Формирование резистентности вируса к антиретровирусным
реклама
Выездной обучающий семинар по лечению детей с ВИЧ-инфекцией для врачей-специалистов Армении, Беларуси, Грузии, Молдовы и Украины 18-20 июня 2013 г. Формирование резистентности вируса к антиретровирусным препаратам 1. Введение Этот учебный модуль посвящен основам формирования резистентности вируса к антиретровирусным препаратам у ВИЧ-инфицированных, получавших или получающих антиретровирусные препараты. Описаны сочетания мутаций, обеспечивающие резистентность вируса к разным группам антиретровирусных препаратов, а также разные методы, применяющиеся для оценки резистентности вируса к препаратам. Интерпретация результатов тестов на резистентность в клинической практике, как генотипических, так и фенотипических, достаточно сложна, и алгоритмы интерпретации все время совершенствуются. Приведены доказательства клинической пользы от применения этих тестов. 2. Цели обучения После завершения изучения этого модуля вы получите знания о разных методах выявления штаммов ВИЧ, резистентных к антиретровирусным препаратам; о сочетаниях мутаций, обеспечивающих резистентность вируса к разным группам антиретровирусных препаратов; о том, как интерпретировать выявленные сочетания мутаций для того, чтобы принимать решения о замене схемы терапии в клинической практике. Курс организован при поддержке Детского фонда ООН и МАС AIDS Fund 3. Биологические основы развития резистентности В организме ВИЧ-инфицированного, который не получает антиретровирусную терапию, репликация ВИЧ происходит с огромной скоростью, с образованием миллионов, даже миллиардов новых вирусных частиц ежедневно. Поскольку фермент обратная транскриптаза допускает ошибки во время синтеза провирусной ДНК, то на этапе обратной транскрипции (ОТ) цикла репликации вируса образуется некоторое количество штаммов со случайными мутациями. Многие мутантные штаммы нежизнеспособны, но некоторые мутации делают вирус резистентным к антиретровирусным препаратам. Иными словами, появляются вирионы с измененными генами, кодирующими обратную транскриптазу или протеазу, со сниженной чувствительностью к одному или нескольким антиретровирусным препаратам. Резистентность к лекарственным препаратам обусловлена структурными изменениями молекул этих ферментов, которые уменьшают степень связывания фермента и блокирующего его функцию препарата. Эти механизмы не так просты; например, если рассматривать штаммы, резистентные к нуклеозидным ингибиторам обратной транскриптазы (НИОТ), то мутации в одних штаммах уменьшают вероятность связывания препарата с ферментом, а в других — ускоряют отсоединение аналога нуклеозида от молекулы фермента после встраивания его в цепь провирусной ДНК. Известно, что точечные мутации, способные обеспечить резистентность вириона к лекарственному препарату, могут возникать случайно, в результате ошибок, допущенных ОТ. Поэтому к препаратам, к которым резистентность высокого уровня обеспечивается только одной мутацией (к таким препаратам относятся, например, ламивудин и невирапин), очень быстро появляется устойчивость, если эти препараты применяются в качестве монотерапии. Это происходит потому, что соответствующие мутантные штаммы присутствуют в очень малом количестве (которое невозможно выявить современными методами) в крови еще до начала лечения, и их количество начинает увеличиваться в присутствии лекарственного препарата. Однако представляется крайне маловероятным, чтобы в крови ВИЧ-инфицированного еще до начала лечения волей случая присутствовали штаммы с широким спектром мутаций резистентности. Это одна из причин, по которой так эффективна терапия тремя антиретровирусными препаратами. Ведь подавляющее большинство вирионов будут чувствительны ко всем трем препаратам, а мутантные штаммы, образовавшиеся до начала терапии, скорее всего, будут резистентны только к одному или к двум из трех препаратов, входящих в схему терапии, и их репликация будет подавлена третьим препаратом. Еще один важный принцип формирования резистентности к препаратам состоит в том, что все резистентные штаммы начинают доминировать в присутствии соответствующих лекарственных препаратов, поскольку они оказываются наиболее адаптированными. Однако в отсутствие молекул лекарственных препаратов в крови многие из этих штаммов намного уступают в способности к репликации штамму дикого типа (не обладающего мутациями резистентности). По этой причине после исчезновения селективного действия антиретровирусной терапии нерезистентные штаммы (дикого типа) получают преимущество и начинают размножаться быстрее, чем штаммы с мутациями резистентности к лекарственным препаратам, и вскоре популяция вируса дикого типа становится доминирующей. Это следует иметь в виду при интерпретации результатов тестов на резистентность, поскольку эти тесты способны выявить только штаммы, процентное содержание которых в популяции достаточно велико (а не большое количество разных «минорных» штаммов). Кроме того, важно понимать, что все штаммы вирусов, образующиеся на протяжении всей жизни ВИЧ-инфицированного, остаются в его организме навсегда вследствие непрерывности циклов инфицирования клеток, которые могут быть достаточно длительными. Поэтому после прекращения приема антиретровирусных препаратов (исчезновения селективного действия), скорее всего, резистентные к этим препаратам штаммы будут вытеснены вирусом дикого типа, и их количество станет ниже порога определения. Важно помнить о том, что все «архивированные» резистентные штаммы способны быстро становиться доминирующими. Поэтому наблюдаемое исчезновение из крови штаммов вируса, резистентных к определенным препаратам, НЕ означает, что эти препараты будут эффективно подавлять вирус после возобновления их приема. 3 Краткое содержание раздела Многие точечные мутации возникают случайно, вследствие высокой скорости репликации и частоты ошибок, допускаемых обратной транскриптазой. На фоне недостаточно высоких (субоптимальных) концентраций лекарственных препаратов в крови в первую очередь утрачивается чувствительность к препаратам с низким генетическим барьером к развитию резистентности. Со временем образуется множество генетически схожих, но в то же время разных вариантов вируса (квазивиды или «псевдовиды»), которые образуют множество «минорных» популяций. Лечение тремя активными препаратами снижает риск вирусологической неудачи, обусловленной случайным (естественным) появлением мутаций резистентности низкого уровня. Мутантные резистентные штаммы могут стать неопределяемыми или «архивированными» после отмены препарата, к которому они устойчивы. После возобновления приема этого препарата или после начала приема препарата той же фармакологической группы (при наличии перекрестной резистентности) резистентный штамм снова станет доминирующим. 4 4. Тесты для определения резистентности вируса Для определения резистентности вируса необходимо амплифицировать большое количество выделенных из плазмы крови генов ВИЧ-1 в пробирке методом, который называется «полимеразная цепная реакция» (ПЦР). В целом, проводить тест на устойчивость намного проще, если вирусная нагрузка в плазме крови >1000 копий/ мл, поэтому это исследование чаще проводят во время подъема вирусной нагрузки на фоне антиретровирусной терапии. Один и тот же фрагмент гена вируса можно исследовать двумя способами (см. рис. 1): Генотипирование Фенотипирование Рисунок 1. Фенотипическая и генотипическая резистентность вируса ГЕНОТИПИЧЕСКАЯ РЕЗИСТЕНТНОСТЬ Вирус дикого типа (до начала приема антиретровирусных препаратов) Выявление мутаций Антиретровирусная терапия Подавление репликации вируса (%) Коэффициент резистентности Вирус, выделенный из крови пациента до начала лечения Вирус, выделенный из крови пациента после неудачи лечения ФЕНОТИПИЧЕСКАЯ РЕЗИСТЕНТНОСТЬ Коэффициент резистентности (Fold resistance) показывает, во сколько раз требуется увеличить концентрацию лекарственного препарата, ингибирующую репликацию 50% (или 90%) вирионов дикого типа, чтобы добиться такого же подавления репликации мутантного штамма вируса. IC90 — концентрация препарата, ингибирующая репликацию 90% вирионов (МПК90) IC50 — концентрация препарата, ингибирующая репликацию 50% вирионов (МПК50) 5 4a. Метод генотипирования Метод генотипирования заключается в определении нуклеотидной последовательности генов обратной транскриптазы и протеазы. На основании полученной нуклеотидной последовательности определяют аминокислотные последовательности этих ферментов. Далее полученные аминокислотные последовательности ферментов выделенного вируса сравнивают с «эталонными» аминокислотными последовательностями ферментов вируса дикого типа (не обладающего резистентностью к препаратам), выявляя наличие известных мутаций резистентности. Выявлено более 50 замен аминокислот, обеспечивающих резистентность вируса к препаратам; эти мутации могут обнаруживаться по отдельности или в комбинациях. Таким образом, существует огромное количество разных сочетаний этих мутаций, и для того, чтобы сделать правильные выводы о чувствительности вируса к лекарственным препаратам, необходимо использовать сложные компьютерные алгоритмы (системы интерпретации данных) (например, см. базу данных Стэнфордского университета (Stanford Database) на сайте http://hivdb.stanford.edu/ pages/algs/HIVdb.html). 4b. Метод фенотипирования Гены ферментов, амплифицированные описанным выше методом, можно использовать иначе. Их можно встроить в неполный вирус, который после рекомбинации становится способным к репликации. Теперь можно определить чувствительность этого вируса к разным антиретровирусным препаратам в лабораторных условиях, определяя «коэффициенты резистентности» (см. пояснения к рис. 1). Эти методы достаточно сложные, и они в основном выполняются коммерческими лабораториями, например, VIRCO, Monogram и Viralliance. Генотипирование дешевле и доступнее, чем фенотипирование. В странах Европы генотипирование проводится намного чаще. Краткое содержание раздела ПЦР применяется для амплификации необходимых генов, которые проверяются на наличие мутаций резистентности к препаратам Амплифицированные гены, полученные с помощью ПЦР, можно либо секвенировать (определить нуклеотидную последовательность) для выявления мутаций (генотипирование) ЛИБО встроить в рекомбинантный вирус и выращивать культуры рекомбинантного вируса в присутствии лекарственных препаратов для определения фенотипических коэффициентов резистентности (фенотипирование) Оба метода не обладают достаточной чувствительностью, чтобы выявлять минорные популяции вируса. Методами генотипирования можно выявить только штаммы, составляющие не менее 20% от общей популяции вируса, а для методов фенотипирования порог обнаружения еще выше, т. е. они еще менее чувствительны 6 5. Система условных обозначений, применяющаяся для описания резистентных свойств вируса Выделяют две основных категории мутаций, обеспечивающих резистентность к антиретровирусным препаратам. Первая категория — точечные мутации, способные обеспечивать резистентность высокого уровня к (как правило) одному антиретровирусному препарату; вторая категория — мутации, которые по отдельности обеспечивают резистентность только низкого уровня, но при накоплении этих мутаций в геноме одного штамма уровень его резистентности к препаратам повышается. Вообще говоря, вирусы с множественными мутациями резистентности в гене протеазы или обратной транскриптазы, часто обладают перекрестной резистентностью к широкому спектру препаратов соответствующих фармакологических групп. Для обозначения мутаций применяются буквенно-цифровые сочетания типа «буква-число-буква», например, «M184V». Первая буква обозначает аминокислоту, которая присутствует у нерезистентных вирусов, а вторая буква обозначает аминокислоту, которая присутствует у резистентного вируса. Число обозначает положение кодона, кодирующего данную аминокислоту, в гене протеазы или гене обратной транскриптазы. Таким образом, аббревиатура «M184V» означает, что у вируса произошла мутация в 184-м кодоне гена обратной транскриптазы, в результате которой аминокислота метионин (М) (184-я аминокислота белка обратной транскриптазы у вирусов дикого типа, не обладающих резистентностью к препаратам), заменена на аминокислоту валин (V), что обеспечивает резистентность высокого уровня к ламивудину. Перед тем, как перейти к принципам интерпретации результатов тестирования вируса на резистентность, необходимо сделать еще одно важное предупреждение, касающееся применения этих методов. Эти методы не способны заменить компетентное врачебное мнение и клинический опыт, и польза от применения этих методов зависит от клинической ситуации и доступных ресурсов. Если проводится тестирование на резистентность, крайне важно, чтобы полученные результаты были правильно интерпретированы, чтобы извлечь максимальную пользу от проведения этих дорогостоящих лабораторных исследований. Кроме того, всегда лучше выполнять тестирование на резистентность для получения ответов на конкретные вопросы, например, «можно ли назначить препарат X или Y этому ребенку?» Метионин обычно обнаруживается у вирусов, не обладающих резистентностью (т. е. у вирусов дикого типа) Валин обнаруживается у большинства штаммов вирусов, выделенных из крови пациентов, у которых неэффективна терапия ламивудином/эмтрицитабином Номер (положение) кодона или номер аминокислоты в конкретном гене, кодирующем определенный фермент. В рассматриваемом случае это 184-й кодон гена, кодирующего фермент обратную транскриптазу Обозначение смешанной популяции вирусов, т. е. были выявлены оба варианта вируса — мутантный вирус и вирус дикого типа 7 6. Сочетания мутаций, обеспечивающие резистентность вируса к препаратам («профили резистентности») На рисунках 2, 3, 4 и 5 приведены основные мутации, обеспечивающие резистентность к антиретровирусным препаратам четырех основных групп. На этих рисунках представлен один частный алгоритм (http://www.iasusa.org/), который не следует рассматривать как точное руководство к интерпретации выявленных мутаций. В дальнейших пояснениях содержатся некоторые ключевые принципы, лежащие в основе алгоритмов интерпретации. Рисунок 2. Нуклеозидные и нуклеотидные ингибиторы обратной транскриптазы Множественная резистентность к НИОТ: комплекс 151 Множественная резистентность к НИОТ: вставка 69 Множественная резистентность к НИОТ: МРАН Зидовудин Ставудин Диданозин Зальцитабин Абакавир Ламивудин Эмтрицитабин Тенофовир Рисунок 3. Ненуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы Множественная резистентность к ННИОТ Множественная резистентность к ННИОТ: накопление мутаций Невирапин Делавирдин Эфавиренз 8 Рисунок 4. Ингибиторы протеазы Множественная резистентность к ИП: накопление мутаций Индинавир Ритонавир Саквинавир Нелфинавир (Фос) ампренавир Лопинавир/ритонавир Атазанавир Типранавир/ритонавир (программа расширенного доступа) Рисунок 5. Мутации гена, кодирующего белок наружной оболочки GP41, обеспечивающие резистентность к ингибиторам проникновения МУТАЦИИ ГЕНА, КОДИРУЮЩЕГО БЕЛОК НАРУЖНОЙ ОБОЛОЧКИ GP41, ОБЕСПЕЧИВАЮЩИЕ РЕЗИСТЕНТНОСТЬ К ИНГИБИТОРАМ ПРОНИКНОВЕНИЯ Энфувиртид Участок HR1 МУТАЦИИ Рисунок 6. Мутации гена интегразы, обеспечивающие резистентность к ралтегравиру 9 6a. Резистентность к нуклеозидным ингибиторам обратной транскриптазы (аналогам нуклеозидов) Выделяют четыре категории мутаций резистентности, хотя описание любой из них нельзя рассматривать как однозначное, и они необязательно взаимно исключают друг друга. МРАТ (мутации резистентности к аналогам тимидина) / МРАН (мутации резистентности к аналогам нуклеозидов) Набор мутаций, которые, как правило, появляются на фоне лечения аналогами тимидина (например, ZDV, d4T), включает M41L, D67N, K70R, L210W, T215F/T и T219Q/E. Их называют МРАТ (мутации резистентности к аналогам тимидина) или МРАН (мутации резистентности к аналогам нуклеозидов). Количество таких мутаций, обнаруженных в популяции выделенного из крови пациента вируса, в целом отражает длительность активной репликации вируса на фоне лечения (т. е. количество времени, в течение которого вирусная нагрузка была выше порога определения). Действительно, при первой вирусологической неудаче они могут не обнаруживаться (хотя резистентность к другим препаратам, таким как ламивудин и ННИОТ, весьма вероятна, если они входили в схему лечения). Если знать, какие именно мутации этой категории присутствуют в популяции вируса, и их количество, то можно предсказать вероятную эффективность препаратов из группы НИОТ (НтИОТ), что поможет при составлении дальнейших схем терапии. Абакавир, тенофовир и диданозин сохраняют антиретровирусную активность в присутствии одной или двух мутаций, но активность этих препаратов резко снижается, если мутаций становится больше трех или четырех. В настоящее время установлено, что у ставудина и зидовудина схожие профили резистентности (см. рис. 2) Мутация M184V Эта очень распространенная мутация обеспечивает резистентность к ламивудину (и его близкому родственнику эмтрицитабину). Она часто возникает спонтанно, и обнаруживается практически у всех детей с вирусологической неудачей, которые получают этот препарат. На практике отсутствие этой мутации у ребенка, которому назначен ламивудин, означает, что ребенок на самом деле его не получает. Интересно, что эта мутация, по-видимому, снижает уровень резистентности вируса к некоторым другим аналогам нуклеозидов, обусловленной присутствием других мутаций из группы МРАТ/МРАН (см. выше). Поэтому, по мнению некоторых специалистов, эта мутация может быть полезной, особенно у детей, у которых количество вариантов схем лечения ограничено. Мутации K65R, L74V Эти мутации не встречаются одновременно и обнаруживаются у вируса, выделенного от пациентов, получавших тенофовир (K65R), абакавир (либо одна, либо другая) и диданозин (либо одна, либо другая). Мутация K65R обеспечивает перекрестную резистентность ко всем аналогам нуклеозидов, за исключением зидовудина, а мутация L74V снижает чувствительность только к абакавиру и диданозину. Интересно, что эти мутации крайне редко обнаруживаются у вирусов, выделенных от пациентов, получавших схемы лечения с зидовудином, и практически никогда не возникают в геноме вирусов, уже содержащих МРАТ/МРАН. Сложные (комплексные) мутации, обеспечивающие полирезистентность к аналогам нуклеозидов (нуклеотидов) Выявлены две такие сложные мутации. Во-первых, это мутация, приводящая к вставке аминокислот в 69-й позиции — как правило, 1–2 серинов (S). Эта мутация обеспечивает резистентность к множеству аналогов нуклеозидов. Во-вторых, это комплекс мутаций Q151M (часто в сочетании с дополнительными мутациями в кодонах 62, 77 и 116). Он обеспечивает резистентность ко всем препаратам группы НИОТ, за исключением тенофовира. Эти мутации возникают при длительной терапии аналогами нуклеозидов. На практике дети, вирус которых содержит эти мутации, получали терапию одним или двумя антиретровирусными препаратами до начала ВААРТ. С мутациями, принадлежащими к описанным выше четырем категориям, клиницистам приходится сталкиваться на практике, но, к сожалению, сейчас врачи склонны скорее формально оценивать результаты генотипирования и не пытаются глубже разобраться в различиях между мутациями. Эти мутации влияют на три разных процесса. Во-первых, такие мутации, как M184V и K65R, способны уменьшать степень связывания препарата с активным центром фермента обратной транскриптазы. Во-вторых, некоторые мутации, такие, как L74V, изменяют конфигурацию молекулы фермента, в которой к ней присоединена молекула вирусной РНК (служащая матрицей для синтеза провирусной ДНК). Наконец, другие мутации (МРАТ) способны ускорять отсоединение встроившихся в синтезирующуюся цепь провирусной ДНК молекул антиретровирусных препаратов, что позволяет вирусу продолжить прерванный цикл репликации (см. рис. 6). 10 Рисунок 7. Механизмы, обеспечивающие резистентность к НИОТ Расположение матричной РНК (связывание с НИОТ) МРАТ Фермент ОТ Связывание с НИОТ Разблокирование ДНКпраймера 6b. Резистентность к ненуклеозидным ингибиторам обратной транскриптазы В отличие от нуклеозидных ингибиторов обратной транскриптазы, механизм резистентности к ННИОТ достаточно прост. Препараты этой группы связываются с очень маленьким участком молекулы фермента (гидрофобным «карманом»), который располагается за пределами домена связывания фермента с аналогами нуклеозидов. По этой причине мутации, обеспечивающие резистентность вируса к одному ННИОТ, также обеспечивают резистентность к другому ННИОТ (невирапину и эфавирензу) (см. рис. 3). Как и в случае с ламивудином, прием ННИОТ в составе вирусологически неэффективной схемы практически неизбежно приводит к появлению одной или нескольких мутаций резистентности к ННИОТ. В отсутствие возможности определения резистентности вируса к препаратам об этом следует помнить, поскольку «архивирование» резистентных к ННИОТ штаммов исключает возможность дальнейшего применения препаратов этой группы. Некоторые доказательства справедливости этого утверждения получены при изучении последствий монотерапии невирапином, назначаемой для профилактики передачи ВИЧ от матери ребенку (см. ниже). Графики C и D показывают, что ответ на ННИОТ-содержащую схему терапии зависит от длительности промежутка времени, прошедшего от родов до начала АРТ. Эти данные указывают на постепенное угасание резистентности к ННИОТ в «архивированной» популяции вируса (находящейся в латентных резервуарах). 11 Женщины, начавшие АРТ через <6 месяцев после родов Одна доза NVP Кумулятивная частота случаев неудачи лечения (%) Плацебо Кол-во месяцев с момента начала АРТ Женщины, начавшие АРТ через ≥6 месяцев после родов Кумулятивная частота случаев неудачи лечения (%) Одна доза NVP Плацебо Кол-во месяцев с момента начала АРТ У детей, родившихся ВИЧ-инфицированными несмотря на проведенную химиопрофилактику препаратом группы ННИОТ, последующая антиретровирусная терапия с использованием ННИОТ-содержащих схем также сопровождается повышенным риском неудачи лечения (см. ниже). 12 Количество случаев вирусологической неудачи лечения у детей до года в течение первых 6 месяцев от начала антиретровирусной терапии (АРТ) Все дети до года Плацебо Одна доза NVP N=15 N=15 Кол-во (%) Кол-во месяцев после начала АРТ 6 1 (9,1) 10 (76,9) <0,001 12 1 (9,1) 10 (76,9) <0,001 24 2 (18,2) 10 (76,9) <0,001 Сейчас хорошо известно, что после приема даже одной дозы невирапина роженицей вероятность появления резистентных штаммов в течение последующих нескольких недель составляет до 50%. В отсутствие продолжающегося селективного давления антиретровирусного препарата популяция резистентных штаммов вируса сокращается (вследствие размножения вируса дикого типа, у которого выше способность к репликации при отсутствии действия антиретровирусных препаратов). Однако при применении крайне чувствительных методов, позволяющих обнаружить минорные штаммы, которые составляют очень маленькие доли от общей популяции вируса, было обнаружено, что резистентные штаммы в организме сохраняются. Сейчас не вызывает сомнений тот факт, что если мать получала одну дозу невирапина во время родов, то в течение нескольких месяцев после родов сохраняется повышенный риск неудачи последующего лечения невирапин-содержащей схемой терапии. У детей, родившихся ВИЧ-инфицированными несмотря на проведенную химиопрофилактику невирапином, последующая антиретровирусная терапия с использованием ННИОТ-содержащих схем также сопровождается повышенным риском неудачи лечения. Однако недавно полученные данные свидетельствуют о том, что существенное значение имеет длительность промежутка времени между приемом одной дозы невирапина и началом антиретровирусной терапии, и что неблагоприятные последствия приема одной дозы невирапина в виде формирования резистентных штаммов, возможно, относительно краткосрочны. 6c. Резистентность к ингибиторам протеазы Современное представление о формировании резистентности вируса к ингибиторам протеазы основывается на истории применения ингибиторов протеазы. Так, при применении не усиленных ритонавиром ИП, таких, как нелфинавир, саквинавир и индинавир, образуются специфические мутантные штаммы, предположительно резистентные только к конкретному применяемому препарату, а не штаммы, обладающие перекрестной резистентностью (см. рис. 4). Например, оказалось, что резистентность к нелфинавиру обеспечивается двумя взаимно исключающими друг друга мутациями гена протеазы — D30N и L90M. Поскольку вирусы с первой из них оказались чувствительными к другим ИП (по результатам исследования in vitro), было широко распространено мнение о том, что ингибитор протеазы, к которому сформировалась резистентность, можно заменить на другой ингибитор протеазы. Клинический опыт показал ошибочность этого представления. Оказалось, что накопление мутаций резистентности к одному ингибитору протеазы обеспечивает перекрестную резистентность к другим ИП, хотя при этом каждая мутация обеспечивает разный уровень резистентности к разным ИП. Интересно, что в современных исследованиях и публикациях, посвященных резистентности к ИП, произошел сдвиг от описания конкретных мутаций к изучению общего количества мутаций резистентности к ИП как определяющего фактора перекрестной резистентности к ИП. До некоторой степени проблема резистентности к ингибиторам протеазы была решена путем расширения применения ингибиторов протеазы, усиленных ритонавиром. Добавление к основному ИП ритонавира в небольшой дозе, неэффективной с точки зрения антиретровирусного действия, но достаточной для ингибирования фермента системы p450, метаболизирующего основной ИП, приводит к повышению концентрации ИП в плазме и в клетках. Поскольку для подавления репликации резистентного вируса необходима более высокая концентрация препарата, усиление фармакокинетики основного ИП ритонавиром позволяет сохранить его активность против вирусов с частичной резистентностью к ингибиторам протеазы. 13 Мутации резистентности к ингибиторам протеазы подразделяют на «большие» (основные, первичные) и «малые» (второстепенные, вторичные) мутации. «Большие» мутации специфично снижают чувствительность вируса к одному или нескольким ингибиторам протеазы, нарушая связывание ингибитора протеазы с активным центром фермента. И наоборот, «малые» мутации сами по себе не оказывают существенного влияния на резистентность вируса к препаратам, однако в присутствии «больших» мутаций они усиливают резистентные свойства вируса. Например, некоторые «большие» мутации резистентности к ингибиторам протеазы значительно снижают жизнеспособность вируса, что существенно затрудняет непрерывную репликацию резистентного штамма даже в присутствии селективного давления соответствующего препарата. У таких штаммов могут появляться вторичные мутации, восстанавливающие их жизнеспособность; такие мутации называют еще «компенсаторными». Но это еще не все. Мутации резистентности к ингибиторам протеазы возникают также в гене, кодирующем белок-предшественник Gag, при этом изменяются участки, подвергающиеся протеолизу. Функция протеазы состоит в расщеплении белка-предшественника Gag-Pol, который синтезируется в результате транскрипции и трансляции вирусного генома в клетке. В результате таких мутаций изменяется субстрат фермента протеазы, т. е. участки протеолиза (расщепления). Эти мутации обеспечивают надлежащий процессинг вирусных белков мутантной формой протеазы перед сборкой вирусной частицы; собственно говоря, это еще одна разновидность компенсаторных мутаций. 6d. Резистентность к ингибиторам слияния Резистентность к T-20 (энфувиртиду) возникает очень часто при повышении вирусной нагрузки на фоне лечения этим препаратом. Мутации резистентности возникают в гене, кодирующем белок gp41, на который направлено действие препарата (см. рис. 5). Поскольку в этой группе есть только один такой препарат, резистентность вируса не является основанием для принятия решений о применении ингибиторов слияния второго ряда. Наоборот, отсутствие мутаций резистентности может свидетельствовать о недостаточном соблюдении режима введения препарата. Стандартные методы исследования резистентности вируса не включают выявление резистентности к T-20, и возможность проведения такого исследования следует обсудить с местной лабораторией. 6e. Резистентность к ингибиторам интегразы Один ингибитор интегразы, ралтегравир (RAL), одобрен для применения у взрослых. Этот препарат характеризуется низким барьером к развитию резистентности, поэтому его следует назначать в комбинации с другими активными препаратами, чтобы снизить риск развития резистентности. Обнаружено два генетических профиля резистентности — мутация либо в кодоне 148, либо в кодоне 155 (в сочетании с другими) (см. рис. 6). Эти мутации, по-видимому, не встречаются одновременно. При прекращении приема ралтегравира мутантные штаммы исчезают, но способны быстро появиться вновь после возобновления лечения этим препаратом. 6f. Резистентность к блокаторам корецепторов CCR5 Один блокатор корецепторов CCR5, маравирок, одобрен для применения у взрослых. Этот препарат связывается с корецептором CCR5, блокируя присоединение CCR5-тропных вирусов к клетке-мишени. Он неактивен в отношении вирусов, использующих корецептор CXCR4. Резистентность к маравироку возникает в результате действия двух разных механизмов: во-первых, увеличения ранее существующей популяции X4-тропных вирусов, и, во-вторых, возникновения мутаций в гене env (кодирующем белки наружной оболочки вируса), что позволяет вирусу связываться с корецепторами CCR5 в присутствии маравирока. Краткое содержание раздела Мутации резистентности формируют определенные «профили резистентности». Можно предсказать с некоторой точностью, какие мутации будут обнаружены у вируса пациента при вирусологической неудаче лечения. При применении комбинации ABC+3TC+NVP наиболее вероятно появление мутаций резистентности к ННИОТ (например, Y181C) и M184V. В некоторых случаях будут обнаружены дополнительные мутации L74V и (или) K65R или дополнительные мутации к ННИОТ. При вирусологической неудаче схемы с усиленным ритонавиром ИП мутации чаще всего не обнаруживаются, но может выявляться мутация M184V (+/- МРАН) или мутация резистентности, специфичная для применяемого ИП. Вирусы с мутацией K65R, как правило, гиперчувствительны к зидовудину. 14 7. Генотипирование Генотипирование — один из методов определения резистентности вируса. Поскольку метод генотипирования способен выявить множество мутаций и их сочетаний в геноме вируса, необходима помощь в интерпретации полученных результатов. Все подходы к интерпретации результатов генотипирования можно разделить на три группы: Таблицы точечных мутаций. Это наиболее простой подход к интерпретации результатов генотипирования. В этих таблицах приведены возможные мутации и указано их влияние на резистентные свойства вируса. Такие таблицы, например, составляет Международное общество по борьбе со СПИДом (International AIDS Society – USA); в этом модуле они приведены на рисунках 2–6. Ими легко пользоваться, кроме того, они содержат краткое описание отдельных мутаций. Сложные алгоритмы интерпретации. По мере расширения представлений о мутациях резистентности появилась необходимость в разработке более сложных методов оценки сочетаний мутаций. Например, разные мутации могут обеспечивать разные уровни резистентности вируса к конкретному препарату, кроме того, некоторые мутации могут даже повышать чувствительность вируса к отдельным препаратам (как упоминавшаяся выше мутация M184V в гене обратной транскриптазы). Для того чтобы оценивать влияние сочетаний мутаций, были предложены разные алгоритмы. В частности, Исследовательская группа университета Стэнфорда (Stanford University Group) (http://hivdb.stanford.edu/) разработала балльные шкалы оценки резистентности к конкретным препаратам, присвоив каждой мутации определенное количество баллов. Уровень резистентности к препарату оценивается по сумме баллов всех обнаруженных мутаций резистентности к этому препарату. Виртуальное фенотипирование. Компания Virco, одна из частных компаний, предоставляющих коммерческие лабораторные услуги, и, в частности, проводящая фенотипирование, создала огромную базу данных результатов генотипирования и фенотипирования одинаковых образцов, что позволяет использовать эту базу данных для поиска фенотипических характеристик определенных сочетаний мутаций, выявленных методом генотипирования. В результате получают фенотипические характеристики вируса (выражаемые в коэффициентах резистентности к каждому препарату) на основании данных генотипирования. Этот подход называется виртуальным фенотипированием. Основная проблема при использовании любого подхода к интерпретации результатов генотипирования состоит в том, чтобы определить, какие именно мутации и в каком количестве необходимы для снижения или полного устранения вирусологического ответа на конкретный препарат. Поскольку между градациями «вирус, абсолютно резистентный к препарату» и «вирус, абсолютно чувствительный к препарату» существует множество промежуточных состояний, важно установить точное количество мутаций или позиции мутаций, которые приводят к клинически значимой резистентности (вирусологической неэффективности конкретного препарата). Эти критерии называются «клиническими порогами резистентности» и на сегодняшний день установлены только для небольшого количества препаратов, в том числе тенофовира, абакавира, лопинавира и атазанавира. Краткое содержание раздела Определяйте резистентность вируса во время приема неэффективной схемы терапии или через небольшое время после ее отмены. Образцы, взятые у пациентов, у которых вирусная нагрузка вернулась к первоначальному уровню, содержат в основном вирус дикого типа, и необходимо учитывать возможность наличия минорных (скрытых) резистентных штаммов. Определяйте резистентность вируса у всех пациентов с недостаточным вирусологическим ответом после возобновления терапии. Для определения чувствительности вируса к препаратам, которые планируется включить в новую схему антиретровирусной терапии, необходимо учитывать не только мутации, выявленные при последнем генотипировании вируса, но также мутации, которые выявлялись во всех предыдущих исследованиях. 15 8. Фенотипирование Еще один метод определения резистентности вируса — фенотипирование. Как уже говорилось выше, с помощью фенотипирования получают значения коэффициентов резистентности. Выделяют три разновидности «пороговых значений» коэффициентов резистентности для интерпретации полученных результатов: Пороговые значения диагностических наборов (тест-систем). До недавнего времени для каждого из конкретных диагностических наборов (тест-систем) определялась вариабельность результатов (разброс результатов, полученных при многократном исследовании одного и того же образца при помощи одного и того же диагностического набора). Так, для диагностических наборов компании Virco пороговое значение диагностического набора равно четырем, а для диагностических наборов компании Virologic Assays, другой компании, предоставляющей лабораторные услуги, пороговое значение диагностического набора составляет 2,5. Иными словами, если при исследовании получено значение коэффициента резистентности, превышающее пороговое значение для конкретного диагностического набора, то это свидетельствует о наличии резистентности вируса к конкретному препарату. Биологические пороговые значения. Впоследствии оказалось, что естественная вариабельность вирусов в отсутствие антиретровирусной терапии существенно превышает пороговые значения диагностических наборов. Иными словами, при исследовании большого количества изолятов, выделенных от пациентов, не получавших ННИОТ, диапазон значений коэффициентов резистентности будет намного шире, чем диапазон значений коэффициентов резистентности, обусловленный вариабельностью диагностического набора. Поэтому для каждого антиретровирусного препарата были установлены биологические пороговые значения. Для ННИОТ это пороговое значение приближается к 10, в то время как для некоторых аналогов нуклеозидов оно равно двум. Определение биологических пороговых значений для конкретных препаратов существенно повысило точность интерпретации результатов фенотипирования. Клинические пороговые значения. Оптимальный способ получения клинически значимых пороговых значений состоит в установлении значений коэффициентов резистентности (или количества мутаций), при котором применение конкретного препарата у конкретного пациента приводит или не приводит к вирусологическому ответу. Такие данные были получены в ходе клинических исследований только для нескольких препаратов — тенофовира, лопинавира, атазанавира и диданозина. Хотя определение клинических пороговых значений представляется очень важным для оптимальной интерпретации результатов этих тестов, получить нужные для этого данные крайне сложно. В идеале для этого нужна группа пациентов с вирусологической неудачей лечения, которым нужно добавить еще один препарат к текущей неэффективной схеме терапии и затем оценить вирусологический ответ на этот препарат с учетом результатов определения резистентных свойств вируса, полученных до начала лечения этим препаратом. К сожалению, это не оптимальная тактика ведения пациентов с вирусологической неудачей, и в дальнейшем планируется очень мало клинических исследований, изучающих добавление нового препарата к текущей неэффективной схеме терапии. Поэтому до сих пор установлено так мало клинических пороговых значений. Для того чтобы улучшить эту ситуацию, потребуется статистическая обработка масштабных баз данных клинических когортных исследований с применением сложных аналитических методов. 9. Определение тропности вируса Маравирок применяется только после подтверждения того, что у пациента популяция вируса состоит из штаммов, использующих для проникновения в клетку корецептор CCR5, т. е. из R5-тропных вирусов. С этой целью образец крови пациента отправляют в лабораторию для проведения исследования на тропность вируса одним из двух методов. Первый метод — фенотипирование; при применении этого метода выделенным из крови пациента вирусом заражают клеточные линии, экспрессирующие рецептор CCR5 и (или) CXCR4, и наблюдают за репликацией вируса в этих клетках. Возможности проведения такого анализа в Великобритании ограничены, и все больше клиницистов сейчас пользуются генотипическим методом определения тропности вируса. При генотипировании при помощи ПЦР амплифицируют, а затем секвенируют участок гена env, кодирующий петлю V3 (участок молекулы gp120, который непосредственно присоединяется к корецептору), после чего определяют, какой корецептор использует вирус, при помощи прогностического моделирования с применением интернеттехнологий. Для проведения этого анализа подходит как плазма крови (при высокой вирусной нагрузке), так и лимфоциты периферической крови (мононуклеарные клетки периферической крови, МКПК), если вирусная нагрузка низкая. 16 10. Субтипы вируса и профили резистентности ВИЧ-1 делится на множество субтипов или «кладов», которые можно объединить в кластеры по генетическим различиям. Различия в геномах между некоторыми субтипами могут составлять до 10%. Очевидно, что эти различия могут влиять на результаты определения резистентности методом генотипирования, при проведении которого определяется генетическая последовательность исследуемого вируса для последующего сравнения со стандартной генетической последовательностью вируса дикого типа, что дает возможность выявить известные мутации резистентности. Поскольку практически все научные исследования резистентности ВИЧ проводились с субтипом В, который распространен среди МСМ и потребителей инъекционных наркотиков (ПИН) в Северной Америке и Западной Европе, в качестве эталона для сравнения при генотипировании используется определенная генетическая последовательность вируса дикого типа субтипа В. Это накладывает ряд ограничений на алгоритмы интерпретации результатов тестов на резистентность. Во-первых, оказалось, что некоторые мутации, отнесенные к «малым» мутациям резистентности к ингибиторам протеазы у вируса подтипа В, обнаруживаются у вирусов дикого типа других подтипов. Пока неясно, влияет ли наличие таких мутаций на антиретровирусную активность отдельных препаратов, но, исходя из данных, полученных на настоящий момент, по-видимому, такого влияния нет. Тем не менее, наличие нескольких таких мутаций у исследуемого вируса должно настораживать, поскольку, возможно, оно указывает на некоторый уровень резистентности к ингибиторам протеазы, даже если пациент никогда ранее не принимал препараты этой группы. Во-вторых, у разных субтипов вируса могут быть разные генетические механизмы резистентности (разная частота появления определенных мутаций резистентности и их сочетаний). Например, мутация L210W в гене обратной транскриптазы (распространенная мутация резистентности к аналогам нуклеозидов и к тенофовиру) намного реже обнаруживается у вируса подтипа F (бразильский штамм) по сравнению с вирусом подтипа B. Повидимому, у каждого подтипа вируса свои ограничения, касающиеся изменения структуры в результате мутаций, что определяет различия в генетических механизмах резистентности. Поскольку многие ВИЧ-инфицированные дети в Европе инфицированы не-В-подтипами вируса, это очень важно учитывать в клинической практике. Получены некоторые доказательства того, что мутация K65R возникает чаще у пациентов с неудачей антиретровирусных схем, включающих d4T, ABC, ddI или TDF, если они инфицированы вирусом подтипа C. 11. Выявление минорных штаммов и «глубокое секвенирование» Как уже говорилось, получены доказательства того, что наличие «архивированных» или «минорных» резистентных штаммов вируса в количестве, не превышающем порог определения современных методов исследования резистентности, может повышать риск неудачи лечения. В частности, последствия приема одной дозы невирапина подтверждают справедливость этого утверждения. Более чувствительные методики обнаружения минорных штаммов, например, глубокое секвенирование, которое представляет собой по сути автоматическое клонирование всех вирусов, содержащихся в крови пациента, со временем войдут в обычную лабораторную практику. Сейчас они применяются только в научных исследованиях. 17 12. Доказательства клинической пользы определения резистентности вируса Определение резистентности вируса — дорогостоящее исследование, и поэтому необходимо найти оптимальные способы применения полученных результатов в клинической практике. Польза от исследований резистентности вируса изучалась в рандомизированных клинических исследованиях. В эти исследования, как правило, включались пациенты с вирусологической неудачей лечения, которые случайным образом распределялись в группы, которым проводилось или не проводилось исследование на резистентность вируса, или в группы, которым проводились разные исследования на резистентность вируса. Первичная конечная точка этих исследований определялась как частота вирусологического ответа на новую схему терапии. Иными словами, основной целью этих исследований был поиск ответа на вопрос, в какой степени исследования резистентности вируса помогают клиницистам выбрать оптимальную схему АРТ для пациентов с вирусологической неудачей лечения. В целом эти исследования продемонстрировали некоторую пользу от проведения исследований резистентности вируса по сравнению с их отсутствием (Dunn et al.). Однако отмечаются некоторые различия между полезностью генотипирования и фенотипирования вируса, причем в некоторых клинических исследованиях было показано преимущество генотипирования над фенотипированием. Тем не менее, важно понимать, что алгоритмы, используемые для интерпретации результатов определения резистентности вируса, меняются со временем, и с большой вероятностью некоторые негативные результаты этих клинических исследований были обусловлены недостаточно оптимальными алгоритмами интерпретации. В одном исследовании с участием детей (PERA), в котором сравнивались клинические исходы у детей, которым проводилось генотипирование вируса (Virtual Phenotype), и у детей, у которых оно не проводилось, не было выявлено отчетливой разницы между группами при сравнении вирусологических и иммунологических результатов лечения. Однако, как уже говорилось, отсутствие очевидной пользы от проведения исследований резистентности, возможно, обусловлено выбором пороговых значений для интерпретации их результатов. Учитывая стоимость исследований резистентности и клинический опыт европейских врачей, рекомендуется по возможности проводить генотипирование вируса всем детям при выявлении вирусологической неэффективности текущей схемы терапии. 13. Заражение резистентным вирусом У перинатально зараженных детей тот же штаммы вируса, что и у их матерей. Поэтому если у матери на момент родов были резистентные штаммы вируса, с высокой вероятностью они будут переданы ребенку, тем самым произойдет заражение резистентным вирусом. Тогда этот мутантный штамм, по определению, будет «вирусом дикого типа» для этого ребенка. Мутации, снижающие репликативные способности вируса, могут со временем исчезнуть, например, мутация M184V может превратиться в M184M. У подростков, инфицированных половым путем, вероятность заражения резистентным вирусом такая же, как у взрослых ВИЧ-инфицированных, и им необходимо проводить исследование вируса на резистентность в рамках первичного обследования. Краткое содержание раздела Важно принимать во внимание все схемы терапии, которые получала мать ребенка и на фоне которых была зарегистрирована вирусологическая неудача лечения, а также результаты всех исследований вируса на резистентность, которые проводились матери. Необходимо определять резистентность вируса до начала лечения, чтобы исключить заражение резистентным вирусом. 18 Литература 1. Welch S, Sharland M, Lyall EG, Tudor-Williams G, Niehues T, Wintergerst U, Bunupuradah T, Hainaut M, Della Negra M, Pena MJ, Amador JT, Gattinara GC, Compagnucci A, Faye A, Giaquinto C, Gibb DM, Gandhi K, Forcat S, Buckberry K, Harper L, Konigs C, Patel D, Bastiaans D. for the PENTA Steering Committee. PENTA 2009 guidelines for the use of antiretroviral therapy in paediatric HIV-1 infection [Клинические стандарты 2009 года, разработанные специалистами сети PENTA, по применению антиретровирусных препаратов для лечения ВИЧ-1-инфекции у детей]. HIV Med. 2009 Nov; 10(10): 591–613. 2. Jourdain et al. Intrapartum exposure to nevirapine and subsequent maternal responses to nevirapine-based antiretroviral therapy. New Eng J Med 2004; 351(3): 229–240. 3. Lockwood et al. N Engl J Med. 2007; Jan 11; 356(2): 135–147. 4. Clavel F, Hance AJ. HIV Drug Resistance. New Eng J Med 2004; 350(10):1023–1035. 5. Dunn DT et al. HIV drug resistance testing: is the evidence really there? Antiviral Ther 2004; 9(5): 641–648. 6. Litalien C, Faye A, Compagnucci A, Giaquinto C, Harper L, Gibb DM, Jacqz-Aigrain E for PENTA. Pharmacokinetics of Nelfinavir and its Active Metabolite, hydroxy-tert-butylamide, in Infants Perinatally Infected with HIV-1. Pediatr Inf Dis J 2003; 22(1): 48–55. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&list_uids=12544409 7. Writing Committee (alphabetical): Aboulker J-P, Babiker A, Chaix ML, Compagnucci A, Darbyshire JH, Debre M, Faye A, Giaquinto C, Gibb DM, Harper L, Saidi Y, Walker AS. 72-week follow-up of HAART started in infants aged less than 3 months: CD4, viral load and drug resistance outcomes in the PENTA 7 study. AIDS Vol. 8, issue 2, January 2004. 8. Luzuriaga K, McManus M, Mofenson L, Britto P, Graham B, Sullivan JL; PACTG 356 Investigators. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cm d=Retrieve&db=PubMed&list_uids=12544409 9. Saez-Llorens X, Violari A, Deetz CO, Rode RA, Gomez P, Handelsman E, Pelton S, Ramilo O, Cahn P, Chadwick E, Allen U, Arpadi S, Castrejon MM, Heuser RS, Kempf DJ, Bertz RJ, Hsu AF, Bernstein B, Renz CL, Sun E. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=pubmed&dopt=Abstract&list_uids=12634581 10. Gibb DM, Goodall RL, Giacomet V, McGee L, Compagnucci A, Lyall H for PENTA. Adherence to Prescribed Antiretroviral Therapy in Human Immunodeficiency Virus-Infected Children in the PENTA 5 Trial. Pediatr Inf Dis J 2003; 22 (1): 56–62. Британские сайты, на которых можно получить поддержку от людей, находящихся в схожей ситуации, и информацию для семей, живущих с ВИЧ • • • • • • • http://www.tht.org.uk/ (Terrence Higgins Trust) [Фонд Терренса Хиггинса] http://www.bodyandsoulcharity.org/ (Body and Soul) [Благотворительная организация «Тело и душа»] http://www.positivelywomen.org.uk/ (Positively Women) [Организация «Позитивные женщины»] http://www.i-base.info/about/linktous.html (HIV i-base) [Информационный сайт по ВИЧ-инфекции] www.bhiva.org [Британская ассоциация по борьбе с ВИЧ-инфекцией] www.aidsinfo.nih.gov/guidelines [Клинические руководства по ВИЧ-инфекции] www.pentatrials.org [Сайт сети PENTA] 19