Российская академия наук Институт биоорганической химии

Российская академия наук
Институт биоорганической химии
им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова
Лаборатория биомолекулярной ЯМР спектроскопии
ШЕНКАРЕВ ЗАХАР ОЛЕГОВИЧ
Мембраноактивные
антимикробные пептиды прототипы новых
антибиотических препаратов
Защитная система организма
(host defense system)
Иммунная система
Адаптивный иммунитет
(Adaptive immune system)
Высшие позвоночные,
млекопитающие
Система представления антигена
Т- и Б- Лимфоциты
Антитела
Врожденный иммунитет
(Innate immune system)
Все эукариотические организмы,
растения, грибы, позвоночные,
млекопитающие,
Защитные системы прокариот
Эпителиальный барьер
Система комплимента
Воспалительные реакции
Лейкоциты (мастоциты, фагоциты,
макрофаги, гранулоциты, …)
Антимикробные пептиды (АП)
Эффекторы в системе врожденного иммунитета (антимикробное действие)
Блокирование эндотоксинов (компоненты микробных мембран, LPS)
Переносчики сигналов (хемотаксис лейкоцитов)
Заживление ран
У млекопитающих продуцируются клетками эпителия и лейкоцитами
Антимикробные пептиды (АП)
Структурные свойства
Небольшие пептидные молекулы (20 - 50 а.о.)
Большое количество гидрофобных/
ароматических остатков
Большое количество положительно заряженных
остатков (общий заряд +1 - +11)
Биологическая активность
Грамположительные и Грамотрицательные
микроорганизмы
Фунгицидная, инсектицидная, противовирусная,
цитотоксическая (гемолитическая), активность
Наличие специфической молекулярной мишени
в мембране клетки увеличивает активность АП
В модельных мембранах формируют поры и
ионные каналы
Разрушают целостность клеточных мембран
Основная мишень действия АП – клеточная
мембрана.
Специфичность действия определяется
липидным составом мембраны.
Некоторые пептиды атакуют специфические
мембранные или внутриклеточные мишени.
Действие 10 μM АП ареницина на клетку
E. coli (G-)
Andra et al, 2008
Специфичность действия АП объясняется разным
составом цитоплазматических мембран клеток
Липиды (заряд молекулы липида)
(-2)
(-1)
(+/-0)
(+/-0)
(+/-0)
(0)
Эритроцит
человека
E. coli (G-)
S. aureus (G+)
B. subtilis (G+)
C. albicans (fungi)
Цитоплазматическая мембрана клеток
бактерий заряжена отрицательно
Yeaman et al, 2003
Внешняя мембрана грамотрицательных бактерий
содержит полианионные молекулы липополисахарида
(LPS)
LPS
Положительно заряженные молекулы АП легко проникают через
внешнюю мембрану грамотрицательных бактерий, дестабилизируя
ее путем замещения двухвалентных катионов, связанных с
молекулами LPS. В результате на внешней мембране клетки
образуются поры и вздутия, что позволяет большому количеству
пептидов проникать внутрь к цитоплазматической мембране
(механизм self-promoting uptake).
Энергетика цитоплазматической мембраны
бактериальной клетки отличается от энергетики
мембраны эукариотической клетки
Эукариотическая клетка
Бактериальная клетка
Дыхательная цепь находится на
мембране митохондрий
ТМ потенциал цитоплазматической
мембраны Δφ ~ -100mV
Дыхательная цепь находится на
цитоплазматической мембране
Δφ ~ -140mV (в фазе логарифмического роста)
ТМ потенциал создает отрицательный заряд на
внутренней стороне цитоплазматической
мембраны, способствуя проникновению
некоторых пептидов через мембрану
Диссипация ТМ потенциала и/или градиента ионов через цитоплазматическую
мембрану летальна для бактериальной клетки (падение уровня внутриклеточного
АТФ, нарушение механизма клеточного деления, осмотический лизис)
Структурное разнообразие АП
1)
Линейные молекулы, принимающие конформацию
амфифильной -спирали в присутствии мембраны:
•
Магаинины (Magainins) и Дермасептины (Dermaseptins)
из кожи амфибий,
•
Секропины (Cecropins) из гемолимфы насекомых
•
Cecropin-P1 из эпителия кишечника свиньи
•
Cathelicidins (LL-37) эпителий, лейкоциты человека
2)
-Структурные пептиды, стабилизированные
дисульфидными связями (могут включать α-спирали):
•
Дефенсины (defensins) растений и насекомых
•
-, -, θ- Дефенсины приматов и человека
•
Тионины (thionins) и Циклотиды (cyclotides) растений,
•
Тахиплезины (tachyplesins) из гемолимфы ракообразных,
•
Протегрины (protegrins) из лейкоцитов свиньи.
3)
Вытянутые пептиды, содержащие большое количество
определенных аминокислотных остатков (пролинов,
триптофанов, аргининов, гистидинов и т.д.) и не
формирующие классических элементов вторичной
структуры:
•
Индолицидин (indolicidin) из нейтрофилов быка.
Общая структурная особенность АП, обусловлена выбором клеточной
мембраны в качестве мишени, – все АП в присутствии липидной мембраны
образуют амфифильную структуру, в которой заряженные (полярные) и
гидрофобные группы пространственно разделены
Дефенсины от грибов до человека
HNP-1 α-defensin
(человек)
hBD1 β-defensin
(человек)
(Дрозофила)
(Дрозофила)
(Устрица)
heliomicin
(бабочка-совка)
VrD1
(фасоль)
Дефенсины человека:
α-defensins: HNP1-4 – нейтрофилы, HD5,6 – ацидофильные клетки кишечника
β-defensins: hBD1-4 – эпителий
θ-defensins: 6 генов, заблокированы стоп-кодоном
В некоторых случаях в синтезе АП задействованы
значительные посттрансляционные модификации.
Θ-дефенсин макаки резус (RTD-1).
Гены
предшественников
θ-дефенсина
-дефенсин
(HNP-4)
Tang et al, 1999
Эволюция -структурных АП и дефенсинов
Девний мотив «γ-ядро» (γ-core)
-дефенсин
hBD-2
Протегрин
(свинья)
-дефенсин
(HNP-3)
sapecin
Ah-AMP-1
antifungal
γ-1-P-thionin
antimicrobial
hPF-4
kinocidin
Charybdotoxin
(скорпион)
Hepcidin
(окунь)
AFP1 (antifungal) plectasin
(Aspergillus giganteus)
MGD-1 дефенсин
(мидия)
subtilosin A
Yount et al, 2006
Современные модели мембранной активности АП
(на примере спиральных молекул)
АП в неупорядоченной
конформации в воде
Уменьшение толщины
мембраны под действием
связанных пептидов
вызывает кооперативный
переход АП в ТМ
состояние
(критическая концентрация
АП на мембране)
Мицеллизация
бислоя
(Модель тороидальной поры)
(Модель связки спиралей)
(Ковровая модель)
Поры, образованные связками спиралей, демонстрируют
характерный набор уровней проводимости в плоских
модельных мембранах (БЛМ)
Проводимость одиночного канала и модель поры
Аламетицина
Некоторые эксперименты, доказывающие
существование связок спиралей и тороидальных пор
Гигантские моноламелярные везикулы
Дифракция рентгеновских лучей на мембранах,
содержащих Br-меченые липиды
Аламетицин
Фрагмент белка BAX
Мелиттин из яда пчелы
в концентрации меньше (А) и больше (B)
критической
Lee et al, 2008
Qian et al, 2008
Факторы, ответственные за стабильность и
активность спиральных АП
•Длина пептида (L)
•Заряд (Q)
•Дипольный момент (μD)
•Гидрофобность (H)
•Амфифильность,
гидрофобный момент (μH)
•Полярный угол (θp)
Наибольшая активность наблюдается у
структурированных α-спиральных пептидов с
большим зарядом, и большой
амфифильностью, однако, увеличение этих
параметров ведет к росту гемолитической
активности и падению специфичности.
Свойства поверхности спирального пептида
определяют механизм поробразования
Аламетицин
(грибы рода Trichoderma)
Q=-1
Образует связки спиралей
Магаинин
(кожа африканской лягушки
Xenopus laevis)
Q=+5
Образует тороидальные поры
Методы исследования пространственной
структуры белков и пептидов
1. Рентгеновская кристаллография
Высокое разрешение
АП плохо кристаллизуются
2. Криоэлектронная микроскопия, AFM
Низкое разрешение
Высокая динамическая подвижность комплексов АП/мембрана
3. ЯМР-спектроскопия в растворе
Позволяет исследовать не только пространственную структуру, но и
динамику белковых молекул
Позволяет исследовать мебраноактивные АП и мембранные белки в
средах, моделирующих биологическую мембрану
Один из основных методов установления химической структуры
«нестандартных» природных соединений («небелковые» остатки,
циклизация, модификации)
Размер изучаемой системы ограничен (< 100kDa)
4. ЯМР-спектроскопия твердого тела
Позволяет проводить исследования в липидных мембранах
Набор получаемых экспериментальных данных ограничен
ЯМР спектроскопия в растворе позволяет
исследовать пространственную структуру и
динамику белков и пептидов
ЯМР спектрометр
N-мерные ЯМР спектры
Метод позволяет
исследовать
водорастворимые
белки и комплексы
белок/липид с массами
до ~100 kDa
Образец целевого белка
Пространственная структура
целевого белка
Мембраномоделирующие среды для
ЯМР-спектроскопии в растворе
A. Изотропные растворы низкой
полярности (ТФЭ, метанол,
смеси ТФЭ/вода,
метанол/хлороформ)
6 nm
B. Мицеллы/бицеллы
детергентов/липидов
C. Липид-белковые нанодиски
(ЛБН)
10 nm
Пептаиболы – спиральные каналообразующие
антибиотики из микопаразитических грибов родов
Emericellopsis и Trichoderma
Зервамицин IIB (16 a.o.)
Линейные пептиды 10-20 а.о.
Заряд -2 .. 0
Нерастворимы в воде
Нерибосомальный синтез (нестандартные остатки)
Ac-Trp (Ac-W)
Aib (U)
Iva (J)
Hyp (O)
Phl (F-l)
Активны по отношению к G+ микроорганизмам, эндо- и экзо- паразитам (амебы,
малярийный плазмодий, гельминты), фитопатогенным грибам, вирусам растений.
В модельных мембранах образуют потенциалозависимые каналы с несколькими
(до 15) уровнями проводимости
ЯМР спектроскопия позволяет определять топологию
комплексов пептид/модельная мембрана с помощью
гидрофобных спиновых зондов
Aam-I/LPN/DOPG
Комплексы небольших белков с мицеллами
могут также изучаться методом ЯМР
Вискотоксин А3 растительный тионин
(Viscum album, омела белая)
46 а.о., заряд +6
Антимикробная активность широкого спектра
Цитотоксическая (противоопухолевая) активность
Используется в народной медицине
Участок, взаимодействующий с мембраной
сформирован двумя α-спиралями
Спиновые зонды позволяют исследовать топологию
более сложных систем
KB1
Циклотиды Kalata B1 и B7
(африканское растение Oldenlandia affinis)
29 а.о. циклические, заряд +/-0; +1
Антимикробная, цитотоксическая,
противовирусная, инсектицидная активность
Используются в народной медицине
Участок, взаимодействующий с мембраной
сформирован β-шпилькой
Сайт связывания двухвалентных катионов
KB7
Отсутствие выраженной мембранной активности у АП
может указывать на наличие специфической мишени
для действия
Растительный дефенсин Lc-def (семена чечевицы Lens culinaris)
47 а.о.; заряд +3; фунгицидная активность
Пептид слабо взаимодействует с
модельными мембранами
Гомологичные растительные
дефенсины взаимодействуют
со специфическими липидными
молекулами из мембран клеток грибов
Аурелин – антимикробный пептид медузы
Аурелин (чашеобразная медуза Aurelia aurita)
40 а.о.; заряд +7; активен против G+ и G- бактерий
гомологичен (30 – 40 %) токсинам анемон, специфическим блокаторам К+ каналов
Пептид активно взаимодействует с анионными везикулами (моделирующими мембрану
бактериальной клетки ) и не взаимодействует с нейтральными везикулами
(моделирующими мембрану эукариотической клетки)
Участок, взаимодействующий с мицеллой DPC сформирован двумя α-спиралями
F18 F15
I11
Ареницин 2 – антимикробный пептид из морского
многощетинкового червя Arenicola marina
21 а.о., заряд +6, активен против G+, G- бактерий и грибов
Участок, взаимодействующий
с мембраной сформирован
β-шпилькой
Водный раствор
Мицелла DPC
ЯМР-спектроскопия твердого тела в
липидных мембранах позволяет исследовать
геометрию тороидальных пор
β-структурный АП протегрин (18 а.о., заряд +6) из лейкоцитов
свиньи формирует ТМ β-бочонки в анионных мембранах
POPE/POPG, моделирующих мембрану бактериальной клетки
Mani et al 2006
При образовании тороидальной поры
положительный заряд боковых цепей остатков Arg
пептида компенсируется отрицательным зарядом
фосфатных групп липидов
β-структурный АП протегрин (18 а.о., заряд +6) из лейкоцитов
свиньи в анионных мембранах POPE/POPG, моделирующих
мембрану бактериальной клетки
Tang et al 2007
ЯМР-спектроскопия твердого тела в
липидных мембранах позволяет исследовать
структуру высокомолекулярных агрегатов АП
Протегрин (18 а.о., заряд +6) формирует β-структрные олигомеры
на поверхности цвиттерионных мембран POPC/холестерин,
моделирующих мембрану эукариотической клетки,
не формируя пор
Mani et al 2006
Лантибиотик Низин при взаимодействии с
мембраной G+ бактерий использует специфическую
мишень (Липид-II)
Низин (молочнокислые бактерии Streptococcus lactis)
более 40 лет используется как консервант в пищевой промышленности (E234)
«Задерживает рост и развитие стафилококков, стрептококков и других микробов.
Неэффективен против дрожжей, плесеней и грамотрицательных бактерий. Обладает
способностью снижать сопротивляемость спор термоустойчивых бактерий к нагреванию.
Разрешён в производстве плавленых и других сыров, молочных продуктов, овощных и
фруктовых консервов.»
29 а.о., рибосомальный синтез, посттрансляциооные модификации
Активен против G+ бактерий в нМ концентрациях
против G- бактерий в мкМ концентрациях
ЯМР спектроскопия выявляет детали специфического
взаимодействия Низина с молекулой липида-II, важным
компонентом биосинтеза клеточной стенки G+ бактерий
Фрагмент ЯМР структуры комплекса
Nisin/LipidII в растворе DMSO
(Hsu et al 2004)
Молекулярный механизм антимикробного
действия лантибиотика Низина
Блокирование Липида-II также приводит к остановке роста
(деления) G+ бактерий
Установление первичной и пространственной
структуры новых антибиотических пептидов
Антибиотик тироцидинового ряда
Латероцин
(Brevibacillus laterosporus)
Нерибосомальный синтез, антимикробная
активность широкого спектра, альгицидная
активность
D-Phe10
Двухкомпонентный лантибиотик
Лихеницидин (Bacillus licheniformis)
Рибосомальный синтез, посттрансляциооные
модификации, синергическая активность в нМ
концентрациях против G+ бактерий
Вероятная мишень действия Lipid-II
Leu6
Phe9
Lchα
Val4
Met3
Pro8 D-Tyr7
Orn5
Asp2
Asn1
Lchβ
Пространственные структуры пептидов в метаноле