Устюгова Екатерина Александровна СИНТЕЗ
реклама
На правах рукописи Устюгова Екатерина Александровна СИНТЕЗ АНТИБИОТИЧЕСКОГО КОМПЛЕКСА ШИРОКОГО СПЕКТРА ДЕЙСТВИЯ ЛАКТОКОККОМ LACTOCOCCUS LACTIS SUBSP. LACTIS 194-K 03.02.03 – микробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2012 Работа выполнена на кафедре микробиологии биологического факультета ФГБОУ ВПО МГУ имени М.В. Ломоносова. Некоторые эксперименты были выполнены в ФГБУ НИИ по изысканию новых антибиотиков имени Г.Ф. Гаузе РАМН, ГУ НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова и ФГБУ науки Институте биоорганической химии имени Шемякина М.М. и Овчинникова Ю.А. РАН. Научный руководитель: доктор биологических наук Стоянова Лидия Григорьевна Научный консультант: Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор Катруха Генрих Степанович доктор биологических наук Ушакова Нина Александровна Федеральное государственное учреждение науки институт проблем экологии и эволюции имени А.Н.Северцова РАН, зав. лабораторией инновационных технологий кандидат биологических наук Загустина Наталья Алексеевна Федеральное государственное учреждение науки институт Биохимии имени А.Н. Баха РАН, старший научный сотрудник Ведущая организация: Государственное научное учреждение Всероссийский научноисследовательский институт молочной промышленности РАСХН Защита состоится 27 ноября 2012 г. в 15.30 мин на заседании диссертационного совета Д 501.001.21 при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, д.1, стр.12, Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, биологический факультет, ауд. М1. Тел: 8 (495) 939-54-83, эл. почта: npiskunkova@rambler.ru С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова. Автореферат разослан «__» 2012 г. Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук Пискункова Н.Ф. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы Молочнокислые бактерии (МКБ) уже более ста лет привлекают внимание исследователей. Исторически в ядро этой группы включены бактерии, относящиеся к родам Lactobacillus, Lactococcus, Streptococcus, Pediococcus и Leuconostoc (Albano et al., 2007). Род Lactococcus, тесно ассоциированный с пищевыми продуктами, является одним из самых значимых среди них (Holzapfel et al., 2001), а некоторые виды лактококков относятся к симбионтной микробиоте человека, в связи с чем были удостоены статуса «GRAS» (Generally Regarded As Safe). Исследования последних десятилетий выявили способность МКБ образовывать антимикробные вещества различной природы, которые могут стать альтернативой существующим антибиотикам и консервантам. Наиболее изученной из них является группа антибактериальных пептидов - бактериоцинов, разнообразных по уровню активности, спектру и механизму действия (Cascales et al., 2007). Бактериоцины легко расщепляются ферментами пищеварительного тракта, и поэтому они могут заменить традиционные химические консерванты (Nes et al., 2007). Бактериоцин низин, образуемый Lactococcus lactis, с успехом используют для увеличения сроков годности продуктов питания в пищевой промышленности многих стран уже более 50 лет (Cleveland et al., 2001). Но применение низина, как и других бактериоцинов, ограничивается относительно узким спектром его антимикробного действия и появлением устойчивых к нему форм пищевых патогенов (Kaur et al., 2011). Особую значимость молочнокислые бактерии приобрели после открытия способности к продукции фунгицидных веществ (Schnürer et al., 2005). Получение новых штаммов МКБ, обладающих антибактериальной и фунгицидной активностью, в перспективе может решить проблему не только порчи продуктов питания, но и лечения ряда инфекционных заболеваний (Marteau et al., 2003; Rouse et al., 2008). Хорошо изучены фунгицидные вещества, образуемыми бактериями рода Lactobacillus (Yang et al., 2010), тогда как наличие фунгицидной активности среди бактерий рода Lactococcus является очень редким и малоизученным свойством, а о природе фунгицидных веществ почти ничего неизвестно (Florianowicz et al., 2001; Стоянова и др., 2007). В этой связи выделение, изучение свойств и синтеза новых антибактериальных и фунгицидных антибиотиков, образуемых лактококками, а также исследование перспективы их применения имеет фундаментальный и практический интерес. Возросший спрос медицины и пищевой промышленности в новых безопасных 1 антимикробных препаратах с широким спектром действия обуславливает актуальность данного исследования. В процессе поиска штаммов лактококков, обладающих широким спектром бактерицидного и фунгицидного действия, на кафедре микробиологии МГУ имени М.В. Ломоносова из коровьего молока Бурятии был выделен штамм Lactococcus lactis subsp. lactis 194 (Стоянова и др., 2006). Однако химическая природа активных компонентов, продуцируемых L. lactis subsp. lactis 194, и особенности их синтеза не были изучены. Данная работа посвящена выделению и установлению химической природы антибиотических веществ, образуемых L. lactis subsp. lactis 194, изучению их синтеза, а также исследованию возможности их практического применения. Цель и задачи работы. Цель исследования: изучение синтеза антибиотического комплекса широкого антимикробного спектра действия, образуемого активным вариантом штамма Lactococcus lactis subsp. lactis 194-K. Для выполнения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи: 1. Изучить диссоциацию штамма Lactococcus lactis subsp. lactis 194 с целью выделения наиболее активного продуцента. 2. Разработать условия выделения и очистки антибиотических веществ, образуемых активным вариантом штамма L. lactis subsp. lactis 194-К. 3. Изучить физико-химические и биологические свойства индивидуальных антибиотиков, установить их химическую природу. 4. Изучить синтез антибиотического комплекса штаммом L. lactis subsp. lactis 194-К и подобрать оптимальную среду культивирования. 5. Испытать эффективность штамма 194-К in vivo на моделе спонтанного хронического дерматоза. Основные положения, выносимые на защиту: 1. Получен активный вариант штамма Lactococcus lactis subsp. lactis 194-К, образующий сложный антибиотический комплекс широкого бактерицидного и фунгицидного спектра действия. 2. Разработаны способы выделения и очистки антибиотиков, образуемых активным вариантом 194-К. 3. Установлен состав антибиотического комплекса: наряду с известным бактериоцином низином А, обнаружен новый бактериоцин 194-D, а также два антибиотика гидрофобной природы (194-А и В), которые являются новыми биологически активными 2 веществами. 4. Эксперименты на мышах линии CBRB-Rb (8.17)1Iem показали эффективность штамма 194-К для лечения воспалительных заболеваний кожи. Научная новизна и практическая значимость работы. 1. Изучена диссоциация штамма Lactococcus lactis subsp. lactis 194 и выделен активный вариант 194-К, продуцирующий антибиотический комплекс с широким спектром антибактериального и фунгицидного действия. 2. Разработана схема выделения и очистки антибиотического комплекса и его отдельных антибиотиков, относящихся к разным классам органических соединений. 3. Впервые показано, что штамм L. lactis subsp. lactis 194-К наряду с низином образует новый бактериоцин 194-D, а также два антибиотика гидрофобной природы (194-А и В), не имеющие аналогов в базе данных природных биологически активных веществ (BNPD). 4. Изучено влияние оптимизированных ферментационных сред различного состава на синтез фунгицидного антибиотика 194-А и нового бактериоцина 194-D. Подобрана оптимальная для их продукции среда. 5. Показана эффективность штамма 194-К для уменьшения степени выраженности симптомов хронического дерматоза у мышей линии CBRB-Rb (8.17)1Iem. Практическая значимость работы заключается в получении активного варианта штамма L. lactis subsp. разработке схемы lactis 194-К, выделения новых антибиотиков, перспективных для использования в пищевой промышленности и медицине. Доказана эффективность перорального применения культуры штамма 194-К для лечения воспалительных заболеваний кожи. Апробация работы и публикации. Результаты диссертационной работы были представлены на международных конференциях студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2009», «Ломоносов2012» (Россия, Москва 2009, 2012); симпозиуме «Современные проблемы физиологии, экологии и биотехнологии микроорганизмов» (Россия, Москва, 2009); III-й научнопрактической конференции «Перспективы развития инноваций в биологии» (Россия, Москва, 2009); III-й Международной конференции «International Conference on Environmental, Industrial and Applied Microbiology» (Португалия, Лиссабон, 2009); VII-й Международной конференции «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии» (Беларуссия, Минск, 2010); VI-м Московском международном конгрессе «Биотехнология, состояние и перспективам развития» (Россия, Москва, 2011); Международной научно-практической конференции «Фармацевтическая и медицинская 3 биотехнология» (Россия, Москва, 2012); ежегодном международном конгрессе «Инфекционные заболевания» (Россия, Москва, 2012). Диссертация апробирована на заседании кафедры микробиологии Биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова 18 сентября 2012 г. По материалам диссертации опубликовано 14 печатных работ, среди которых 6 статей в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ. Структура и объем диссертации Работа изложена на 130 страницах машинописного текста, содержит 17 таблиц и 32 рисунка. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, содержащего 258 отечественных и зарубежных источников. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ В обзоре литературы представлены сведения об антимикробных метаболитах молочнокислых бактерий. Особое внимание уделено рассмотрению многообразия бактериоцинов и фунгицидных веществ, их спектру и механизму антибактериального действия. В отдельных главах рассмотрены перспективы применения молочнокислых бактерий и их метаболитов в пищевой промышленности и медицине. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ В работе использовали штамм Lactococcus lactis subsp. lactis 194, выделенный из коровьего молока Бурятии (Стоянова и др., 2006). Штамм был лиофилизирован и хранился в условиях бытового холодильника. Культуру восстанавливали в обрате в стационарных условиях при 28°С. Из обрата бактерии пересевали в посевную среду, приготовленную на водопроводной воде с дрожжевым экстрактом (20 г/л) и глюкозой (10 г/л), рН среды устанавливали 6,8-7,0. Затем посевной материал вносили в ферментационную среду, содержащую в (г/л): сахароза - 20,0; KH2PO4 - 20,0; NaCl - 2,0; MgSO4 - 0,2; дрожжевой экстракт- 20,0; рН=6,8-7,0 (Стоянова и др., 2006). На данной ферментационной среде изучали диссоциацию штамма 194 с целью выделения активного варианта; антимикробный спектр действия выделенного варианта штамма 194-К, динамику его роста и накопления антибиотика. Разрабатывали схему выделения и очистки отдельных антибиотиков для изучения их биологических и физико-химических свойств. Изучали ферментационных сред различного состава на синтез антибиотиков штаммом влияние 194-К. Антибиотическую активность определяли методом диффузии в агар с измерением зоны подавления роста тест-культуры Bacillus coagulans в мм (Егоров, 2004). 4 Диссоциацию культуры L. lactis subsp. lactis 194 изучали на твердой ферментационной среде с добавлением 2% агара. Отбор наиболее активных по уровню антибиотической активности клонов лактококков проводили методом рассева бактериальной суспензии с последующим отбором колоний разной морфологии (Милько и др., 1991). Спектр антимикробного действия L. lactis subsp. lactis 194-К на разные группы микроорганизмов определяли, используя в качестве стандартов низин, левомицетин и нистатин. В качестве тест-культур использовали микроорганизмы музея кафедры микробиологии ФГБУ ВОП МГУ имени М.В. Ломоносова и ФГБУ НИИ по изысканию новых антибиотиков имени Г.Ф. Гаузе РАМН. Экстракцию антибиотиков и фракционирование культуральной жидкости штамма 194-К проводили по схеме, представленной на рис.7. Культуральную жидкость экстрагировали смесью ацетон - уксусная кислота - культура (4:1:5) при 55С в течение 1.5 ч (Стоянова и др., 2007). Полученный экстракт упаривали в вакууме, к оставшемуся водному концентрату добавляли избыток метанола для осаждения части антибиотиков (рис. 7); осадок отделяли от маточного раствора и получали фракцию I (осадок, порошок-сырец) и фракцию II – водный остаток. фракции II проводили Извлечение гидрофобных антибиотиков (194-А и В) из экстракцией н-бутанолом. Разделение антибиотиков 194-А и В, содержащихся в бутанольном экстракте, проводили с помощью колоночной хроматографии на силикагеле («Merck», Германия); элюцию осуществляли органическими растворителями в следующей последовательности: хлороформ, хлороформ-метанол (1:1), метанол. Выделение антимикробных пептидов проводили из порошка-сырца (рис. 7) методом препаративного изоэлектрофокусирования (ИЭФ; Sova, 1990). Напряжение в приборе для ИЭФ изменяли следующим образом: 1 ч – 200 В, 4 ч – 400 В, следующие 19 ч – 250 В. По окончании процесса содержимое ячеек собирали и упаривали на роторном испарителе «Rotavapor-R Bǘchi» (Швейцария). Сухой остаток растворяли в 0.1 % растворе трифторуксусной кислоты (ТФУ). Все фракции (спиртовые концентраты, маточники, осадок) на каждой стадии выделения анализировали на присутствие антибиотических веществ, используя тесткультуры Bacillus subtilis и Аspergillus niger, а также с помощью ТСХ и электрофореза с последующей биоавтографией. Очистку антибиотиков (194-А и 194-D) от примесей проводили с помощью ОФ-ВЭЖХ на микроколоночном хроматографе «Милихром А-02» (ЗАО «Эконова», Россия). Антибиотик 194-В был очищен с помощью картриджей Диапак-С8 (ЗАО «БиоХимМак СТ», Россия). Полученные индивидуальные антибиотики 194-А, 194-В, 5 194-D анализировали с помощью ИК-спектроскопии, масс-спектрометрии, а также устанавливали спектр их антимикробного действия. Электрофорез проводили на бумаге Filtrak F-14 на V-образном приборе Durruma при 550 В в течение 150 мин в 30% уксусной кислоте с рН 1.7. ТСХ проводили на пластинках DC Alufoilien Kieselgel-60 (“Merck”, Германия) размером 15х15 см в системе растворителей хлороформ-бензол-метанол (30:20:7). Биоавтографию выделенных антибиотиков проводили по известной методике с использованием тест-организма B. subtilis АТСС 6633 (Haese, Keller, 1989). ОФ-ВЭЖХ анализ проводили на микроколоночном жидкостном хроматографе Милихром А-02 (ЗАО «Эконова», Россия), термостатируемом при 35˚С, с колонками из нержавеющей стали размером 2.0x75.0 мм, заполненных сорбентом Prontosil 120-5C18AQ или Nucleosil 300-5C4 («Macherey-Nagel», Германия). В работе использовали линейный градиент подвижной фазы, создаваемый элюентом А (0.1%-ный раствор ТФУ в воде) и элюентом В (0.1%-ный раствор ТФУ в ацетонитриле) при скорости потока 100 мкл/мин. Реагенты готовили с применением воды высшей степени очистки (18.1 Мом/см), полученной на установке Milli-Q®Plus («Millipore», Франция). Детектирование разделяемых веществ осуществляли при нескольких длинах волн 214, 250 и 270 нм в градиенте концентрации элюента В (от 0 до 80-100%); время анализа составляло 20-25 мин для каждой пробы. Контрольным образцом был низин А, растворенный в 0.1%-ной ТФУ, с концентрацией 1 мг/мл. Объем вводимых проб составлял 10-15 мкл. Полученные в ходе ОФ-ВЭЖХ анализа фракции, соответствующие отдельным пикам, были собраны. Антибиотически активные фракции анализировали с помощью физико-химических и биологических методов. Спектр антимикробного действия веществ, содержащихся во фракциях, определяли дисковым методом. UV-VIS-спектры снимали на спектрофотометре Shimadzu UV-1601 PC UV-Visible Spectrophotometer (Japan). Масс-спектры антибиотиков были получены на приборе Ultraflex II MALDI ToF/ToF “Bruker Daltoniсs” (Германия), оснащенном УФ лазером 355 нм (Nd) в режиме получения положительных ионов с использованием рефлектрона. Точность измеренных масс составляла 0.001 %. ИК-спектры выделенных антибиотиков получали на приборе ИК-Фурье спектрометре Nicolet-iS10 (Thermo Fisher Scientific, США) с использованием детектора DTGS, светоделителя KBr, и приставки Smart Performer, оснащенной ZnSe кристаллом. Измерение 6 проводили при разрешении 4 см-1; зона спектра 3000-650 см-1. Спектры обрабатывали с использованием программы OMNIC -7.0. Аминокислотный состав антимикробных пептидов, полученных в ходе ОФ-ВЭЖХ анализа, определяли методом ионно-обменной хроматографии на аминокислотном анализаторе «Hitachi L-8800» (Япония) после полного кислотного гидролиза при следующих условиях: НСlконц.:ТФУ (2:1) с добавлением 0.01%-ного раствора β-меркаптоэтанола в течение 1 ч при 155°С. Объем вводимой пробы на колонку - 95 мкл (Spackman et al., 1958). Изучение влияния ферментационных сред на синтез антибиотического комплекса, образуемого штаммом L. lactis subsp. lactis 194-К, проводили с использованием сред различного состава: среда №1 (г/л): глюкоза – 20,0; гидролизат казеина – 20,0; дрожжевой экстракт – 10,0; КН2РО4 – 30; MgSO4 – 0,2 (Tagg et al., 1976). №2 (г/л): меласса – 20,0; дрожжевой экстракт – 20,0; NH4Н2РО4- 20,0; K2SO4 – 10,0 (Кудряшов и др., 1995). №3 (г/л): меласса – 20,0; дрожжевой экстракт – 20,0; КН2РО4 – 20,0 (Егоров и др., 1986). №4 (г/л): пептон – 4,5; сахароза – 10,0; дрожжевой экстракт – 10,0; КН2РО4 – 28,4; MgSO4 – 0,2; NaCl – 2,0 (Li et al., 2002). №5 (г/л): глюкоза – 25,0; пептон – 10,0; дрожжевой экстракт – 10,0; ацетат натрия – 15,0; цитрат Na - 15,0; K2HPO4 - 5,0; Na2 SO4 - 10,0 (Hirsh, 1981). №6 (г/л): сахароза - 20,0; дрожжевой экстракт – 20,0; KH2PO4 - 10,0; NaCl - 2,0; MgSO4 – 0,2 (Стоянова и др., 2006). №7 (г/л): сахароза – 20,0; гидролизат казеина – 10,0; дрожжевой экстракт – 5,0; K2HPO4 – 2,0; ацетат натрия – 5,0; MgSO4 – 0,2; MnSO4 – 0,5 (de Mann et al., 1960). №8 (г/л): сахароза – 26,8; триптон –5,0; дрожжевой экстракт – 10,0; твин-80 – 3,0; MgSO4 – 0,2; NaCl 8,1; K2HPO4 –1,91 (Zhou et al., 2008). Лактококки культивировали в стационарных условиях при 28°С. рН во всех средах устанавливался на уровне 6.5-6.8. Ферментационная среда №6 являлась контрольной. Количественное содержание бактериоцина 194-D определяли с помощью ОФ-ВЭЖХ анализа по высоте соответствующего ему пика и выражали в оптических единицах в мл культуральной жидкости. Количественное содержание антибиотика 194-А определяли по фунгицидной активности в отношении A. niger в спиртовых концентратах бутанольных экстрактов и выражали в единицах активности по нистатину в мл культуральной жидкости. Изучение влияния культуры штамма L. lactis subsp. lactis 194-К на проявление симптомов дерматоза проводили на самцах мышей линии CBRB-Rb (8.17)1Iem (Моисеева и др., 2009) в возрасте 23,0±1,3 недели, являющихся адекватной моделью спонтанных хронических заболеваний кожи - дерматозов, типа импетиго, эктимы, синдрома ошпаренной кожи. Мыши содержались в стандартных условиях вивария (вне SPF-specific pathogen free барьера). Животных кормили полнорационными гранулированными кормами. В качестве 7 стандартной подкормки использовали зерновые каши (5 г на мышь в день) с добавлением подсолнечного масла и витаминов А, Е, D, F; воду предоставляли без ограничений. Самцам опытной группы (n=17) ежедневно в течение двух недель добавляли к подкормке культуру лактококка 194-К по 300 мкл на мышь в день. Оценку проявления симптомов дерматоза проводили двойным слепым методом один раз в неделю у всех мышей индивидуально. Регистрировали следующие параметры: 1) степень изъязвления кожи на спине по 7-ми бальной шкале; 2) степень проявления алопеции на спине по 7-бальной шкале; 3) площадь пораженного участка спины, в мм2. Статистическую обработку результатов исследований проводили с помощью программы Excel. Данные представляли как среднее ± стандартная ошибка среднего; статистическую значимость различий определяли по общепринятой методике с использованием t- критерия Стьюдента. Достоверность различий соответствовала p<0,05. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Изучение диссоциации популяции штамма Lactococcus lactis subsp. lactis 194 и отбор наиболее активного диссоцианта При изучении диссоциации на твердой ферментационной среде было установлено, что штамм L. lactis subsp. lactis 194 диссоциировал на G (мелкие, прозрачные колонии) с активностью от 3600 до 4000 МЕ/мл (по низину) и S (крупные, белые колонии) с активностью от 2600 до 3600 МЕ/мл (по низину). Были отобраны несколько колоний с разным уровнем антибиотической активности (табл.1). Наиболее активным диссоциантом была популяция, полученная из колонии №14, далее обозначенная как вариант штамма L. lactis subsp. lactis 194-К. Штамм 194-К обладал широким спектром антимикробного действия, эффективно подавлял рост грамположительных (Bacillus subtilis, B. coagulans B. mycoides, Micrococcus luteus, Staphylococcus aureus), грамотрицательных бактерий (E. coli, Pseudomonas aeruginosa, Comamonas terrigena) и обладал фунгицидной активностью в отношении грибов Aspergillus niger, Penicillium chrysogenum и дрожжей Candida tropicales, Rhodotorula aurantiaca, что является редким и малоизвестным биологическим свойством для L. lactis subsp. lactis. Общая антибиотическая активность штамма 194-К в отношении грамположительных бактерий составляла 4100±132 МЕ/мл (по низину), что было на 57% больше по сравнению с популяцией, полученной из колонии № 17 (рис. 1), в отношении грамотрицательных бактерий - 1630±115 ед/мл (по левомицетину), фунгицидная активность составила 1751±93 ед/мл (по нистатину). 8 Рис. 1. Зоны подавления роста Вacillus coagulans диссоциантами штамма L. lactis subsp. lactis 194, полученными из колоний №14 и 17. Табл. 1 Рост и антибиотическая активность разных колоний штамма Lactococcus lactis subsp. lactis 194 за 20 ч инкубирования (тест-организм B. coagulans) № колонии Морфология рН ОП540 Антибиотическая активность, МЕ/мл 10 короткие цепочки кокков (до четырех) отдельные клетки и цепочки кокков отдельные клетки и цепочки из 4-8 кокков короткие цепочки кокков и отдельные кокки отдельные кокки и цепочки из 6-10 клеток отдельные кокки и цепочки разной длины отдельные кокки и цепочки разной длины 4,3 1,0 3000±180 4,5 1,15 4100±132 4,5 1,05 2600±155 4,3 0,85 2700±137 4,6 0.89 3600±175 4,2 0,83 3100±144 4,4 1,0 3000±100 14 17 18 19 20 21 Выделение, очистка и идентификация антибиотических веществ, продуцируемых культурой Lactococcus lactis subsp. lactis 194-К В процессе нашего исследования была разработана схема выделения антибиотического комплекса, а также разделения и очистки отдельных антибиотиков (рис. 7). В связи с тем, что часть антибиотиков всегда связана с клетками продуцента (Hurst, 1981; Yang et al., 1992), мы провели обработку культуры ацетон-уксусной смесью, цель которой заключалась в десорбции антибиотиков из клеток. После осаждения метанолом с последующим отделением осадка культуральная жидкость штамма 194-К была разделена на две фракции. 9 Биологический анализ фракций I и II (рис. 2) показал, что обе фракции содержали вещества, активные в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий, а фракция II обладала фунгицидной активностью. В результате хроматографического исследования полученных фракций было установлено, что фракция I содержала два полярных вещества, одно из которых мигрировало к аноду и имело пептидную природу (рис. 2б). Во фракции II содержались два электронейтральных вещества, одно из них с Rf=0.55-0.6 обладало выраженными гидрофобными свойствами (рис. 2а). Таким образом, в маточном растворе от осаждения (фракция II) содержались гидрофобные антибиотики, в осадке – антибиотики пептидной природы (фракция I). Основной компонет, Rf=0.55-0.6 (194-А и В) Фракция I (194-С и D) (+) Линия старта Низин А Минорный компонент, Rf=0.15-2.0 (194-Е) Линия старта т.1 т.2 т.3 1 1 1 Фракция II (194-А и В) (-) Фракция I Фракция II б а Рис. 2. Биоавтография компонентов антибиотического комплекса, образуемого L. lactis subsp. lactis 194-К (тест-организм B. subtilis). а) ТСХ в системе хлороформ-бензол-метанол 30:20:7; б) электрофорез. Используя экстракцию н-бутанолом нам удалось избавиться от минорного компонента 194-Е фракции II с Rf=0.15-2.0. С помощью колоночной хроматографии на силикагеле основной компонент этой фракции с Rf=0.55-0.6 был разделен на два гидрофобных антибиотика 194-А и 194-В (рис. 3). Их выделение и очистка до индивидуальных веществ была проведена с помощью ОФ-ВЭЖХ, либо методом твердофазной экстракции. Установлено, что антибиотик 194-А обладал фунгицидной активностью и слабой активностью в отношении грамположительных бактерий, а 194-В был активен в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий (табл. 2). Анализ фунгицидного антибиотика 194-А показал, что его молекулярная масса составила 290 Да. В ИК–спектре (рис. 4; табл. 2) присутствовали следующие характеристические полосы поглощения (νmax, см-1): 3412 (альдегидная группа), 2958 (-CH3), 2923(-CH3), 2853 (-СН2-), 1738 (предельный алифатический альдегид), 1631 (альдегидная группа при двойной связи), 1466 10 (алкильный радикал в алкилбензоле), 1378 (метильная группа в алифатическом углеводороде), 1266 (альдегид), 1166 (-С(СН3)2), 1100 (CH-OH), 1073 (-C-OH), 949 (C-O-C), 721 (СНR1= CHR2). Наличие перечисленных характеристических полос указывало, что данное вещество относится к альдегид-содержащим органическим соединениям алкилфенильного ряда. Минимальная ингибирующая концентрация антибиотика 194-А в водном растворе в отношении таких микроорганизмов, как A. niger, A. repens, P. chrysogenum, C. tropicales составляла 0,25 мг/мл (рис. 5а, б). Рис. 3. Биоавтография антибиотиков, образуемых L. lactis subsp. lactis 194-К, выделенных из фракции II (ТСХ в системе хлороформ-бензол-метанол 30:20:7; Kieselgel-60; тест-организм B.subtilis). 194-А 194-В Линия старта Рис. 4. ИК-спектр L. lactis subsp. lactis 194-К. фунгицидного антибиотика 194-А, образуемого Антибиотик 194-В представлял собой более высокомолекулярное вещество с молекулярной массой 879 Да. В его характеристические полосы поглощения, инфракрасном спектре присутствововали указывающие на ароматическую природу и непредельный храктер этого соединения (рис. 6; табл. 2). 11 а б Рис. 5. Минимальная ингибирующая концентрация антибиотика 194-А в отношении микроскопических грибов: A. repens (а), P. chrysogenum (б). Рис. 6. ИК-спектр антибиотика 194-В, образуемого L. lactis subsp. lactis 194-К. Из литературы известно, что бактерии рода Lactococcus являются продуцентами практически важных антимикробных пептидов – бактериоцинов, имеющих относительно узкий спектр действия (Zendo et al., 2010). В немногочисленных работах, посвященных поиску штаммов лактококков, обладающих фунгицидной активностью (Batish et al., 1989; Florianowicz, 2001; Lertcanawanichakul, 2005), отсутствуют сведения о природе фунгицидных веществ. В нашей работе было показано, что природный штамм лактококка L. lactis subsp. lactis 194-К продуцирует два гидрофобных антибиотика, один из которых обладает фунгицидной активностью. Впервые с помощью ИК-спектроскопии была установлена природа фунгицидного антибиотика и показано, что он является альдегид-содержащим органическим соединениям алкил-фенильного ряда. Выделение и изучение физико-химических свойств антимикробных пептидов (194-D и низина А), продуцируемых культурой Lactococcus lactis subsp. lactis 194-К. Согласно данным литературы общие методы выделения бактериоцинов из культуральной жидкости сводятся к их осаждению и нескольких этапов очистки с помощью катионо-обменной, гель-проникающей, обращенно-фазовой хроматографии (Carolissen12 Mackay et al., 1997; Yamamoto et al., 2003; Yamazaki et al., 2005). Также могут использоваться различные стратегии для выделения бактериоцинов из сложных сред, основанные на использовании катионных характеристик (Venema et al., 1997; Cheigh et al., 2004). Табл. 2 Физико-химические и биологичемские свойства антибиотиков 194-А и В образуемых Lactococcus lactis subsp. lactis 194-К Физико-химические свойства UV спектр (EtOH), λmax, нм MALDI-MS (m/z) (M+H)+ ТСХ (Kieselgel-60), Rf в системе хлороформбензол- метанол (30:20:7) ИК-спектр ( νmax, см-1) Антибактериальный спектр действия Растворимость Компонент 194-А Компонент 194-В Нет 271 290 879 0,63 0,57 3412сл, 2958, 2923, 2853, 1738, 1631сл, 1466, 1378, 1266сл, 1166, 1100, 1073, 949сл, 721сл Грамположительные бактерии: B. subtilis Микроскопические грибы: A. niger, A. repens P. chrysogenum C. tropicales 1667сл, 1454, 1143, 847сл, 801, 726, 669сл. растворим в хлороформе, ацетонитриле, этилацетате; не растворим в воде, водном этаноле растворим в н-бутаноле, этилацетате, водном ацетонитриле; не растворим в этаноле, воде Грамположительные бактерии: B. subtilis, B. coagulans M. luteus, S. aureus Грамотрицательные бактерии: E. coli, C. terrigena В нашем исследовании антибиотики пептидной природы, содержащиеся во фракции I (рис. 2б), выделяли с помощью препаративного изоэлектрофокусирования (ИЭФ), в котором разделение основано на разнице в электрических зарядах пептидных молекул. Примененный метод позволил нам выделить два бактериоцина, поэтому его можно рекомендовать для выделения бактериоцинов из их смесей. 13 Культура Lactococcus lactis subsp. lactis 194-К 1) Экстракция смесью ацетон-СН3СООН (4:1) 55оС, 1.5 ч 2) Концентрирование в вакууме до водного остатка Водный концентрат 1) Осаждение метанолом до образования осадка 2) Фильтрация осадка на стеклянном фильтре Осадок Маточный раствор от осаждения 1) Концентрирование в вакууме 2) Промывка остатка 2%-м NaHCO3 Высушивание 2) Фракция II Водный раствор Фракция I (порошок - сырец) 22 Экстракция н-бутанолом Препаративное изоэлектофокусирование. 2 Бутанольный экстракт Фракции ИЭФ-11 и ИЭФ-15 Концентрирование в вакууме досуха ОФ-ВЭЖХ анализ Водно-спиртовый концентрат (Кб) Антибиотик 194-D (ИЭФ- 11) и низин А (ИЭФ-15) Колоночная хроматография на силикагеле Концентраты К1 и К2 Очистка К1 с помощью ОФ-ВЭЖХ, К2 с помощью картриджа «Диапак С8» Антибиотики 194-А (К1) и 194-В (К2) Рис. 7. Схема выделения и очистки компонентов антибиотического комплекса из культуры штамма Lactococcus lactis subsp. lactis 194-К. 14 В ходе работы было установлено, что L. lactis subsp. lactis 194-К образует два биологически активных вещества пептидной природы. Одно из них по времени выхода на ОФ-ВЭЖХ (рис. 8а; 16.2 мин) и молекулярной массе (3353 Да) совпадало с аналогичными характеристиками (пик 1, рис. 8б) бактериоцина низина А (Zendo et al., 2010), и поэтому это вещество было нами идентифицировано как известный бактериоцин низин А. 1.5 0.6 1 0.5 0.4 0.9 О.Е. О.Е. 1 1.2 0.3 0.6 0.2 0.3 0.1 0.0 A270 A214 0.0 A270 A214 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 Время, мин 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 Время, мин а б Рис. 8. Сравнительный ОФ-ВЭЖХ анализ антибиотика, образуемого Lactococcus lactis subsp. lactis 194-К, содержащегося во фракция I (а) и стандартного препарата низина А (б). Другое антимикробное вещество, обозначенное как 194-D, содержалось в пике 2 (рис. 9а); его молекулярная масса составляла 2589 Да (рис. 9б). Для подтверждения пептидной природы антибиотика, содержащегося в пике 2 (рис. 9а), был проведен аминокислотный анализ этого соединения, который показал, что в состав полипептида 194D входят следующие аминокислоты: Асп, Тре, Сер, Глу, Про, Гли, Ала, Вал, Иле, Лей, Фен, Лиз, Трп в количественном соотношении 2:1:2:4:2:2:1:1:1:1:1:1:1. Отсутствие лантионина и относительно низкая молекулярная масса бактериоцина 194-D позволяет предположить, что он относится ко второму классу бактериоцинов. Для идентификации выделенных антибиотиков по имеющимся физико-химическим характеристикам был проведен поиск аналогов по компьютерной базе (BNPD) данных природных биологически активных веществ (Berdy, 1994). По результатам анализа было сделано заключение, что компоненты 194-А, 194-В и D не имеют известных аналогов и являются новыми природными биологически активными веществами. Полипептид 194-D в отличие от низина А, действующего только на грамположительные бактерии (Hurst, 1981), подавлял развитие как грамположительных (B. subtilis, B. coagulans, B. mycoides, Micrococcus luteus), так и грамотрицательных бактерий (E. coli, Comamonas terrigena), что является редким и ценным свойством для антимикробных пептидов, синтезируемых бактериями подвида L. lactis subsp. lactis. 15 2589.063 1.5 600 0.9 2 200 0.3 0.0 A270 A214 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 Время, мин а 2473.977 400 0.6 2460.078 О.Е. 1.2 02460 2500 2520 2560 2600 m/z б Рис. 9. ОФ-ВЭЖХ анализ фракции, содержащей антимикробный полипептид 194-D (пик 2), образуемый Lactococcus lactis subsp. lactis 194-К (а); масс-спектр пептида 194-D (б). Имеются данные (Morgan et al., 1995) о способности штаммом L. lactis subsp. lactis biovar diacetylactis DPC938 образовывать несколько близкородственных бактериоцинов лактококцинов A, B и М. В нашем исследовании впервые было показано, что штамм L. lactis subsp. lactis 194-К способен одновременно с лантибиотиком низином продуцировать еще другой тип бактериоцина. Благодаря продукции двух разных бактериоцинов и двух гидрофобных антибиотиков, один из которых обладал фунгицидной активностью, штамм L. lactis subsp. lactis 194-К является уникальным. В связи с возможностью практического применения фунгицидного антибиотика 194-А и бактериоцина 194-D в дальнейшем было проведено исследование по изучению влияния состава ферментационных сред на их продукцию. Изучение влияния ферментационных сред на синтез фунгицидного антибиотика 194-А и бактериоцина 194-D, образуемых Lactococcus lactis subsp. lactis 194-К Лактококки чрезвычайно требовательны к составу питательных сред, поэтому для их культивирования применяют комплексные среды, содержащие избыток белков и пептидов (De Mann et al., 1960; Tagg et al., 1976). Из литературы был отобран ряд оптимизированных сред, поддерживающих рост продуцента на оптимальном уровне и содержащих в качестве источника углерода либо очищенные сахара (сахароза, глюкоза), либо смесь сахаров в виде мелассы, а в качестве источников аминного азота в разных средах присутствовал дрожжевой экстракт, гидролизат казеина, пептон, соли аммония. Культивирование штамма L. lactis subsp. lactis 194-К показало, что на всех отобранных средах поддерживался высокий уровень роста продуцента и накопления антибиотиков. Этот 16 факт говорит о том, что антибиотическая активность штамма поддерживается как при росте на богатых средах № 1, 4, 6, 7, 8, содержащих комбинации дрожжевого экстракта с пептоном, триптоном, либо гидролизатом казеина, так и на относительно бедных средах (среда №2, №3) с мелассой и дрожжевым экстрактом. Наибольшая общая антибиотическая активность к 23 ч роста культуры была зафиксирована на средах № 1, 2, 4, 7, 8 и составляла от 4375 до 4700 МЕ/мл по низину. Максимальная фунгицидная активность, которая составляла 2434 ед/мл, была зафиксирована на среде №1, содержащей глюкозу, дрожжевой экстракт, гидролизат казеина и фосфат калия (табл. 3). В ходе исследования было установлено, что оптимальной для образования бактериоцина 194-D также являлась среда №1, на которой его количество в культуре штамма 194-К превышало содержание низина А в 1123 раза и составляло 1683 ОЕ/мл (табл. 3). Это говорит о том, что низин А является минорным компонентом в антибиотическом комплексе штамма 194-К. Было замечено, что оба бактериоцина в разном соотношении присутствовали на всех средах только в клеточных экстрактах (табл. 4). В нативном растворе культуральной жидкости был обнаружен только новый бактериоцин 194-D. Содержание бактериоцина 194-D на среде №1 было больше в 3,7 раз, а фунгицидная активность была выше на 39% по сравнению с контрольной средой №6. Возможно этот факт объясняется присутствием гидролизата казеина, олигопептиды которого являются основным источником азота для лактококков (Juillard et al., 1995), а также повышенным содержанием фосфата калия, необходимого для многих внутриклеточных биосинтетических процессов. Табл. 3 Влияние среды культивирования на фунгицидную активность штамма Lactococcus lactis subsp. lactis 194-К (тест-организм Aspergillus niger) Среда культивирования Рост, ОП540 №1 №2 №3 №4 №5 №6 №7 №8 1,39±0,23 1,12±0,08 1,50±0,18 1,43±0,12 1,10±0,13 1,41±0,18 1,25±0,14 1,48±0,10 17 Фунгицидная активность по нистатину, ед/мл 2434±254 90±12 0 1565±133 667±85 1751±93 1845±55 1190±99 Табл. 4 Влияние среды культивирования на количественное содержание бактериоцинов (194-D и низина А) в культуральной жидкости Lactococcus lactis subsp. lactis 194-К (в клетках и нативном растворе) Среда культивирования №1 №2 №3 №4 №5 №6 №7 №8 Количественное содержание бактериоцинов, ОЕ/мл Нативный раствор Клетки 194-D Низин А 194-D Низин А 1683±117 2,2±0,05 1,5±0,05 543±103 2,6±0,05 2,0±0,24 465±49 1,2±0,14 1,90±0,09 687±65 1,6±0,05 1,7±0,09 813±75 2,1±0,19 1,2±0,05 456 ±39 1,2±0,03 933±34 1,3 0,93±0,02 758±19 2,4±0,09 1,2±0,09 Результаты исследований по культивированию штамма 194-К на оптимальной среде №1 в течение 30 ч показали, что синтез бактериоцина 194-D осуществлялся параллельно росту штамма, а синтез фунгицидного антибиотика 194-А начинался после 3-х ч инкубирования. Максимальное накопление обоих антибиотиков достигалось к 20 ч роста культуры (рис. 10). Рис. 10. Динамика образования бактериоцина 194-D и фунгицидного антибиотика 194А при росте Lactococcus lactis subsp. lactis 194-К на среде 1 c гидролизатом казеина, дрожжевым экстрактом и глюкозой. 18 Изучение влияния лактококка Lactococcus lactis subsp. lactis 194-К на проявление симптомов спонтанного хронического дерматоза мышей Возможным практическим применением штамма L. lactis subsp. lactis 194-К, образующего несколько новых антимикробных веществ, является создание на его основе метаболитного пробиотика – препарата, содержащего антимикробные вещества, образуемые симбионтными бактериями. Известно, что такие препараты положительно влияют как на физиологические функции, так и на биохимические реакции макроорганизма (Бондаренко, 2005). Значительное преимущество метаболитных пробиотиков заключается в возможности их применения вместе с антибактериальными препаратами у больных, нуждающихся в повторных курсах антибиотикотерапии. Действие метаболитных пробиотиков реализуется не только как восстанавливающее по отношению к нарушенному микробиоценозу, но и как профилактическое, препятствуя усиленному размножению условно-патогенных бактерий кишечника, которое наблюдается при наличии хронических заболеваний. В настоящее время лекарственные препараты, содержащие метаболиты и микробные фракции, используются для терапии и профилактики дисфункций пищеварительного тракта, при нарушении липидного обмена, болезнях кожи (Молохова и др., 2010). В связи с этим было проведено изучение свойств штамма 194-К в опытах in vivo. В наших исследованиях в качестве экспериментальных животных были выбраны мыши линии CBRB-Rb (8.17)1Iem, являющиеся адекватной моделью хронических воспалительных заболеваний кожи – дерматозов (Моисеева и др., 2009). Дерматозы – это комплексные заболевания, в развитии которых участвуют генетические (чувствительность к аллергенам, дефектная функция кожного барьера, нарушение иммунологических реакций) и инфекционные факторы (Leung et al., 2004). Важным свойством данной модели животных являлась ее наглядность, которая позволяла легко фиксировать изменения, происходящие с животными в процессе приема препарата. Мы предположили, что антимикробные вещества, входящие в состав культуры лактококка 194-К, могут привезти к улучшению состояния кожных покровов животных за счет улучшения микроэкологического состояния кишечника. В результате проведенного исследования было показано, что ежедневное употребление мышами культуры L. lactis subsp. lactis 194-К per os уже через одну неделю привело к улучшению состояния кожи спины: изъязвления у опытных животных были выражены в среднем на 80% меньше (рис. 11а; р=0,001); по сравнению с контрольными животными улучшилось и состояние шерстного покрова (рис. 11б, р=0,02); площадь пораженного участка спины в среднем была меньше, чем у контрольных животных на 24% (рис. 11в; р=0,01). Наименьшая степень проявления алопеции в опытной группе наблюдалась через две 19 недели применения культуры, когда уменьшение по сравнению с началом эксперимента составило 18% (рис. 11б, р=0,04). Опираясь на полученные результаты мы можем говорить о том, что штамм 194-К может быть использован для лечения воспалительных заболеваний кожи. * *** 11а ** 11б Рис. 11. Изменение степени выраженности симптомов дерматоза у мышей линии CBRB, ■ - опыт, ● – контроль; а) степень изъязвления (баллы); б) степень алопеции (баллы); в) площадь поражения (мм2). Примечание: * - достоверное отличие значения показателя в опыте по сравнению с контролем; *** - р=0,001; ** - р=0,01; * - р=0,02. * 11в ВЫВОДЫ: 1. Изучена диссоциация штамма Lactococcus lactis subsp. lactis 194, выделен активный вариант 194-К, обладающий широким спектром антибактериального и фунгицидного действия с антибиотической активностью порядка 4000 МЕ/мл по низину и 1750 ед/мл по нистатину. 2. Разработана схема выделения и очистки двух бактериоцинов (низина А и 194-D) и антибиотиков гидрофобной природы (194-А и В), образуемых L. lactis subsp. lactis 194-К; изучены их физико-химические и биологические свойства, позволяющие заключить, что антибиотики 194-А, В и D являются новыми и не имеют известных аналогов в компьютерной базе данных биологически активных веществ (BNPD). 20 3. Установлено, что активный вариант синтезирует новый бактериоцин 194-D (М= 2589 Да), который в отличие от низина А подавляет рост как грамположительных, так и грамотрицательных бактерий. 4. Фунгицидный антибиотик 194-А является альдегид-содержащим органическим соединениям алкил-фенильного ряда с молекулярной массой 290 Да. 5. Антибиотик 194-В с молекулярной массой 879 Да активен в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий и по химической природе является ароматическим соединением, содержащим алкильные заместители непредельного ряда. 6. Показано, что оптимальной для образования фунгицидного антибиотика 194-А и нового бактериоцина 194-D является среда, содержащая гидролизат казеина, дрожжевой экстракт, глюкозу и фосфат калия, которая способствует увеличению фунгицидной активности на 39%, а продукции нового бактериоцина 194-D в 3,7 раз. 7. Показана эффективность штамма L. lactis subsp. lactis 194-К для лечения хронического дерматоза у мышей линии CBRB-Rb (8.17)1Iem. Список работ, опубликованных в рецензируемых журналах, рекомендуемых ВАК РФ 1. Тренина М. А., Складнев Д. А., Бронников С. В., Стоянова Л. Г., Устюгова Е.А. 2009. Развитие популяций бактерий Lactococcus lactis ssp. lactis на агаризованных средах // Экология и промышленность России. №5. C. 42-46. 2. Stoyanova L.G., Ustyugova E.A., Sultimova T.D., Bilanenko E.N., Fedorova G.B., Katrukha G.S., Netrusov A.I. 2010. New antifungal bacteriocin-synthesizing strains of Lactococcus lactis ssp. lactis as the perspective biopreservatives for protection of raw smoked sausages // Am. J. Agricult. Biol. Sci. V. 5. No4. P. 477-485. 3. Устюгова Е. А., Федорова Г. Б., Катруха Г. С., Стоянова Л. Г. 2011. Изучение антибиотического комплекса, образуемого Lactococcus lactis subsp. lactis 194 вариант-К // Микробиология. Т. 80. №5. С. 644-650. 4. Стоянова Л. Г., Устюгова Е. А., Нетрусов А. И. 2012. Антимикробные метаболиты молочнокислых бактерий: разнообразие и свойства (обзор) // Прикл. Биохим. Микробиол. Т. 48. №3. С. 259-275. 5. Устюгова Е. А., Тимофеева А.В., Стоянова Л.Г., Нетрусов А.И., Катруха Г.С. 2012. Характеристика и идентификация бактериоцинов, образуемых Lactococcus lactis subsp. lactis 194-K // Прикл. Биохим. Микробиол. Т. 48. №6. С. 618-625. 6. Моисеева Е.В., Устюгова Е.А., Семушина С.Г., Аронов Д.А., Стоянова Л.Г. 2012. Влияние культуры Lactococcus lactis subsp. lactis 194-K на проявление симптомов спонтанного хронического дерматоза // Фундаментальные исследования. №6. С. 333-337. 21 Тезисы докладов 1. Устюгова Е.А. Новый антибиотический комплекс, синтезируемый природным штаммом Lactococcus lactis ssp. lactis194. Тезисы докладов международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2009». Москва. 14-17 апреля 2009. C. 173. 2. Устюгова Е.А., Федорова Г.Б., Катруха Г.С., Стоянова Л.Г. Lactococcus lactis ssp. lactis 194 - продуцент антибиотика широкого спектра Всероссийского симпозиума действия. «Современные проблемы Тезисы физиологии, докладов экологии и биотехнологии микроорганизмов». Москва. 24-27 декабря 2009. С. 184. 3. Устюгова Е.А. Стоянова Л.Г. Новый фунгицидный биоконсервант, продуцируемый Lactococcus lactis ssp. lactis 194. Тезисы III научно-практической конференции «Перспективы развития инноваций в биологии». Москва. 11-13 ноября 2009. С. 164. 4. Stoyanova L.G., Ustyugova E.A., Sultimova T.D., Netrusov A.I. New antifungal bacteriocin synthesizing strains of Lactococcus lactis ssp. lactis as the perspective biopreservatives for protection of raw smoked sausages. Abstract of the «III Int. Conf. Environ, Indust. and Appl. Microbiol». Lisboan 2-4 dec. 2009. Р. 326. 5. Устюгова Е.А., Федорова Г.Б., Катруха Г.С., Стоянова Л.Г. Синтез антибиотика широкого спектра действия Lactococcus lactis ssp. lactis. Тезисы VII международной конференции «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии». Минск. 31 мая - 4 июня 2010. С. 168-170. 6. Устюгова Е.А., Федорова Г.Б., Стоянова Л.Г., Катруха Г.С., Сультимова Т.Д. Исследование наиболее перспективных для пищевой промышленности антибиотиков, образуемых природным штаммом Lactococcus lactis ssp. lactis194. Материалы VI московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития». Москва. 21-25 марта 2011. С. 137. 7. Устюгова Е.А., Тимофеева А.В., Стоянова Л.Г., Федорова Г.Б., Катруха Г.С. Бактериоцины, образуемые Lactococcus lactis ssp. lactis 194-К с широким спектром антимикробного действия. Материалы Московской международной научно- практической конференции «Фармацевтические и медицинские биотехнологии». Москва. 20-22 марта 2012. С. 147. 8. Моисеева Е.В., Устюгова Е.А., Семушина С.Г., Аронов Д.А., Стоянова Л.Г. Влияние культуры Lactococcus lactis subsp. lactis 194-К на проявление симптомов хронического дерматита у самцов мышей линии CBRB. Материалы ежегодного Всероссийского конгресса по инфекционным болезням. Москва. 26-28 марта 2012. С. 61. 22 Автор приносит благодарность Федоровой Г.Б. (ФГБУ НИИ по изысканию новых антибиотиков имени Г.Ф. Гаузе РАМН) за помощь в выделении и идентификации антибиотических веществ, Тимофеевой А.В. и Ксенофонтову А.Л. (ГУ НИИ физикохимической биологии имени А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова) за проведение ОФ-ВЭЖХ анализа и установления аминокислотного состава пептидов, Хряповой Е.В. (ФГБУ НИИ биомедицинской спектрометрический анализ, а химии также им. В.Н. Моисеевой Ореховича Е.В. (ФГБУ РАМН) науки за масс- Институт биоорганической химии имени Шемякина М.М. и Овчинникова Ю.А.) за помощь в проведение экспериментов с животными. 23
