М.В. Храмов - О некоторых особенностях контроля и

Храмов М.В.,
заместитель директора
ФБУН ГНЦ ПМБ
Федеральная служба по надзору в
сфере защиты прав потребителей
и благополучия человека РФ
ОБОЛЕНСК-МОСКВА
24 сентября 2015г.
Храмов М.В., заместитель директора
ФБУН ГНЦ ПМБ
О НЕКОТОРЫХ ОСОБЕННОСТЯХ
КОНТРОЛЯ И ИСПОЛЬЗО ВАНИЯ
БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИХ ПИТАТЕЛЬНЫХ
СРЕД И ИХ АНАЛОГОВ В ПРАКТИКЕ
БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИХ ЛАБОРАТОРИЙ.
МОСКВА 2015
КРАТКАЯ ИСТОРИЧЕСКАЯ
СПРАВКА

Всесоюзный научно-исследовательский институт прикладной
микробиологии (ВНИИ ПМ) был образован 01.01.1974 г. (приказ
начальника Главного управления микробиологической промышленности
при Совете Министров СССР №67 от 04.12.1973г.).

В апреле 1974 г. выходит Постановление ЦК КПСС и Совета Министров
СССР №704 “О мерах по ускоренному развитию молекулярной биологии
и молекулярной генетики и использованию их достижений в народном
хозяйстве”, в котором ставилась задача – в кратчайшие сроки достичь
передового уровня развития молекулярной биологии, молекулярной
генетики и других областей естествознания, непосредственно связанных
с изучением физико-химических основ жизненных явлений. Конечной
целью было внедрение новейших достижений этой области
естествознания в различные отрасли народного хозяйства.

В июне 1994 г. ВНИИ ПМ присваивается статус государственного
научного центра. Новое название организации - Государственный
научный центр прикладной микробиологии (ГНЦ ПМ).
Научные подразделения института располагались в 36 зданиях общей
площадью более 90 тыс. м2. Основной объект научно-исследовательской
базы - лабораторный корпус №1, представляет собой 9-этажное здание
общей площадью 37,2 тыс. м2. Специализированные инженерные
системы корпуса наряду с объектами медицинского обеспечения
позволяют проводить исследования с бактериями-возбудителями особо
опасных заболеваний человека и животных, надежно защищая персонал и
г.
объекты окружающей среды.
Место, занимаемое ФБУН ГНЦ ПМБ в
национальном здравоохранении, и наличие
государственной поддержки
НАПРАВЛЕНИЯ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ ЦЕНТРА







Микробиология возбудителей особо опасных и других инфекционных
заболеваний, молекулярные основы их патогенности и иммуногенности,
постгеномные исследования.
Разработка методов идентификации патогенных бактерий. Создание
технологий с использованием биочипов, усовершенствование
агглютинационных и иммуносуспензионных методов, разработка
быстрых хроматографических тестов, развитие методов генной
диагностики, в том числе, для определения лекарственной
устойчивости.
Развитие направления по изучению таксономии и геносистематики,
генотипирование для решения задач молекулярной эпидемиологии.
Информационное обеспечение научных исследований по особо
опасным инфекционным и другим заболеваниям.
Разработка новых, на основе современных достижений генетики,
иммунологии, биотехнологии вакцин для профилактики особо опасных
и других инфекций
Разработка и совершенствование технологий производства препаратов
для профилактики, диагностики и лечения особо опасных инфекций.
Разработка и производство питательных сред.
Основные задачи ФБУН ГНЦ ПМБ
проведение фундаментальных и прикладных научных исследований и работ в области эпидемиологии, бактериологии и биотехнологии, направленных на обеспечение санитарно-эпидемиологического
благополучия населения, включая опытно-промышленное производство биотехнологической продукции. Государственная коллекция патогенных микроорганизмов, грибов и культур клеток.
Система физической защиты
ГНЦ ПМБ
1
2
3
4
5
1. Железобетонный забор с 2-мя рубежами охранной сигнализации и TV.
2. Периметр корпуса 1, оборудованный датчиками обнаружения.
3. Периметр каждого этажа.
4. Хранилище материалов.
5. Контейнеры с биологическими материалами.
System of physical safety maintenance
Система физической защиты.
Biosafety level (BSL-2, BSL-3)
Государственная коллекция штаммов
патогенных бактерий
5 927 штаммов микроорганизмов: 114 штаммов микроорганизмов I-II
групп патогенности, 10 штаммов фагов бактерий, 1065 штаммов
грибов (микромицетов), 80 перевиваемых клеточных линий и
гибридом.
Паспортизация штаммов –
унифицированные формы
паспортов
Комиссия по депонированию
Положение о коллекции
Новые формы хранения
Замена холодильного
оборудования
Виварии
соответствуют международным требованиям
Подтвержден сертификат на соответствие
международным требованиям
Организовано разведение и резервное
хранение животных для биопроб
Animal Facilities at SRCAM compliance
USA standards
Special training of the personnel
Центр по нанобезопасности
РОСПОТРЕБНАДЗОРА РФ

Методические подходы

Сверхчувствительное определение патогенов и наночастиц –
атомно-силовая микроскопия аффинных поверхностей

Фаги – наноразмерный живой организм – диагностика, лечение
фагами и фрагментами.

Бактерицидность и токсичность нанообъектов – на бактериях и
клеточных культурах

Электрооптика и наночастицы – идентификация бактерий.

Использование аэрозольных камер – изучение воздействия наночастиц
в виде аэрозолей на организм животных.
По приказу №88
Роспотребнадзора
Верефикационные Центры по :
Туляремии
Ешерихиозам (геморрагическим)
Клещевым боррелиозам
Клостридиозам
Стафилококковой инфекции.
Сальмонеллезам.
Использование аэрозольных камер
изучение
действия на
живые системы наночастиц
в виде аэрозолей в
контролируемых и
изменяемых условиях.
возможность имитации
производственных условий,
где содержатся
наночастицы

оценка
действия
наночастиц
Производство и разработка питательных сред
Схема производства
питательных сред
Регистрация препаратов
Диагностические среды:
1.Среды для культивирования (широкий
спектр М\О).
2.Среды для выделения (селективные)
3.Среды дифференциальные.
4.Среды накопительные.
5.Среды для идентификации.
Производственные среды:
1.Среды использыемые в
производственном процессе получения
препаратов.
2.Белковые основы:пептоны,
стимуляторы роста, экстракты и т.п.
3.Среды для контроля качества
препаратов (стерильность и др.).
Требования по биологическим показателям
предъявляемые к бактериологическим питательным
средам и тест системам (в том числе и ПЦР)
Бактериологический
1.Чувствительность- 10-7
-10-9 (от 1 клетки на 2550г продукта или в 225
мл).
2.Показатель ингибиции и
дифференциации.
3.Скорость роста: от 10
часов.
4. Цена: самая низкая
Тест-ситемы
1. Чувствительность -Пределы
детекции: токсины – не ниже 10
нг/мл, микробы- 100 кл/мл
2. Время: меньше 15 минут
3. Специфичность:
вид/род
4. Размер: можно держать в
руках (только ИХА) (обычно
сегодня это несколько кг.)
(цена среды в чашке Петри 3 рубля)
5. Цена: супер высокая или
относительно низкая
(ОТНОСИТЕЛНО НИЗКАЯ от
чего?)
Разрешительная документация
Сертификат
ы
менеджмент
а качества
ISO 9001 :2008
ISO 13485 :2003
Кроме питательных сред сухих, готовых к
употреблению, в различных емкостях (от чашек
Петри и пробирок до флаконах и полипропиленовых
мешках до 15-20 литр сегодня на рынке предлагаются
новые виды продукци :
Питательные подложки SARTORIUS




Питательные подложки (сокращенно ПКП) - это питательные среды в сухой форме,
используются для микробиологического анализа воды, напитков и продуктов питания,
фармацевтических и косметических препаратов. В сочетании с методом мембранной
фильтрации ПКП являются быстрым, точным и эффективным решением проблемы
контроля сырья и продукта на различных стадиях производственного процесса.
ПКП представляют собой картонные диски толщиной 1 мм и диаметром 50 или 47 мм,
импрегнированные питательными веществами и простерилизованные. После смачивания
3,0-3,5 мл стерильной или деминерализованной водой подложки готовы к
использованию.
Питательные подложки валидированы для анализа жидких сред и воздуха в соответствии
с GMP, обеспечивая безопасность и эффективность использования. Каждая партия ПКП
контролируется внутренним аудитом фирмы (на стерильность, рН и по параметрам
микробиологического роста) и сопровождается сертификатом качества.
(Но имеются специальные условия) Все типы ПКП поставляются в комплекте с
оптимально подобранными стерильными мембранными фильтрами из нитрата
целлюлозы, каждый фильтр упакован в индивидуальном полиэтиленовом конверте. Для
удобства при количественном подсчёте фильтры снабжены специальной сеткой с
квадратами по 3.1х3.1 мм, которая не оказывает влияния на рост микроорганизмов.
ДИПСТРИК ISRAEL Питательные среды на
пластиковой подложке
Дипстрик - устройство для бактериологического анализа мочи, обеспечивающий
изоляцию, идентификацию и количественный учет специфических бактерий в моче1 .
Устройство предназначено для использования врачами-клиницистами и работниками
бактериологических лабораторий с целью ускоренной диагностики инфекций
мочевыводящих путей.
Дипстрик представляет собой пластиковую подложку, покрытую с обеих сторон слоем
питательной среды (хромогенный агар и Мак-Конки агар). Подложка вмонтирована в
завинчивающуюся крышку прозрачной пластиковой пробирки. К краю подложки
прикреплено пластиковое кольцо с зубцами (по три с каждой стороны). Концы зубцов
погружают в контейнер с образцом мочи приблизительно до половины их длины. При
помещении подложки в исходную пробирку кольцо с зубцами застревает в отверстии
пробирки, осуществляя штриховой посев на поверхности питательных сред.
Особые условия ХРАНЕНИЕ 1. Хранить Дипстрик при температуре 4-8C в течение 6
месяцев или при температуре 15- 25C - не более 4-х месяцев. 2. Предохранять от
прямых солнечных лучей света.

ПЕТРИФИЛЬМЫ
Петрифильмы – новый формат готовых
питательных сред.







Петрифильмы – это тесты для количественного определения
микроорганизмов
• На подложку теста наносится питательная среда для роста
микроорганизмов
• Если используется хромогенная среда, то – ускорение
исследования
• В состав среды входит специальное вещество, которое при
добавлении жидкости превращается в гель при комнатной
температуре!
• Образование среды на петрифильме происходит только в
момент посева образца (до этого момента петрифильм – неактивен
и может храниться очень долго)
• Петрифильмы сохраняют стерильность благодаря закрывающей
внешней пленке
• Объем посевного образца – 1 мл (иногда 5 )
Петрифильмы компании 3М
(США).
Американец Боб
Нельсон в 1984 году
изобрел новый
формат готовых
питательных сред –
петрифильмы
(Petrifilm)
Petri - от чашек Петри,
film – пленка (англ.),
т.е. аналог чашки
Петри с готовой
средой, но в виде
пленки!
Петрифильмы 3М (США) официально
одобрены в России (МУК 4.2.2884-11), 2011 г.
«Методы микробиологического контроля объектов
окружающей среды и пищевых продуктов с
использованием петрифильмов»
ГОСТ 54354-2011. Мясо и мясные продукты.
Организация и методы микробиологического
анализа. Петрифильмы и Petrifilm Plate Reader
могут использоваться для анализа мясных
продуктов как альтернативный метод
исследования.
ГОСТ 54354-2011 одобрен с 01.01.2013.
Все забыли про СП по работе с
микрорганизмами 3-4 групп
патогенности и
1-2 группы.
Контроль бактериологических
питательных сред.
Физико-химические показатели
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
рН среды.
Цветность или прозрачность.
Аминный азот.
Общий азот.
Хлориды (фосфаты, сульфаты).
Определение ионов Ca, Mg, Zn, тимидина и др.
Остаточная влажность или сухой остаток.
Прочность агарового студня по Валенту.
Биологические показатели
1.Чувствительность- рост из максимального
разведения контрольной культуры м\о (на всех
засеянных емкостях или на 2 из 3 емкостях, или
рост от единичных клеток, от десяти или выше на
чашках петри .
2.Эффективность- по выходу биомассы в КОЕ с1мл
питательной среды.
3.Показатель стабильности-сохранение основных
свойств м\о в %.
4.Дифференцирующие свойства.
5.Показатель ингибиции.
6.Скорость роста.
7.Стерильность.
На основании чего должен проходить контроль?!
1. МУ МЗ СССР 1980г.-контроль питательных сред по биологическим показателям
2. МУК 4.1/4.2.588- 96 Методичекие указания по методам контроля МИБП.
3.ФС 42-3874-99- физхим, хим., физические и иммунохимические методы контроля МИБП.
4.ГФ -Х11 издание.
5. МУК 4.2.2316-08 «Методы контроля бактериологических питательных сред»
6. МУ 3.3.2.2124-06 «Контроль диагностических питательных сред по биологическим показателям для
возбудителей чумы, холеры, сибирской язвы, туляремии, бруцеллеза, легионеллеза.»
Планируемые или
неутвержденные ГОСТЫ
ГОСТ Р ЕН 12322-2010 «Изделия медицинские для диагностики in vitro.
Питательные среды для микробиологии. Критерии эксплуатационных
характеристик питательных сред»
 В 2013 году группой авторов разработан документ «Стандартизованная технология “Внутрилабораторный контроль
качества питательных сред для клинических микробиологических
исследований”»
 ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ТЕХНИЧЕСКОМУ РЕГУЛИРОВАНИЮ
И МЕТРОЛОГИИ разработало НАЦИОНАЛЬНЫЙ ГОСТ Р 51088-2012
СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Медицинские изделия для
диагностики ин витро. Реагенты, наборы реагентов, тест - системы,
контрольные материалы, питательные среды. Требования к изделиям и
поддерживающей документации.
 Вопрос ?:А может сообществу бактериологов разработать
объединенный документ?.

Спасибо за внимание