Естественные регуляторные Т клетки и цитокины у больных

Иммунопатология, аллергология, инфектология
Immunopathology, allergology, infectology
2009,№4:35-44
АЛЛЕРГОЛОГИЯ
УДК 616.248-018.1-039:576.3
Естественные регуляторные Т-клетки и цитокины у больных
бронхиальной астмой в разные периоды заболевания
Ж.В. Антонович1, В.П. Царев1, Н.В. Гончарова2
1
Белорусский государственный медицинский университет,
220116, г. Минск, пр-т Дзержинского, 83, Беларусь
2
РНПЦ гематологии и трансфузиологии МЗ РБ,
223059, г. Минск, Долгиновский тракт, 160, Беларусь
Naturally occurring T-regulatory cells and cytokines in bronchial asthma patients
observed during the different periods of the disease
Zh.V. Antonovich1, V.P. Tsarev 1, N.V. Goncharova2
1
Belarusian State Medical University
2
The research institute of hematology and blood transfusion, Minsk, Belarus
Аннотация
Summary
В работе представлены результаты динамического исследования Т-регуляции иммунного ответа у 48 больных
бронхиальной астмой (БА) в периоды обострения и ремиссии заболевания и 30 практически здоровых лиц. Период обострения БА характеризуется снижением относительного и абсолютного количества естественных регуляторных Т-клеток (CD4+CD25hi) и повышением относительного и абсолютного количества активированных клеток (CD25+), что сопровождается снижением концентраg и повышением концентрации IL-4 и отражает
ции IFN-g
активность воспалительного процесса с преобладанием
Т-лимфоцитов-хелперов 2-го типа (Th2). Период ремиссии БА характеризуется повышением CD4+CD25hi-клеток
g и снижением IL-4
более чем в 3 раза, повышением IFN-g
по сравнению с обострением заболевания, но сохранением снижения относительного количества CD4+CD25hiклеток по сравнению с группой практически здоровых
лиц. Установлено, что естественные регуляторные Т-клетки являются чувствительным маркером для периодов
обострения и ремиссии БА, а их снижение при БА, наиболее выраженное в период обострения заболевания,
может обуславливать повышение активности Th2, характерное для БА. Естественные регуляторные Т-клетки могут играть роль в предотвращении обострений и прогрессирования БА.
In the work results of the research of T-regulation of
immune responses in 48 patients with exacerbation and
remission of bronchial asthma (BA) and 30 practically healthy
persons are presented. The period of exacerbation of BA is
characterized by decreasing in relative and absolute quantity
of naturally occurring T-regulatory cells (CD4+CD25hi) and
increasing in relative and absolute quantity of activated cells
g concentration decrease
(CD25+) that is accompanied by IFN-g
and IL-4 concentration increase and reflects activity of the
inflammatory process with the prevalence of Th2-cells. The
period of remission of BА is characterized by CD4+CD25hig increase and IL-4
cells increase more than in 3 times, IFN-g
decrease in comparison with exacerbation of BA, but
CD4+CD25hi-cells relative quantity decrease in comparison
with the practically healthy persons group is remained. It is
established, that naturally occurring T-regulatory cells is a
sensitive marker for BA exacerbation and remission and their
quantity decrease in asthma, the most expressed in the disease
exacerbation, can explain Тh2-cells activity increase,
characteristic for BA. Naturally occurring T-regulatory cells
can play a role in the prevention of exacerbations and
progression of BA.
Ключевые слова
Key words
Бронхиальная астма, лимфоциты периферической крови,
естественные регуляторные Т-клетки, цитокины.
Bronchial asthma, peripheral blood lymphocytes, naturally
occurring T-regulatory cells, cytokines.
Иммунопатология, Аллергология, Инфектология 2009 N°4
35
Ж.В. Антонович, В.П. Царев, Н.В. Гончарова
Т-лимфоциты-хелперы 2-го типа (Тh2) играют важную роль в инициации, прогрессировании и персистенции аллергических заболеваний, включая бронхиальную астму (БА) [1].
Однако недостаточно известно об иммунорегуляторных механизмах, определяющих восприимчивость к БА и тяжесть ее течения. Концепция нарушенного баланса Тh1/Тh2, хотя и
способствует настоящему пониманию иммунорегуляции при БА, однако не может объяснить многие (до) клинические и экспериментальные наблюдения [2]. Тогда как не исключаются взаимные ингибиторные эффекты Тh1
и Тh2-опосредованных иммунных ответов,
вероятно, имеется более мощный контрольный механизм. В настоящее время естественные регуляторные Т-клетки рассматриваются как решающие иммунорегуляторные
клетки, способные к супрессии Тh1 и Тh2 опосредованных иммунных ответов [3].
В последние годы накапливаются данные
относительно роли регуляторных Т-клеток
при инфекционных, аутоиммунных заболеваниях, бронхиальной астме и аллергенспецифической иммунотерапии. Наиболее серьезно
обосновано наличие регуляторных функций у
субпопуляции CD4 + -Т-клеток, экспрессирующих б-цепь рецептора IL-2 (CD25) [3]. Эти
клетки формируются в процессе нормальной дифференцировки в тимусе, а не под
действием антигенной стимуляции, поэтому
они получили название естественных (в отличие от адаптивных) регуляторных Т-клеток и осуществляют супрессорный эффект
посредством прямого контакта с клеткамимишенями [4]. Содержание CD25 + -клеток в
субпопуляции наивных зрелых CD4+ -Т-клеток периферической крови взрослых мышей
составляет 5-10% [4]. У человека функции естественных регуляторных Т-клеток выполняют не все CD4+CD25+-лимфоциты, а только их
фракция с высоким уровнем экспрессии CD25
(CD4 +CD25hi-клетки) [5].
Естественные регуляторные Т-клетки принимают участие в инициации и прогрессировании БА. Их исследование представляет научный и практический интерес, поскольку обострения БА отражают высокую активность
воспалительного процесса в дыхательных путях, прогрессирование аллергического воспаления, исходом которого является ремоделирование морфологической структуры бронхов
с последующим развитием хронической дыхательной недостаточности, а целью лечения БА
36
является достижение ремиссии и поддержание
контроля над заболеванием.
В связи с этим целью работы явилось динамическое исследование Т-регуляторного звена
иммунной системы у больных бронхиальной
астмой в периоды обострения и ремиссии заболевания.
Материалы и методы
В исследование (2007-2008 гг.) включено 48
больных бронхиальной астмой в период обострения заболевания (до начала лечения в
пульмонологическом отделении УЗ «6-ая городская клиническая больница» г. Минска) и
в период ремиссии заболевания (через 6 недель после выписки из стационара), а также 30
практически здоровых лиц (группа контроля).
Исследование являлось динамическим, поскольку проводилось на одной и той же группе пациентов в разные периоды бронхиальной
астмы. Средний возраст больных составил 46
лет (от 27 до 52 лет). По половому составу
больные бронхиальной астмой распределились следующим образом: 12 мужчин (25%) и
36 женщин (75%). Средняя продолжительность БА составила 10 лет (от 3 до 17 лет). Аллергическая форма БА (атопический клиникопатогенетический вариант) наблюдалась у 13
больных (27%), смешанная (сочетание атопического и инфекционно-зависимого клиникопатогенетических вариантов) – у 35 больных
(73%). Легкое персистирующее течение БА
имели 13 больных (27%), среднетяжелое персистирующее течение – 19 больных (40%), тяжелое персистирующее течение – 16 больных
(33%). Отягощенная наследственность по
бронхиальной астме имелась у 17 больных
(35%). Средний возраст лиц контрольной
группы составил 39 лет (от 35 до 52 лет), группа включала 11 мужчин (37%) и 19 женщин
(63%). Статистически значимых различий по
возрасту (критерий Манна-Уитни р=0,789) и
полу (двусторонний точный критерий Фишера р=0,314) между группами больных БА и
контрольной не было. Средний возраст больных аллергической формой БА составил 35 лет
(от 26 до 38 лет), группа включала 6 мужчин
(46%) и 7 женщин (54%). Средний возраст
больных смешанной формой БА составил
49 лет (от 28 лет до 56 лет), в группу вошли
6 мужчин (17%) и 29 женщин (83%). Больные с аллергической формой БА в 46% случаев имели сенсибилизацию к одной группе
аллергенов (6 человек) и в 54% случаев - к
Immunopathology, Allergology, Infectology 2009 N°4
Аллергология: Естественные регуляторные Т-клетки и цитокины у больных бронхиальной астмой в разные периоды заболевания
двум и более группам аллергенов (7 человек). Пациенты со смешанной формой БА в
100% случаев имели сенсибилизацию к двум
и более группам аллергенов.
Обострение БА определялось как необычно острая и тяжелая потеря контроля над заболеванием, требующая неотложной терапии
и протекало в виде острого приступа или затяжного варианта, который мог сохраняться более 24 часов и сопровождался на фоне
персистирующей бронхиальной обструкции
повторными острыми приступами удушья.
Период ремиссии характеризовался отсутствием острых приступов и персистирующей бронхиальной обструкции. При полной
ремиссии показатели функции внешнего дыхания соответствовали возрастной или индивидуальной норме [6].
Методы обследования включали клинические, лабораторные, функциональные и иммунологические исследования. Диагноз аллергической и смешанной форм БА устанавливался нами в соответствии с МКБ-10. При определении формы заболевания использовались
данные аллергоанамнеза и предшествующего
аллергологического обследования, включавшего кожные тесты и определение в крови аллергенспецифических IgЕ. Клинико-патогенетические варианты БА представлены согласно
классификации Г.Б. Федосеева [7]. Клиническое обследование включало сбор анамнеза и
количественную оценку выраженности основных семиотических проявлений бронхиальной
астмы (приступов удушья, кашля, одышки,
отхождения мокроты), потребности в ингаляциях в 2-агонистов короткого действия, данных аускультации легких. Выраженность клинических симптомов БА оценивалась по 4-х
балльной шкале, когда трем баллам соответствует максимальное проявление признака, а
нулю – отсутствие симптома.
Лабораторное обследование включало в
себя клинический анализ крови.
Исследование показателей функции внешнего дыхания (ФВД), проводилось на компьютерном спирографе «МАС-1» (Беларусь). Определялись жизненная емкость легких (ЖЕЛ),
форсированная жизненная емкость легких
(ФЖЕЛ), объем форсированного выдоха за 1ю секунду (ОФВ 1), ОФВ 1/ЖЕЛ, ОФВ 1/ФЖЕЛ,
пиковая объемная скорость выдоха (ПОСвыд.), максимальная объемная скорость воздуха на уровне выдоха 25% ФЖЕЛ (МОС 25),
50% ФЖЕЛ (МОС 50 ), 75% ФЖЕЛ (МОС 75 ),
Иммунопатология, Аллергология, Инфектология 2009 N°4
средняя объемная скорость воздуха за период
выдоха от 25 до 75% ФЖЕЛ (СОС 2575), максимальная вентиляция легких (МВЛ), проводился бронходилятационный тест с в2-агонистом
короткого действия.
Концентрации цитокинов IL-4 и IFN-g определяли в сыворотке крови у 21 больного БА
(в периоды обострения и ремиссии заболевания) и у 15 практически здоровых лиц (контрольная группа) методом иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием тест-систем «интерлейкин-4-ИФА-Бест» и «гамма-интерферон-ИФА-Бест» (ЗАО «Вектор-Бест»,
Россия) соответственно, согласно рекомендации фирмы-производителя. Средний возраст
больных БА составил 49±17 лет, лиц контрольной группы – 45±13 лет. Статистически
значимых различий по возрасту (t-критерий
Стьюдента р=0,425) и полу (двусторонний
точный критерий Фишера р=0,122) между
группами не было.
Определение Т-лимфоцитов (CD3 + ), Тлимфоцитов-хелперов (CD4+), цитотоксических Т-лимфоцитов (CD8+), естественных киллерных клеток (CD16+), естественных киллерных клеток с фенотипом Т-лимфоцитов
(CD3 +CD16 + ), активированных клеток
(CD25+), естественных регуляторных Т-клеток
(CD4+CD25hi) проводилось на проточном цитофлюориметре FACScan (Becton Dickinson,
США). Естественные регуляторные Т-клетки
определялись как фракция CD4+CD25 +-лимфоцитов с высоким уровнем экспрессии CD25
(CD4+CD25hi-клетки) [8]. Материалом для исследования являлась венозная кровь, которую
забирали у больных БА и у здоровых лиц в утреннее время натощак в пробирки с гепарином (из расчета 20 ЕД на 1 мл крови). Для
идентификации поверхностных маркеров
применялись поверхностные антиген-специфичные моноклональные антитела (Beckman
Coulter, США) к дифференцировочным клеточным антигенам, конъюгированные с флюорохромами фикоэритрином (PE), фикоэритрин-цианином 5 (PС5) и флюоресцеин изотиоцианатом (FITC). Для изотипического контроля применялся подкласс иммуноглобулинов
IgG1-РЕ/IgG1-РС5/IgG1-FITC
(Beckman
Coulter, США). Популяции и субпопуляции
лимфоцитов оценивались в гейте лимфоцитов. На пробу анализировалось не менее 30 000
клеток. Учет и анализ данных производился в
автоматическом режиме с использованием
программы CELLQuest. Иммунорегуляторный
37
Ж.В. Антонович, В.П. Царев, Н.В. Гончарова
индекс (ИРИ) определялся по соотношению
Т-хелперов/цитотоксических Т-лимфоцитов
(CD4+/CD8+). Абсолютное количество лимфоцитов, несущих соответствующие маркеры, в
1 мкл крови, рассчитывалось относительно абсолютного числа всех лимфоцитов, принимаемого за 100%. Абсолютное количество естественных
регуляторных
Т-клеток
(CD4+CD25hi), в 1 мкл крови, рассчитывалось
относительно абсолютного числа CD4+-лимфоцитов, принимаемого за 100%.
Статистическую обработку материала выполняли с использованием пакета прикладных
программ Statistica 6,0 (StatSoft, Inc., США). К
количественным признакам, имеющим нормальное распределение (критерий Шапиро-Уилка р>0,05), применялись параметрические методы и использовался t-критерий Стьюдента. К
количественным признакам, имеющим распределение, отличное от нормального, а также к
качественным (порядковым или номинальным)
признакам применялись непараметрические
методы и использовались критерии Манна-Уитни, Вилкоксона, Краскела-Уоллиса. Для анализа
взаимосвязи количественного и качественного
признака либо количественных признаков с рас-
пределением, отличным от нормального, использовался непараметрический корреляционный метод Спирмена. Значения показателей
приводятся в виде среднее значение±стандартное отклонение (М±s) для значений признаков,
подчиняющихся нормальному распределению,
и медиана (интерквартильный размах) (Ме
(25%-75%)) для не подчиняющихся нормальному распределению значений. Описательная статистика качественных признаков представлена
абсолютными и относительными частотами. За
критический уровень статистической значимости принимали вероятность безошибочного
прогноза равную 95% (р<0,05) [9].
Результаты и обсуждение
При сравнении групп больных с обострением и ремиссией БА между собой получены статистически значимые различия по выраженности клинических симптомов (критерий Вилкоксона р<0,001), а также по всем исследованным
показателям ФВД (табл. 1). При сравнении групп
больных с обострением и ремиссией БА с контрольной группой также получены статистически значимые различия по всем исследованным
показателям ФВД (табл. 1).
Таблица 1
Выраженность клинических симптомов и показатели функции внешнего дыхания в группах больных бронхиальной астмой в разные периоды заболевания и в группе практически здоровых лиц
Параметр
Выраженность
клинических
симптомов, баллы
ЖЕЛ, %
ФЖЕЛ, %
ОФВ1, %
ОФВ1/ЖЕЛ, %
ОФВ1/ФЖЕЛ,%
ПОСвыд, %
МОС25, %
МОС50, %
МОС75, %
СОС2575, %
МВЛ
Группы обследованных
Больные БА в
Больные БА в
период обострения
период ремиссии
(n=48)
(n=48)
М ± s или
М ± s или
Ме (25%-75%)
Ме (25%-75%)
Практически
здоровые лица
(n=28)
М ± s или
Ме (25%-75%)
36 (29; 40,5)
2,5 (1,0; 10,5)
-
83 ± 18
71 ± 19
58 ± 22
56 (45; 69)
67 ± 13
57 ± 25
39 (27; 60)
31 (22; 50)
28 (21; 44)
36 (24; 51)
38 (24; 51)
91 ± 19
83 ± 21
70 ± 24
64 (51; 73)
71 ± 13
68 ± 25
55 (37; 81)
43 (26; 63)
40 (24; 57)
46 (26; 69)
42 (30; 54)
105 ± 11
105 ± 11
106 ± 10
80 (77; 84)
87 ± 6
93 ± 17
95 (85; 115)
100 (88; 108)
92 (80; 109)
104 (99; 113)
53 (43; 63)
Примечание – во всех сравнениях р<0,05.
38
Immunopathology, Allergology, Infectology 2009 N°4
Аллергология: Естественные регуляторные Т-клетки и цитокины у больных бронхиальной астмой в разные периоды заболевания
Заслуживают внимания результаты корреляционного анализа по Спирмену, указывающие на сильные положительные корреляционные связи между периодом БА и количеством естественных регуляторных Т-клеток
(r=0,86; p<0,001; n=96), а также на сильные
обратные корреляционные связи между выраженностью клинических проявлений БА и количеством естественных регуляторных Т-клеток (r= - 0,78; p<0,001; n=96). Иначе, снижение
количества естественных регуляторных Тклеток совпадало с обострением БА и утяжелением клинической симптоматики.
Нами была проанализирована средняя интенсивность флюоресценции, показатель которой для CD25+ составил (медиана и интерквартильный размах) 53 (46; 64), а для CD25hi – 1385
(1172; 1641), т.е. был в десятки раз выше, чем для
CD25 +, что соответствует определению естественных регуляторных Т-клеток, как фракции
CD4 +CD25 +-лимфоцитов с высоким уровнем
экспрессии CD25 (CD4+CD25hi-клетки).
Результаты оценки показателей клеточного
иммунитета у практически здоровых лиц и
больных бронхиальной астмой в разные периоды заболевания представлены в таблице 2.
Таким образом, для периода обострения БА
было характерно при повышенном абсолютном количестве CD3+, CD4+-лимфоцитов снижение относительного количества цитотоксических CD8 +-лимфоцитов, в результате чего
повышался ИРИ; снижение относительного и
абсолютного количества естественных регуляторных Т-клеток (CD4+CD25hi) и повышение
относительного и абсолютного количества активированных клеток (СД25 +). Особенностью
периода ремиссии БА являлось повышение
относительного и абсолютного количества естественных регуляторных Т-клеток более чем
в 3 раза по сравнению c обострением заболевания, но сохранение снижения их относительного количества по сравнению с группой
практически здоровых лиц. Статистически
значимых различий по количеству CD16 + ,
CD3 +CD16 +-лимфоцитов у практически здоровых лиц и больных БА в разные периоды
заболевания выявлено не было.
Функциональную активность Т-лимфоцитов-хелперов 1-го и 2-го типов отражают концентрации секретируемых ими цитокинов IFNg и IL-4, соответственно [10].
Результаты оценки концентраций цитокинов
IFN-g и IL-4 в сыворотке крови практически
здоровых лиц и больных бронхиальной астмой
Иммунопатология, Аллергология, Инфектология 2009 N°4
в периоды обострения и ремиссии заболевания
представлены в таблице 3.
В период обострения БА выявлено снижение
концентрации IFN-g и повышение концентрации IL-4 по сравнению с ремиссией заболевания.
У больных БА в периоды обострения и ремиссии заболевания отмечалось повышение
уровней цитокинов IFN-g и IL-4 по сравнению
с группой практически здоровых лиц, преимущественно за счет IL-4.
Наблюдаемое при БА нарушение соотношения Th1 и Th2-лимфоцитов, приводящее к поляризации Th2-клеток и усиленному синтезу
ими цитокинов IL-4, IL-5, IL-9, IL-10, IL-13, которые подавляют пролиферацию Th1-клеток
и их функции [10], в т.ч. секрецию IL-2, необходимого для пролиферации цитотоксических
CD8+ Т-лимфоцитов, может объяснять снижение относительного количества цитотоксических CD8+ Т-лимфоцитов в период обострения
БА, в результате чего повышается ИРИ, а также снижение концентрации IFN-г в период
обострения БА. Повышенное количество
СД25+-клеток и повышенная концентрация IL4, наблюдаемые в период обострения БА, отражают активность воспалительного процесса с
преобладанием Тh2-клеток.
У здоровых же лиц Т-регуляция иммунного
ответа обеспечивается за счет сбалансированной
функциональной активности Т-лимфоцитовхелперов 1-го и 2-го типов. Другим Т-регуляторным уровнем являются естественные регуляторные Т-клетки.
Обращает на себя внимание тот факт, что в
гемограмме у пациентов с аллергической формой БА в 38% случаев была зарегистрирована
эозинофилия, тогда как у пациентов со смешанной формой БА в гемограмме отмечался
лейкоцитоз. При сравнении показателей гемограммы в период обострения БА в группах
аллергическая БА – смешанная БА статистически значимые различия (t-критерий Стьюдента) получены по количеству лейкоцитов,
кл/мкл (8743,08±3031,36; 12281,1±4084,2, соответственно, р=0,007), абсолютному количеству
нейтрофилов, кл/мкл (5524,42±2424,54;
8296,6±3563,5, соответственно, р=0,013); абсолютному количеству эозинофилов, кл/мкл
(225,00 (49,2; 477,0); 98,00 (0; 282,0), соответственно, критерий Манна-Уитни р=0,008). Статистически значимых различий по процентному содержанию эозинофилов (3 (1; 5); 1 (0; 2),
соответственно, критерий Манна-Уитни
р=0,060), сегментоядерных нейтрофилов (58±8;
39
Ж.В. Антонович, В.П. Царев, Н.В. Гончарова
Таблица 2
Показатели клеточного иммунитета у практически здоровых лиц и больных бронхиальной астмой в периоды
обострения и ремиссии заболевания
Показатель
Лейкоциты, кл/мкл
Группы обследованных
Больные БА в
Больные БА в
период обострения
период ремиссии
(n=48)
(n=48)
М ± s или
М ± s или
Ме (25%-75%)
Ме (25%-75%)
11400,00*
(8610,00; 13650,00)
Лимфоциты, %
27,06±10,30**
Лимфоциты, кл/мкл 2617,20***
(2112,00; 3365,00)
+
Т-лимфоциты CD3 , % 65,08
(60,11; 72,30)
Т-лимфоциты CD3+, 1759,49***
кл/мкл
(1215,70; 2292,28)
+
Т-хелперы CD4 , %
38,19
(35,37; 44,33)
1066,65***
Т-хелперы CD4+,
кл/мкл
(758,70; 1475,01)
Т-цитотоксические
20,41±4,52***
CD8+, %
Т-цитотоксические
502,59
CD8+, кл/мкл
(360,38; 767,91)
Естественные киллеры 13,42
(10,05; 17,75)
Естественные киллеры 299,21
кл/мкл
(201,36; 495,79)
Т-клетки с
7,16
киллерной активностью (3,47; 18,35)
CD3+CD16+, %
Т-клетки с
182,61
киллерной активностью (73,32; 382,99)
CD3+CD16+, кл/мкл
Активированные
10,22
клетки CD25+, %
(4,92; 13,09)*
Активированные
266,45*
клетки CD25+, кл/мкл (125,11; 366,27)
Естественные
1,56
регуляторные
(1,14; 1,97)*
Т-клетки CD4+CD25hi, %
Естественные
16,41*
регуляторные
(11,25; 22,22)
Т-клетки CD4+CD25hi,
кл/мкл
ИРИ
1,92
(1,67; 2,26)***
Практически
здоровые лица
(n=30)
М ± s или
Ме (25%-75%)
7265,00**
(6105,00; 8920,00)
30,92±9,04 #
2229,40
(1722,10; 2764,05)
67,99
(64,56; 71,64)
1508,73
(1150,65; 1955,03)
39,23
(33,69; 43,76)
843,89
(664,02; 1146,83)
23,29±5,08
5985,00
(4660,00; 6550,00)
36,27±8,60
2074,95
(1751,10; 2458,60)
68,49
(66,14; 70,77)
1413,97
(1193,00; 1659,04)
40,08
(36,93; 41,72)
876,74
(676,56; 960,27)
23,19±3,37
488,73
(387,69; 654,73)
13,97
(9,79; 18,33)
312,29
(178,12; 422,56)
7,33
(3,33; 12,32)
480,31
(394,57; 582,52)
14,08CD16+, %
(11,35; 16,93)
286,21CD16+,
(221,87; 343,74)
5,06
(3,87; 8,91)
117,52
(71,10; 357,06)
109,45
(67,87; 195,94)
5,85
(4,14; 7,83)
130,23
(90,88; 176,79)
5,90
(4,96; 6,71)**
5,49
(3,69; 6,01)
112,06
(56,61; 144,38)
7,40
(6,41; 8,52)
51,16
(32,82; 66,37)
59,30
(45,82; 73,88)
1,69
(1,43; 1,93)
1,74
(1,61; 1,85)
Примечания:
1. *- р<0,001 по сравнению с ремиссией и контрольной группой.
2. **- р<0,001 по сравнению с контрольной группой.
3. ***- р<0,01 по сравнению с ремиссией и р<0,05 по сравнению c контрольной группой.
4. # - р=0,011по сравнению с контрольной группой.
40
Immunopathology, Allergology, Infectology 2009 N°4
Аллергология: Естественные регуляторные Т-клетки и цитокины у больных бронхиальной астмой в разные периоды заболевания
Таблица 3
g и IL-4 в сыворотке крови практически здоровых лиц и больных бронхиальной
Концентрации цитокинов IFN-g
астмой в периоды обострения и ремиссии заболевания, пг/мл
Цитокин
IFN-g, пг/мл
Ме (25%-75%)
IL-4, пг/мл
Ме (25%-75%)
Группы обследованных
Больные БА
в период
обострения
(n=21)
Больные БА
в период
ремиссии
(n=21)
Практически
здоровые лица
(n=15)
7,88*
(4,85; 10,30)
332,39**
(231,82; 401,90)
12,73***
(10,12; 21,60)
174,66***
(97,69; 267,33)
2,35
(1,44; 3,99)
1,53
(0,96; 1,99)
Примечания:
1. *-р<0,001 по сравнению с ремиссией и группой практически здоровых лиц.
2. **-р=0,030 по сравнению с ремиссией и р<0,001 по сравнению с группой практически здоровых лиц.
3. ***-р<0,001 по сравнению с группой практически здоровых лиц.
63±11, соответственно, р=0,144), лимфоцитов
(28±7; 27±11, соответственно, t-критерий Стьюдента р=0,752) и абсолютному количеству лимфоцитов, кл/мкл (2204,59 (1869,6; 2550,0); 3038,0
(2245,8; 3422,0), соответственно, критерий Манна-Уитни р=0,056) выявлено не было.
При анализе причин обострения БА было установлено, что у пациентов с аллергической
формой БА обострение возникало преимущественно вследствие контакта с причинно-значимыми аллергенами (100% случаев – 13 больных),
тогда как у пациентов со смешанной формой БА
обострение возникало вследствие контакта с
причинно-значимыми аллергенами и/или при
обострении инфекционных заболеваний верхних дыхательных путей.
Предваряя сравнительный анализ показателей клеточного иммунитета в группах больных с аллергической и смешанной формами
БА и контрольной группы, хочется отметить,
что поскольку группы не отличались по полу
(анализ таблиц сопряженности с использованием критерия l2 Пирсона р=0,080), но отличались по возрасту (критерий Краскела-Уоллиса р=0,029), нами был проведен корреляционный анализ по Спирмену между возрастом
и показателями клеточного иммунитета в
группах больных БА и контрольной, не выявивший корреляционных связей как для относительного и абсолютного количества
CD4+CD25hi-клеток, так и для других показателей клеточного иммунитета, что позволило
нам провести сравнительный анализ этих показателей в группах.
Иммунопатология, Аллергология, Инфектология 2009 N°4
При сравнении групп аллергическая БА –
смешанная БА – контрольная в период обострения БА получены статистически значимые
различия (критерий Краскела-Уоллиса) по абсолютному количеству CD3 + -лимфоцитов
(р=0,031), относительному количеству CD8+лимфоцитов (р=0,018), относительному и абсолютному количеству CD25+-лимфоцитов и
CD4+CD25 hi-клеток (р<0,001), а также по ИРИ
(р=0,018). Мы провели парные сравнения
групп по этим показателям, выявившие статистически значимые различия. При сравнении
показателей клеточного иммунитета в период
обострения в группах аллергическая БА – смешанная БА статистически значимые различия
(t-критерий Стьюдента) получены по процентному содержанию CD4 + -лимфоцитов
(42,50±5,94; 37,08±8,35, соответственно,
р=0,038) и CD25 +-лимфоцитов (12,95±6,51;
9,08±5,34, соответственно, р=0,041). Статистически значимых различий (критерий МаннаУитни) по процентному содержанию (1,37
(1,06; 1,65); 1,60 (1,26; 2,38), соответственно,
р=0,210) и абсолютному количеству (12,6 (9,3;
19,8); 17,2 (12,3; 24,5), соответственно, р=0,147)
CD4+CD25hi-клеток получено не было. Мы не
выявили статистически значимых различий
между группами по ИРИ, процентному содержанию и абсолютному количеству CD3 + ,
CD8+, CD16+, CD3+CD16+-лимфоцитов и по абсолютному количеству CD4 +, CD25 +-лимфоцитов. При сравнении групп больных с аллергической и смешанной формами БА в период
обострения заболевания с контрольной груп41
Ж.В. Антонович, В.П. Царев, Н.В. Гончарова
пой получены статистически значимые различия по показателям гемограммы, CD8+, CD25+лимфоцитам, CD4+CD25hi-клеткам, аналогичные полученным при сравнении обострения
БА с контрольной группой (табл.2), помимо
этого для аллергической формы БА по сравнению с контрольной группой было характерно повышение ИРИ (2,05 (1,87; 2,28); 1,74
(1,61; 1,85), соответственно, критерий Манна-Уитни р=0,028), а для смешанной – абсолютного количества CD3+, CD4+-лимфоцитов;
в группе больных с аллергической формой БА
абсолютное количество лимфоцитов не отличалось от контрольной группы (критерий
Манна-Уитни р=0,397).
При сравнении групп аллергическая БА –
смешанная БА – контрольная в период ремиссии БА получены статистически значимые
различия (критерий Краскела-Уоллиса) по количеству лейкоцитов (р<0,001), нейтрофилов
(р<0,001), процентному содержанию лимфоцитов (р=0,036), процентному содержанию и
абсолютному количеству эозинофилов
(р<0,001), а также процентному содержанию
(р<0,001) и абсолютному количеству (р=0,046)
CD4+CD25hi-клеток. Мы провели парные сравнения групп по этим показателям, выявившие
статистически значимые различия. При сравнении групп больных с аллергической и смешанной формами БА в период ремиссии заболевания получены статистически значимые
различия (критерий Манна-Уитни) по количеству лейкоцитов, кл/мкл (6330,0 (5630,0;
7000,0); 7820,0 (6790,0; 9570,0), соответственно,
р=0,001), абсолютному количеству нейтрофилов, кл/мкл (3 440,8 (2764,8; 3789,5); 4674,6
(3235,0; 5704,0), соответственно, р=0,006), а
также по процентному содержанию
CD4+CD25hi-клеток (5,19±1,09; 6,20±1,58, соответственно, t-критерий Стьюдента р=0,040).
Мы не выявили статистически значимых различий между группами по абсолютному количеству CD4+CD25 hi-клеток (39,7 (29,9; 54,34);
55,5 (37,6; 70,4), соответственно, критерий
Манна-Уитни р=0,072), процентному содержанию и абсолютному количеству CD3 + ,
CD4+, CD8+, CD16+, CD25+, CD3+CD16+-лимфоцитов, ИРИ. При сравнении группы больных
с аллергической формой БА в период ремиссии заболевания с контрольной группой получены статистически значимые различия по
относительному (5,19±1,09; 7,44±2,13, соответственно, t-критерий Стьюдента р<0,001) и абсолютному (39,7 (29,9; 54,34); 59,3 (45,82;
42
73,88), соответственно, критерий Манна-Уитни р=0,028) количеству CD4+CD25hi-клеток, в
то время как для смешанной формы БА по
сравнению с контрольной группой были характерны различия по показателям гемограммы и CD4+CD25hi-клеткам, аналогичные полученным при сравнении ремиссии БА и контрольной группы (табл.2).
При аллергической форме БА относительное (t-критерий Стьюдента р<0,001) и абсолютное (критерий Вилкоксона р<0,001) количество CD4 +CD25hi-клеток повышалось в период ремиссии более чем в 3 раза по сравнению с обострением заболевания. Та же тенденция отмечена в группе больных со смешанной
формой БА (критерий Вилкоксона р<0,001).
Таким образом, для аллергической формы
БА по сравнению со смешанной формой БА
характерно повышение относительного количества CD4 + и CD25 +-лимфоцитов в период
обострения и снижение относительного количества CD4 +CD25hi-клеток в период ремиссии
заболевания.
Аллергическая форма БА по сравнению с
контрольной группой характеризуется снижением относительного и абсолютного количества CD4+CD25hi-клеток, как в период обострения, так и в период ремиссии заболевания, в то
время как, для смешанной формы БА характерно снижение относительного и абсолютного количества CD4 + CD25 hi-клеток в период
обострения заболевания и снижение относительного количества CD4+CD25hi-клеток в период ремиссии БА.
Как для аллергической, так и для смешанной форм БА характерно нарастание относительного и абсолютного количества
CD4+CD25hi-клеток в период ремиссии БА более чем в 3 раза по сравнению с обострением
заболевания.
Полученные нами результаты, демонстрирующие повышение количества естественных
регуляторных Т-клеток при достижении ремиссии БА, согласуются с данными литературы о роли естественных регуляторных Т-клеток при аллергии и БА [11, 12, 13]. Данные о
способности естественных регуляторных Тклеток подавлять аллергические процессы
получены в контролируемых условиях экспериментов in vivo и in vitro. Так, в экспериментальной модели бронхиальной астмы уменьшение содержания естественных регуляторных Т-клеток вызывало накопление Тh2-клеток, индуцирующих эозинофильное воспале-
Immunopathology, Allergology, Infectology 2009 N°4
Аллергология: Естественные регуляторные Т-клетки и цитокины у больных бронхиальной астмой в разные периоды заболевания
ние дыхательных путей [13]. Интересная работа относительно роли естественных регуляторных Т-клеток при аллергии выполнена
Karlsson и соавт. у детей с аллергией к лактальбумину [12]. Дети, которые утратили
гиперчувствительность к лактальбумину,
имели большее число CD4+CD25+ Т-клеток
в крови, чем те, у кого сохранялась клинически активная аллергия. Отмечена способность естественных регуляторных Т-клеток
подавлять активность как Th1-клеток, так и
Th2-клеток [11], однако, очевидно, сильнее
проявляется их действие на те субпопуляции Т-хелперов, функция которых повышена, что обозначается как регулирующее действие CD4 + CD25 hi -клеток на баланс Тh1/
Th2-клеток [14]. Так, при БА преимущественно проявляется подавляющее действие
CD4 + CD25 hi -клеток на Th2-ответ, вызванный аллергенами [15]. Выполненные работы
указывают на потенциальную роль естественных регуляторных Т-клеток в спонтанном изменении течения БА и других аллергических заболеваний и могут свидетельствовать о способности естественных регуляторных Т-клеток регулировать эти патологические процессы. В результате проведенного нами динамического исследования
получены новые данные о том, что у больных бронхиальной астмой количество естественных регуляторных Т-клеток, сниженное в период обострения заболевания, повышается в период ремиссии, однако, при
этом, не достигает нормального уровня.
Выводы
1. Период обострения БА характеризуется
снижением относительного и абсолютного количества естественных регуляторных Т-клеток
(CD4 +CD25hi) и повышением относительного
и абсолютного количества активированных
клеток (CD25 +), что сопровождается снижением концентрации IFN-г и повышением концентрации IL-4 и отражает активность воспалительного процесса с преобладанием Т-лимфоцитов-хелперов 2-го типа.
Период ремиссии БА характеризуется повышением относительного и абсолютного количества естественных регуляторных Т-клеток более чем в 3 раза, повышением концен-
Иммунопатология, Аллергология, Инфектология 2009 N°4
трации IFN-g и снижением концентрации
IL-4 по сравнению с обострением заболевания, но сохранением снижения относительного количества естественных регуляторных
Т-клеток по сравнению с группой практически здоровых лиц.
У больных БА в периоды обострения и ремиссии заболевания отмечается повышение
уровней цитокинов IFN-г и IL-4 по сравнению
с группой практически здоровых лиц, преимущественно за счет IL-4.
Статистически значимых различий по количеству CD16 +, CD3 + CD16 + -лимфоцитов у
практически здоровых лиц и больных БА в
периоды обострения и ремиссии заболевания
не выявлено.
2. Для аллергической (атопический вариант) формы БА характерно снижение относительного количества CD4 + CD25 hi -клеток по
сравнению со смешанной формой БА (сочетание атопического и инфекционно-зависимого
вариантов), наблюдаемое в период ремиссии
заболевания.
3. Как для аллергической (атопический вариант), так и для смешанной (сочетание атопического и инфекционно-зависимого вариантов) форм БА характерно снижение относительного и абсолютного количества
CD4+CD25hi-клеток в период обострения заболевания, нарастание их количества в период
ремиссии БА более чем в 3 раза, но сохранение
снижения относительного и абсолютного количества CD4 +CD25 hi-клеток при аллергической форме БА и относительного количества
CD4+CD25hi-клеток при смешанной форме БА
в период ремиссии заболевания по сравнению
с группой практически здоровых лиц.
4. Установлено, что естественные регуляторные Т-клетки являются чувствительным
маркером для периодов обострения и ремиссии БА, а снижение их количества при БА, наиболее выраженное в период обострения заболевания, может обуславливать повышение активности Т-лимфоцитов-хелперов 2-го типа,
характерное для БА.
5. Естественные регуляторные Т-клетки,
в зависимости от их количества и функциональной активности, могут играть роль в
предотвращении обострений и прогрессирования БА.
43
Ж.В. Антонович, В.П. Царев, Н.В. Гончарова
Литература
1. Larche M., Robinson DC., Kay AB. The role of T
lymphocytes in pathogenesis of asthma. J. Allergy Clin.
Immunol. 2003; 111: 450-63.
Пособие для врачей-лаборантов / Б.В. Пинегин, А.А. Ярилин, А.В. Симонова и др. М.; 2001. – 53 с.
2. Gor DO., Rose NR., Greenspan NS. TH1- TH2: a
Procrustean paradigm. Nat. Immunol. 2003; 4: 503-5.
7. Реброва О. Ю. Статистический анализ медицинских
данных. Применение пакета прикладных программ
Statistica. М.: Медиасфера; 2002. – 312 с.
1. Ярилин А. А., Донецкова А. Д. Естественные регуляторные Т-клетки и фактор FOXP3. Иммунология. 2006; 3: 176-88.
8. Медуницын Н. В. Цитокины и аллергия. Иммунология.
1999; 5: 5-9.
2. Sakaguchi S. Natural arising CD4 + regulatory T cells for
immunologic self-tolerance and negative control of immune
responses. Annu. Rev. Immunol. 2004; 22: 531-62.
9. Bellinghausen I, Klostermann B, Knop J, Saloga J. Human
CD4+CD25+ Т-cells derived from the majority of atopic
donors are able to suppress TH1 and TH2 cytokine production.
J. Allergy Clin. Immunol. 2003; 111: 862-8.
3. Baecher-Allan C., Wolf E., Hafler DA. Functional analysis of
highly defined, FACS-isolated populations of human regulatory
CD4+CD25+ T cells. Clin. Immunol. 2005; 115:10-8.
4. Глобальная стратегия лечения и профилактики бронхиальной астмы (GINA). Пересмотр 2006 г. Под ред. Чучалина А. Г. – М.: «Атмосфера»; 2007. – 104 с.
5. Федосеев Г.Б. Бронхиальная астма. Аллергология, Т II.
Частная аллергология. Под ред. Г.Б. Федосеева. – СПб:
«Нордмед-Издат»; 2005: 64-138.
6. Применение проточной цитометрии для оценки функциональной активности иммунной системы человека.
10. Karlsson MR, Rugtveit J, Brandtzaeg P. Allergen-responsive
CD4+CD25+ regulatory T-cells in children who have outgrown
cow,s milk allergy. J. Exp. Med. 2004; 199: 1679-88.
11. Jaffar Z, Sivacuru T, Roberts K. CD4+CD25+ T-cells
regulate airway eosinophilic inflammation by modulating the
TH2 cell phenotype. J. Immunol. 2004; 172: 3842-9.
12. Nelson HS. Advances in upper airway diseases and allergen
immunotherapy. J.Allergy Clin. Immunol. 2004; 113: 635-42.
13. Robinson DS. Regulation: the art of control? Regulatory Tcells and asthma and allergy. Thorax. 2004; 59: 640-3.
Антонович Жанна Владимировна, ассистент
кафедры пропедевтики внутренних болезней
БГМУ
Дом. адрес: 220095 г. Минск, ул. Якубова, д.
48, к. 2, кв. 91, тел: 8 (017) 214-79-30,
8 (029) 657-36-73 (Velcom)
Царёв Владимир Петрович, д.м.н., зав.
кафедрой пропедевтической терапии БГМУ
Дом. адрес: 220037 г. Минск, ул.
Филимонова, д. 14, кв. 46, раб. тел: 245-2699,
8 (029) 701-23-67 (МТС)
Гончарова Наталья Васильевна, тел. 8 (029)
255-17-79 (МТС) ст. науч. сотрудник
РНПЦ гематологии и трансфузиологии
Поступила 3.11.09 г.
44
Immunopathology, Allergology, Infectology 2009 N°4