорить о
закономерности данного феномена при онкологических процессах [284].
Продукция Tr1-клетками IL-35 ранее не изучалась. Однако известно, что
супрессорный эффект iTr35-клеток опосредуется IL-35, но IL-10-зависимым
путем. Конверсия Tcon в iTr35-клетки индуцируется также IL-35 и IL-10,
секретированными nTreg-клетками, а рекомбинантный IL-35 индуцирует
продукцию IL-10 CD4+ T-клетками. Интересно, что по данным литературы, IL35 повышает количество именно CD4+CD39+ Treg-клеток, экспрессирующих
FoxР3 и IL-10 и стимулирует пролиферацию таких клеток in vitro [285].
Согласно нашим данным в ПК больных РМЖ повышен процент клеток именно
76
с таким фенотипом и, помимо этого, IL-35-продуцирующих Tr1-клеток. Тесная
взаимосвязь IL-35 и IL-10 в функционировании iTreg-клеток и тот факт, что
механизмы функциональной активности iTr35- и Tr1-клеток очень схожи
между собой, можно предположить, что данные клетки представляют единную
субпопуляцию iTreg-клеток. Возможно, что для образования таких клеток in
vivo трубуется действие как iTr35-, так и Tr1-индуцирующих факторов. Помимо
этого, мы можем предположить, что у больных РМЖ, наравне с IL-10,
повышается уровень IL-35, что приводит к индукции и активной пролиферации
IL-35+ Tr1-клеток в опухолевом микроокружении и возможно, в ПК и
лимфоидных
органах.
Данное
предположение
подверждается
опубликованными ранее результатами, согласно которым в мышиных моделях
меланомы и колоректальной карциномы, повышена экспрессия IL-35 CD4+клетками, инфильтрирующими опухоль. Также, описанные в предыдущей главе
результаты, а именно увеличение IL-35+ nTreg-клеток в группе больных РМЖ,
также объясняют повышение доли IL-35+ Tr1-клеток при РМЖ. Механизм
индукции продукции IL-35 и ауторегуляции IL-35+-клеток объясняется
следующим: при связывании IL-35 с рецепторами IL-12Rβ2 и gp130 сигнал
далее передается через STAT1 и STAT4, которые в свою очередь могут
образовывать гетеродимеры и влиять на экспрессию генов, в том числе и
стимулировать транскрипцию генов, кодирующих IL-35 (p35 и Ebi3) [285, p. 3],
в результате чего формируется обратная связь и индуцируется экспрессии IL-35
клетками-мишенями (в том числе и Tcon), после чего такие клетки приобретают
супрессорные свойства.
IL-35 вероятнее всего является фактором канцерогенеза, влияя как на
иммунитет, так и непосредственно на опухолевые клетки. IL-35+ Tr1-клетки
обладают супрессорными свойствами по отношению к противоопухолевой
активности CD4+ и CD8+ Т-клеток, что было доказано в опытах на мышах с
привитыми опухолями. Также, IL-35 повышает пролиферацию опухолевых
клеток, положительно влияя на ангиогенез опухоли [285, p. 7]. Таким образом,
увеличение количества циркулирующих IL-35-продуцирующих Treg-клеток
(nTreg-клеток- и Tr1-клеток) вносит вклад в развитие опухоли.
Ранее считалось, что iTreg-клетки индуцируются непосредственно в ткани
и не циркулируют в ПК. Согласно недавно опубликованным сообщениям,
nTreg-клетки практически не продуцируют IL-10 и TGF-β. Кроме этого,
супрессорный эффект nTreg-клеток не зависит от данных цитокинов [127, p.
2259]. Таким образом, мы можем заключить, что IL-10- и TGF-βпродуцирующие Treg-клетки ПК могут представлять собой как истинные iTregклетки, так и быть предшественниками или предактивированными iTregклетками. Так как экспрессия маркеров активации (GITR и CTLA-4) Tклетками ПК, экспрессирующими IL-10 и TGF-β была низкой, мы
предполагаем,
что
такие
клетки
более
вероятно
находятся
в
предактивированном состояние и для полной конверсии, возможно, требуется
встреча с толерогенными АPC. Из полученных нами результатов следует, что в
ПК здоровых доноров циркулирует незначительная часть таких клеток, которые
77
могут участвовать в поддержании периферической иммунной толерантности к
аутоантигенам в нормальных физиологических условиях.
Повышенный уровень данных клеток в циркуляции больных РМЖ может
быть результатом выхода Tr1-клеток из опухолевого микроокружения и/или
индукции образования таких клеток в ПК. Согласно литературным данным, в
опухолевом микроокружении содержится высокий уровень Tr1-индуцирующих
цитокинов и DC10-клеток. Помимо этого, было показано увеличенное
количество иммуносупрессорных Tr1-клеток в лимфатических узлах больных
лимфомой Ходжкина, а также в ПК и в опухолевой ткани HNSCC [279, p. 9;
286]. Анализ циркулирующих CD4+-клеток больных глиобластомой показал
увеличенную продукцию IL-10 [243, p. 4352]. Tr1-клетки также были
обнаружены в ПК больных раком яичников, после адаптивного переноса in
vitro стимулированных Т-клеток [287]. Согласно этому, мы можем
предположить, что в опухолевом микроокружение РМЖ так же активно
происходит конверсия Tr1-клеток. Данное предположение подтверждается
данными, показывающими повышенный уровень мРНК IL-10 и TGF-β1 в
области РМЖ по сравнению со здоровой тканью [242, p. 573]. Tr1 могут
частично выходить в русло и другие лимфоидные органы, участвовать в
передаче толерогенного состояния остальным наивным Т-клеткам и создавать
общий супрессорный фон. Кроме этого, высокий уровень IL-10 и TGF-β в
сыворотке больных РМЖ может запускать конверсию Tr1-клеток уже в ПК. На
МНПК больных HNSCC было показано, что при онкологическом процессе
Tcon-клетки в большей степени способны конвертировать в Tr1 субпопуляцию
при действии на них Tr1-индуцирующих цитокинов in vitro [279, p. 6]. Данный
феномен может иметь место и при РМЖ. При том, что мы не обнаружили
разницы в количестве циркулирующих TGF-β-продуцирующих Treg-клеток
между здоровыми женщинами и больными РМЖ, мы не исключаем
образования таких клеток в опухолевом микроокружении.
Важен вопрос: «Могут ли IL-10- и TGF-β-продуцирующие iTreg-клетки
быть использованы в иммунотерапии рака?» Значение IL-10 и TGF-β в
развитии онкологических заболеваний до сих пор не ясно. Ранее была описана
двоякая роль IL-10 и TGF-β в развитии опухолей: данные цитокины обладают
как ингибиторными, так и иммуностимулирующими свойствами. В модельных
опытах было показано, что IL-10 способствует противоопухолевой активности
NK-клеток, за счет снижения экспрессии опухолевыми клетками молекул HLAI, что снижает их чувствительность к CTL, но повышает NK-клеточную
цитотоксичность против данных клеток [288]. В модели глиомы IL-10продуцирующие CD4+-клетки способствовали противоопухолевой активности
CTL и NK-клеток [289]. В тоже время, IL-10 проявляет про-опухолевую
активность, подавляя созревание APC, что ограничивает их способность
процессировать АГ и способствует их поляризации по типу М2 фенотипа [290].
IL-10 также подавляет продукцию IFN-γ и TNF-α NK-клетками [291]. IL-10
необходим для супрессорной активности MDSC [1, p. 109]. TGF-β является
супрессором опухолевого роста, замедляя клеточный цикл, индуцируя апоптоз
и предотвращая клеточную иммортализацию. Экспрессия TGF-βRII клетками
78
РМЖ предотвращает образование и развитие опухоли. С другой стороны, ранее
было показано, что TGF-β играет ключевую роль в миграции, инвазии и
метастазировании клеток РМЖ, влияя на строму, клетки, окружающие опухоль,
и непосредственно на раковые клетки. TGF-β снижает экспрессию NKG2D и
NKp30 NK-клетками [292] и способствует стимуляции и привлечению
супрессорных клеток в опухолевое микроокружение, таких как MDSC, T- и Bрегуляторных клеток, а также повышает экспрессию ими FoxP3 и образование
iTreg-клеток на периферии [157, p. 5150; 293]. IL-10 и TGF-β «альтернативно»
активируют iDC, а также индукцию ими Т-клеточной анергии, пролиферации
аллоантиген-специфичных
T-лимфоцитов,
увеличение
количества
+
+
+
CD4 CD25 Foxp3 nTreg-клеток и других iTreg-клеток [1, p. 298]. Таким
образом, основываясь на многочисленных данных о супрессорном влияние Tr1
на противоопухолевый иммунитет [279, p. 6; 280, p. 1759], супрессорные
свойства Th3 [152, p. 211], а также ингибирующем влиянии, продуцируемых
ими цитокинов, мы можем заключить, что такие клетки негативно влияют на
противоопухолевый иммунный ответ.
Обобщая все выше сказанное, при РМЖ наблюдается позитивная
регуляция iTreg-клеток, которые, повышая супрессию nTreg-клето, безусловно
вносят вклад в создание условий для выживания опухоли, и удаление таких
клеток при онкологических заболеваниях может рассматриваться как
перспективный подход иммунотерапии рака.
3.1.3 Изучение CD3+HLA-G+ регуляторной популяции клеток
периферической крови здоровых доноров и больных РМЖ
Негативный вклад в развитие онкологических заболеваний, путем
подавления
противоопухолевой
активности
эффекторных
иммунокомпетентных клеток и индукции периферической толерантности к
опухолевым АГ осуществляется не только CD4+ Тreg-клетки, но также широко
известен вклад и других супрессорных субпопуляций Т-лимфоцитов, например,
CD8+CD122+-клеток [28, p. 326], CD8+CD28- [294] и T-лимфоцитов негативных
по TCRαβ (CD4−CD8−) [295]. Количество CD8+ Тreg-клеток, также, как и
CD4+CD25+, резко увеличивается в ПК и среди опухоль-инфильтрирующих
лимфоцитов при различных типах рака, в том числе при РМЖ.
Аккумулирование CD4+ и CD8+ Тreg-клеток в опухолевой ткани коррелирует со
стадией рака и является неблагоприятным прогностическим фактором
выживаемости больных [296].
Молекула HLA-G была обнаружена в малигнизированных клетках
различных типов рака и РМЖ [297]. Предполагается, что аберрантная
экспрессия HLA-G опухолевыми клетками является одним из ключевых
механизмов ускользания данных клеток от иммунного надзора. Молекулы
HLA-G индуцируют образование iDC, увеличение количества MDSC,
активируют Treg-клетки и опухоль-ассоциированные макрофаги и индуцируют
образование Tr1-клеток [180, p. 7]. Участие HLA-G в регуляции иммунного
ответа заключается в супрессии пролиферации аллогенных T-клеток и
цитотоксичности CD8+ T- и NK-клеток [297, p. 10143].
79
Как уже отмечалось выше, CD4+ и CD8+ Т-клетки, экспрессирующие HLAG1, обладают супрессорной активностью и способны подавлять Т-клеточный
иммунный ответ. Присутствие данной субпопуляции Т-клеток в области
воспаления при острых нейровоспалительных заболеваниях предполагает ее
участие в регуляции иммунного ответа в паренхиме. Экспрессия HLA-G Тклетками была также обнаружена в децидуальной оболочке, при аллогенной
трансплантации и у ВИЧ-инфицированных пациентов [29, p. 568; 30, p. 408].
Таким образом, очевидно, что HLA-G+ Тreg-клетки играют важную роль в
регуляции иммунного ответа и принимают участие в развитии патологических
процессов. Однако их роль при онкопатологии никем ранее не изучалась.
Мы исследовали содержание циркулирующих Т-клеток, экспрессирующих
HLA-G, и продукцию ими супрессорных цитокинов в норме и при РМЖ. Для
оценки как CD4+, так и CD8+ субпопуляций, экспрессирующих HLA-G1,
изучали общий CD3+CD56- пул Т-лимфоцитов.
Достоверного различия в относительном содержании CD3 +CD56- Тлимфоцитов в ПК между группами больных РМЖ и здоровых женщин
обнаружено не было (61,0±11,0% и 69,2±8,1% соответственно) (рисунок 7А).
Однако, цитофлуориметрический анализ показал почти двукратное
повышение уровня CD3+CD56-HLA-G+-клеток у больных РМЖ по сравнению
со здоровыми женщинами (3,6±1,4%; 1,9±0,3%; p=0,005, соответственно)
(рисунок 7Б).
Как уже было отмечено, продукция IL-10 и TGF-β связана с одним из
механизмов супрессорного действия Тreg-клеток и индукцией iTreg- клеток
[287, p. 9]. Ранее была показана экспрессия мРНК IL-10 и TGF-β и секреция
CD4+HLA-G+ лимфоцитами соответствующих цитокинов [29, p. 572]. Мы
изучили экспрессию данных цитокинов HLA-G+ Тregs после активации РНА,
известного стимулятора продукции IL-10 и TGF-β и пролиферации Тreg-клеток
[298]. Стимуляция РНА увеличивала экспрессию HLA-G на CD3+ Т-клетках
здоровых доноров и больных РМЖ в сравнении с неактивированными
клетками. При этом мы не обнаружили достоверной разницы в количестве
HLA-G+ Treg-клеток после активации между больными и здоровыми
женщинами (рисунок 7Б).
80
А - репрезентативные результаты оценки экспрессии HLA-G на
свежевыделенных CD3+ клетках
Б - обобщенные данные экспрессии HLA-G свежевыделенными (СВ),
нестимулированными (БС) и активированными РНА (РНА) МНПК в виде
M±SD при *p<0,001, **p<0,01 и ***p<0,05 (по критерию Стьюдента).
Рисунок 7 - Содержание CD3+HLA-G+ клеток в свежевыделенных (СВ),
нестимулированных (БС) и активированных РНА (РНА) МНПК здоровых
доноров и больных РМЖ
Анализ продукции внутриклеточных цитокинов показал, что у здоровых
доноров клетки, позитивные по экспрессии IL-10 и TGF-β, представляют лишь
небольшую часть от всех HLA-G+ Treg-клеток (11,8% и 10,1%, соответственно)
(рисунок 8).
81
% CD3+HLA-G+ клеток
30
25
*
20
Здоровые
доноры
РМЖ
15
10
5
0
IL-10+ TGF-β+ IFN-γ+
*p≤0,05 (по критерию Стьюдента).
Рисунок 8 - Продукция IL-10, TGF-β и IFN-γ CD3+HLA-G+ клетками
здоровых доноров и больных РМЖ после 18 ч стимуляции РНА
Мы также обнаружили, что у больных РМЖ наблюдается достоверное
увеличение доли IL-10-продуцирующих HLA-G+ Treg-клеток по сравнению со
здоровыми донорами (19,1±5,0% и 11,8±3,3%, соответственно, p˂0,05) (рисунок
8). Содержание CD3+HLA-G+TGF-β+-клеток в обеих группах было одинаковым.
При этом только незначительная часть HLA-G+ Тreg-клеток как у здоровых
доноров, так и у больных РМЖ продуцировала IFN-γ (рисунок 8).
Согласно литературным данным, супрессорный эффект CD4+HLA-G+клеток опосредуется через молекулу HLA-G, так как ее блокирование AT в
условиях in vitro восстанавливало уровень пролиферации CD4+HLA-G- клеток
при их совместном культивировании с CD4+HLA-G+ клетками [29, p. 572].
Кроме того, Huang Y. с соавт. показали, что после поликлональной стимуляции
CD4+HLA-G+ клетки, в отличие от CD4+HLA-G-, секретировали высокий
уровень IL-10, который также участвовал в подавлении пролиферации
эффекторных Т-лимфоцитов [179, p. 278; 299]. Исходя из полученных нами
результатов и литературных данных, можно предположить, что увеличение у
больных РМЖ относительного содержания циркулирующих CD3+HLA-G+ Тклеток, в том числе и продуцирующих IL-10, вносит вклад в подавление
противоопухолевого иммунитета.
Как уже было отмечено выше, HLA-G+ Т-клетки могут быть образованы в
тимусе или индуцированны на периферии в толерогенном микроокружении.
Согласно литературным данным, часть неактивированных, и большая часть
активированных CD4+ и CD8+ T-лимфоцитов (экспрессирующих CD25+)
приобретают регуляторные свойства в ходе трогоцитоза HLA-G1 в течение
82
нескольких минут инкубации с HLA-G+ APC. Данный процесс не зависит от
CD28-B7 или MHC-TCR взаимодействий и активируется при TCR стимуляции.
Захват HLA-G не изменяет значительно характеристики Т-клеток, но такие
клетки cразу же теряют свои эффекторные свойства и начинают подавлять
пролиферацию аллогенных Т-клеток HLA-G1-зависимым путем. Интересно,
что супрессорная активность данных клеток сохраняется и после потери HLAG1 с цитоплазматической мембраны, но осуществляется уже через другие
механизмы [300]. Также, трогоцитоз HLA-G1 от опухолевых клеток был
показан для человеческих NK, что вызывало такое же приобретение ими
супрессорных свойств [226, p. 1429]. А учитывая то, что при РМЖ, опухолевые
клетки и моноциты/макрофаги, инфильтрирующие опухоль, экспрессируют
увеличенный уровень HLA-G1 [301], мы можем предположить, что увеличение
циркулирующих HLA-G+ Тregs вызвано опухолевым микроокружением. Таким
образом, молекула HLA-G1 может рассматриваться в качестве одной из
мишеней противоопухолевой иммунотерапии для блокирования супрессорной
активности и предотвращения их образования HLA-G+ Тregs.
3.1.4 Изучение гиалуронан-связывающих и -несвязывающих Tрегуляторных клеток здоровых доноров и больных раком молочной железы
Один из центральных механизмов привлечения Treg-клеток из кровяного
русла в места воспаления опосредован взаимодействием между активными
изоформами рецептора CD44 (v6, v9) на клетках и его лигандом НА на
поверхности эндотелия [5, p. 1126]. CD44 экспрессируется Т-лимфоцитами и
является трансмембранным гликопротеином I типа, однако, для связывания с
лигандом требуется предварительная активация данного рецептора. Переход от
низкой к высокой способности связывания CD44 с НА на Т-клетках
осуществляется несколькими стимулами, такими как непосредственное
лигирование НА, активация TCR, влияние цитокинов/хемокинов, а также
энзиматическое удаление сиаловый кислоты от двух терминальных участков Nсвязанных гликанов в НА-связывающем домене [302-303].
Высокомолекулярный
НА
является
основным
компонентом
межклеточного матрикса и представляет собой полимер дисахарида,
состоящего из N-ацетил глюкозамина и D-глюкуроновой кислоты, с
молекулярной массой более 400 kDa. НА привлекает внимание исследователей
Treg-клеток ввиду его участия в механизме возникновения и регуляции
воспаления, которое характеризуется его патологическим синтезом и
накоплением в сайтах воспаления [304]. Ранее было продемонстрировано, что
высокомолекулярный НА приводит к увеличению экспрессии FoxP3, mb-TGF-β
и продукции IL-10 Treg-клетками, обладающими иммунорегуляторным
эффектом [305, 306]. Более того в исследованиях на мышах показано, что
способность связывать НА дискриминирует Treg-клетки с повышенным
супрессорным потенциалом и степенью активации. Treg-клетки мышей с
отсутствием гена, кодирующего CD44, обладали сниженной способностью
подавления Т-клеточного иммунитета [88, p.]. Таким образом, разработка
нового методологического подхода к выделению и оценке функциональной
83
активности Treg-клеток ПК здоровых людей, основанного на способности Tregклеток связывать высокомолекулярный гиалуронан, с целью дальнейшей
дискриминации и анализа такой субпопуляции Treg-клеток в норме и при
патологических состояниях нам представлялась весьма актуальной.
Сначала мы попытались выявить НА-связывающие Treg-клетки,
выделенные с помощью иммуномагнитной сепарации мононуклеаров ПК
здоровых
доноров,
при
использовании
биотинилированного
высокомолекулярного НА в комбинации со стрептавидином, меченным РЕ.
Однако проточная цитометрия показала отсутствие таких клеток (данные не
показаны). Иная картина наблюдалась, когда мы попытались физически
разделить
выделенные
Treg-клетки,
используя
сорбированный
высокомолекулярный НА [307].
На этапе отработки технологии сепарации НА+ и НА- Treg-клеток мы
использовали МНПК здоровых доноров. На первом этапе МНПК инкубировали
с биотинилированным НА, связанным с парамагнитными частицами (бусами) с
диаметром 3,5 мкм, нагруженными АТ к биотину, разработанными специально
для клеточной сепарации (Miltenyi Biotec). После окончания инкубации клетки
разделяли в магнитном поле сепаратора клеток. Оказалось, что клетки, не
связывающие гиалуронан (НА-), оставались свободными в жидкой фазе
сепаратора, а клетки, связывающие гиалуронан (НА+), задерживались в
магнитном поле, фиксируясь на твердой фазе (стенках пробирки). Повидимому, крупные бусы с иммобилизованным НА имитировали
экстраклеточный матрикс, клеточное взаимодействие с которым было
существенно более выраженным, чем с растворенным в жидкой среде НА.
Подсчет клеток в обеих фракциях показал, что НА+ клетки составляют
примерно 29,8±15,9% от всех МНПК. Таким образом, удалось показать, что
разработанный нами методологический подход пригоден для разделения клеток
по
способности
связывать
НА.
Принципиальная
схема
нового
методологического подхода к оценке Treg-клеток представлена на рисунке 9.
84
Рисунок 9 – Алгоритм разделения Т-клеток на основе связывания
высокомолекулярного HA
Следующая серия экспериментов была посвящена фенотипическому
анализу НА+ и НА- клеток, который проводили по следующей схеме: МНПК
здоровых доноров, разделенные по способности связывать НА, метили
флуоресцентными AT к маркерам Treg-клеток и определяли их процентное
содержание в лимфоцитарном гейте с помощью проточной цитофлуориметрии.
Статистический непараметрический анализ, проведенный нами с
использованием критерия Уилкоксона для связанных выборок, показал, что
НА-связывающая фракция МНПК содержит достоверно больше Treg-клеток с
фенотипом СD4+СD25+, по сравнению с НА-несвязывающей фракцией. Так,
медиана содержания СD4+CD25+ клеток составила 9,9% (6,6%-12,6%) в НА+
фракции и 4,6% (3,3%-8,7%) в НА- фракции (р=0,03; n=9) (рисунок 10А).
Поскольку маркер CD25 может кратковременно экспрессироваться также
на активированных Th, выполняющих эффекторные функции, но не
регуляторных Т-клеток, для идентификации истинно Treg-клеток помимо
маркеров СD4 и CD25, мы использовали ядерный транскрипционный фактор
FoxP3 [308]. Оказалось, что при гейтировании СD4+CD25+ клеток, процент
FoxP3+ клеток, был значительно выше в НА+ фракции МНПК, чем в НА85
фракции (19,4% (8,7%-21,1%), 5,2% (4,0%-7,3%), p=0,04; n=9, соответственно)
(рисунок 10Б).
А
Б
Медиана, квартильный размах (25%, 75% процентили), размах (минимум,
максимум) содержания CD4+CD25+ (А) и СD4+СD25+FoxP3+ (Б), достоверность
отличий НА+ от НА- расчитана по критерию Уилкоксона.
Рисунок 10 – Содержание CD4+CD25+ и СD4+СD25+FoxP3+ Treg-клеток в
свежевыделенных НА+ и НА- фракциях МНПК здоровых доноров
Следующим шагом мы попытались выявить, коррелирует ли способность
связывать НА с супрессорной активностью Treg-клеток. Для оценки
супрессорной активности Treg-клеток применялся стандартный супрессорный
тест подавления пролиферации аутологичных Тcon-клеток, стимулированных
PHA, при совместном их кокультивировании. Субпопуляции Treg-клеток и
Tcon МНПК здоровых доноров (n=6) сортировали на основании свечения CD4PerCP и CD25-PE, используя FACSAria II. Стратегия сортинга СD4+CD25+ Tregклеток и СD4+CD25- представлена на рисунке 11. Затем, СD4+CD25+ Tregклетки подвергали позитивной селекции на связывание с НА по
вышеприведенному методу. Полученные в результате магнитной сепарации
НА+ и НА- фракции культивировали с CFSE-мечеными аутологичными Тconклетками в различных соотношениях и затем оценивали пролиферацию клетокмишеней с использованием проточной цитофлуориметрии.
86
Рисунок 11 – Сортинг СD4+CD25+ и СD4+CD25-субпопуляций Т-клеток
здоровых доноров
Как показали результаты исследования НА+ фракция Treg-клеток была
более супрессорной по сравнению с НА- фракцией. НА- Treg-клетки проявляли
супрессорную активность только в соотношении 5:1 (супрессор:эффектор) и не
влияли на пролиферацию Тcon-клеток в меньшей концентрации. В тоже время,
НА+ фракция Treg-клеток достоверно подавляла пролиферацию Тcon-клеток
даже в соотношение 1:1 (супрессор:эффектор) (рисунок 12).
87
М±SD (n=6) при *р≤0,005 и **р≤0,01 (по критерию Стьюдента).
Рисунок 12 – Оценка пролиферативной активности Тcon-клеток
в присутствии Treg-клеток, разделенных по связыванию с гиалуронаном
Ранее было показано, что около 1% наивных Т-лимфоцитов, выделенных
из лимфатических узлов, связывают растворимый НА без всякой стимуляции
[88, p.]. Ariel с соавт. показали, что около 5-15% свежевыделенных Тлимфоцитов ПК человека способны связываться с иммобилизованным на
пластике НА [303, p. 347]. Однако вопрос о существовании НА-связывающих
Treg-клеток в ПК здоровых доноров и больных с различной иммунопатологией
остается открытым. Данные, полученные нами, привели к заключению, что НАсвязывающая фракция МНПК здоровых доноров обогащена Тreg-клетками с
фенотипом CD4+CD25+FoxP3+, что свидетельствует о том, что значительная
часть циркулирующих Treg-клеток способна к НА-опосредованному роллингу
в нормальных физиологических условиях и, более того, такие клетки являются
функционально более активными, чем НА-несвязывающие Treg-клетки [309].
Можно предположить, что субпопуляция циркулирующих Treg-клеток,
способных связывать НА, в нормальных условиях участвует в поддержании
периферической иммуной толерантности к аутоантигенам.
Уровень синтеза и деградации НА значительно выше в строме опухолей,
чем в здоровых тканях. Было показано, что при прогрессирующем раке
аберрантный синтез НА опухолевыми клетками и его распад ведет к
88
формированию микроокружения, которое характеризуется патологической
аккумуляцией высокомолекулярного НА и его фрагментов, что способствует
дальнейшему злокачественному перерождению клеток и негативно влияет на
иммунокомпетентные клетки [307, p. 3197]. Ряд исследований выявил, что
злокачественная опухоль молочной железы содержит больше НА, чем
нормальная ткань молочной железы или ее доброкачественные
новообразования [310-312]. Взаимодействие НА с рецептором CD44 опосредует
миграцию Т-клеток, в том числе и Тreg-клеток, из крови в место воспаления
[302, p. 508]. Как уже отмечалось, Тreg-клетки подавляют противоопухолевый
иммунитет в микроокружении опухоли, что приводит к ускользанию опухоли
от иммунологического надзора, ее прогрессированию и метастазированию [3, p.
823]. Более того, нам удалось показать, что именно НА-связывающая
субпопуляция Тreg-клеток обладает наибольшим супрессорным потенциалом.
Основываясь на этих данных, мы можем заключить, что одна из причин
недостаточности противоопухолевого иммунитета при РМЖ может быть
связана, в том числе и с НА-связывающей субпопуляцией Treg-клеток, которая
активно привлекается к месту локализации опухоли и участвует в подавлении
иммунных реакций, направленных на уничтожение трансформированных
клеток.
Для проверки нашей гипотезы мы провели серию экспериментов по
разделению CD4+ клеток ПК здоровых доноров и больных РМЖ по
способности связывать НА и оценке супрессорной активности полученных
фракций.
Было обнаружено, что содержание СD4+ клеток, способных связывать НА,
было значительно выше у пациентов с РМЖ, чем у здоровых доноров и
составляло 14,8±8,3% и 6,5±2,6% (n=16) от всех СD4+ клеток в группах РМЖ и
здоровых доноров, соответственно (рисунок 13).
Примечание - данные представлены в виде М±SD при *р≤0,01 (по
критерию Стьюдента).
Рисунок 13 – Содержание НА+ и НА- клеток в CD4+ фракции МНПК
здоровых доноров и больных РМЖ (РМЖ)
89
Среди НА+ клеток как здоровых женщин, так и больных РМЖ, был
обнаружен больший процент Treg-клеток с фенотипами СD4+CD25+FoxP3+ и
СD4+FoxP3+ по сравнению с НА- фракцией (рисунок 14). В НА+ фракции
больных РМЖ (n=12) было выявлено достоверно больше СD4+CD25+FoxP3+ и
СD4+FoxP3+ клеток по сравнению с группой здоровых доноров (n=7) (рисунок
14).
Медиана и каждое индивидуальное зачение содержания СD4+СD25+FoxP3+
(А) и СD4+FoxP3+ (Б), достоверность различий между НА+ и НА- фракциями
при +р≤0,01 и ++р≤0,05 (по критерию Уилкоксона); между группами доноров
при *р≤0,01 и **р≤0,05 (по критерию Стьюдента).
Рисунок 14 – Содержание СD4+СD25+FoxP3+ и СD4+FoxP3+ Treg-клеток
в НА+ и НА- фракциях МНПК здоровых доноров и больных РМЖ (РМЖ)
90
Таким образом, мы можем заключить, что при РМЖ происходит
увеличение содержания циркулирующих СD4+CD25+FoxP3+ и СD4+FoxP3+
Treg-клеток, способных связывать НА.
Как было отмечено выше, экспрессия СD39 ассоциирована с супрессорной
активностью Treg-клеток. Каталитическая инактивация поверхностного ATP
молекулой CD39 является одним из ключевых противовоспалительных
механизмов Treg-клеток. Более того, последние исследования показали особую
роль СD4+CD25+CD39+ Treg-клеток в патогенезе рака. Увеличение экспрессии
CD39+ на Treg-клетках при злокачественных образованиях и ее прямая
корреляция с прогрессированием рака выявлены рядом работ [258, p. 4].
Учитывая важность данной молекулы, мы исследовали ее экспрессию на
+
СD4 CD25+ Treg-клеток НА+ и НА- фракций. Цитофлуорометрический анализ
не выявил статистических различий в относительном содержание CD39+ клеток
в СD4+CD25+ гейте между НА+ и НА- фракциями здоровых доноров (Ме=11,9%
(3,5%-18,2%), Ме=18,8% (9,8%-22,9%), соответственно, p=0,07, критерий
Уилкоксона, (n=7)) и в группе больных РМЖ (Ме=27,2% (19,2%-36,8% в НА+ и
Ме=22,3% (17,1%-33,7%) в НА-, р=0,3, критерий Уилкоксона (n=12)) (рисунок
15). Проведенный нами анализ установил, что экспрессия CD39+ была
значительно выше на НА+СD4+CD25+ Treg-клетках, полученных от пациенток с
РМЖ, чем на той же субпопуляции Treg-клеток, полученной от здоровых
доноров (рисунок 15). Не понятно, индуцирует ли экспрессию CD39 на Tregклетках связывание с НА, но, можно предположить, что показанная рядом
работ аккумуляция СD4+CD25+CD39+ Treg-клеток в строме опухоли может
быть опосредована НА-зависимой миграцией [313].
91
A - репрезентативные данные
Б - отображены медианы и индивидуальные зачения с достоверностью
различий при *р≤0,01 (по критерию Стьюдента).
Рисунок 15 – Содержание СD4+СD25+СD39+ Treg-клеток
в НА+ и НА- фракциях Т-клеток здоровых доноров и больных РМЖ (РМЖ)
Далее мы изучали фенотип НА+ и НА- Тreg-клеток после стимуляции TCR
рецепторов. Для этого CD4+ T-клетки, полученные в результате негативной
селекции из ПК здоровых женщин (n=7) и больных РМЖ (n=12), разделяли на
НА+ и НА- фракции и затем стимулировали TSI в течение ночи и анализировали
на проточном цитофлуориметре.
В результате проведенных экспериментов выяснилось, что в обеих
исследуемых группах повышенное содержание CD4+СD25+FoxP3+ клеток в НА+
фракции сохранялось после 18 ч. активации. Так, доля клеток, позитивных по
92
экспрессии CD4, СD25 и FoxP3, составляла 10,1% (5,3%-20,3%) в НА+ фракции
и 2,8% (2,0%-3,3%) в НА- фракции у здоровых доноров, р=0,03 по критерию
Уилкоксона; 5,9% (5,0%-10,2%) в НА+ фракции и 3,8% (3,3%-6,0%) в НАфракции в группе РМЖ, р=0,004, критерий Уилкоксона (рисунок 16).
Полученные нами данные согласуются с ранее опубликованными
результатами исследования группы A.G. Levine и соавт., которая показала, что
пул индуцированных CD4+ T-клеток содержит две популяции Treg-клеток:
«подобные наивным» – CD44loCD62Lhi и «подобные эффекторным», с
фенотипом CD44hiCD62Llo [314]. Из этого можно предположить, что переход в
активированное состояние индуцируется в тимусе и на периферии в ходе
стимуляции TCR рецептора, предпочтительнее аутоантигенами [315]. Тем не
менее, являются ли CD44hiCD62Llo Treg-клетки аутореактивными остается не
известным.
Ранее был описан вклад CD4+FoxP3+ субпопуляции клеток в развитие рака
и негативное влияние данных клеток на противоопухолевую терапию [316].
Анализ, проведенный нами показал, что большая часть циркулирующих
CD4+FoxP3+-клеток способна связывать HA и доля таких клеток увеличена в
ПК больных РМЖ. Также, CD4+ T-клетки экспрессируют FoxP3 в
независимости от CD25. Мы можем заключить, что при РМЖ большее
количество индуцированных Treg-клеток, включающих больший процент
CD4+CD25-FoxP3+, чем CD4+CD25+FoxP3+-клеток, потенциально способны к
HA-индуцированной адгезии и к более быстрой миграции в опухолевое
микроокружение, где данные клетки могут подавлять иммунный ответ [317].
93
2,6%
3,8%
А - репрезентативные данные
Б - обобщенные данные, показывающие каждое индивидуальное значение,
достоверность отличий между НА+ и НА- +р≤0,001 и ++р≤0,05 (по критерию
Уилкоксона)
Рисунок 16 – Содержание СD25+FoxP3+ и FoxP3+ Treg-клеток
в НА+ и НА- фракциях СD4+-клеток здоровых доноров и больных РМЖ
(РМЖ)
Для изучения функциональной активности Тregs, разделенных по
связыванию НА, оценивали экспрессию эффекторных молекул (CTLA-4, LAP,
GITR) и продукцию супрессорных цитокинов (TGF-β, IL-10 и IL-35) данными
клетками. Для этого CD4+ T-клетки, полученные в результате негативной
селекции из ПК здоровых женщин (n=7) и больных РМЖ (n=12), разделяли на
94
НА+ и НА- фракции, стимулировали TSI 18 ч., после чего клетки метили АТ к
CD25, FoxP3, CTLA-4, LAP, GITR, TGF-β, IL-10, IL-35 и анализировали на
проточном цитофлуориметре. Мы выделяли гейт клеток с фенотипом
CD4+СD25+FoxP3+ и CD4+FoxP3+, где оценивали экспрессиию супрессорных
маркеров и цитокинов. Результаты исследования представлены на рисунке 17 и
18.
Нами было обнаружено, что в CD4+FoxP3+НА+ фракции клеток здоровых
доноров количество CTLA-4-экспрессирующих клеток было значительно
больше по сравнению с CD4+FoxP3+НА- субпопуляцией (21,4±6,2%; 9,9±6,2%;
р=0,04 (по критерию Стьдента), n=7, соответственно) (рисунок 17). Однако, мы
не выявили отличий в эспрессии CTLA-4 между НА+ и НА- фракциями
CD4+СD25+FoxP3+-клеток здоровых доноров, как и CD4+СD25+FoxP3+- так и
CD4+FoxP3+-клеток в группе больных РМЖ. К тому же не было выявлено
достоверной разницы между двумя группами доноров.
M±SD при *р=0,04 (по критерию Стьюдента).
Рисунок 17 – Анализ индуцированной экспрессии CTLA-4 на НА+ и НАСD4+СD25+FoxP3+ и СD4+FoxP3+ Treg-клеток здоровых доноров и больных
РМЖ (РМЖ) после 18 ч инкубации в присутствии TSI
Как уже отмечалось, молекула CTLA-4 является одним из основных
маркеров супрессорной активности Тreg-клеток. Предположительно, в
физиологических условиях, молекула CTLA-4, экспрессированная на Тregклетках предотвращает патологическую активацию наивных T-лимфоцитов и
повышенный уровень экспрессии CTLA-4 на HA+ Treg-клетках подразумевает
важность данной субпопуляции в поддержании иммуной толерантности в
тканях и органах.
Мы не обнаружили статистически существенных различий в экспрессии
LAP, GITR, TGF-β, IL-10 и IL-35 между НА+ и НА- фракциями, а также между
исследуемыми группами доноров (рисунок 18).
95
M±SD, процента клеток, позитивных по экспрессии TGF-β, IL-35, LAP, IL10 и GITR в CD4+CD25+FOXP3+ (A) и CD4+FOXP3+ (Б) гейтах в виде
отклонений.
Рисунок 18 – Сравнительный анализ индуцированной экспрессии
мембранных маркеров и супрессорных цитокинов на НА+ и НА- Tregклеток здоровых доноров и больных РМЖ
Суммируя вышесказанное, нами был разработан новый метод физического
разделения клеток периферической крови человека на фракции, связывающие и
не связывающие молекулы высокомолекулярного HA, главного компонента
внеклеточного матрикса. Данный подход позволил изучить субпопуляцию
Treg-клеток, потенциально способную к адгезии внеклеточного матрикса и
миграции в опухолевое микроокружение. Проведя исследование мы можем
заключить, что в норме в иммунной системе генерируются Treg-клетки,
которые интенсивно связываются с иммобилизованным высокомолекулярным
HA. Способность связывать НА дискриминирует субпопуляцию Treg-клеток,
обладающих повышенной супрессорной активностью и степенью экспрессии
CTLA-4 после активации в условиях in vitro. Назначение HA-связывающих
Treg-клеток в норме не ясно. Данная субпопуляция циркулирующих Tregклеток, возможно, является ранее активированной, и присутствие таких клеток
96
в периферической крови в норме свидетельствует об их роли в поддержании
иммунологической толерантности к аутоантигенам. При раке молочной железы
отмечено повышение абсолютного количества HA-связывающих Treg-клеток в
ПК и увеличение экспрессии эктонуклеотидазы CD39 в данной субпопуляции
Treg-клеток. Увеличение количества циркулирующих HA-связывающих Tregклеток свидетельствует о повышенной активности Treg-клеток при РМЖ. Более
того, можно предположить, что именно HA опосредует миграцию и
аккумуляцию иммуносупрессорных CD39+ Treg-клетолк в микроокружении
опухоли, которое, согласно литературным данным, характеризуется
повышенным содержанием высокомолекулярного НА и его фрагментов.
Однако, данная гипотеза должна быть подтверждена исследованиями большего
числа больных на различных стадиях заболевания с тем, чтобы установить ее
терапевтическую значимость.
Обобщая все сказанное в подразделе 3.1, можно сделать вывод о том, что
увеличение
количества
и
функциональной
активности
различных
субпопуляций Treg-клеток, скорее всего, является комплексным феноменом,
включающим различные механизмы, в том числе и влияние самих опухолевых
клеток, цитокинового и хемокинового окружения и др. Аккумулирование
большого числа Treg-клеток в опухолевом микроокружении является
результатом не только активной индукции образования и миграции уже
существующего пула nTreg-клеток из ПК, но и активной индукции iTregклеток. Таким образом, ориентация на тимус-образованные и опухольиндуцированные Treg-клетки в иммунотерапии рака является весьма
перспективным направлением.
3.2 Изучение регуляторных субпопуляций NK-клеток в норме и при
раке молочной железы
3.2.1 Изучение экспрессии IL-10 и TGF-β NK-клетками здоровых доноров
и больных РМЖ
Согласно современной концепции иммунологии, цитокины играют
важную роль в развитие злокачественных новообразований, модулируя
активность иммунных клеток. IL-10 и TGF-β являются иммунорегуляторными
цитокинами, обладающими противовоспалительными и супрессорными
свойствами. Как уже неоднократно отмечалось, уровень данных цитокинов
увеличен в сыворотке и опухолевой ткани при РМЖ [318] и используется в
качестве маркера прогрессии заболевания [319]. Продукция IL-10 коррелирует
с Т-клеточной анергией и, совместно с TGF-β, считается одним из основных
иммуносупрессорных факторов, продуцируемых опухолевыми клетками [1, p.
298]. Ранее было показано, что у трансгенных мышей, с нокдауном гена IL-10,
наблюдалась повышенная элиминация опухоли и выживаемость, по сравнению
с контрольными животными [320]. Известно, что IL-10 ингибирует
пролиферацию, активацию, продукцию цитокинов и цитотоксичность NKклеток. Эндогенный и экзогенный TGF-β подавляет цитотоксичность, секрецию
IFN-γ и экспрессию NKG2D и NKp30 на NK-клетках [321, 322].
97
Регуляторную и супрессорную функцию NK-клеток традиционно
связывают с цитокиновой продукцией [7, p. 461]. Так, ранее в норме была
описана продукция IL-10 и TGF-β малочисленными популяциями NK-клеток
[323, 324]. IL-10-продуцирующие NK-клетки были охарактеризованы как
иммуносупрессорные, т.к. они подавляли пролиферацию и продукцию IFN-γ
АГ-специфическими Т-лимфоцитами. Данная субпопуляция NK-клеток
экспрессировала повышенный уровень мРНК IL-10, низкий уровень мРНК
TGF-β и IL-13 и не экспрессировала IFN-γ [10, p. 855]. M. Giuliani с соавт.
получили в условиях in vitro регуляторные NK-клетки (NKPSG), которые
секретировали супрессорные цитокины, в том числе и IL-10 [9, p. 13-15]. Кроме
этого, увеличенный процент IL-10-секретирующих NK-клеток был показан в
ПК и децидуальной оболочке на ранних стадиях беременности, в сравнении со
случаями спонтанных абортов [8, p. 5] и у женщин во время фолликулярной
фазы овариального цикла [325]. Эти данные свидетельствуют о наличие
регуляторных свойств IL-10-секретирующих NK-клеток и их участии в
обеспечении иммунной толерантности к плоду. Тем не менее, IL-10- и TGF-βпродуцирующие NK-клетки при раке до сих пор не были изучены.
Хорошо известна роль IL-15 в развитии, активации, дифференциации и
пролиферации NK-клеток [326]. Ранее было показано, что гемопоэтические
предшественники
CD34+
ПК
экспрессируют
mb-IL-15,
который
транспрезентируется и запускает программу дифференцировки данных клеток
по пути NK. К тому же, образование NKPSG-клеток в условиях in vitro зависело
от mb-IL-15, и данные клетки экспрессировали mb-IL-10 [9, p. 7, 9].
Учитывая вышесказанное, мы решили проверить, сохраняется ли
экспрессия mb-IL-15 в циркулирующих NK-клетках и наличие mb-IL-10 на
мембране данных клеток здоровых доноров. Мы также исследовали экспрессию
mb-TGF-β NK-клетками, по аналогии с Treg-клетками, которые, по
литературным данным, осуществляют свои супрессорные функции, в том
числе, за счет mb-TGF-β [133, p. 7313].
В ходе исследования, мы не обнаружили экспрессии mb-IL-15 среди
свежевыделенных NK-клеток здоровых доноров (данные не представлены).
Также не было выявленно статистически значимых изменений уровня mb-IL-15
после стимуляции NK-клеток PHA, IL-2, IL-15Rα по отдельности или в их
комбинациях (данные не представлены). Используя поверхностное мечение АТ,
мы обнаружили небольшое количество mb-IL-10- (рисунок 19) и mb-TGF-βэкспрессирующих NK-клеток здоровых доноров (1,6±1,1%, n=17; 2,1±1,0%,
n=9, соответственно).
IL-2 один или в комбинации с PHA (n=5) не увеличивал процент mb-IL-10+
NK-клеток выше порогового уровня. При этом, наблюдалось значительное
увеличение количества mb-IL-10+ NK после 18 ч. стимуляции PHA, по
отношению к нестимулированным NK-клеткам (3,7±1,5%; 2,3±0,8%; p=0,006,
n=15, соответственно) (рисунок 19). Для изучения стимуляции экспрессии mbTGF-β NK-клетками здоровых доноров мы применяли только PHA и
обнаружили, что инкубация с PHA достоверно увеличивает процент mb-TGF-β+
NK-клеток (3,9±1,3%; 2,0±0,7%; p=0,007, n=8, соответственно). Следует
98
отметить, что мы не применяли метод кислотных смывов для изучения mb-IL10 и mb-TGF-β на NK-клетках, поэтому остается неясным, заякорены ли данные
цитокины непосредственно через мембрану или связаны с рецепторами к
данным цитокинам.
Было также исследовано влияние РНА и IL-2 на экспрессию
внутриклеточных цитокинов: i-IL-10 и i-TGF-β. По палученным нами данным,
стимуляция NK-клеток IL-2 или его комбинацией с PHA не влияла
статистически на процент ни i-IL-10+, ни i-TGF-β+ (n=5). В то же время РНА
достоверно увеличивал количество данных клеток по отношению к
нестимулированным культурам (5,9±2,4%; 3,0±0,8%; p=0,0001, n=18; 4,8±2,4%;
2,7±1,1%; p=0,01, n=13; соответственно) (рисунок 19).
БС - без стимуляции, IL-2 - после инкубации с IL-2, РНА - после
инкубации с РНА, РНА+IL-2 - после инкубации с IL-2 и РНА;
M±SD, достоверность различий рассчитана по критерию Стьюдента.
Рисунок 19 – Анализ содержания mb-IL-10+, i-IL-10+ и iTGF-β+ NK-клеток
МНПК здоровых доноров без стимуляции, после инкубации с IL-2, РНА и
комбинации IL-2 и РНА
Учитывая роль IL-10 и TGF-β в регуляции иммунного ответа и показанную
ранее супрессорную активность IL-10- и TGF-β-экспрессирующих NK-клеток
здоровых доноров [10, p. 855], мы исследовали данные субпопуляции в ПК
больных РМЖ на разных стадиях заболевания.
В ходе исследования нами было обнаружено, что свежевыделенные
мононуклеарные клетки ПК больных РМЖ содержат в сравнении со здоровыми
женщинами повышенный процент CD3-CD56+-клеток (12,9±5,6, n=20; 7,2±2,4,
n=12; p=0,0007, соответственно) (рисунок 20).
99
А - репрезентативные данные
Б - обобщены данные с медианными значениями, каждая точка отражает
каждое индивидуальное значение при *р≤0.0007 (по критерию Стьюдента).
Рисунок 20 – Содержание циркулирующих NK-клеток здоровых доноров и
больных РМЖ (РМЖ)
У больных РМЖ процент циркулирующих i-IL-10+ и mb-IL-10+ NK-клеток
оказался также достоверно выше по сравнению с группой здоровых женщин
(6,4±2,0%, n=20; 3,7±1,2%, n=12; p=0,0001; 3,7±1,2%; n=20; 1,6±1,1%; n=17;
p˂0,0005, соответственно) (рисунок 21).
100
А - репрезентативные данные
Б - M±SD, достоверность различий между группами при *р≤0,0005,
**р≤0,005 и ***р≤0,05 (по критерию Стьюдента).
Рисунок 21 – Содержание i-IL-10+ и mb-IL-10+ NK-клеток здоровых
доноров и больных РМЖ (РМЖ) среди свежевыделенных (СВ) МНПК и после
их инкубации без стимуляции (БС) и в присутствие РНА (РНА)
Количество IL-10-экспрессирующих CD3-CD56+ клеток было оценено
нами после 18 ч. стимуляции РНА. Полученные результаты показали, что РНА
значительно усиливает экспрессию i-IL-10 NK-клетками больных РМЖ, в
сравнении с нестимулированными клетками (12,0±2,5%, 6,2±2,5%, n=15;
p˂0,0001, соответственно), аналогично здоровым донорам. Также наблюдалось
увеличение уровня mb-IL-10+ NK-клеток в группе больных РМЖ в ответ на
воздействие РНА, в сравнении с нестимулированными клетками (7,5±2,0%;
5,3±1,6%, n=18; p=0,004, соответственно). При этом РНА-активированных NKклеток, экспрессирующих i-IL-10 и mb-IL-10 было значительно больше у
больных РМЖ по сравнению со здоровыми донорами (рисунок 21). Мы не
обнаружили статистически значимой зависимости экспрессии IL-10 NK101
клетками от стадии заболевания РМЖ, как в свежевыделенных, так и в
активированных МНПК.
Как показано на рисунке 22, количество NK-клеток ПК, экспрессирующих
i-TGF-β, было повышено у больных РМЖ в сравнении со здоровыми
женщинами (6,4±2,0%, n=20; 3,7±1,2%, n=12; p=0,0001, соответственно).
Стимуляция РНА повышала количество NK-клеток, экспрессирующих i-TGF-β,
в группе больных РМЖ (8,6±2,7%, 6,3±2,6%, n=18; p˂0,02, соответственно),
также как и в группе здоровых женщин. При этом увеличенный процент i-TGFβ+ NK в группе больных по отношению к группе здоровых женщин сохранялся
и после стимуляции РНА (рисунок 22).
А - репрезентативные
Б - обощенные данные в виде M±SD с достоверностью различий между
группами: *р≤0,0005, **р≤0,005 и ***р≤0,05 (по критерию Стьюдента).
Рисунок 22 – Содержание i-TGF-β+ и mb-TGF-β+ NK здоровых доноров и
больных РМЖ (РМЖ) среди свежевыделенных (СВ) МНПК и после их
инкубации без стимуляции (БС) и в присутствие РНА (РНА)
102
Мы не обнаружили в группе больных достоверного увеличения mb-TGF-β+
NK-клеток после стимуляции РНА. Несмотря на это, в сравнении с группой
здоровых женщин, в группе больных РМЖ был обнаружен больший процент
mb-TGF-β+ NK-клеток как среди свежевыделенных МНПК, так и после их
инкубации без стимуляции и в присутствие РНА (p=0,0001; p=0,0003; p=0,004,
соответственно) (рисунок 22). Мы не выявили статистически значимых
различий в количестве NK-клеток, экспрессирующих i-TGF-β и mb-TGF-β
между возрастными группами и группами больных на различных стадиях
РМЖ, как до, так и после стимуляции (данные не представлены).
ELISPOT анализ был использован нами как альтернативный метод для
анализа секреции IL-10 и TGF-β NK-клетками. Количество IL-10- и TGF-βсекретирующих NK-клеток было в среднем в 2,5 и 18,6 раза выше,
соответственно, в группе РМЖ, по сравнению со здоровыми донорами (n=2)
(рисунок 23).
Рисунок 23 – Анализ количества IL-10- (А) и TGF-β-секретирующих (Б)
NK-клеток ПК здоровых доноров и больных РМЖ (РМЖ), активированных
РНА
Цитокин-продуцирующие NK-клетки традиционно относят к CD56bright
субпопуляции NK. CD56bright NK были ранее охарактеризованы как CD57незрелые клетки. По литературным данным, маркер CD57 экспрессируется
CD56dim NK-клетками на завершающей стадии созревания. CD57+ NK
характеризуются наибольшей цитотоксической активностью, высокой
103
восприимчивостью на активацию CD16 и натуральных цитотоксических
рецепторов (NCRs), но при этом, обладают низким ответом на действие
цитокинов и пролиферативной активностью [327].
Для уточнения фенотипа IL-10+ и TGF-β+ NK-клеток мы анализировали
экспрессию CD57 данными клетками. В группе здоровых женщин, большая
часть mb-IL-10+ NK-клеток находилась в CD57- гейте, тогда как i-IL-10+ NK не
были ассоциированы ни с CD57-, ни с CD57+ фенотипом. Аналогичное
распределение клеток было обнаружено в группе больных РМЖ (рисунок 24).
M±SD с достоверностью различий между CD57+ и CD57- при ×р˂0.01,
××
р˂0,05 (по критерию Уилкоксона) и между группами доноров при *р≤0,0005,
**р≤0,005 и ***р≤0,05 (по критерию Стьюдента).
Рисунок 24 – Содержание i-IL-10+ (А) и mb-IL-10+ (Б) NK ПК здоровых
доноров (n=9) и больных РМЖ (РМЖ) (n=19) в CD57+ и CD57- субпопуляциях
NK-клеток
В группе здоровых доноров и больных РМЖ большая часть mb-TGFβ+ NKклеток имела незрелый фенотип (CD57-), тогда как количество i-TGF-β+-клеток
не различалось между CD57+ и CD57- субпопуляциями NK-клеток (рисунок.
25).
104
M±SD с достоверностью различий между CD57+ и CD57- при ×р˂0,01,
××
р˂0,05 (по критерию Уилкоксона) и между группами доноров при *р≤0,0005,
**р≤0,005 и ***р≤0,05 (по критерию Стьюдента).
Рисунок 25 – Содержание i-TGF-β+ (А) и mb-TGFβ+ (Б) NK ПК здоровых
доноров (n=9) и больных РМЖ (РМЖ) (n=19) в CD57+ и CD57- субпопуляциях
NK-клеток
Следует отметить, что увеличение процентного содержания mb-IL-10+, iIL-10+, mb-TGFβ+ и i-TGF-β+ NK-клеток было выявлено как среди CD57+, так и
CD57- субпопуляций NK-клеток в группе больных РМЖ по сравнению с
группой здоровых женщин (рисунки 24 и 25). Необходимо отметить, что мы не
обнаружили различий в общем содержании CD57+ NK-клеток как между
группами больных и здоровых, так и в обеих данных группах до и после
активации РНА (данные не представлены). Таким образом, NK-клетки ПК
больных РМЖ содержат повышенный процент IL-10- и TGF-βэкспрессирующих NK-клеток и NK-клеток, приобретающих данную
способность при митогенной стимуляции.
Регуляторные субпопуляции NK-клеток мало изучены, также, как и
стимулы, активирующие данные клетки. В нашем исследовании мы хотели
изучить, различаются ли способности IL-10- и TGF-β-экспрессирующих NKклеток отвечать на стимулы у больных РМЖ и здоровых доноров. Известно,
что поликлональная стимуляция вызывает активацию и усиление
пролиферации NK-клеток. Ранее было показано, что уже после 2 ч стимуляции
РНА в сочетании с IL-2 продукция IL-10 и экспрессия мРНК IL-10 в NKклетках повышается [10, p. 853]. PHA индуцирует NK-клетки за счет
неспецифического связывания с гликолизированными рецепторами, что ведет к
активации клеток [328]. По полученным нами данным, РНА увеличивает
процент IL-10- и TGF-β-экспрессирующих NK-клеток как здоровых доноров,
так и больных РМЖ. Необходимо отметить, что процент данных клеток был
значительно выше в группе больных РМЖ по сравнению со здоровыми
105
женщинами, что свидетельствует о повышенной способности регуляторной
субпопуляции NK больных отвечать на митогенную стимуляцию. Кроме того,
повышенная доля IL-10- и TGF-β-экспрессирующих NK больных РМЖ была
выявлена как среди CD57+, так и CD57- субпопуляций NK. Возможно, что не
только незрелые CD57- NK-клетки, но и небольшая часть зрелых CD57+ NK
приобретают цитокин-продуцирующую способность при развитие РМЖ.
Как уже было отмечено выше, негативная роль IL-10 и TGF-β в развитии
онкологических заболеваний не была однозначно доказана; данные цитокины
могут проявлять как про-, так и противоопухолевые эффекты. Полученные
нами данные не исключают паракриннго или аутокринного влияния IL-10 и
TGF-β, продуцированных NK-клетками и их ингибиторного или
активирующего влияния на противоопухолевый иммунитет [329]. В
дальнейшем нами планируется провести дополнительные исследования для
уточнения механизмов влияния данных субпопуляций на развитие
злокачественных новообразований. Но, исходя из преобладания фактов в
литературе, свидетельствующих об ингибирующем влиянии данных цитокинов
на противоопухолевый иммунитет [320, p. 11], эффекторные функции NKклеток [330], а также супрессорные свойства IL-10+ NK против антигенспецифических Т-клеток [10, p. 855], на данном этапе мы можем предположить,
что IL-10+ и TGF-β+ NK-клетки участвуют в создание супрессорного фона в
опухолевом микроокружении и, тем самым, могут приводить к ускользанию
опухолевых клеток от иммунного надзора.
3.2.2 Изучение HLA-G+ NK-клеток здоровых доноров и больных РМЖ
Как уже было отмечено, супрессорная субпопуляция NKPSG была получена
в условиях in vitro из CD34+ гемопоэтических прогениторных клеток ПК,
экспрессирующих mb-IL-15. NKPSG имели зрелый фенотип, секретировали
супрессорные цитокины, экспрессировали HLA-G и не обладали
цитолитической активностью. NKPSG ингибировали толерогенные DC и
цитотоксическую активность NK-клеток ПК с помощью HLA-G1 и
секретируемого IL-10 [9, p. 13]. Более того, было показано, что NK-клетки
способны к трогоцитозу HLA-G. В ходе кратковременного межклеточного
взаимодействия с опухолевой линией, трансфектной по гену HLA-G1, NKклетки ПК человека и NK-клеточная линия, активированные IL-2, приобретают
мембранные фрагменты HLA-G1, теряют свою цитотоксичность и становятся
супрессорными, подавляя NK-клеточную цитотоксичность. Супрессия
цитотоксичности NK-клеток напрямую зависела от взаимодействия между
HLA-G1 со своим рецептором ILT2 на эффекторных NK. Блокада или потеря
молекул HLA-G1 полностью восстанавливала эффекторные свойства и
вызывала потерю супрессорных фукции NK-клеток [226, p. 1423]. Как уже
было отмечено выше, аберрантная экспрессия HLA-G опухолевыми клетками
является одним из ключевых механизмов ускользания от иммуного надзора.
Как растворимые, так и мембран-связанные изоформы способны связываться с
рецепторами NK-клеток (KIR2DL4, NKG2A, ILT2, CD160) и приводить к
инактивации эффекторной активности NK-клеток. Ранее было показано, что
106
взаимодействие с HLA-G приводит к подавлению лизиса клеток-мишений NKклетками и продукции IFN-γ [331, 332]. Более того, HLA-G влияет на секрецию
провоспалительных и иммуносупрессорных цитокинов NK-клеток ПК и NK,
находящихся в децидуальной оболочке [333-335] и, более того, может
приводить к киллингу аутологичных NK-клеток [336]. Учитывая
вышесказанное, мы исследовали наличие потенциально супрессорных NKклеток ПК, экспрессирующих HLA-G, которые могут участвовать в подавление
цитотоксичности NK [337].
Мы обнаружили, что свежевыделенные NK-клетки ПК содержат
минорную популяцию, конститутивно экспрессирующую HLA-G на клеточной
мембране, составляющую в среднем 4,5% от всех NK-клеток (диапазон 2,8%6,6%; n=11) (рисунок 26А и 27). Ни уровень экспрессии, ни количество HLA-G+
NK не были ассоциированны с возрастом или полом доноров (данные не
представлены).
Для проверки специфичности иммуноокрашивания, мы проверили
связывание АТ против HLA-G, меченных PE и APC на моноцитах ПК, так как
их экспрессия HLA-G была ранее неоднократно показана [252, p. 805]. Данные
проточной цитофлуориметрии дали позитивные результаты по поверхностному
(рисунок 26А) и внутриклеточному мечению в CD14+ и CD3-CD56+ гейтах
МНПК (n=2). В дополнение к этому, мы доказали экспрессию мРНК мембрансвязанной изоформы HLA-G1 в NK-клетках здоровых доноров в ПЦР анализе
(n=3) (рисунок 26Б).
Таким образом, в нашем исследовании мы впервые обнаружили
экспрессию HLA-G1 NK-клетками ПК здоровых доноров. Ранее группа
исследователей во главе с M.Giuliani сообщили о том, что около 4% NK-клеток
плаценты экспрессируют HLA-G. Группа не обнаружила HLA-G+ NK-клеток в
ПК беременных женщин [9, p. 11]. Возможно, что малочисленная субпопуляция
NK, констуитивно экспрессирующая молекулу HLA-G, может мигрировать в
область плаценты [338] для обеспечения материнской иммуной толерантности
к плоду [339], что может объяснять отсутсвие данных клеток в ПК во время
беремености. Также, используя Western blot анализ, исследователи не выявили
ни растворимой, ни мембран-связанной изоформы HLA-G в NK-клетках ПК
контрольной группы. Мы можем предположить, что количество HLA-G+ NKклеток было недостаточным для их детекции методом Western blott, вследствие
чего, группа M.Giuliani с соавт. не обнаружила данные клетки в ПК здоровых
доноров. В то же время, более чувствительным методом ПЦР анализа мы
доказали экспрессию мРНК HLA-G1 NK-клетками ПК, что исключает
приобретение молекул HLA-G от других клеток через трогоцитоз, описанный
ранее [226, p. 1423], или детекцию HLA-G, связанного с рецепторами на
поверхности NK.
107
А - репрезентативные данные экспрессии HLA-G1 на CD14+- и CD3-CD+клетках ПК, а также их изотипические и FMO контроли, анализируемые
методом проточной цитофлуориметрии
Б - ПЦР-анализа м-РНК HLA-G1 в NK-клетках; моноциты и CD8+ клетки
использовались в качестве позитивных контролей, В-клетки – в качестве
негативного контроля.
Рисунок 26 – Анализ экспрессии HLA-G NK-клетками здоровых доноров
Далее, для изучения стимула, индуцирующего экспрессию мембранассоциированного HLA-G на NK-клетках, мы изучали влияние PHA и IL-2 или
их комбинации. Мы обнаружили, что PHA повышает в 2 раза количество HLAG-экспрессирующих NK по отношению к нестимулированным клеткам
(8,8±2,3%; 4,1±0,9%; p˂0,0001, n=10, соответственно), в то время как эффект
108
PHA в комбинации с IL-2 был незначительно ниже (7,4±2,5%, p=0,04, n=10), а
IL-2 в отдельности, не влиял на экспрессию HLA-G (рисунок 27). Таким
образом, HLA-G является стабильным фенотипическим маркером
малочисленной субпопуляции NK-клеток, и экспрессия молекул HLA-G
повышается при митогенной стимуляции.
СВ – свежевыделенные МНПК, БС - без стимуляции, IL-2 - после
инкубации с IL-2, РНА - после инкубации с РНА, РНА+IL-2 - после инкубации
с IL-2 и РНА, представленны M±SD с достоверностью различий при: *р≤0,0005
и **р≤0,005 - (по критерию Стьюдента).
Рисунок 27 – Анализ содержания HLA-G+ NK-клеток здоровых доноров
среди свежевыделенных МНПК без стимуляции, после инкубации с IL-2, РНА
и комбинации IL-2 и РНА
Moreau с соавт. показали ранее, что экзогенный IL-10 селективно
индуцирует экспрессию HLA-G в трофобластах и моноцитах человека [252, p.
805]. Из полученных нами данных видно, что митогенная стимуляция NKклеток повышает количество как HLA-G+, так и IL-10+ NK. Мы проверили,
опосредуется ли индукция экспрессии HLA-G NK-клетками эндогенным IL-10,
секретируемым данными клетками. Для этого, отсортированные NK здоровых
доноров инкубировали в ПКС в течение 1 и 2 дней без стимуляции и в
присутствие РНА. Для элиминации влияния IL-10 к клеточным культурам
добавляли блокирующие АТ против IL-10 (10 мкг/мл). Мы не обнаружили
достоверной разницы в проценте HLA-G+ NK-клеток между культурами с
блокирующими IL-10 АТ и без них (данные не представлены). Из этого мы
можем заключить, что IL-10, продуцируемый в ответ на митогенную
стимуляцию, не участвует в ауторегуляции HLA-G в NK-клетках.
109
Ранее было показано, что HLA-G-экспрессирующие NK-клетки
децидуальной оболочки и генерированные in vitro секретируют IL-10 [9, p. 10].
Более того, супрессорный эффект HLA-G+ T-регуляторных клеток зависел от
секреции данными клетками IL-10 [179, p. 278]. Исходя из этого, мы
исследовали цитокиновый профиль CD3-CD56+HLA-G+ клеток после 18 ч
стимуляции NK-клеток PHA для того, чтобы проанализировать все HLA-Gэкспрессирующие NK-клетки. Также к культурам добавляли Brefeldin A для
предотвращения эксфлюкса цитокинов в среду. Мы обнаружили, что
активированные HLA-G+ NK-клетки экспрессируют IL-10, TGF-β и IFN-γ
(4,4±2,0%, 3,0±1,8% и 2,7±2,3% в пересчете на общее количество
гейтированных клеток; n=6, соответственно). Субпопуляция HLA-G+ NK
содержала около 55% IL-10+, 66% TGF-β+ и 35% IFN-γ+ от всех NK-клеток.
Таким образом, HLA-G-экспрессирующая субпопуляция NK обогащена TGF-βпродуцирующими и низким количеством IFN-γ-продуцирующих клеток по
сравнению с HLA-G- NK (рисунок 28).
M±SD с достоверностью различий при *р≤0,0005 и **р≤0,005 (по
критерию Стьюдента).
Рисунок 28 – Анализ содержания IL-10+, TGF-β+ и IFN-γ+ клеток среди
HLA-G+ и HLA-G- субпопуляций NK-клеток здоровых доноров
Ингибиторный эффект молекулы HLA-G на эффекторные функции NKклеток
и продукция
HLA-G+
субпопуляцией
NK
потенциально
толерогенных/иммуносупрессорных цитокинов позволили нам предположить
участие
данной
субпопулиции
в
регулирование
NK-клеточной
цитотоксичности. Для проверки данной гипотезы отсортированные HLA-G+ и
HLA-G- NK-клетки здоровых доноров проверяли в цитолитическом тесте
против клеточной линии К562. Для этого свежевыделенные МНПК здоровых
110
доноров сортировали на основании свечения CD3-FITC-CD56-PerCP-Cy5.5+.
Затем клетки инкубировали ночь в присутствие РНА, метили HLA-G-PE и
сортировали HLA-G+ и HLA-G- субпопуляции, используя FACSAria II. Данные
сортинга клеток представлены на рисунке 29.
Рисунок 29 – Репрезентативные данные сортинга HLA-G+ и HLA-Gсубпопуляций NK-клеток здоровых доноров
Сначала мы анализировали цитолиз клеток-мишеней, инкубируя K562клетки, предварительно меченные CFSE, с HLA-G+ или HLA-G- NK-клетками в
соотношении эффектор:мишень 5:1, в течение 2 дней и определяли долю
позитивных клеток по свечению CFSE/PI. В отличие от HLA-G- субпопуляции
NK мы не обнаружили цитолитической активности HLA-G+-клеток, достоверно
изменяющей фоновый уровень гибели клеток линии К562 (рисунок 30). Для
проверки гипотезы об ассоциации экспрессии HLA-G NK-клетками и наличия
регуляторной функции мы добавляли HLA-G+ NK в качестве супрессора к кокультурам аутологичных HLA-G- NK- и K562-клеток в соотношение 25:5:1
супрессор:эффектор:мишень в аналогичном тесте, в присутствии или без АТ,
блокирующих HLA-G. Данный тест показал, что добавление HLA-G+
субпопуляции NK-клеток приводило к снижению цитотоксичности HLA-G- NK
до 50% по сравнению с ко-культурой HLA-G- NK- и К562-клеток (19,0±9,7%;
37,0±9,3%; p=0,001, n=8, соответственно) (рисунок 30).
111
А - репрезентативные данные
Б - суммарные значения в виде M±SD и достоверностью различий между
группами при *р≤0,005 (по критерию Стьюдента).
Рисунок 30 – Анализ супрессорной активности HLA-G+ NK в
цитолитическом тесте
Затем мы исследовали механизмы супрессии цитотоксичности HLA-G+
NK-клеток. В результате проведенных экспериментов выяснилось, что в
присутствие HLA-G+ субпопуляции экспрессия CD107a (рисунок 31А) и
продукция перфорина, гранзима-В (рисунок 31Б) аутологичными HLA-G- NKклетками достоверно снижается по сравнению с ко-культурами HLA-G- NK и
K562. При этом мы не обнаружили достоверных изменений в экспрессии IFN-γ
(рисунок 31Б).
112
M±SD и достоверностью различий между группами при *р≤0,005 и
**р≤0,05 (по критерию Стьюдента).
Рисунок 31 – Анализ супрессии HLA-G+ NK-клетками экспрессии CD107a
(А), а также перфорина, гранзима-Б и IFN-γ (Б) аутологичными HLA-G- NKклетками
Далее мы проверили опосредована ли супрессорная активность HLA-G+
NK-клеток растворимыми факторами, воспроизведя супрессорный тест
описанный выше и инкубируя HLA-G+ и HLA-G- NK-клетки (в соотношение
5:1, супрессор:эффектор) в течение 18 ч в Transwell системе с полупроницаемой
мембраной, разделяющей данные субпопуляции, HLA-G+-клетки инкубировали
в верхней части, а HLA-G- в нижней. После этого, HLA-G+ и HLA-G- NK
дополнительно инкубировали 2 дня с клетками линии К562, в описанном выше
супрессорном тесте. В качестве контроля использовали клетки К562 и кокультуры клеток HLA-G- NK и K562. Исследовали цитотоксичность HLA-GNK-клеток против клеток линии К562. В результате исследования, нами не
было обнаружено никакого ингибиторного влияния секретируемыми
молекулами HLA-G+ NK-клеткок на цитотоксическую активность
аутологических HLA-G- NK (n=3) (рисунок 32). Таким образом, супрессорная
активность HLA-G+ NK-клеток зависит от мембран-ассоциированных молекул
и требует межклеточного взаимодействия.
113
А
Б
А - схема культивирования клеток
Б - значения цитотоксичности в виде M±SD.
Рисунок 32 – Изучение механизма супрессии HLA-G+ NK-клеток в
цитолитическом тесте
Для проверки гипотезы о супрессорном влиянии молекулы HLA-G,
экспрессированной NK-клетками, мы повторили супрессорный тест с
использованием блокирующих HLA-G АТ. Нейтрализация молекулы HLA-G
антагонизировала супрессорный эффект и востанавливала цитотоксичность
HLA-G- NK-клеток до 80% (рисунок 30).
Полученные нами данные согласуются с ранее описанным эффектом
влияния молекул HLA-G на NK-клеточную цитотоксичность и секрецию
перфорина [332, p. 689].
Необходимо отметить, что мы использовали АТ одного клона (87G) для
сортинга HLA-G+ NK-клеток (анти-HLA-G-PE и -APC) и дальнейшего
блокирования молекул HLA-G1 на поверхности данных клеток в супрессорном
тесте, т.к. мы установили, что HLA-G+ NK-клетки теряют HLA-G, меченные АТ
с клеточной мембраны в ходе 2-дневной инкубации. Для доказательства этого,
отсортированные HLA-G+ NK-клетки отмыли и культивировали в ПКС в
течение 2 дней без всякой стимуляции, как и в супрессорном тесте. Затем,
наличие АТ к HLA-G было проанализировано методом проточной
цитофлуориметрии без повторного мечения HLA-G (рисунок 33А) и после
114
инкубации с теми же АТ, что были использованы для сортинга данных клеток
(рисунок 33Б). Было обнаружено, что около 80% HLA-G+ NK-клеток после 2
дней инкубации связывают АТ, в то время, как только около 1,5% данных
клеток сохраняют АТ, связавшиеся с молекулами HLA-G до сортинга (n=3)
(рисунок 33).
Б
A
79,5
%
CD56
1,3%
HLA-G
А - без меченния анти-HLA-G-APC
Б - меченные анти-HLA-G-APC NK-клетки.
Рисунок 33 – Экзоцитоз и обновление молекул HLA-G1 на мембране NKклеток in vitro
Таким образом, можно предположить, что отсортированные HLA-G+ NKклетки теряют АТ против HLA-G в ходе интернализации молекул HLA-G и
дальнейшей внутриклеточной деградации АТ, после чего, HLA-G
восстанавливается на поверхности данных клеток. В подтверждение этого,
существуют данные, показывающие, что клетки B-клеточной линии 721.221,
трансфектные по гену HLA-G, теряют данный белок с клеточной мембраны, со
скоростью около 6% клеток в час. Эта же группа исследователей обнаружила
слабое окрашивание молекул HLA-G, заключенных в цитозоле, что
свидетельствует о спонтанном эндоцитозе данного белка [340]. Точный
механизм избавления от АТ против HLA-G с поверхности HLA-G+ NK-клеток
нам не известен, не смотря на это, нами было показано освобождение эпитопа,
связывающегося с АТ клона 87G во время 2-дневного культивирования данных
клеток и его нейтрализации блокирующими АТ, используемыми нами в
супрессорном тесте.
Учитывая ранее показанный супрессорный эффект IL-10 на эффекторные
функции NK-клеток [341] и полученные нами данные об экспрессии IL-10
HLA-G+ NK-клетками [342], мы провели аналогичный супрессорный тест в
присутствии и без IL-10 блокирующих АТ. Было обнаружено, что
нейтрализация IL-10 частично восстанавливала цитолитическую активность
HLA-G- NK-клеток (n=2) (данные не представлены).
Из представленых нами результатов следует, что HLA-G+ NK не обладают
115
цитолитической активностью, при этом, аналогично супрессорной
субпопуляции NKPSG, полученой in vitro, HLA-G+ NK-клетки ПК являются
иммунорегуляторными. Данные клетки способны подавлять цитолиз клетокмишений, за счет снижения дегрануляции перфорина и гранзима-В HLA-G- NKклетками. Так как супрессорный эффект осуществлялся только при
межклеточном взаимодействие и элиминировался при блокаде HLA-G1, мы
можем заключить, что основную роль в подавление эффекторных функций NKклеток играет молекула HLA-G1 и частично IL-10.
Полученные нами результаты согласуются с опубликованными ранее
данными о том, что HLA-G1 подавляет цитолитическую активность NK-клеток.
Мы можем предположить, что молекулярные механизмы супрессии NKклеточной
цитотоксичности,
опосредуемые
молекулой
HLA-G1,
экспрессированной на NK-клетках ПК, эдентичны опубликованным ранее
молекулярным событиям, происходящим при образовании синапса NK/клеткамишень. Было показано, что связывание рецептора ILT2 на NK-клетках с HLAG1 на клетках-мишенях значительно подавляет мишень-индуцированную
внутриклеточную мобилизацию кальция в NK, аккумулирование F-актина и
LFA-1 в области контакта с мишенью, а также поляризацию гранул MTOC и
перфорина против клеток мишений [333, p. 694]. Данное предположение
согласуется с полученными нами данными, согласно которым резко снижается
дегрануляция цитолитических молекул NK-клетками в супрессорном тесте.
Таким образом, HLA-G+ NK-клетки являются иммунорегуляторной
субпопуляцией, экспрессирующей регуляторные цитокины и подавляющей
эффекторные функции NK через молукулу HLA-G1.
Ранее было показано, что увеличенный уровень HLA-G в биологических
жидкостях коррелирует с подавлением иммуного ответа. Считается, что
эктопическая экспрессия HLA-G трансформированными клетками способствует
ускользанию опухоли от иммуного распознавания и уничтожения.
Моноциты/макрофаги, T- и DC способны секретировать растворимый HLA-G in
vitro. Молекулы HLA-G в сыворотке, представляющие собой отсоединившиеся
мембран-связанные изоформы HLA-G, такие как HLA-G1, и секретируемые
растворимые
изоформы,
такие
как
HLA-G5,
могут
подавлять
противоопухолевый иммунитет локально в опухолевом микроокружение и
систематично, распрастроняясь с кровотоком. Уровень плазматического HLA-G
значительно увеличен у пациентов с меланомами, глиомами, карциномами
яичников и молочной железы [297, p. 10141]. Экспрессия HLA-G встречается в
значительной части опухолей РМЖ, инфильтрированных иммуноцитами.
Увеличенная экспрессия HLA-G в опухоли в значительной части относится к
опухолевым
эпителиальным
клеткам
и
к популяциям
опухоль+
+
инфильтрирующих CD8 и CD68 клеток [343]. Следует отметить, что NKклетки также экспрессируют CD68. Эти данные предполагают, что HLA-Gопосредованные эффекты индуцированы при РМЖ. Учитывая это, мы
исследовали процент HLA-G+ NK-клеток ПК больных РМЖ на разных стадиях
заболевания.
Анализ NK-клеток ПК больных РМЖ показал увеличенный процент
116
клеток, экспрессирующих мембран-ассоциированный HLA-G по сравнению со
здоровыми женщинами (7,2±1,2, n=15; 4,5±1,3, n=11; p˂0,0001, соответственно)
(рисунок 34). Уровень экспрессии HLA-G не зависел от возраста и стадии
заболевания (данные не представлены).
M±SD при *р≤0,0005 (по критерию Стьюдента).
Рисунок 34 – Анализ содержания HLA-G+ NK-клеток здоровых доноров и
больных РМЖ (РМЖ) среди свежевыделенных МНПК (СВ) без стимуляции
(БС) и после инкубации с РНА (РНА)
Как и в группе здоровых доноров, PHA повышал экспрессию HLA-G NKклетками больных РМЖ, в сравннении с нестимулированными клетками. Более
того, в группе больных РМЖ процент HLA-G+ NK-клеток, ативированных
PHA, был достоверно выше по сравнению с группой здоровых женщин
(11,8±2,8%, n=15; 8,8±2,3%, n=11; p˂0,003, соответственно) (рисунок 34), что
может свидетельствовать о повышении способности реагировать на
неспецифическую поликлональную стимуляцию NK-клеток больных РМЖ.
Для уточнения фенотипа HLA-G+ NK-клеток мы определяли экспрессию
данной субпопуляцией маркера CD57. Мы выявили, что HLA-G+ клетки
принадлежат в большей степени к CD57-, чем к CD57+ субпопуляции NKклеток как в группе здоровых доноров, так и больных РМЖ (2,9±0,5%;
1,3±0,4%, p=0,04; n=6 в группе здоровых доноров и 4,5±1,3%; 2,7±1,4%, p=0,01;
n=15 в группе РМЖ, соответственно). В сравнении со здоровыми женщинами,
увеличение доли HLA-G+ NK-клеток в группе больных РМЖ было
зафиксировано и в CD57+, и в CD57- субпопуляциях NK (рисунок 35).
117
Б
+
А - репрезентативные данные
Б - обобщенные значения в виде M±SD, достоверность различий между
CD57+ и CD57- при ×р˂0,05 (по критерию Уилкоксона) и между исследуемыми
группами доноров при *р≤0,005 (по критерию Стьюдента).
Рисунок 35 – Анализ содержания HLA-G+ среди CD57+ и CD57субпопуляциях NK-клеток здоровых доноров и больных РМЖ (РМЖ) среди
МНПК, инкубированных в течение 18 ч без стимуляции (БС) и в присутствие
РНА (РНА)
Следует отметить, что в обеих исследуемых группах доноров, PHAиндуцированное увеличение HLA-G-экспрессирующих клеток наблюдалось
только среди CD57- NK-клеточной субпопуляции, но не среди зрелых CD57+
NK, по сравнению с нестимулированными клетками. Достоверность различий в
доли HLA-G-экспрессирующих клеток между группами здоровых доноров и
больных РМЖ, а также между CD57+ и CD57- NK сохранилась после
воздействия РНА на NK-клетки (рисунок 35).
Таким образом, экспрессия HLA-G на NK-клетках не ассоциированна с
маркером зрелости CD57 и повышается при митогенной стимуляции среди
незрелых NK, это говорит о том, что степень экспресси HLA-G1 ассоцирована с
активацией пролиферации CD57-HLA-G+ NK-клеток и не является маркером
отдельной субпопуляции, отличающейся по происхождению.
Необходимо отметить, что анализ не выявил достоверных различий в
процентом содержании IL-10-, TGF-β- и IFN-γ-экспрессирующих HLA-G+ NKклеток между группой здоровых доноров и больных РМЖ (данные не
представлены).
Таким образом, мы обнаружили и описали новую регуляторную
субпопуляцию NK-клеток человека. Полученные нами данные свидетельствуют
об увеличении процентного содержания данной субпопуляции при развитии
118
РМЖ, что может понижать общую цитолитическую активность NK, описанную
ранее при РМЖ [12, p. 1150] и приводить к общему снижению
противоопухолевого
потенциала
иммуного
ответа.
Необходимы
дополнительные исследования для выявления механизма расширения
субпопуляции HLA-G+ NK-клеток при раке и их активности в опухолевом
микроокружение.
Суммируя результаты, описанные в подразделе 3.2, можно заключить, что
при РМЖ увеличен процент HLA-G+, i-IL-10+, i-TGF-β+ и mb-IL-10+ NK-клеток
как среди CD57+, так и CD57- субпопуляций NK-клеток. Более того, мы
показали увеличенное количество циркулирующих CD3-CD56+-клеток в группе
больных РМЖ по сравнению со здоровыми женщинами, что соответствует
ранее опубликованным данным [344]. Хотя, в другом исследовании,
основанном на анализе маркеров CD56 и CD16, было показано что количество
NK-клеток при РМЖ статистически не отличается от нормы [12, p. 1148]. В то
же время, инвазивные характеристики и степень тяжести РМЖ ассоциированы
с увеличенным количеством циркулирующих незрелых и нецитолитических
CD56brightCD16- NK-клеток [195, p. 2428]. Малигнизированная ткань содержит
меньший процент CD56dimCD16+-клеток, чем здоровая ткань молочных желез.
Инфильтрирующие опухоль молочной железы NK-клетки, обладают низкой
цитолитической активность и данные изменения в функцианировании NKклеток, более вероятно, вызваны влиянием факторов опухолевого
микроокружения [345], с наибольшей корреляцией с TGF-β1 и PGE2 [194, p.
3616]. Также, эндогенный TGF-β подавляет развитие NK-клеток из CD34+предшественников, ингибирует созревание CD16+ NK и индуцирует конверсию
CD56brightCD16+-клеток ПК в CD56brightCD16- NK-клетки [346]. Известно, что
опухолевые клетки и супрессорные популяции, аккумулированные в
опухолевом микроокружении, экспрессируют высокий уровень TGF-β [1, p.
298]. К тому же, молекулы HLA-E, экспрессированные опухольассоциированными макрофагами, индуцируют продукцию IL-10 и TGF-β NKклетками [180, p. 11]. Несмотря на то, что в наших экспрериментах
наблюдалось увеличение экспрессии HLA-G в условиях активации in vitro
выделенных NK-клеток, и данный показатель был достоверно выше в группе
РМЖ, что говорит о усиленном ответе на стимуляцию и NK-клеток больных,
мы не можем исключить повышения доли HLA-G+ NK у больных РМЖ за счет
трогоцитоза данной молекулы от опухолевых клеток [226, p. 1423] и HLA-G+
APC опухолевого микроокружения [300, p. 2042; 301, p. 245].
Таким образом, мы можем предположить, что увеличенный пул NK-клеток
периферической крови при РМЖ может являться результатом повышения
количества иммунорегуляторных NK-клеток, характеризующихся высокой
экспрессией HLA-G и супрессорных цитокинов и данные изменения могут
быть вызваны факторами, индуцированными в опухолевой ткани.
119
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Регуляция иммунного ответа имеет большое значение для достижения
нужного уровня специфичности и иммунной памяти, включения именно тех
эффекторных механизмов, которые бы наилучшим образом отвечали
потребностям организма, а также для исключения нежелательных последствий
гиперактивации иммунной системы. Изучение иммунорегуляторных клеток
важно для раскрытия механизмов поддержания гомеостаза и развития многих
заболеваний. Настоящее исследование было посвящено изучению NK- и Трегуляторных клеток, как важнейших участников иммунного ответа.
В результате исследований были получены следующие основные
результаты:
1.
Циркулирующая в периферической крови здоровых людей
субпопуляция наивных nTreg-клеток отличается большей экспрессией маркера
функциональной активности LAP от субпопуляций эффекторных nTreg-клеток
и клеток памяти, в то время как эффекторы/клетки памяти отличаются от
наивных nTreg-клеток большей экспрессией CTLA-4. РМЖ характеризуется
увеличением доли всех циркулирующих субпопуляций nTreg-клеток и
повышенным уровнем экспрессии маркеров функциональной активности
(GITR, LAP, CD39, IL-35);
2.
В периферической крови здоровых людей циркулируют
индуцированные
IL-17-продуцирующие
iTreg-клетки
(iTreg-17),
экспрессирующие маркеры функциональной активности LAP и GITR. У
больных РМЖ содержание CD25+ iTreg-17-клеток повышено в два раза, причем
данные клетки дополнительно приобретают экспрессию CTLA-4, CD39 и IL-35.
3.
В периферической крови здоровых людей циркулируют Tr1-клетки,
экспрессирующие CD25, FoxP3, GITR, CTLA-4, LAP, CD39 и IL-35. При РМЖ
повышен процент циркулирующих Tr1-клеток, экспрессирующих CD25, FoxP3,
CD39 и IL-35;
4.
При РМЖ повышается доля циркулирующих HLA-G+ Т-клеток,
продуцирующих IL-10;
5.
Т-клетки ПК здоровых людей, связывающих высокомолекулярный
НА содержит больше Treg-клеток с фенотипом CD4+CD25+FoxP3+ и обладает
повышенной супрессорной активностью, чем не связывающая НА. РМЖ
характеризуется повышенным содержанием НА-связывающих Treg-клеток,
экспрессирующих маркер функциональной активности CD39.
6.
Минорная субпопуляция NK-клеток периферической крови
здоровых людей экспрессирует супрессорную молекулу HLA-G. HLA-G+ NKклетки обладают регуляторными свойствами, связанными с подавлением
цитолитической активности NK. В периферической крови больных РМЖ
увеличено содержание регуляторных NK-клеток, экспрессирующих HLA-G, IL10 и TGF-β.
На основании данных, полученных при изучении субпопуляций Tregклеток здоровых доноров можно сделать вывод, что в физиологических
120
условиях в циркуляции постоянно присутствуют Treg-клетки, включающие как
наивные клетки, непрерывно доставляемые из тимуса, уже активированные,
встретившие АГ и формирующие пул регуляторных клеток памяти, так и
индуцированные различными факторами iTreg-клетки и Treg-клетки,
способные связывать молекулы межклеточного матрикса и активно
мигрировать в область воспаления. Помимо этого, в циркуляции здоровых
доноров также обнаружены NK-клетки, обладающие иммунорегуляторными
свойствами. Содержание таких клеток в ПК в норме свидетельствует об их
роли в поддержании иммунологической толерантности к аутоантигенам и пул
супрессорных клеток состоит из сложной сети различных субпопуляций с
различными механизмами функциональной активности.
Анализ состава иммуносупрессорных клеток ПК больных РМЖ показал
увеличение доли большинства циркулирующих субпопуляций NK- и Трегуляторных клеток, а также повышение функциональной активности данных
клеток.
Таким образом,
мы можем
заключить,
что
усиление
иммуносупрессорных свойств при развитии онкологических заболеваний, в том
числе и РМЖ, является общим феноменом, негативно сказывающимся на
противоопухолевом иммунитете.
Основываясь на полученных нами и описанных ранее литературных
данных, мы можем предположить, что позитивная регуляция иммуносупрессии
является вторичной и, вероятнее всего, запускается во время предопухолевых
состояний или ранних стадий онкологических заболеваний. Основными
факторами, участвующими в индукции NK- и T-регуляторных клеток при раке,
считаются супрессорные цитокины и молекулы, продуцируемые опухолевыми
клетками и опухоль-конвертированными иммуноцитами, также мы можем
предположить аналогичное влияние непосредственно молекул, продуцируемых
NK- и T-регуляторными клетками.
В дальнейшем необходимо доказать возможные механизмы расширения
пула NK- и T-регуляторных клеток при раке и найти наиболее эффективные
мишени для комбинированной коррекции данного процесса, что приведет к
возможности восстанавливать противоопухолевые реакции и запускать регресс
опухолевого роста.
Рекомендации и исходные данные по использованию результатов
Полученные нами результаты могут быть использованы в разработке АТсодержащих препаратов для иммунотерапии РМЖ. Рассматриваются
следующие подходы иммунотерапии: удаление NK- и Т-клеток, обладающих
супрессорной активностью из опухолевого микроокружения; блокирование
супрессорных молекул, продуцированных данными клетками или индукция
обратной конверсии индуцированных супрессоров в наивные/эффекторные
клетки; элиминация факторов, индуцирующих NK- и Т-регуляторные клетки.
Кроме этого, наши данные подтверждают обоснованность применения
иммунотерапии, основанной на блокировании CTLA-4 (ипилимумаба) или
комбинации АТ против CTLA-4 и CD25 при РМЖ.
Полученные нами результаты также могут быть использованы в качестве
научной основы для разработки новых подходов к ранней диагностики РМЖ.
121
Оценка полноты решений поставленных задач
Все задачи, поставленные в диссертационной работе, выполнены в полном
объеме.
Оценка научного уровня выполненной работы в сравнении с
лучшими достижениями в данной области
При выполнении данной работы использовались современные
иммунологические и молекулярно-генетические методы, с использованием
современного оборудования, в разработке цели исследования учитывались
последние данные и тенденции современной онкоиммунологии. Результаты
работы неоднократно обсуждались и докладывались на научных конференциях
международного уровня, опубликованы в научных изданиях Республики
Казахстан, ближнего и дальнего зарубежья, что является подтверждением
соответствия технического уровня диссертационной работы принятым
стандартам.
Настоящая диссертационная работа соответствует научно-техническим
требованиям, предъявляемым к исследованиям в области современной
иммунологии.
122
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ
1 Gabrilovich D.I. Tumor-Induced Immune Suppression. Mechanisms and
Therapeutic Reversal / под ред. Hurwitz A.A. – Springer, 2014. – 464 р.
2 Liyanage U.K., Moore T.T., Joo H.G., Tanaka Y., Herrmann V., Doherty
G., Drebin J.A., Strasberg S.M., Eberlein T.J., Goedegebuure P.S., Linehan D.C.
Prevalence of regulatory T cells is increased in peripheral blood and tumour
microenvironment of patients with pancreas or breast adenocarcinoma // J. Immunol.
– 2002. – Vol. 169. – P. 2756–2761.
3 Sutmuller R.P., van Duivenvoorde L.M., van Elsas A., Schumacher T.N.,
Wildenberg M.E., Allison J.P., Toes R.E., Offringa R., Melief C.J. Synergism of
cytotoxicT lymphocyte-associated antigen 4 blockade and depletion of CD25(+)
regulatoryTcells in anti tumor therapy reveals alternative pathways for suppression of
autoreactive cytotoxicT lymphocyte responses // J. Exp. Med. - 2001. - Vol. 194. - P.
823–832.
4 Whiteside T.L. The tumor microenvironment and its role in promoting
tumor growth // Oncogene. – 2008. - Vol. 27, № 45. – P. 5904-12.
5 DeGrendele H.C., Estess P., Picker L.J., Siegelman M.H. CD44 and its
ligand hyaluronate mediate rolling under physiologic flow: a novel
lymphocyte/endothelial cell primary adhesion pathway // J. Exp. Med. - 1996. - Vol.
183. - P. 1119-1130.
6 Zimmer J. Natural killer cells: at the forefront of modern immunology. Springer-Verlag, - 2010, 230 p.
7 Poli A., Michel T., Thérésine M., Andrès E., Hentges F., Zimmer J.
CD56bright natural killer (NK) cells: an important NK cell subset // Immunology. 2009. - Vol. 126. - P. 458–465.
8 Higuma-Myojo S., Sasaki Y., Miyazaki S., Sakai M., Siozaki A., Miwa N.,
Saito S. Cytokine profile of natural killer cells in early human pregnancy // AJRI. 2005. – Vol. 54. - P.21–29.
9 Giuliani M., Giron-Michel J., Negrini S., Vacca P., Durali D., Caignard A.,
Le Bousse-Kerdiles C., Chouaib S., Devocelle A., Bahri R., Durrbach A., Taoufik Y.,
Ferrini S., Croce M., Mingari M.C., Moretta L., Azzarone B. Generation of a novel
regulatory NK cell subset from peripheral blood CD34+ progenitors promoted by
membrane-bound IL-15 // PLoS One. – 2008. - Vol. 3, № 5. - e2241.
10
Deniz G., Erten G., Kücüksezer U.C., Kocacik D., Karagiannidis C.,
Aktas E., Akdis C.A., Akdis M. Regulatory NK cells suppress antigen-specific T cell
responses // J. Immunol. – 2008. - Vol. 180. – P. 850–857.
11
Garner W.L., Minton J.P., James A.G., Hoffmann C.C. Human breast
cancer and impaired NK cell function // J. Surg. Oncol. –1983. -Vol. 24.–P. 64–66.
12
Caras I., Grigorescu A., Stavaru C., Radu D.L., Mogos I., Szegli G.,
Salageanu A. Evidence for immune defects in breast and lung cancer patients //
Cancer Immunol. Immunother. – 2004. - Vol. 53. – P. 1146–1152.
13
Artavanis-Tsakonas K, Tongren J.E, Riley E.M. The war between the
malaria parasite and the immune system: immunity, immunoregulation and
immunopathology// Clin. Exp. Immunol. - 2003. - Vol. 133. – P.145–152.
123
14 von Herrath M.G., Harrison L.C. Antigen-induced regulatory T cells in
autoimmunity // Nat. Rev. Immunol. - 2003. - Vol 3. -P. 223–232
15 O‘Garra A., Vieira P. Regulatory T cells and mechanisms of immune system
control // Nat. Med. - 2004. - Vol. 10. - P. 801–805.
16 Jiang H., Chess L. An integrated view of suppressor T cell subsets in
immunoregulation // J. Clin. Invest. – 2004. - Vol. 114. - P. 1198–1208.
17 Reise Sousa C. Dendritic cells as sensors of infection // Immunity. – 2001. Vol. 14. – P. 495–502.
18 Godfrey D.I., Kronenberg M. Going both ways: immune regulation via
CD1d-dependent NKT cells. J. Clin. Invest. – 2004. - Vol. 114. – P. 1379–1388.
19 Zou W. Regulatory T cells, tumour immunity and immunotherapy // Nature
Rev. Immunol. – 2006. - Vol. 6. – P. 295-307.
20 Gregg R., Smith C.M., Clark F.J., Dunnion D., Khan N., Chakraverty R.,
Nayak L., Moss P.A. The number of human peripheral blood CD4+CD25high
regulatory T cells increases with age // Clin. Exp. Immunol. – 2005. - Vol. 140. - P.
540-546.
21 Chen Y., Perry D., Boackle S.A. Sobel E.S., Molina H., Croker B.P., Morel
L. Several genes contribute to the production of autoreactive B and T cells in the
murine lupus susceptibility locus Sle 1c // J. Immunol. – 2005. - Vol. 175. - P.10801089.
22 Piccirillo C.A., Shevach E.M. Naturally-occurring CD4+CD25+
immunoregulatory T cells: central players in the arena of peripheral tolerance //
Semin. Immunol. – 2004. - Vol. 16. - P. 81-88.
23 Sakaguchi S., Sakaguchi N., Asano M. Immunologic sell-tolerance
maintained by activated T cells expressing IL-2 receplor a-chains (CD25) // J.
Immunol. – 1995. - Vol. 155. - P. 1151-1164.
24 Suri-Payer E., Amar A. Z., Thornton A. M., Shevach E.M. CD4+CD25+ T
cells inhibit both the induction and effector function of autoreactive T cells and
represent a unique lineage of immunoregulatoiy cells // J. Immunol. – 1998. - Vol.
160. - P. 1212-1218.
25 Thornton A.M., Shevach E.M. CD4+CD25+ immunoregulatory T cells
suppress polyclonal-T cell activation in vitro by inhibiting interleukin 2 production //
J. Exp. Med. – 1998. - Vol. 188. - P. 287-296.
26 Shevach E.M. CD4+CD25+ suppressor T cells: more questions than
answers // Nature Rev. Immunol. – 2002. – Vol. 2. – P. 389–400.
27 Elkord E. Thymus-Derived, Peripherally Derived, and in vitro-Induced T
Regulatory Cells // Front. Immunol. – 2014. – Vol. 5. – 17p.
28 Li S., Xie Q., Zeng Y., Zou C., Liu X., Wu S., Deng H., Xu Y., Li X.C.,
Dai Z. A naturally occurring CD8+CD122+ T-cell subset as a memory-like Treg
family // Cellul. Mol. Immunol. – 2014. – Vol. 11, № 4. – P. 326-331.
29 Feger U., Tolosa E., Huang Y.H., Waschbisch A., Biedermann T., Melms
A., Wiendl H. HLA-G expression defines a novel regulatory T-cell subset present in
human peripheral blood and sites of inflammation // Blood. – 2007. - Vol. 110. – P.
568–577.
124
30 Amodio G., Mugione A., Sanchez A.M., Viganò P., Candiani M.,
Somigliana E., Roncarolo M.G., Panina-Bordignon P., Gregori S. HLA-G expressing
DC-10 and CD4(+) T cells accumulate in human decidua during pregnancy // Hum.
Immunol. – 2013. - Vol. 74, № 4. – P. 406-411.
31 Athanassakis I., Vassiliadis S. T-regulatory cells: are we re-discovering T
suppressors? // Immunol. Lett. – 2002. - Vol. 84. - P. 179-183.
32 Cassis L., Aiello S., Noris M. Natural versus adaptive regulatory T cells //
Contrib. Nephrol. – 2005. - Vol. 146. - P. 121-131.
33 Ng W.F., Duggan P.J., Ponchel F., Matarese G., Lombardi G., Edwards
A.D., Isaacs J.D., Lechler R.I. Human CD4+CD25+ cells: a naturally occurring
population of regulatory T cells // Blood. – 2001. - Vol. 98. - P. 2736-2744.
34 Berthelot J.M., Maugars Y. Role for suppressor T cells in the pathogenesis
of autoimmune diseases (including rheumatoid arthritis). Facts and hypotheses //
Joint Bone Spine. - 2004. - Vol. 71, № 5. - P. 374–380.
35 Fehervari Z., Sakaguchi S. CD4(+) Tregs and immune control // J. Clin.
Invest. - 2004. - Vol. 114, № 9. - P. 1209–1217.
36 Lan R.Y., Aftab Ansarib A., Zhe-Xiong L., Gershwina M.E. Regulatory T
cells: development, function and role in autoimmunity // Autoimm. Rev. - 2005. Vol. 4, № 6. - P. 351–363.
37 Stassen M., Fondel S., Bopp T., Richter C., Müller C., Kubach J., Becker
C., Knop J., Enk A.H., Schmitt S., Schmitt E., Jonuleit H. Human CD25+ regulatory
T cells: two subsets defined by the integrins alpha 4 beta 7 or alpha 4 beta 1 confer
distinct suppressive properties upon CD4+ T helper cells // Eur. J. Immunol. - 2004. Vol. 34, № 5. - P. 1303–1311.
38 Grossman W.J., Verbsky J.W., Barchet W., Colonna M., Atkinson J.P., Ley
T.J. Human T regulatory cells can use the perforin pathway to cause autologous
target cell death // Immunity. - 2004. - Vol. 21, № 4. - P. 589–601.
39 Voo K.S., Wang Y-H, Santori F.R., Boggiano C., Wang Y.H., Arima K.,
Bover L., Hanabuchi S., Khalili J., Marinova E., Zheng B., Littman D.R., Liu Y.J.
Identification of IL-17-producing FOXP3+ regulatory T cells in humans // Proc. Natl.
Acad. Sci. USA. – 2009. - Vol.106, № 12. – P. 4793-4798.
40 Randolph D.A., Fathman C.G. CD4+CD25+ regulatory T cells and their
therapeutic potential // Annu. Rev. Med. – 2006. - Vol. 57. - P. 381-402.
41 Sakaguchi S. Naturally arising CD4+ regulatory T cells for immunologic
self- tolerance and negative control of immune responses // Annu. Rev. Immunol. –
2004. - Vol. 22. - P. 531-562.
42 Schwartz R.H. Natural regulatory T cells and self-tolerance // Nat.
Immunol. – 2005. - Vol. 6. - P. 327-330.
43 Brunkow M., Jeffery E., Hjerrild K. Paeper B., Clark L.B., Yasayko S.A.,
Wilkinson J.E., Galas D., Ziegler S.F., Ramsdell F. Disruption of a new
forkhead/winged- helix protein, scurfin, results in the fatal' lymphoproliferative
disorder of the scurfy mouse // Nat. Genet. – 2001. - Vol. 27. - P. 68-73.
44 Chai J.G., Xue S.A., Coe D., Addey C., Bartok I., Scott D., Simpson E.,
Stauss H.J., Hori S., Sakaguchi S., Dyson J. Regulatory T cells, derived from naive
125
CD4+CD25- T cells by in vitro foxp3 gene transfer, can induce transplantation
tolerance // Transplant. - 2005. - Vol. 79. - P. 1310-1316.
45 Coombes J.L., Robinson N.J., Maloy K.J., Uhlig H.H., Powrie F.
Regulatory T cells and intestinal homeostasis // Immunol. Rev. – 2005. - Vol. 204. P. 184-194.
46 Suciu-Foca N., Manavalan J.S., Scotto L., Kim-Schulze S., Galluzzo S.,
Naiyer A.J., Fan J., Vlad G., Cortesini R. Molecular characterization of allospecific T
suppressor and tolerogenic dendritic cells: review // Int. Immunopharmacol. – 2005. Vol. 5. - P. 7-11.
47 Hayashi Y., Tsukumo S., Shiota H., Kishihara K., Yasutomo K. Antigenspecific T cell repertoire modification of CD4+CD25+ regulatory T cells // J.
Immunol. – 2004. - Vol. 172. - P. 5240-5248.
48 Battaglia M., Stabilini A., Roncarolo M.G. Rapamycin selectively expands
CD4+CD25+foxp3+regulatory T cells // Blood. – 2005. - Vol. 105. - P. 4743-4748.
49 Cohen J.L., Salomon B.L. Therapeutic potential of CD4+CD25+ regulatory
T cells in allogeneic transplantation // Cytother. – 2005. - Vol. 7. - P. 166-170.
50 Waldmann H., Graca L., Cobbold S., Adams E., Tone M., Tone Y.
Regulatory T cells and organ transplantation // Semin. Immunol. – 2004. - Vol. 16. P. 119-126.
51 Nomura T., Sakaguchi S. Naturally arising CD4+CD25+ regulatory T cells
in tumor immunity // Curr. Top. Microbiol. Immunol. – 2005. - Vol. 293. - P. 287302.
52 Miura Y., Thoburn C.J., Bright E.C. Phelps M.L., Shin T., Matsui E.C.,
Matsui W.H., Arai S., Fuchs E.J., Vogelsang G.B., Jones R.J., Hess A.D. Association
of foxp3 regulatory gene expression with graft-versus-host disease // Blood. – 2004. Vol. 104. - P. 2187-2193.
53 Kariminia A., Bourreau E., Pascalis H., Couppié P., Sainte-Marie D.,
Tacchini-Cottier F., Launois P. Transforming growth-factor betal production by
CD4+CD25+ regulatory T cells in peripheral blood mononuclear cells from healthy
subjects stimulated with Leishmania guyanensis // Infect. Immun. – 2005. - Vol. 73. P. 5908-5914.
54 Vahlenkamp T.W., Tompkins M.B., Tompkins W.A. The role of
CD4+CD25+ regulatory T cells in viral infections // Vet. Immunol. Immunopathol. –
2005. – Vol. 108. - P. 219¬225.
55 Oswald-Richter K., Grill S.M., Shariat N., Leelawong M., Sundrud M.S.,
Haas D.W., Unutmaz D. HIV infection of naturally occurring and genetically
reprogrammed human regulatory T-cells // PLoS Biol. –2004. –Vol.2. - P.955-966.
56 Uhlig H.H., Powrie F. The role of mucosal T lymphocytes in regulating
intestinal inflammation // Springer Semin. Immunopathol. – 2005. - Vol. 27. - P. 167180.
57 Setoguchi R., Hori S., Takahashi T., Sakaguchi S. Homeostatic
maintenance of natural Foxp3+CD4+CD25+ regulatory T cells by interleukin(IL)-2
and induction of autoimmune disease by IL-2 neutralization // J. Exp. Med. – 2005. Vol. 201. - P. 723-735.
126
58 Sakaguchi S. Control of immune responses by naturally arising CD4+
regulatory T cells that express toll-like receptors // J. Exp. Med. – 2003. - Vol. 197. P. 397-401.
59 Sasaki Y., Sakai M., Miyazaki S., Higuma S., Shiozaki A., Saito S.
Decidual and peripheral blood CD4+CD25+ regulatory T cells in early pregnancy
subjects and spontaneous abortion cases // Mol. Hum. Reprod. – 2004. - Vol. 10. - P.
347-353.
60 Sakaguchi S., Hori S., Fukui Y., Sasazuki T., Sakaguchi N., Takahashi T.
Thymic generation and selection of CD4+CD25+ regulatory T cells: implications of
their broad repertoire and high self- reactivity for the maintenance of immunological
self-tolerance // Novartis Found. Symp. –2003. -Vol. 252. -P. 6-16.
61 Thornton A.M. Signal transduction in CD4+CD25+ regulatory T cells:
CD25 and IL-2 // Front. Biosci. – 2006. - Vol. 11. - P. 921-927.
62 Wildin R., Ramsdell F., Peake J., Faravelli F., Casanova J.L., Buist N.,
Levy-Lahad E., Mazzella M., Goulet O., Perroni L., Bricarelli F.D., Byrne G.,
McEuen M., Proll S., Appleby M., Brunkow M.E. X-linked neonatal diabetes
mellitus, enteropathy and endocrinopathy syndrome is the human equivalent of
mouse scurfy // Nat. Genet. – 2001. - Vol. 27. - P. 18-20.
63 Bennett C.L., Brunkow M.E., Ramsdell F., O'Briant K.C., Zhu Q., Fuleihan
R.L., Shigeoka A.O., Ochs H.D., Chance P.F. A rare polyadenylation signal mutation
of the FOXP3 gene (AAUAAAAAUGAA) leads to the IPEX syndrome //
Immunogenetics. – 2001. - Vol. 53. - P. 435-439.
64 Ochs H.D., Ziegler S.F., Torgerson T.R. FOXP3 acts as a rheostat of the
immune response // Immunol. Rev. – 2005. - Vol. 203. - P. 156-164.
65 Huan J., Culberston N., Spencer L., Bartholomew R., Burrows G.G., Chou
Y.K., Bourdette D., Ziegler S.F., Offner H., Vandenbark A.A. Decreased FOXP3
levels in multiple sclerosis patients // J. Neyrosci. Res. – 2005. – Vol. 81. - P. 45-52.
66 Toubi E., Kessel A., Mahmudov Z., Hallas K., Rozenbaum M., Rosner I.
Increased spontaneous apoptosis of CD4+CD25+ T cells in patients with active
rheumatoid arthritis is reduced by infliximab // Ann. NY Acad. Sci. – 2005. - Vol.
1051. - P. 506-514.
67 Martin B., Banz A., Bienvenu B., Cordier C., Dautigny N., Bécourt C.,
Lucas B. Suppression of CD4+ T lymphocyte effector functions by CD4+CD25+
cells in vivo // J. Immunol. – 2004. - Vol. 172. - P. 3391-3398.
68 Park O., Grishina I., Leung P.S., Gershwin M.E., Prindiville T. Analysis of
the foxp3/scurfin gene in Crohn's disease // Ann. NY Acad. Sci. – 2005. - Vol. 1051.
- P. 218-228.
69 Romagnani S. The increased prevalence of allergy and hygiene hypothesis:
missing immune deviation? Reduced immune suppression, or both? // Immunol. –
2004. – Vol. 112. - P. 352-363.
70 Wildin R.S., Smyk-Pearson S., Filipovich A.H. Clinical and molecular
features of the immunodysregulation, polyendocrinopathy, enteropathy, X linked
(IPEX) syndrome // J. Med. Genet. – 2002. - Vol. 39. - P. 537-545.
127
71 Lim H.W., Hillsamer P., Banham A.H., Kim C.H. Cutting edge: direct
suppression of B cells by CD4+CD25+ regulatory T cells // J. Immunol. – 2005. Vol. 175. - P. 4180-4183.
72 Kohno T., Yamada Y., Akamatsu N., Kamihira S., Imaizumi Y., Tomonaga
M., Matsuyama T. Possible origin of adult T-cell leukemia/lymphoma cells from
human T lymphotropic virus type-1-infected regulatory T cells // Cancer Sci. – 2005.
- Vol. 96. - P. 527-533.
73 Berger C.L., Tigelaar R., Cohen J., Mariwalla K., Trinh J., Wang N.,
Edelson R.L. Cutaneous T-cell lymphoma: malignant proliferation of T-regulatory
cells // Blood. – 2005. - Vol. 105. - P. 1640-1647.
74 Beyer M., Kochanek M., Darabi K., Popov A., Jensen M., Endl E., Knolle
P.A., Thomas R.K., von Bergwelt-Baildon M., Debey S., Hallek M., Schultze J.L.
Reduced frequencies and suppressive function of CD4+CD25hi regulatory T cells in
patients with chronic lymphocytic leukemia after therapy with fludarabine // Blood .
– 2005. - Vol. 106. - P. 2018-2025.
75 Ohkura N., and Sakaguchi, S. Regulatory T cells: roles of T cell receptor
for their development and function // Semin. Immunopathol. – 2010. – Vol. 32. – P.
95–106.
76 Baecher-Allan C., Wolf E., Hafler D.A. Functional analysis of highly
defined, FACS-isolated populations of human regulatory CD4+CD25+ T cells // Clin.
Immunol. – 2005. - Vol. 115. - P. 10-18.
77 Shimizu J., Yamazaki, S., Takahashi, T., Ishida, Y., Sakaguchi, S.
Stimulation of CD25+CD4+ regulatory T cells through GITR breaks immunological
selftolerance // Nature Immunol. – 2002. – Vol. 3. – P. 135–142.
78 Baecher-Allan C., Viglietta V., Hafler D.A. Human CD4+CD25+
regulatory T cells. Semin // Immunol. – 2004. - Vol. 16. - P. 89-97.
79 Cupedo T., Nagasawa M., Weijer K., Blom B., Spits H. Development and
activation of regulatory T cells in the human fetus // Eur. J. Immunol. – 2005. - Vol.
35. - P. 383-390.
80 Earle K.E., Tang Q., Zhou X., Liu W., Zhu S., Bonyhadi M.L., Bluestone
J.A. In vitro expanded human CD4+CD25+ regulatory T cells suppress effector T
cell proliferation // Clin. Immunol. – 2005. - Vol. 115. - P. 3-9.
81 Thornton C.A., Upham J.W., Wikstrom M.E., Holt B.J., White G.P., Sharp
M.J., Sly P.D., Holt P.G. Functional maturation of CD4+CD25+CTLA4+CD45RA+
T regulatory cells in human T cell responses to environmental antigens/allergens // J.
Immunol. – 2004. - Vol. 173. - P. 3084-3082.
82 Baecher-Allan C., Brown J.A., Freeman G.J., Hafler D.A. CD4+CD25high
regulatory cells in human peripheral blood // J. Immunol. – 2001. – Vol. 167. - P.
1245-1253.
83 Thornton A.M., Shevach E.M. CD4+CD25+ immunoregulatory T cells
suppress polyclonal T cell activation in vitro by inhibiting interleukin 2 production //
J. Exp. Med. – 1998. – Vol. 188. – P. 287–296.
84 Dieckmann D., Plottner H., Berchtold S., Berger T., Schuler G. Ex vivo
isolation and characterization of CD4+CD25+ T cells with regulatory properties from
human blood // J. Exp. Med. – 2001. - Vol. 193. - P. 1303-1310.
128
85 Birebent B., Lorho R., Lechartier H., de Guibert S., Alizadeh M., Vu N.,
Beauplet A., Robillard N., Semana G. Suppressive properties of human CD4 CD25
regulatory T cells are dependent on CTLA-4 expression // Eur. J. Immunol. – 2004. –
Vol. 34. - P. 3485-3496.
86 McHugh R.S., Whitters M.J., Piccirillo C.A., Young D.A., Shevach E.M.,
Collins M., Byrne M.C. CD4+CD25+ immunoregulatory T cells: gene expression
analysis reveals a functional role for the glucocorticoid-induced TNF receptor //
Immunity. – 2002. - Vol. 16. - P. 311-323.
87 Gambineri E., Torgerson R.T., Ochs H.D. Immune dysregulation,
polyendocrinopathy, enteropathy, and X-linked inheritance (IPEX), a syndrome of
systemic autoimmunity caused by mutations of FOXP3, a critical regulator of T-cell
homeostasis // Curr. Opin. Rheumatol. – 2003. - Vol. 15. - P. 430-435.
88 Firan M., Dhillon S., Estess P., Siegelman M.H. Suppressor activity and
potency among regulatory T cells is discriminated by functionally active CD44 //
Blood. – 2006. – Vol. 107, № 2. - P619-627.
89 Yagi H., Nomura T., Nakamura K., Yamazaki S., Kitawaki T., Hori S.,
Maeda M., Onodera M., Uchiyama T., Fujii S., Sakaguchi S. Crucial role of FOXP3
in the development and function of human CD4+CD25+ regulatory T cells // Int.
Immunol. – 2004. – Vol. 16. - P. 1643-1656.
90 Weigel D., Jurgens G., Kuttner F., Seifert E., Jäckle H. The homeotic gene
fork head encodes a nuclear protein and is expressed in the terminal regions of the
Drosophila embryo // Cell. – 1989. - Vol. 57. - P. 645-658.
91 Ziegler S.F. FOXP3: of mice and' men // Annu. Rev. Immunol. – 2006. Vol. 24. - P. 209-226.
92 Bettelli E., Dastrange M., Oukka M. FOXP3 interacts with nuclear factor
of activated T cells and NF-kappa B to repress .cytokine gene expression and effector
functions of T helper cells // Proc. Natl. Acad Sci. USA. – 2005. – Vol. 102. - P.
5138-5143.
93 Schubert L.A., Jeffery E., Zhang Y., Ramsdell F., Ziegler S.F. Scurfin
(F0XP3) acts as a repressor of transcription and regulates T cell activation // J. Biol.
Chem. – 2001. - Vol. 276. - P. 37672¬37679.
94 Coffer P., Burgering M. Forkhead-box transcription factors and their role in
the immune system // Nat. Rev. Immunol. – 2004. - Vol. 4. - P. 889-899.
95 Robinson D.S. Regulation: the art of control? Regulatory T cells and
asthma and allergy // Thorax. – 2004. - Vol. 59. - P. 640-643.
96 Taams L.S., Akbar A.N. Peripheral generation and function of
CD4+CD25+ regulatory T cells // Curr. Top. Microbiol. Immunol. – 2005. - Vol.
293. - P. 115-131.
97 Marie J.C., Letterio J.J., Gavin M., Rudensky A.Y. TGF-βl maintains
suppressor function and FOXP3 expression in CD4 CD25 regulatory T cells // J. Exp.
Med. – 2005. - Vol. 201. – P. 1061-1067.
98 Ohkura N., Hamaguchi M., Morikawa H., Sugimura K., Tanaka A., Ito Y.,
Osaki M., Tanaka Y., Yamashita R., Nakano N., Huehn J., Fehling H.J., Sparwasser
T., Nakai K., Sakaguchi S. T cell receptor stimulation induced epigenetic changes
129
and Foxp3 expression are independent and complementary events required for Treg
cell development // Immunity. – 2012. – Vol. 37, № 5. – P. 785–99.
99 Piccirillo C.A., Thornton A.M. Cornerstone of peripheral tolerance:
naturally occurring CD4+CD25+ regulatory T cells // Trends Immunol. – 2004. –
Vol. 25. – P. 374–380.
100 Valmori D., Merlo A., Souleimanian N.E., Hesdorffer C.S., Ayyoub M. A
peripheral circulating compartment of natural naive CD4 Tregs // J. Clin. Invest. –
2005. – Vol. 115. – P. 1953-1962.
101
Seddiki N., Santner-Nanan B., Tangye S.G., Alexander S.I., Solomon
M., Lee S., Nanan R., Fazekas de Saint Groth B. Persistence of naive CD45RA+
regulatory T cells in adult life // Blood. – 2006. – Vol. 107, № 7. – P. 2830-2838.
102
Booth N.J., McQuaid A.J., Sobande T., Kissane S., Agius E., Jackson
S.E., Salmon M., Falciani F., Yong K., Rustin M.H., Akbar A.N., Vukmanovic-Stejic
M. Different Proliferative Potential and Migratory Characteristics of Human CD4+
Regulatory T Cells That Express either CD45RA or CD45RO // J. Immunol. – 2010.
– Vol. 184. – P. 4317-4326.
103
Itoh M., Takahashi T., Sakaguchi N., Kuniyasu Y., Shimizu J., Otsuka
F., Sakaguchi S. Thymus and autoimmunity: production of CD4+CD25+ naturally
anergic and suppressive T cells as a key function of the thymus in maintaining
immunologic self-tolerance // J. Immunol. – 1999. - Vol. 162. - P. 5317-5326.
104
Picca C.C., Caton A.J. The role of self-peptides in the development of
CD4+CD25+ regulatory T cells // Curr. Opin. Immunol. – 2005. - Vol. 17. - P. 131136.
105
Tai X., Cowan M., Feigenbaum L., Singer A. CD28 costimulation of
developing thymocytes induces FOXP3 expression and regulatory T cell
differentiation independently of interleukin 2 // Nat Immunol. – 2005. - Vol. 6. - P.
152-162.
106
Watanabe N., Wang Y.H., Lee H.K., Ito T., Wang Y.H., Cao W., Liu
Y.J. Hassall's corpuscles instruct dendritic cells to induce CD4+CD25+ regulatory T
cells in human thymus // Nature. – 2005. - Vol. 436. - P. 1181-1185.
107
Salomon B., Lenschow D.J., Rhee L., Ashourian N., Singh B., Sharpe
A., Bluestone J.A. B7/CD28 costimulation is essential for the homeostasis of the
CD4+CD25+ immunoregulatory T cells that control autoimmune diabetes //
Immunity. – 2000. – Vol. 12. – P. 431–440.
108
Nishikawa H., Kato T., Tawara I., Saito K., Ikeda H., Kuribayashi K.,
Allen P.M., Schreiber R.D., Sakaguchi S., Old L.J., Shiku H. Definition of target
antigens for naturally occurring CD4+CD25+ regulatory T cells // J. Exp. Med. –
2005. – Vol. 201. - P. 681-686.
109
Hontsu S., Yoneyama H., Ueha S., Terashima Y., Kitabatake M.,
Nakano A., Ito T., Kimura H., Matsushima K. Visualization of naturally occurring
FOXP3+ regulatory T cells in normal and tumor-dearing mice // Int.
Immunopharmacol. – 2004. – Vol. 4. - P. 1785-1793.
110
Thornton A.M., Shevach E.M. Suppressor effector function of
CD4+CD25 immunoregulatory T cells is antigen nonspecific // J. Immunol. – 2000. Vol. 164. - P. 183-190.
130
111
Shevach E.M. Mechanisms of FOXP3 T regulatory cell-mediated
suppression // Immunity. – 2009. – Vol. 30. – P. 636–45.
112 Kojima H., Kanno Y., Hase H., Kobata T. CD4+CD25+ regulatory T cells
attenuate the phosphatidylinositol 3-kinase/Akt pathway in antigen-primed immature
CD 8- CTLs during functional maturation // J. Immunol. – 2005. - Vol. 174. - P.
5959-5967.
113 Antony Р.А., Restifo N.P. CD4+CD25+ T regulatory cells, immunotherapy
of cancer, and interleukin-2 // J. Immunother. – 2005. - Vol. 28. - P. 120-128.
114 Bensinger S.J., Walsh P.T., Zhang J., Carroll M., Parsons R., Rathmell
J.C., Thompson C.B., Burchill M.A., Farrar M.A., Turka L.A. Distinct IL-2 receptor
signaling pattern in CD4+CD25+ regulatory T cells // J. Immunol. – 2004. – Vol.
172. - P. 5287-5296.
115 Wiegard C., Frenzel C., Herkel J., Kallen K.J., Schmitt E., Lohse A.W.
Murine liver antigen presenting cells control suppressor activity of CD4+CD25+
regulatory T cells // Hepatol. – 2005. - Vol. 42. - P.193-199.
116 Fritzsching B., Oberle N., Eberhardt N., Quick S., Haas J., Wildemann B.,
Krammer P.H., Suri-Payer E. In contrast to effector T cells,
CD4+CD25+FOXP3+regulatory T cells are highly susceptible to CD95 ligand- but
not to TCR-mediated cell death // Immunol. – 2005. - Vol. 175. - P. 32-36.
117 Pace L., Pioli C., Doria G. IL-4 modulation of CD4+CD25+ T regulatory
cell-mediated suppression // J. Immunol. – 2005. - Vol. 174. - P. 7645-7653.
118 Li L., Greenwald R.J., Lafuente E.M., Tzachanis D., Berezovskaya A.,
Freeman G.J., Sharpe A.H., Boussiotis V.A. Rapl-GTP is a negative regulator of Th
cell function and promotes the generation of CD4+CD103+ regulatory T cells in vivo
// J. Immunol. – 2005. - Vol. 175. - P. 3133-3139.
119 Takahashi T., Tagami T., Yamazaki S., Uede T., Shimizu J., Sakaguchi N.,
Mak T.W., Sakaguchi S. Immunologic self-tolerance maintained by CD4+CD25+
regulatory T cells constitutively expressing cytotoxic T lymphocyte-associated
antigen 4 // J. Exp. Med. – 2000. – Vol. 192. - P. 303-310.
120 Francisco L.M., Sage P.T., Sharpe A.H. The PD-1 Pathway in Tolerance
and Autoimmunity // Immunol. rev. – 2010. – Vol. 236. – P. 219-242.
121 McCoy K.D., Le Gros G. The role of CTLA-4 in the regulation of T cell
immune response // Immun. and Cell. Biol. – 1999. – Vol. 77. – P. 1–10.
122 Onishi Y., Fehervari Z., Yamaguchi T., Sakaguchi S. Foxp3+ natural
regulatory T cells preferentially form aggregates on dendritic cells in vitro and
actively inhibit their maturation // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 2008. – Vol. 105. –
P. 10113–10118.
123 Ermann J., Fathman C.G. Costimulatory signals controlling regulatory T
cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 2003. – Vol. 100, № 26. – P. 15292-15293.
124 Schaer D.A., Budhu S., Liu C., Bryson C., Malandro N., Cohen A., Zhong
H., Yang X., Houghton A.N., Merghoub T., Wolchok J.D. GITR pathway activation
abrogates tumor immune suppression through loss of regulatory T cell lineage
stability // Cancer. Immunol. Res. – 2013. – Vol. 1, № 5. – P. 320-31.
131
125 Tadokoro C.E., Shakhar G., Shen S., Ding Y., Lino A.C., Maraver A.,
Lafaille J.J., Dustin M.L. Regulatory T cells inhibit stable contacts between CD4+ T
cells and dendritic cells in vivo // J. Exp. Med. – 2006. – Vol. 203. – P. 505–511.
126 Gondek D.C., Lu L.F., Quezada S.A., Sakaguchi S., Noelle R.J. Gutting
edge: contact-mediated suppression by CD4+CD25+ regulatory cells involves a
granzyme B-dependent, perforin- independent mechanism // J. Immunol. – 2005. Vol. 174. - P. 1783-1786.
127
Schmetterer K.G., Neunkirchner A., Pickl W.F. Naturally occurring
regulatory T cells: markers, mechanisms, and manipulation // FASEB J. – 2012. –
Vol. 26, № 6. – P. 2253-2276.
128
Belladonna M.L., Puccetti P., Orabona C., Fallarino F., Vacca C., Volpi
C., Gizzi S., Pallotta M.T., Fioretti M.C., Grohmann U. Immunosuppression via
tryptophan catabolism: the role of kynurenine pathway enzymes // Transplant. –
2007. - Vol. 84. - P. I7-20.
129
Fehervari Z., Sakaguchi S. Control of FOXP3+CD4+CD25+ regulatory
cell activation and function by dendritic cells // Int. Immunol. – 2004. - Vol. 16. P.1769-1780.
130
Bettelli E., Carrier Y., Gao W., Korn T., Strom T.B., Oukka M., Weiner
H.L., Kuchroo V.K. Reciprocal developmental pathways for the generation of
pathogenic effector Thl7 and regulatory T cells // Nature. – 2006. - Vol. 441. - P.
235-238.
131 Bluestone J.A., Abbas A.K. Natural versus adaptive regulatory T cells //
Nat. Rev. Immunol. – 2003. – Vol. 3, № 3. – P. 253–257.
132 Taams L.S., Smith J., Rustin M.H., Salmon M., Poulter L.W., Akbar A.N.
Human anergic/suppressive CD4(+)CD25(+) T cells: a highly differentiated and
apoptosis-prone population // Eur. J. Immunol. –2001. –Vol.31.–P.1122–1131.
133 Gregg R.K., Jain R., Schoenleber S.J., Divekar R., Bell J.J., Lee H.H., Yu
P., Zaghouani H. A sudden decline in active membrane-bound TGF-beta impairs both
T regulatory cell function and protection against autoimmune diabetes // J. Immunol.
– 2004. – Vol. 173, № 12. – P. 7308-16.
134 Stockis J., Colau D., Coulie P.G., Lucas S. Membrane protein GARP is a
receptor for latent TGF-beta on the surface of activated human Treg // Eur. J.
Immunol. – 2009. – Vol. 39. – P. 3315–3322.
135 Li M.O., Flavell R.A. TGF-beta: a master of all T cell trades // Cell. –
2008. – Vol. 134. – P. 392–404.
136 Andersson J., Tran D.Q., Pesu M., Davidson T.S., Ramsey H., O'Shea
J.J., Shevach E.M. CD4+ FoxP3+ regulatory T cells confer infectious tolerance in a
TGF-beta-dependent manner // J. Exp. Med. – 2008. – Vol. 205. – P. 1975–1981.
137 Mahalingam J., Lin C-Y., Chiang J-M., Su P.J., Chu Y.Y., Lai H.Y., Fang
J.H., Huang C.T., Lin Y.C. CD4+ T Cells Expressing Latency-Associated Peptide
and Foxp3 Are an Activated Subgroup of Regulatory T Cells Enriched in Patients
with Colorectal Cancer // PLoS ONE. – 2014. – Vol. 9, № 9. e108554.
138 Kitani A., Chua K., Nakamura K., Strober W. Activated self-MHCreactive T cells have the cytokine phenotype of Th3/T regulatory cell 1 T cells // J.
Immunol. – 2000. – Vol. 165. – P. 691–702.
132
139 Collison L.W., Workman C.J., Kuo T.T., Boyd K., Wang Y., Vignali
K.M., Cross R., Sehy D., Blumberg R.S., Vignali D.A. The inhibitory cytokine IL-35
contributes to regulatory T-cell function // Nature. –2007.–Vol.450.–P.566–569.
140 Collison L.W., Chaturvedi V., Henderson A.L., Giacomin P.R., Guy C.,
Bankoti J., Finkelstein D., Forbes K., Workman C.J., Brown S.A., Rehg J.E., Jones
M.L., Ni H.T., Artis D., Turk M.J., Vignali D.A. IL-35-mediated induction of a
potent regulatory T cell population // Nat.Immunol.–2010.–Vol.11. –P.1093–1101.
141 Niedbala W., Wei X.Q., Cai B., Hueber A.J., Leung B.P., McInnes I.B.,
Liew F.Y. IL-35 is a novel cytokine with therapeutic effects against collagen-induced
arthritis through the expansion of regulatory T cells and suppression of Th17 cells //
Eur. J. Immunol. – 2007. – Vol. 37, № 11. – P. 3021-3029.
142 Liang S., Alard P., Zhao Y., Parnell S., Clark S.L., Kosiewicz M.M.
Conversion of CD4+CD25- cells into CD4+CD25+ regulatory T cells in vivo
requires B7 costimulation, but not the thymus // J. Exp. Med. – 2005. - Vol. 201. - P.
127-137.
143 Jonuleit H., Schmitt E., Kakirman H., Stassen M., Knop J., Enk A.H.
Infectious tolerance: Human CD25+ regulatory T cells convey suppressor activity to
conventional CD4+ T helper cells // J. Exp. Med. –2002. -Vol. 196. -P. 255-260.
144 Sato K., Yamashita N., Baba M. Matsuyama T. Modified myeloid
dendritic cells act as regulatory dendritic cells to induce anergic and regulatory T
cells // Blood. – 2003. - Vol. 101. - P. 3581-3589.
145 Cong Y., Konrad A., Iqbal N., Hatton R.D., Weaver C.T., Elson C.O.
Generation of antigen-specific, FOXP3- expressing CD4+ regulatory T cells by
inhibition of APC proteosome function // J. Immunol. – 2005. - Vol. 174. - P. 27872795.
146 Kleinclauss F., Perruche S., Masson E., de Carvalho Bittencourt M.,
Biichle S., Remy-Martin J.P., Ferrand C., Martin M., Bittard H., Chalopin J.M.,
Seilles E., Tiberghien P., Saas P. Intravenous apoptotic spleen cell infusion induces a
TGF-beta-dependent regulatory T-cell expansion // Cell Death. Differ. – 2006. - Vol.
13. - P.41-52.
147 Soligo M., Camperio C., Caristi S., Scotta C., Del Porto P., Costanzo A.,
Mantel P.Y., Schmidt-Weber C.B., Piccolella E. CD28 costimulation regulates
FOXP3 in a RelA/NF-kappaB-dependent mechanism // Eur. J. Immunol. – 2011. –
Vol. 41. – P. 503-513.
148 Taylor P.A., Friedman T.M., Korngold R., Noelle R.J., Blazar B.R.
Tolerance induction of alloreactive T cells via ex vivo blockade of the CD40–CD40L
costimulatory pathway results in the generation of a potent immune regulatory cell //
Blood. – 2002. – Vol. 99. – P. 4601–4609.
149 Malek T.R., Yu A., Vincek V., Scibelli P. Kong L. CD4 regulatory T cells
prevent lethal autoimmunity in IL-2Rβ- deficient mice. Implications for the
nonredundant function of IL-2 // Immunity. - 2002. – Vol. 17. – P. 167–178.
150 Curotto de Lafaille M.A., Lino A.C., Kutchukhidze N., Lafaille J.J. CD25T cells generate CD25+Foxp3+ regulatory T cells by peripheral expansion // J.
Immunol. – 2004. – Vol. 173. - P. 7259-7268.
133
151 Chen W., Jin W., Hardegen N., Lei K.J., Li L., Marinos N., McGrady G.,
Wahl S.M. Conversion of peripheral CD4+CD25- naive T cells to CD4+CD25+
regulatory T cells by TGF-beta induction of transcription factor Foxp3 // J. Exp. Med.
– 2003. - Vol. 198. - P. 1875-1886.
152 Weiner H.L. Induction and mechanism of action of transforming growth
factor-β-secreting Th3 regulatory cells // Immunol. Rev. - 2001. – Vol. 182. – P. 207214.
153 Banham A.H. Cell-surface IL-7 receptor expression facilitates the
purification of FOXP3+ regulatory T cells // Trends Immunol. – 2006. - Vol. 27. - P.
541-544.
154 Gol-Ara M., Jadidi-Niaragh F., Sadria R., Azizi G., Mirshafiey A. The role
of different subsets of regulatory T cells in immunopathogenesis of rheumatoid
arthritis // Arthr. – 2012. - e2012:805875.
155 Chen Y., Kuchroo V.K., Inobe J., Hafler D.A., Weiner H.L. Regulatory T
cell clones induced by oral tolerance: suppression of autoimmune encephalomyelitis
// Science. – 1994. - Vol. 265, № 5176. - P. 1237–1240.
156 Iwasaki A., Kelsall B.K. Mucosal immunity and inflammation. I. Mucosal
dendritic cells: their specialized role in initiating T cell responses // Am. J. Physiol. –
1999. – Vol. 276. – P. 1074–1078.
157 Fantini M.C., Becker C., Monteleone G., Pallone F., Galle P.R., Neurath
M. Cutting Edge: TGF-b Induces a Regulatory Phenotype in CD4+CD25- T Cells
through Foxp3 Induction and Down-Regulation of Smad7 // J. Immunol. – 2004. –
Vol. 172. – P. 5149-5153.
158 Apostolou I., Sarukhan A., Klein L., von Boehmer H. Origin of regulatory
T cells with known specificity for antigen // Nat. Immunol. – 2002. - Vol. 3, № 8. - P.
756–763.
159 Xu L., Kitani A., Fuss I., Strober W. Cutting edge: Regulatory T cells
induce CD4+CD25-Foxp3- T cells or are self-induced to become Th17 cells in the
absence of exogenous TGF-beta // J. Immunol. – 2007. –Vol. 178. – P. 6725-6729.
160 Radhakrishnan S., Cabrera R., Schenk E.L., Nava-Parada P., Bell M.P.,
Van Keulen V.P., Marler R.J., Felts S.J., Pease L.R. Reprogrammed FoxP3+ T
regulatory cells become IL-17+ antigen-specific autoimmune effectors in vitro and in
vivo // J. Immunol. – 2008. – Vol. 181. – P. 3137-3147.
161 Fossiez F., Djossou O., Chomarat P., Flores-Romo L., Ait-Yahia S., Maat
C., Pin J.J., Garrone P., Garcia E., Saeland S., Blanchard D., Gaillard C., Das
Mahapatra B., Rouvier E., Golstein P., Banchereau J., Lebecque S. T cell interleukin17 induces stromal cells to produce proinflammatory and hematopoietic cytokines //
J. Exp. Med. – 1996. – Vol. 183. – P. 2593–603.
162 Kitani A., Xu L. Regulatory T cells and the induction of IL-17 // Mucosal
Immunol. – 2008. – Vol. 1, Suppl 1. – P. 43-46.
163 Kryczek I., Wu K., Zhao E., Wei S., Vatan L., Szeliga W., Huang E.,
Greenson J., Chang A., Roliński J., Radwan P., Fang J., Wang G., Zou W. IL-17+
regulatory T cells in the microenvironments of chronic inflammation and cancer // J.
Immunol. – 2011. – Vol. 186, № 7. – P. 4388-4395.
134
164 Singh B., Schwartz J.A., Sandrock C., Bellemore S.M., Nikoopour E.
Modulation of autoimmune diseases by interleukin (IL)-17 producing regulatory T
helper (Th17) cells // Indian J. Med. Res. – 2013. – Vol. 138, № 5. – P. 591-594.
165 Kamada N., Núñez G. Role of the Gut Microbiota in the Development and
Function of Lymphoid Cells // J.Immunol. – 2013. – Vol. 190. – P. 1389-1395.
166 Maynard C.L., Weaver C.T. Diversity in the contribution of IL-10 to Tcell-mediated immune regulation // Immunol. rev. –2008. –Vol.226.–P. 219-233.
167 Bacchetta R., Bigler M., Touraine J.L., Parkman R., Tovo P.A., Abrams
J., de Waal Malefyt R., de Vries J.E., Roncarolo M.G. High levels of interleukin 10
production in vivo are associated with tolerance in SCID patients transplanted with
HLA mismatched hematopoietic stem cells // J. Exp. Med. – 1994. – Vol. 179. – P.
493–502.
168 Amodio G., Comi M., Tomasoni D., Gianolini M.E., Rizzo R., LeMaoult
J., Roncarolo M.G., Gregori S. HLA-G expression levels influence the tolerogenic
activity of human DC-10 // Haematol. – 2015. – Vol. 100, № 4. – P. 548-557.
169 Awasthi A., Carrier Y., Peron J.P., Bettelli E., Kamanaka M., Flavell R.A.,
Kuchroo V.K., Oukka M., Weiner H.L. A dominant function for interleukin 27 in
generating interleukin 10-producing анти-inflammatory T cells // Nat Immunol. –
2007. – Vol. 8. – P. 1380–1389.
170 Rutz S., Janke M., Kassner N., Hohnstein T., Krueger M., Scheffold A.
Notch regulates IL-10 production by T helper 1 cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. –
2008. – Vol. 105. – P. 3497-3502.
171 Groux H., O‘Garra A., Bigler M., Rouleau M., Antonenko S., deVries J.E.,
Roncarolo M.G. A CD4+ T-cell subset inhibits antigen-specific T-cell responses and
prevents colitis // Nature. – 1997. – Vol. 389. – P. 737–742.
172 Bacchetta R., Sartirana C., Levings M.K., Bordignon C., Narula S.,
Roncarolo M.G. Growth and expansion of human T regulatory type 1 cells are
independent from TCR activation but require exogenous cytokines // Eur. J.
Immunol. – 2002. – Vol. 32. – P. 2237–2245.
173 Sebastiani S., Allavena P., Albanesi C., Nasorri F., Bianchi G., Traidl C.,
Sozzani S., Girolomoni G., Cavani A.Chemokine receptor expression and function in
CD4+ T lymphocytes with regulatory activity // J. Immunol. – 2001. – Vol. 166. – P.
996–1002.
174 Zelenika D., Adams E., Humm S., Graca L., Thompson S., Cobbold
S.P.,Waldmann H. Regulatory T cells overexpress a subset of Th2 gene transcripts //
J. Immunol. – 2002. – Vol. 168. – P. 1069–1079.
175 Roncarolo M.G., Bacchetta R., Bordignon C., Narula S., Levings M.K.
Type 1 T regulatory cells // Immunol. Rev. - 2001. – Vol. 182. – P. 68-79.
176 Thomson A.W., Turnquist H.R., Raimondi G. Immunoregulatory functions
of mTOR inhibition // Nat. Rev. Immunol. –2009. –Vol. 9. – P. 324–337.
177 Wang Y.M. Alexander S.I. CD8 regulatory T cells: what's old is now new
// Immunol. Cell Biol. – 2009. – Vol. 87, № 3. – P. 192-193.
178 Hunt J.S., Petroff M.G., McIntire R.H., Ober C. HLA-G and immune
tolerance in pregnancy // FASEB J. – 2005. – Vol. 19, № 7. – P. 681-693.
135
179 Huang Y.H., Zozulya A.L., Weidenfeller C., Schwab N., Wiendl H. T cell
suppression by naturally occurring HLA-G-expressing regulatory CD4+ T cells is IL10-dependent and reversible // J. Leukoc. Biol. – 2009. – Vol. 86. – P. 273–281.
180 Marchesi M., Andersson E., Villabona L., Seliger B., Lundqvist A.,
Kiessling R., Masucci G.V. HLA-dependent tumour development: a role for tumour
associate macrophages? // J. Translat. Med. – 2013. – Vol. 11. 247p.
181 Hsu P., Santner-Nanan B., Joung S., Peek M.J., Nanan R. Expansion of
CD4(+) HLA-G(+) T Cell in human pregnancy is impaired in pre-eclampsia // Am. J.
Reprod. Immunol. – 2014. – Vol. 71, № 3. – P. 217-228.
182 Andolfi G., Fousteri G., Rossetti M., Magnani C.F., Jofra T., Locafaro G.,
Bondanza A., Gregori S., Roncarolo M.G. Enforced IL-10 expression confers type 1
regulatory T cell (Tr1) phenotype and function to human CD4(+) T cells // Mol. Ther.
– 2012. – Vol. 20, № 9. – P. 1778-1790.
183 Abbas A.K., Lichtman A.H. Cellular and Molecular Immunology. Saunders Copyright, 2003.- 566p.
184 Stewart C.A., Vivier E. Strategies of Nk cell recognition and their roles in
tumor immunosurveillance. How the immune system recognizes self and nonself:
immunoreceptors and their signaling. - Tokyo: Springer, 2007.-P.37-81.
185 Lieberman J. The ABCs of granule-mediated cytotoxicity: new weapons
in the arsenal // Nat. Rev. Immunol. - 2003. - Vol. 3. - P. 361-370.
186 Wu P., Wei H., Zhang C., Zhang J., Tian Z. Regulation of NK cell
activation by stimulatory and inhibitory receptors in tumor escape from innate
immunity // Front Biosci. – 2005. –Vol. 10. – P.3132–3142.
187 Cooper M.A., Fehniger T.A., Fuchs A., Colonna M., Caligiuri M.A. NK
cell and DC interactions // Trends Immunol. – 2004. – Vol. 25. – P. 47–52.
188 Storkus W.J., Salter R.D., Alexander J., Ward F.E., Ruiz R.E., Cresswell
P., Dawson J.R. Class I-induced resistance to natural killing: identification of
nonpermissive residues in HLA-A2 // Proc. Nat. Acad. Sc. USA. – 1991. – Vol. 88,
№ 14. – P. 5989-5992.
189 Waldhauer I., Steinle A. NK cells and cancer immunosurveillance //
Oncogene. – 2008. – Vol. 27, № 45. – P. 5932-43.
190 Cheng M., Chen Y., Xiao W., Sun R., Tian Z. NK cell-based
immunotherapy for malignant diseases // Cel. Mol. Immunol. – 2013. – Vol. 10, № 3.
– P. 230-252.
191 Hanna N. Inhibition of experimental tumor metastasis by selective
activation of natural killer cells // Cancer Res. –1982. –Vol. 42, № 4. –P. 1337-42.
192 Gorelik E., Herberman R.B. Susceptibility of various strains of mice to
urethan-induced lung tumors and depressed natural killer cell activity // J. Natl.
Cancer Inst. – 1981. – Vol. 67, № 6. – P. 1317-22.
193 Balch C.M., Tilden A.B., Dougherty P.A., Cloud G.A. Depressed levels
of granular lymphocytes with natural killer (NK) cell function in 247 cancer patients
// Ann.Surg. – 1983. – Vol. 198, № 2. – P. 192-199.
194 Mamessier E., Sylvain A., Thibult M.L., Houvenaeghel G., Jacquemier J.,
Castellano R., Gonçalves A., André P., Romagné F., Thibault G., Viens P., Birnbaum
D., Bertucci F., Moretta A., Olive D. Human breast cancer cells enhance self
136
tolerance by promoting evasion from NK cell antitumor immunity // J. Clin. Invest. –
2011. – Vol. 121. – P. 3609–3622.
195 Mamessier E., Pradel L.C., Thibult M.-L.M.-L., Drevet C., Zouine A.,
Jacquemier J., Houvenaeghel G., Bertucci F., Birnbaum D., Olive D. Peripheral
Blood NK Cells from Breast Cancer Patients Are Tumor-Induced Composite Subsets
// J.Immunol. – 2013. – Vol. 190. – P. 2424–2436.
196 Pross H.F., Lotzova E. Role of Natural killer cells in cancer //
Nat.Immunol. -1993. – Vol. 12. – P.279-292.
197 Langers I., Renoux V.M., Thiry M., Delvenne P., Jacobs N. Natural killer
cells: role in local tumor growth and metastasis // Biol.  Targ. & Ther. – 2012. – Vol.
6. – P. 73-82.
198 Guan H., Moretto M., Bzik D.J., Gigley J., Khan I.A. NK cells enhance
dendritic cell response against parasite antigens via NKG2D pathway // J. Immunol. –
2007. – Vol. 179. – P. 590–596.
199 Zitvogel L. Dendritic and Natural killer cells cooperate in the
control/switch of innate immunity // J. Exp. Med. – 2002. – Vol. 195. - F9–F14.
200 Bennett S.R., Carbone F.R., Karamalis F., Flavell R.A., Miller J.F., Heath
W.R. Help for cytotoxic-T-cell responses is mediated by CD40 signaling // Nat. –
1998. – Vol. 393. – P. 478–480.
201 Adam C., King S., Allgeier T., Braumuller H., Luking C., Mysliwietz J.,
Kriegeskorte A., Busch D.H., Rocken M., Mocikat R. DC-NK cell cross talk as a
novel CD4+ T-cell-independent pathway for antitumor CTL induction // Blood. –
2005. – Vol. 106. – P. 338–344.
202 Kelly J.M., Darcy P.K., Markby J.L., Godfrey D.I., Takeda K., Yagita H.,
Smyth M.J. Induction of tumor-specific T cell memory by NK cell-mediated tumor
rejection // Nat. Immunol. – 2002. – Vol. 3. – P. 83–90.
203 Wilcox R.A., Tamada K., Strome S.E., Chen L. Signaling through NK
cell-associated CD137 promotes both helper function for CD8+ cytolytic T cells and
responsiveness to IL-2 but not cytolytic activity // J. Immunol. – 2002. – Vol. 169. –
P. 4230–4236.
204 Phillips J.H., Le A.M., Lanier L.L. Natural killer cells activated in a
human mixed lymphocyte response culture identified by expression of Leu-11 and
class II histocompatibility antigens // J.Exp. Med. –1984. –Vol. 159. – P.993–1008
205 Roncarolo M.G., Bigler M., Haanen J.B., Yssel H., Bacchetta R., de Vries
J.E., Spits H. Natural killer cell clones can efficiently process and present protein
antigens // J. Immunol. – 1991. – Vol. 147. – P. 781–787.
206 Zingoni A., Sornasse T., Cocks B.G., Tanaka Y., Santoni A., Lanier L.L.
Cross-talk between activated human NK cells and CD4+ T cells via OX40-OX40L
interaction // J. Immunol. – 2004. – Vol. 173. – P. 3716–3724.
207 Hanna J., Gonen-Gross T., Fitchett J., Daniels M., Heller M., GonenGross T., Manaster E., Cho S.Y., LaBarre M.J., Mandelboim O. Novel APC-like
properties of human NK cells directly regulate T cell activation // J. Clin. Invest. –
2004. – Vol. 114. – P. 1612–1623.
208 Moretta A. Natural killer cells and dendritic cells: rendezvous in abused
tissues // Nat. Rev. Immunol. – 2002. – Vol. 2. – P. 957–963.
137
209 Heinzel F.P., Schoenhaut D.S., Rerko R.M., Rosser L.E., Gately M.K.
Recombinant interleukin 12 cures mice infected with Leishmania major // J. Exp.
Med. – 1993. – Vol. 177. – P. 1505–1509.
210 Bernstein H.B., Plasterer M.C., Schiff S.E., Kitchen C-M.R., Kitchen S.,
Zack J.A. CD4 expression on activated NK cells: ligation of CD4 induces cytokine
expression and cell migration // J.Immunol. –2006.–Vol.177, № 6. –P. 3669–3676.
211 Moretta L., Ferlazzo G., Mingari M.C., Melioli G., Moretta A. Human
natural killer cell function and their interactions with dendritic cells // Vac. – 2003. –
Vol. 21. - S38–S42.
212 Chiesa M.D., Vitale M., Carlomagno S., Ferlazzo G., Moretta L., Moretta
A.. The natural killer cell-mediated killing of autologous dendritic cells is confined to
a cell subset expressing CD94/NKG2A, but lacking inhibitory killer Ig-like receptors
// Eur. J. Immunol. – 2003. – Vol. 33, № 6. – P. 1657–1666.
213 Trivedi P.P., Roberts P.C., Wolf N.A., Swanborg R.H. NK cells inhibit T
cell proliferation via p21-mediated cell cycle arrest // J. Immunol. – 2005. – Vol. 174.
– P. 4590–4597.
214 Yu G., Xu X., Vu M.D., Kilpatrick E.D., Li X.C. NK cells promote
transplant tolerance by killing donor antigen-presenting cells // J. Exp. Med. – 2006.
– Vol. 203. – P. 1851–1858.
215 Cooper M.A., Fehniger T.A., Turner S.C., Chen K.S., Ghaheri B.A.,
Ghayur T., Carson W.E., Caligiur M.A. Human natural killer cells: a unique innate
immunoregulatory role for the CD56bright subset // Blood. – 2001. – Vol. 97. – P.
3146–3151.
216 Hu P.F., Hultin L.E., Hultin P., Hausner M.A., Hirji K., Jewett A.,
Bonavida B., Detels R., Giorgi J.V. Natural killer cell immunodeficiency in HIV
disease is manifest by profoundly decreased numbers of CD16+CD56+ cells and
expansion of a population of CD16dimCD56- cells with low lytic activity // J. Acq.
Immun. Defic. Syndr. Hum. Retrovirol. – 1995. – Vol. 10. – P. 331–340.
217 Koopman L.A., Kopcow H.D., Rybalov B., Boyson J.E., Orange J.S.,
Schatz F., Masch R., Lockwood C.J., Schachter A.D., Park P.J., Strominger J.L.
Human decidual natural killer cells are a unique NK cell subset with
immunomodulatory potential // J. Exp.Med. – 2003. – Vol. 198. – P. 1201–1212.
218 Croy B.A., Esadeg S., Chantakru S., van den Heuvel M., Paffaro V.A., He
H., Black G.P., Ashkar A.A., Kiso Y., Zhang J. Update on pathways regulating the
activation of uterine natural killer cells, their interactions with decidual spiral arteries
and homing of their precursors to the uterus // J. Reprod. Immunol. – 2003. – Vol. 59.
– P. 175–191.
219 Chan A., Hong D.L., Atzberger A., Kollnberger S., Filer A.D., Buckley
C.D., McMichael A., Enver T., Bowness P. CD56bright human NK cells differentiate
into CD56dim cells: role of contact with peripheral fibroblasts // J. Immunol. – 2007.
– Vol. 179. – P. 89–94.
220 Zheng X., Wang Y., Wei H., Ling B., Sun R., Tian Z. Bcl-xL is associated
with the antiapoptotic effect of IL-15 on the survival of CD56(dim) natural killer
cells // Mol. Immunol. – 2008. – Vol. 45. – P. 2559–2569.
138
221 Spaggiari G.M., Carosio R., Pende D., Marcenaro S., Rivera P., Zocchi
M.R., Moretta L., Poggi A.. NK cell-mediated lysis of autologous antigen-presenting
cells is triggered by the engagement of the phosphatidylinositol 3-kinase upon
ligation of the natural cytotoxicity receptors NKp30 and NKp46 // Eur. J. Immunol. –
2001. – Vol. 31, № 6. – P. 1656–1665.
222 Wei H., Zhang J., Xiao W., Feng J., Sun R., Tian Z. Involvement of
human natural killer cells in asthma pathogenesis: Natural killer cell 2 cells in type 2
cytokine predominance // J. Allergy Clin. Immunol. – 2005. – Vol. 115. – P. 841–
847.
223 Shigeru S, Akitoshi N, Subaru MH, Shiozaki A (2008) The balance between
cytotoxic NK cells and regulatory NK cells in human pregnancy. J Reprod Immunol
77:14–22
224 Caminschi I., Ahmet F., Heger K., Brady J., Nutt S.L., Vremec D.,
Pietersz S., Lahoud M.H., Schofield L., Hansen D.S., O'Keeffe M., Smyth M.J.,
Bedoui S., Davey G.M., Villadangos J.A., Heath W.R., Shortman K. Putative IKDCs
are functionally and developmentally similar to natural killer cells, but not to
dendritic cells // J. Exp. Med. – 2007. – Vol. 204. – P. 2579–2590.
225 Maroof A., Beattie L., Zubairi S., Svensson M., Stager S., Kayr P.M.
Posttranscriptional regulation of il10 gene expression allows natural killer cells to
express immunoregulatory function // Immunity. – 2008. – Vol. 29. – P. 295–305.
226 Caumartin J., Favier B., Daouya M., Guillard C., Moreau P., Carosella
E.D., LeMaoult J. Trogocytosis-based generation of suppressive NK cells // EMBO J.
– 2007. – Vol. 26. – P. 1423–1433.
227 Stewart B.W., Wild C.P. World Cancer Report. WHO, 2014. – 619 p.
228 Cheng F., Gabrilovich D., Sotomayor E.M. Immune tolerance in breast
cancer // Breast Dis. – 2004. – Vol. 20. – P. 93–103.
229 Investigational PD-L1–targeted Immunotherapy Safe for Patients With
Triple-negative Breast Cancer, Effective in Some. http://www.aacr.org 20.04.2015.
230 Singh B., Read S., Asseman C., Malmström V., Mottet C., Stephens L.A.,
Stepankova R., Tlaskalova H., Powrie F. Control of intestinal inflammation by
regulatory T cells // Immunol. Rev. – 2001. – Vol. 182. - P. 190-200.
231 Mougiakakos D., Choudhury A., Lladsev A., Kiessling R., Johansson
C.C. Regulatory T cells in cancer //Adv.Cancer.Res. –2010.–Vol. 107. –P. 57–117.
232 Ladoire S., Arnould L., Mignot G., Coudert B., Rébé C., Chalmin F.,
Vincent J., Bruchard M., Chauffert B., Martin F., Fumoleau P., Ghiringhelli F.
Presence of FoxP3 expression in tumor cells predicts better survival in HER2overexpressing breast cancer patients treated with neoadjuvant chemotherapy //
Breast Cancer Res.Treat. – 2010. – Vol. 125, № 1. – P. 65-72.
233 Curiel T.J., Coukos G., Zou L., Alvarez X., Cheng P., Mottram P.,
Evdemon-Hogan M., Conejo-Garcia J.R., Zhang L., Burow M., Zhu Y., Wei S.,
Kryczek I., Daniel B., Gordon A., Myers L., Lackner A., Disis M.L., Knutson K.L.,
Chen L., Zou W. Specific recruitment of regulatory T cells in ovarian carcinoma
fosters immune privilege and predicts reduced survival // Nat.Med. – 2004. – Vol. 10.
– P. 942–949.
139
234 Ladoire S., Arnould L., Apetoh L., Coudert B., Martin F., Chauffert B.,
Fumoleau P., Ghiringhelli F. Pathologic complete response to neoadjuvant
chemotherapy of breast carcinoma is associated with the disappearance of tumorinfiltrating foxp3+ regulatory T cells // Clin. Cancer. Res. – 2008. – Vol. 14. – P.
2413–2420.
235 Bates G.J., Fox S.B., Han C., Leek R.D., Garcia J.F., Harris A.L., Banham
A.H. Quantification of regulatory T cells enables the identification of high-risk breast
cancer patients and those at risk of late relapse // J.Clin.Oncol. – 2006. – Vol. 24. – P.
5373–5380.
236 Adeegbe D.O., Nishikawa H. Natural and Induced T Regulatory Cells in
Cancer // Front. Immunol. – 2013. – Vol. 4. – P. 190.
237 Hindley J.P., Ferreira C., Jones E., Lauder S.N., Ladell K., Wynn K.K.,
Betts G.J., Singh Y., Price D.A., Godkin A.J., Dyson J., Gallimore A. Analysis of the
T-cell receptor repertoires of tumor-infiltrating conventional and regulatory T cells
reveals no evidence for conversion in carcinogen-induced tumors // Cancer Res. –
2011. – Vol. 71, № 3. – P. 736–746.
238 Valzasina B., Piconese S., Guiducci C., Colombo M.P. Tumor-induced
expansion of regulatory T cells by conversion of CD4+CD25- lymphocytes is thymus
and proliferation independent // Cancer Res. – 2006. – Vol. 66, № 8. – P. 4488–4495.
239 Haribhai D., Williams J.B., Jia S., Nickerson D., Schmitt E.G., Edwards B,
Ziegelbauer J., Yassai M., Li S.H., Relland L.M., Wise P.M., Chen A., Zheng Y.Q.,
Simpson P.M., Gorski J., Salzman N.H., Hessner M.J., Chatila T.A., Williams C.B. A
requisite role for induced regulatory T cells in tolerance based on expanding antigen
receptor diversity // Immunity. – 2011. – Vol. 35, № 1. – P. 109–122.
240 Shimizu J., Yamazaki S., Sakaguchi S. Induction of tumor immunity by
removing CD25+CD4+ T cells: a common basis between tumor immunity and
autoimmunity // J. Immunol. – 1999, - Vol. 163. – P. 5211–5218.
241 Abo-Elenein A., Elgohary S.E., Hashish A., El-Halaby E. Significance of
immunoregulatory T cells in different stages of breast cancer patients // Egypt. J.
Immunol. – 2008. – Vol. 15. – P. 145-52.
242 Watanabe M.A., Oda J.M., Amarante M.K., Cesar Voltarelli J. Regulatory
T cells and breast cancer: implications for immunopathogenesis // Cancer Metastasis
Rev. – 2010. – Vol. 29, № 4. – P. 569-79.
243 Akasaki Y., Liu G., Chung N.H., Ehtesham M., Black K.L., Yu J.S.
Induction of a CD4+ T regulatory type 1 response by cyclooxygenase-2overexpressing glioma // J. Immunol. – 2004. – Vol. 173, № 7. – P. 4352–4359.
244 Conroy H., Galvin K.C., Higgins S.C., Mills K.H. Gene silencing of TGFbeta1 enhances antitumor immunity induced with a dendritic cell vaccine by reducing
tumor-associated regulatoryTcells // Cancer Immunol. Immunother. – 2012. – Vol.
61, № 3. – P. 425–431.
245 Yu X., Li H., Ren X. Interaction between regulatory T cells and cancer
stem cells // Int. J. Cancer. - 2012. – Vol. 131. – P. 1491–1498.
246 Bergmann C., Strauss L., Zeidler R., Lang S., Whiteside T.L. Expansion of
human T regulatory type 1 cells in the microenvironment of cyclooxygenase 2
140
overexpressing head and neck squamous cell carcinoma // Cancer Res. – 2007. – Vol.
67, № 18. – P. 8865–8873.
247 Gabrilovich D.I., Nagaraj S. Myeloid-derived suppressor cells as regulators
of the immune system // Nat. Rev. Immunol. – 2009. – Vol. 9, № 3. – P. 162–174.
248 Ramos R.N., Chin L.S., Dos Santos A.P., Bergami-Santos P.C., Laginha
F., Barbuto J.A. Monocyte-derived dendritic cells from breast cancer patients are
biased to induce CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cells // J. Leukoc. Biol. – 2012. –
Vol. 92, № 3. – P. 673–682.
249 Carlsten M., Norell H., Bryceson Y.T., Poschke I., Schedvins K.,
Ljunggren H.G., Kiessling R., Malmberg K.J. Primary human tumor cells expressing
CD155 impair tumor targeting by down-regulating DNAM-1 on NK cells // J.
Immunology. – 2009. - Vol. 183, № 8. - P. 4921–4930.
250 Paul P., Rouas-Freiss N., Khalil-Daher I., Moreau P., Riteau B., Le Gal
F.A., Avril M.F., Dausset J., Guillet J.G., Carosella E.D. HLA-G expression in
melanoma: a way for tumor cells to escape from immunosurveillance // Proc. Natl.
Acad. Sci. USA. – 1998. – Vol. 95. – P. 4510–4515.
251 Rezvany M.R., Kazemi A., Hajifathali A., Kaviani S., Mellstedt H.
Analysis of HLA-G gene expression in B-lymphocytes from chronic lymphocytic
leukemia patients // Iran. Biomed. J. – 2007. – Vol. 11. – P. 125–129.
252 Moreau P., Adrian-Cabestre F., Menier C., Guiard V., Gourand L.,
Dausset J., Carosella E.D., Paul P. IL-10 selectively induces HLA-G expression in
human trophoblasts and monocytes // Int. Immunol. – 1999. -Vol. 11. –P. 803–811.
253 Beyer M., Schultze J.L. CD4+CD25highFOXP3+ regulatory T cells in
peripheral blood are primarily of effector memory phenotype // J. Clin. Oncol. –
2007. – Vol. 25, № 18. – P. 2628-2630;
254 Seddiki N., Santner-Nanan B., Tangye S.G., Alexander S.I., Solomon M.,
Lee S., Nanan R., Fazekas de Saint Groth B. Persistence of naive CD45RA
regulatory T cells in adult life // Blood. – 2006. – Vol. 107. – 7p.
255 Cesana G.C., DeRaffele G., Cohen S., Moroziewicz D., Mitcham J.,
Stoutenburg J., Cheung K., Hesdorffer C., Kim-Schulze S., Kaufman H.L.
Characterization of CD4+CD25+ regulatory T cells in patients treated with high-dose
interleukin-2 for metastatic melanoma or renal cell carcinoma // J. Clin. Oncol. –
2006. – Vol. 24. – P. 1169-1177.
256 Ronchetti S., Ricci E., Petrillo M.G., Cari L., Migliorati G., Nocentini G.,
Riccardi C. Glucocorticoid-Induced Tumour Necrosis Factor Receptor-Related
Protein: A Key Marker of Functional Regulatory T Cells // J. Immunol. Res. – 2015. Vol. 2015. - 17p.
257 Krausz L.T., Fischer-Fodor E., Major Z.Z., Fetica B. GITR-expressing
regulatory T-cell subsets are increased in tumor-positive lymph nodes from advanced
breast cancer patients as compared to tumor-negative lymph nodes // Int. J.
Immunopathol. Pharmacol. – 2012. – Vol. 25, № 1. – P. 59-66.
258 Schuler P.J., Schilling B., Harasymczuk M., Hoffmann T.K., Johnson J.,
Lang S., Whiteside T.L. Phenotypic and functional characteristics of CD4+CD39+
FOXP3+ and CD4+CD39+FOXP3neg T-cell subsets in cancer patients // Eur. J. of
Immun. - 2012. - Vol.42. - P.1876-1885.
141
259 Mandapathil M., Szczepanski M.J., Szajnik M., Ren J., Lenzner D.E.,
Jackson E.K., Gorelik E., Lang S., Johnson J.T., Whiteside T.L. Increased
ectonucleotidase expression and activity in regulatory T cells of patients with head
and neck cancer//J. Clin. Cancer. Res.-2009.-Vol.15.-P.6348-6357.
260 Rech A.J., Mick R., Kaplan D.E., Chang K.M., Domchek S.M.,
Vonderheide R.H. Homeostasis of peripheral FoxP3(+) CD4 (+) regulatory T cells in
patients with early and late stage breast cancer // Cancer Immunol. Immunother. –
2010. – Vol. 59. – P. 599-607.
261 Verma C., Eremin J.M., Robins A., Bennett A.J., Cowley G.P., El-Sheemy
M.A., Jibril J.A., Eremin O. Abnormal T regulatory cells (Tregs: FOXP3+, CTLA4+), myeloid-derived suppressor cells (MDSCs: monocytic, granulocytic) and
polarised T helper cell profiles (Th1, Th2, Th17) in women with large and locally
advanced breast cancers undergoing neoadjuvant chemotherapy (NAC) and surgery:
failure of abolition of abnormal treg profile with treatment and correlation of treg
levels with pathological response to NAC // J. Transl. Med. – 2013. – Vol. 15. – P.
11-16.
262 Jie H-B, Gildener-Leapman N., Li J., Srivastava R.M., Gibson S.P.,
Whiteside T.L., Ferris R.L. Intratumoral regulatory T cells upregulate
immunosuppressive molecules in head and neck cancer patients // Brit. J. Cancer. –
2013. – Vol. 109, № 10. – P. 2629-2635.
263 Beyer M., Classen S., Endl E., Kochanek M., Weihrauch M.R., DebeyPascher S., Knolle P.A., Schultze J.L. Comparative approach to define increased
regulatory T cells in different cancer subtypes by combined assessment of CD127
and FOXP3 // Clin. Dev. Immunol. – 2011. – e2011:734036.
264 Lin X., Chen M., Liu Y., Guo Z., He X., Brand D., Zheng S.G. Advances
in distinguishing natural from induced Foxp3+ regulatory T cells // Int. J. Clin. Exp.
Pathol. – 2013. – Vol. 6, № 2. – P. 116-123.
265 Wainwright D.A., Sengupta S., Han Y., Lesniak M.S. Thymus-derived
rather than tumor-induced regulatory T cells predominate in brain tumors // Neuro.
Oncol. – 2011. – Vol. 13, № 12. – P. 1308-1323.
266 Jiang Q., Su H., Knudsen G., Helms W., Su L. Delayed functional
maturation of natural regulatory T cells in the medulla of postnatal thymus: role of
TSLP // BMC Immunol. – 2006. – Vol. 7. – P. 6.
267 Bruinsma M., van Soest P.L., Leenen P.J., Lambrecht B.N., Cupedo T.,
Löwenberg B., Cornelissen J.J., Braakman E. Keratinocyte growth factor induces
expansion of murine peripheral CD4+Foxp3+ regulatory T cells and increases their
thymic output // J. Immunol. – 2007. – Vol. 179. – P. 7424-7430.
268 Zhao X., Ye F., Chen L., Lu W., Xie X. Human epithelial ovarian
carcinoma cell-derived cytokines cooperatively induce activated CD4+CD25CD45RA+ naïve T cells to express forkhead box protein 3 and exhibit suppressive
ability in vitro // Cancer Sci. – 2009. – Vol. 100, № 11. – P. 2143-2151.
269 Yin Y., Cai X., Chen X., Liang H., Zhang Y., Li J., Wang Z., Chen X.,
Zhang W., Yokoyama S., Wang C., Li L., Li L., Hou D., Dong L., Xu T., Hiroi T.,
Yang F., Ji H., Zhang J., Zen K., Zhang C.Y. Tumor-secreted miR-214 induces
142
regulatory T cells: a major link between immune evasion and tumor growth // Cell
Res. – 2014. – Vol. 24, № 10. – P. 1164-1180.
270 Ramos R.N., de Moraes C.J., Zelante B., Barbuto J.A. What are the
molecules involved in regulatory T-cells induction by dendritic cells in cancer? //
Clin. Dev. Immunol. – 2013. - e2013:806025.
271 Martin-Orozco N. T helper 17 cells promote cytotoxic T cell activation in
tumor immunity // Immunity. – 2009. – Vol. 31, № 5. – P. 787-798.
272 Islas-Vazquez L., Prado-Garcia H., Aguilar-Cazares D., Meneses-Flores
M., Galicia-Velasco M., Romero-Garcia S., Camacho-Mendoza C, Sullivan LopezGonzalez J. LAP TGF-Beta Subset of CD4+CD25+CD127− Treg Cells is Increased
and Overexpresses LAP TGF-Beta in Lung Adenocarcinoma Patients // BioMed.
Res. Intern. - 2015. - e430943.
273 Ji Y., Zhang W. Th17 cells: positive or negative role in tumor? // Cancer
Immunol. Immunother. – 2010. – Vol. 59, № 7. – P. 979-987.
274 Yang L. Expression of Th17 cells in breast cancer tissue and its
association with clinical parameters // Cell Biochem. Biophys. – 2012. – Vol. 62, №
1. – P. 153-159.
275 Canavan J.B., Scottà C., Vossenkämper A., Goldberg R., Elder M.J.,
Shoval I., Marks E., Stolarczyk E., Lo J.W., Powell N., Fazekasova H., Irving P.M.,
Sanderson J.D., Howard J.K., Yagel S., Afzali B., MacDonald T.T., HernandezFuentes M.P., Shpigel N.Y., Lombardi G., Lord G.M. Developing in vitro expanded
CD45RA+ regulatory T cells as an adoptive cell therapy for Crohn's disease // Gut. –
2015. - e2014-306919.
276 Goldberg J.E., Schwertfeger K.L. Proinflammatory Cytokines in Breast
Cancer: Mechanisms of Action and Potential Targets for Therapeutics // Curr. Drug.
Targets. – 2010. – Vol. 11, № 9. – P. 1133-1146.
277 Barcellos-Hoff M.H., Akhurst R.J. Transforming growth factor-beta in
breast cancer: too much, too late//Breast Cancer Res. –2009.–Vol. 11,№1. –P. 202.
278 Yu P., Lee Y., Liu W., Krausz T., Chong A., Schreiber H., Fu Y.X.
Intratumor depletion of CD4+ cells unmasks tumor immunogenicity leading to the
rejection of late-stage tumors // J. Exp. Med. –2005. –Vol. 201, № 5. – P. 779-791.
279 Bergmann C., Strauss L., Wang Y., Szczepanski M.J., Lang S., Johnson
J.T., Whiteside T.L. T regulatory type 1 cells in squamous cell carcinoma of the head
and neck: mechanisms of suppression and expansion in advanced disease // Clin.
Cancer Res. – 2008. – Vol. 14, № 12. – P. 3706-15.
280 Marshall N.A., Christie L.E., Munro L.R., Culligan D.J., Johnston P.W.,
Barker R.N., Vickers M.A. Immunosuppressive regulatory T cells are abundant in the
reactive lymphocytes of Hodgkin lymphoma // Blood. – 2004. – Vol. 103, № 5. – P.
1755–62.
281 Vieira P.L., Christensen J.R., Minaee S., O‘Neill E.J., Barrat F.J., Boonstra
A., Barthlott T., Stockinger B., Wraith D.C., O'Garra A. IL-10-secreting regulatory T
cells do not express Foxp3 but have comparable regulatory function to naturally
occurring CD4+CD25+ regulatory Tcells // J. Immunol. – 2004. – Vol. 172, № 10. –
P. 5986–5993.
143
282 Tran D.Q., Ramsey H., Shevach E.M. Induction of FOXP3 expression in
naïve human CD4+FOXP3- T cells by T-cell receptor stimulation is transforming
growth factor-beta dependent but does not confer a regulatory phenotype // Blood. –
2007. – Vol. 110, № 8. – P. 2983–2990.
283 Mandapathil M., Whiteside T.L. Targeting human inducible regulatory T
cells (Tr1) in patients with cancer: blocking of adenosine-prostaglandin E2
cooperation // Exp. Opin. Boil. Ther. – 2011. – Vol. 11, № 9. – P. 1203-1214.
284 Mandapathil M., Szczepanski M.J., Szajnik M., Ren J., Jackson EK.,
Johnson J.T., Gorelik E., Lang S., Whiteside T.L. Adenosine and Prostaglandin E2
Cooperate in the Suppression of Immune Responses Mediated by Adaptive
Regulatory T Cells // J. Biol. Chem. – 2010. – Vol. 36. – P. 27571-27580.
285 Olson B.M., Sullivan J.A., Burlingham W.J. Interleukin 35: A Key
Mediator of Suppression and the Propagation of Infectious Tolerance // Front.
Immunol. – 2013. – Vol. 4. – 315p.
286 Whiteside T.L., Schuler P., Schilling B. Induced and natural regulatory T
cells in human cancer // Exp. Opin. Biol. Ther. – 2012. – Vol. 12, № 10. – P. 1383–
1397.
287 Farashi-bonab S., Khansari N. Regulatory T Cells in Cancer Patients and
Their Roles in Cancer Development/Progression // MOJ Immunol. – 2013. – Vol. 1,
№ 4. e00024.
288 Mocellin S., Marincola F.M., Young H.A. Interleukin-10 and the immune
response against cancer: a counterpoint // J. Leukoc. Biol. – 2005. – Vol. 78. – P.
1043–1051.
289 Segal B.M., Glass D.D., Shevach E.M. CuttingEdge: IL-10- producing
CD4+ T cells mediate tumor rejection//J. Immunol. –2002. –Vol. 168,№1. –P. 1–4.
290 Mocellin S., Panelli M.C., Wang E., Nagorsen D., Marincola F.M. The
dual role of IL-10 // Trends Immunol. – 2003. – Vol. 24. – P. 36–43.
291 Wang R., Jaw J.J., Stutzman N.C., Zou Z., Sun P.D. Natural killer cellproduced IFN-γ and TNF-α induce target cell cytolysis through up-regulation of
ICAM-1 // J. Leukoc. Biol. – 2012. – Vol. 91. – P. 299–309.
292 Lebrun J.J. The dual role of TGF-β in human cancer: from tumor
suppression to cancer metastasis // ISRN Mol. Biol. – 2012. - 1-28.
293 Chen Z-M., O‘Shaughnessy M.J., Gramaglia I., Panoskaltsis-Mortari A.,
Murphy W.J., Narula S., Roncarolo M.G., Blazar B.R.. IL-10 and TGF-β induce
alloreactive CD4+CD25- T cells to acquire regulatory cell function // Blood. - 2003. Vol. 101, № 12. – P. 5076-5083.
294 Cortesini R., LeMaoult J., Ciubotariu R., Cortesini N.S. CD8+CD28- T
suppressor cells and the induction of antigen-specific, antigen-presenting cellmediated suppression of Th reactivity // Immunol. Rev. – 2001. – Vol. 182. – P. 201206.
295 Fischer K., Voelkl S., Heymann J., Przybylski G.K., Mondal K., Laumer
M., Kunz-Schughart L., Schmidt C.A., Andreesen R., Mackensen A. Isolation and
characterization of human antigen-specific TCR alpha beta+ CD4(-)CD8- doublenegative regulatory T cells // Blood. – 2005. – Vol. 105. – P. 2828-2835.
144
296 Filaci G., Fenoglio D., Fravega M., Ansaldo G., Borgonovo G., Traverso
P., Villaggio B., Ferrera A., Kunkl A., Rizzi M., Ferrera F., Balestra P., Ghio M.,
Contini P., Setti M, Olive D., Azzarone B., Carmignani G., Ravetti J.L., Torre G.,
Indiveri F. CD8+CD28− T Regulatory Lymphocytes Inhibiting T Cell Proliferative
and Cytotoxic Functions Infiltrate Human Cancers // J Immunol. - 2007. - Vol. 179. P. 4323-4334.
297 Rouas-Freiss N., Moreau P., Ferrone S., Carosella E.D. HLA-G proteins
in cancer: do they provide tumor cells with an escape mechanism? // Cancer Res. –
2005. – Vol. 65, № 22. – P. 10139-44.
298 Wang H., Daniel V., Sadeghi M., Opelz G. Differences in the induction of
induced human CD4(+) CD25(+) FoxP3(+) T-regulatory cells and CD3(+) CD8(+)
CD28(-) T-suppressor cells subset phenotypes in vitro: comparison of phorbol 12myristate 13-acetate/ionomycin and phytohemagglutinin stimulation // Transplant
Proc. - 2013. - Vol. 45, № 5. - P. 1822-1831.
299 Ostapchuk E.O., Perfi‘eva Y.V., Talaeva S.G., Omarbaeva N.A., Belyaev
N.N. Analysis of peripheral blood HLA-G+ T cells in healthy donors and breast
cancer patients // Bulletin Exp. Biol. Med. – 2015. - Vol.159, № 5. P. 649-651.
300 LeMaoult J., Caumartin J., Daouya M., Favier B., Le Rond S., Gonzalez
A., Carosella E.D. Immune regulation by pretenders: cell-to-cell transfers of HLA-G
make effector T cells act as regulatory cells // Blood. – 2007. – Vol. 109, № 5. – P.
2040-2048.
301 Ibrahim E.C., Aractingi S., Allory Y., Borrini F., Dupuy A., Duvillard P.,
Carosella E.D., Avril M.F., Paul P. Analysis of HLA antigen expression in benign
and malignant melanocytic lesions reveals that upregulation of HLA-G expression
correlates with malignant transformation, high inflammatory infiltration and HLA-A1
genotype // Int. J. Cancer. – 2004. – Vol. 108, № 2. – P. 243-50.
302 Baaten J.G., Li C-R., Bradley L.M. Multifaceted regulation of T cells by
CD44 // Сommun Integr. Biol. – 2010. – Vol. 3. – P. 508-512.
303 Ariel A., Lider O., Brill A., Cahalon L., Savion N., Varon D., Hershkoviz
R. Induction of interactions between CD44 and hyaluronic acid by a short exposure
of human T cells to diverse pro-inflammatory mediators // Immunol. – 2000. – Vol.
100. – P. 345–351.
304 Petrey A., Motte C. Hyaluronan, a crucial regulator of inflammation //
Front. Immunol. – 2014. – Vol. 5. – P. 1-13.
305 Bollyky P.L., Falk B.A., Long S.A., Preisinger A., Braun K.R., Wu R.P.,
Evanko S.P., Buckner J.H., Wight T.N., Nepom G.T. CD44 costimulation promotes
FoxP3+ regulatory T cell persistence and function via production of IL-2, IL-10, and
TGF-β // J. Immunol. - 2009. - Vol. 183. - P. 2232-2241.
306 Абрамова В.А., Абдолла Н., Перфильева Ю.В., Остапчук Е.О.,
Беляев Н.Н. Исследование влияния высокомолекулярного гиалуронана на
функциональную активность Т-регуляторных клеток человека // Вестник
КазНУ, Сер. Биол. – 2013. - T. 2, № 58. - С.129-137.
307 Ostapchuk E.O., Perfilyeva Y.V., Kustova E.A., Urazalieva N.T.,
Abramova V.A., Abdolla N., Zakiryanova G.K., Belyaev N.N. Phenotypic analysis of
human peripheral blood CD4+CD25+ Treg cells binding and non-binding high
145
molecular hyaluronan // Вестник КазНУ, Сер. Биол. - 2013. - Т.3/2, № 59. – P.413417.
308 Hori S., Nomura T., Sakaguchi S. Control of regulatory T cell
development by the transcription factor FoxP3//J. Science. - 2003. - V.299.-P.1057–
1061.
309 Perfilyeva Y., Ostapchuk Y., Tolmachyov S., Talaeva S., Omarbaeva N.,
Belyaev N. Hyaluronan-binding T regulatory cells in human peripheral blood //
Abstracts of 3rd Int. Conf. Exh. ―Clinical & Cellular Immunology‖. – Baltimore:
J.Clin. Cell. Immunol., 2014. – 159.
310 Iijima J., Konno K., Itano N. Inflammatory Alterations of the
Extracellular Matrix in the Tumor Microenvironment // J. Cancers.-2011. -Vol. 3.-P.
3189-3205.
311 Bertrand P., Girard N., Delpech B., Duval C., d‗Anjou J., Dauce J.P.
Hyaluronan and hyaluronectin in the extracellular matrix of human breast
carcinomas: comparison between invasive and non-invasive areas // Int. J. Cancer.1992.-Vol.52.-P.1–6.
312 Takeuchi J., Sobue M., Sato E., Shamoto M., Miura K., Nakagaki S:
Variation in glycosaminoglycan components of breast tumors // J. Cancer. Res.-1976.
- Vol. 36. - P. 2133-2139.
313 Hilchey S.P., Kobie J.J., Cochran M.R., Secor-Socha S., Wang J.C.,
Hyrien O., Burack W.R., Mosmann T.R., Quataert S.A., Bernstein S.H. Human
follicular lymphoma CD39+-infiltrating T cells contribute to adenosine-mediated T
cell hyporesponsiveness // J. Immunol. - 2009. - Vol.183. - P.6157-6166.
314 Levine A.G., Arvey A., Jin W., Rudensky A.Y. Continuous requirement
for the TCR in regulatory T cell function // Nat. Immunol. – 2014. – Vol. 15. – P.
1070–1078.
315 Zhu J., Shevach E.M. TCR signaling fuels Treg cell suppressor function //
Nat. Immunol. - 2014. – Vol. 11. – P. 1002-1003.
316 Yao X., Ahmadzadeh M., Lu Y.C., Liewehr D.J., Dudley M.E., Liu F.,
Schrump D.S., Steinberg S.M., Rosenberg S.A., Robbins P.F. Levels of peripheral
CD4(+)FoxP3(+) regulatory T cells are negatively associated with clinical response
to adoptive immunotherapy of human cancer // Blood. – 2012. – Vol. 119. – P. 56885696.
317 Wan Y.Y., Flavell R.A. Identifying FoxP3-expressing suppressor T cells
with a bicistronic reporter // Proc. Natl. Acad. Sci. – 2005. – Vol. 102. – P. 5126–
5131.
318 Kozłowski L., Zakrzewska I., Tokajuk P., Wojtukiewicz M.Z.
Concentration of interleukin-6 (IL-6), interleukin-8 (IL-8) and interleukin-10 (IL-10)
in blood serum of breast cancer patients // Rocz. Akad. Med. Bialymst. - 2003. – Vol.
48. -P. 82-84.
319 Llanes-Fernandez L. Alvarez-Goyanes R.I., Arango-Prado Mdel C.,
Alcocer-González J.M., Mojarrieta J.C., Pérez X.E., López M.O., Odio S.F.,
Camacho-Rodríguez R., Guerra-Yi M.E., Madrid-Marina V., Tamez-Guerra R.,
Rodríguez-Padilla C. Relationship between IL-10 and tumor markers in breast cancer
patients // Breast. - 2006. - Vol. 15, № 4. - P. 482-489.
146
320 Hamidullah, Changkija B., Konwar R. Role of IL-10 in breast cancer //
Breast Cancer Res. Treat. - 2012. - Vol. 133, № 1.- P. 11-21.
321 Scott M.J., Hoth J.J., Turina M., Woods D.R., Cheadle W.G. Interleukin-10
suppresses natural killer cell but not natural killer T cell activation during bacterial
infection // Cytokine.-2006.-Vol.33, № 2. - P. 79-86.
322 Crane C.A., Han S.J., Barry J.J., Ahn B.J, Lanier L.L., Parsa A.T. TGF-b
downregulates the activating receptor NKG2D on NK cells and CD8 T cells in
glioma patients // Neuro-Oncol. - 2010. - Vol. 12, № 1.-P.7–13.
323 Gray J.D., Hirokawa M., Ohtsuka K., Horwitz D.A. Generation of an
inhibitory circuit involving CD8 T cells, IL-2, and NK cell-derived TGF-b:
contrasting effects of anti-CD2 and anti-CD3 // J. Immunol.-1998, №160.-P.2248.
324 Zakiryanova G.K., Perfilyeva Y., Abdolla N., Kustova E.A., Urazalieva
N.T., Ostapchuk E.O., Tleulieva R., Belyaev N.N. Human CD117-positive and
CD117-negative NK cell subsets // Abstracts of An. Cong. Brit. Soc. Immunol. –
Liverpool: Immunology, 2011. – P. 90.
325 Veenstra van Nieuwenhoven A.L., Bouman A., Moes H., Heineman M.J.,
de Leij L.F., Santema J., Faas M.M. Cytokine production in natural killer cells and
lymphocytes in pregnant women compared with women in the follicular phase of the
ovarian cycle // Fertil. Steril. - 2002.-Vol. 77. – P. 1032–1037.
326 Carson W.E., Giri J.G., Lindemann M.J., Linett M.L., Ahdieh M., Paxton
R., Anderson D., Eisenmann J., Grabstein K., Caligiuri M.A. Interleukin (IL) 15 is a
novel cytokine that activates human natural killer cells via components of the IL-2
receptor // J.Exp. Med. – 1994. – Vol. 180, № 4.- P. 1395-1403.
327
Nielsen C.M., White M.J., Goodier M.R., Riley E.M., Functional
significance of CD57 expression on human NK cells and relevance to disease //
Front. Immunol. – 2013. – Vol. 4, № 412. e 00422.
328
Rasmussen H., The calcium messenger system (1) // N. Engl. J. Med. –
1986. – Vol. 314. – P. 1094-1101.
329
Остапчук Е.О., Перфильева Ю.В., Абдолла Н., Тлеулиева Р.Т.,
Юрикова О.Ю., Оскольченко И.А., Талаева Ш.Ж., Омарбаева Н.А., Беляев Н.Н.
Экспрессия IL-10 и TGF-β цитокинов натуральными киллерными клетками
больных раком молочной железы // Вестник КазНУ, Сер. Биол. – 2014. Т.3, №
62. - С. 81-86.
330
Wilson E.B., El-Jawhari J.J., Neilson A.L., Hall G.D., Melcher A.A.,
Meade J.L., Cook G.P. Human tumour immune evasion via TGF-β blocks NK cell
activation but not survival allowing therapeutic restoration of anti-tumour activity //
PLoS ONE. - 2011. - Vol. 6, № 9. – P. 10.
331
Lesport E., Baudhuin J., LeMaoult J., Sousa S., Doliger C., E.D.
Carosella, Favier B. Human melanoma cell secreting human leukocyte antigen-G5
inhibit natural killer cell cytotoxicity by impairing lytic granules polarization toward
target cell // Hum. Immunol. – 2009. – Vol. 70. – P. 1000–1005.
332
Favier B., Lemaoult J., Lesport E., Carosella E.D. ILT2/HLA-G
interaction impairs NK-cell functions through the inhibition of the late but not the
early events of the NK-cell activating synapse // FASEB J. – 2010. – Vol. 24. – P.
689–699.
147
333
Li C., Houser B.L., Nicotra M.L., Strominger J.L. HLA-G homodimerinduced cytokine secretion through HLA-G receptors on human decidual
macrophages and natural killer cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 2009. – Vol.
106. – P. 5767–5772.
334
Morel E., Bellón T. HLA class I molecules regulate IFN-gamma
production induced in NK cells by target cells, viral products, or immature dendritic
cells through the inhibitory receptor ILT2/CD85j // J. Immunol. – 2008. – Vol. 181. –
P. 2368–2381.
335
van der Meer A., Lukassen H.G.M., van Cranenbroek B., Weiss E.H.,
Braat D.D.M., van Lierop M.J., Joosten I. Soluble HLA-G promotes Th1-type
cytokine production by cytokine-activated uterine and peripheral natural killer cells //
Mol. Hum. Reprod. – 2007. – Vol. 13. – P. 123–133.
336
Lindaman A., Dowden A., Zavazava N. Soluble HLA-G molecules
induce apoptosis in natural killer cells // Am. J. Reprod. Immunol. – 2006. – Vol. 56.
– P. 68–76.
337
Ostapchuk Y., Aktas Cetin E, Perfilyeva Y., Yilmaz A, Belyaev N.,
Deniz G. HLA-G expressing NK cell subset with suppressive properties is expanded
in breast cancer // Abstracts of An. Meeting Am. Assoc. Immunol. ―Immunology
2015‖. - New Orleans: J. Immumol., 2015. - TUM10P.1043.
338
Lidström C., Matthiesen L., Berg G., Sharma S., Ernerudh J., Ekerfelt
C., Cytokine secretion patterns of NK cells and macrophages in early human
pregnancy decidua and blood: implications for suppressor macrophages in decidua //
Am. J. Reprod. Immunol. – 2003. – Vol. 50. – P. 444–452.
339
Chaouat G., Zourbas S., Ostojic S., Lappree-Delage G., Dubanchet S.,
Ledee N., Martal J. A brief review of recent data on some cytokine expressions at the
materno-foetal interface which might challenge the classical Th1/Th2 dichotomy // J.
Reprod. Immunol. – 2002. – Vol. 53. – P. 241–256.
340
Davis D.M., Reyburn H.T., Pazmany L., Chiu I., Mandelboim O.,
Strominger J.L. Impaired spontaneous endocytosis of HLA-G. Eur // J. Immunol. 1997. – Vol. 27. – P. 2714-2719.
341
Taylor A., Verhagen J., Blaser K., Akdis M., Akdis C.A. Mechanisms of
immune suppression by interleukin-10 and transforming growth factor-b: the role of
T regulatory cells // Immunol. – 2006. – Vol. 117. – P. 433–442.
342
Ostapchuk Y.O., Aktas Cetin E, Perfilyeva Y, Yilmaz A, Belyaev N,
Deniz G. Characterization of HLA-G expressıng human NK cells // Abstracts of 2nd
Int. Mol. Immunol. & Immunogenet. Cong. II (MIMIC II). - Antalya, 2014. – P. 90.
343
Lefebvre S., Antoine M., Uzan S., McMaster M., Dausset J., Carosella
E.D., Paul P. Specific activation of the non-classical class I histocompatibility HLAG antigen and expression of the ILT2 inhibitory receptor in human breast cancer // J.
Pathol. – 2002. – Vol. 196. – P. 266–274.
344
Mozaffari F., Lindemalm C., Choudhury A., Granstam-Björneklett H.,
Helander I., Lekander M., Mikaelsson E., Nilsson B., Ojutkangas M.L., Osterborg A.,
Bergkvist L., Mellstedt H. NK-cell and T-cell functions in patients with breast
cancer: effects of surgery and adjuvant chemo- and radiotherapy // Br. J. Cancer. 2007. – Vol. 97. – P. 105–111.
148
345 Abramova V.A., Kali A., Abdolla N., Yurikova O.Y., Perfilyeve Y.V.,
Ostapchuk Y.O., Tleulieve R.T., Madenova S.K., Belyaev N.N. Influence of tumor
cells on natural killer cell phenotype and cytotoxicity // Int. J. Biol. Chem. – 2015. Vol.8, № 1. – P. 9-14.
346
Allan D.S., B. Rybalov, G. Awong, J.C. Zúñiga-Pflücker, H.D. Kopcow,
J.R. Carlyle, Strominger J.L. TGF-b affects development and differentiation of
human natural killer cell subsets // Eur. J. Immunol. – 2010. – Vol. 40. – P. 2289–
2295.
149