S-БЕЛОК КЛЕТОК BACILLUS SPHAERICUS AP2

S-БЕЛОК КЛЕТОК BACILLUS SPHAERICUS AP2 – ПЕРСПЕКТИВНЫЙ
ОБЪЕКТ БИОТЕХНОЛОГИИ И НАНОТЕХНОЛОГИИ
В.Н. Бурдь, Г.А. Бурдь, К. Нахтигаль*, К.-Х. ван Пе*
Гродненский государственный университет имени Янки Купалы, г. Гродно, Беларусь,
burd@mail.grsu.grodno.by
*Институт биохимии, Дрезденский технический университет, г. Дрезден, Германия
Мономолекулярный кристаллический слой, состоящий из белков, принадлежит
к наиболее часто встречаемой поверхностной структуре многих представителей
прокариот. Во время роста и деления клетки ее поверхность покрывается замкнутой
высокопористой решеткой. Морфологические, химические, генетические и
морфогенетические исследования показали, что данная структура представляет собой
простейшую биологическую стенку, возникшую в ходе эволюции [1]. Как правило, Sслой состоит из белковой молекулы одного типа, часто гликопротеина [2]. В последние
годы с развитием методов биотехнологии и нанотехнологии [3] возрос интерес
исследователей к этой группе белков. Важнейшими свойствами S-белков,
обуславливающих их широкий спектр практического приложения, являются:
¾
способность раствора белка при контакте с гидрофобной поверхностью,
например, кремневой пластинкой, липидной пленкой или липосомой, образовывать
кристаллический монослой;
¾
образуемая высокопористая кристаллическая структура обладает
размером пор, соответствующим размеру пор мембран для ультрафильтрации;
¾
функциональные группы боковых цепей протеина на поверхности и в
порах имеют строго упорядоченное расположение и ориентацию, что позволяет
производить высокоточную направленную модификацию мембраны.
Указанные уникальные физико-химические свойства белков S-слоя позволяют
найти им применение в биотехнологии, молекулярной нанотехнологии, медицине,
диагностике и т.п. [3].
В настоящей работе c поверхности клеток Bacillus sphaericus AP2 экстрагированы
и разделены методом электрофореза белки. Последующее парциальное секвенирование
основных белков и сравнение полученных результатов с базой данных National Center
for Biotechnology Information (NCBI) [4] позволило идентифицировать белок
поверхностного слоя с Мr ≈118 кДа. Подтверждением этому является образование
монослоя тетрагональной (р4) симметрии при обработке кремниевой пластинки
раствором выделенного белка (рис.1).
Наиболее
высокую
степень
гомологии исследуемый белок показал
с белками S–слоя клеток B. sphaericus
CCM 2177 [5] и B. sphaericus 2362 [6].
Предположив, что указанные S–белки
имеют высокую степень гомологии в
N–терминальной части с искомым, что
для родственных организмов нередко,
нам удалось осуществить синтез
методом ПЦР фрагмента ДНК длиной
Рис. 1 Электронная микрофотография
0,5 т.п.н. Используя данный фрагмент
поверхностного слоя S-белка клеток B.
ДНК в качестве генетического зонда,
sphaericus AP2 на кремниевой пластинке
было осуществлено клонирование и
25
секвенирование ряда фрагментов ДНК, содержащий искомый ген. Длина
секвенированного таким образом гена составляет 3429 п.н., а соответствующий ему
белок состоит из 1142 аминокислотных остатков с рассчитанной молекулярной массой
118951 Да.
Сравнение аминокислотных последовательностей выделенного нами белка с
известными белками поверхностного слоя подтвердило тесную связь степени
гомологии S-белков со степенью родства микроорганизмов. Так, степень гомологии для
близкородственных продуцентов составляет: B. sphaericus CCM 2177 – 44 % [5], B.
sphaericus JG-A12 – 39 % [7], B. sphaericus 2362 – 28 % [6]. Для других
микроорганизмов р. Bacillus степень гомологии заметно ниже: B. anthracis A2012 – 23
% [8], B. firmus – 22 % [9] и B. thuringiensis – 22 % [10]. Как и следовало ожидать,
гомология наблюдается в N–терминальной части макромолекул.
Исходя из нуклеотидной последовательности гена, осуществлен синтез двух
праймеров и методом ПЦР получен полномасштабный ген. Далее ген был клонирован с
помощью вектора pUC 18 в клетки E. coli. Получены клоны pWB_slp_un и pWB_slp_re
с прямой и обратной относительно промотора ориентациями генов соответственно.
Установлено, что добавление в питательную среду клонов IPTG индуцирует
экспрессию гена (рис.2, дорожки 6,7, 9 и10).
Рис.2 Элетрофорез в SDS-ПААГ экстрактов исходного штамма E. coli (дорожки 3 и 4) и
клонов pWB_slp_un через 4, 8 и 24 ч. культивирования (дорожки 5, 6, 7 соответственно) и
pWB_slp_re через 4, 8 и 24 ч. культивирования (дорожки 8, 9, 10 соответственно). Дорожка 1 –
S-белок клеток B. sphaericus AP2. Дорожки 2 и 11 – молекулярный маркер.
Таким образом, из бактериального штамма B. sphaericus AP2 выделен белок
поверхностного слоя, способный образовывать кристаллический монослой
тетрагональной симметрии, а также осуществлено клонирование, секвенирование и
экспрессия соответствующего ему гена.
ЛИТЕРАТУРА
1. Sleytr U.B. , Messner P. , Pum P. , Sára M. // Crystalline Bacterial Cell Surface Layers. SpringerVerlag, Berlin. –1988.
2. Messner P., Allmaier G., Schäffer C. e.a. // FEMS Microbiol. Rew. –1997. –Vol.20. –P. 25-46.
3. Sleytr U.B., Messner P., Pum D., Sara M. // Angew. Chem. –1999. –Vol.111. –P. 1098-1120.
4. http://www.ncbi.nlm.nih.gov
5. Ilk N., Egelseer E.M., Jarosch M., Sleytr U.B., Sara M. // NCBI Database. AF211170
6. Bowditch R.D., Baumann P., Yousten A.A. // NCBI Database. M28361.
7. Raff J. // NCBI Database. CAC19881.
8. Read T.D., Salzberg S.L., Pop M. e.a. // NCBI Database. NP_654829.
9. Gilmour R., Messner P., Guffanti A.A. e.a. // NCBI Database. AAF68436
10.
Sun M., Yu Z. // NCBI Database. CAA09981.
26