Характеристики молекулярно

ХАРАКТЕРИСТИКИ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ МЕТОДОВ ИДЕНТИФИКАЦИИ
ЭНТЕРОГЕМОРРАГИЧЕСКОЙ E. COLI
Дудчик Н.В.1, Канашкова Т.А.2, Трешкова Т.С.1, Ушкова Л.Л.1, Грищенкова Т.В.1
1Республиканский
2Белорусский
научно-практический центр гигиены;
государственный медицинский университет, Минск, Беларусь
Резюме. В работе представлены основные результаты сравнительных исследований ускоренных методов идентификации энтерогеморрагической E. coli (ИФА, ПЦР) с традиционными стандартизованными методами анализа. Данные,
полученные при исследовании методов ПЦР, ИФА и традиционных культуральных методов для выделения энтерогеморрагической E. coli показывают, что применение комбинированного подхода к идентификации энтерогеморрагической E. coli
позволяет сократить время проведения анализа и более точно идентифицировать бактериальные культуры.
Ключевые слова: пищевые продукты, патогенные микроорганизмы, эмерджентные пищевые инфекции, энтерогеморрагическая E. coli, методы идентификации.
Введение. Чтобы обнаружить наличие в пищевых продуктах или пробах из окружающей среды продуцирующий шигатоксин штамм E. coli 0157 (STEC), необходимы особо чувствительные методы, т.к. этот патогенный микроорганизм может
присутствовать только в небольшом количестве наряду с высокой концентрацией конкурирующих микроорганизмов. Выявление маленьких количеств STEC в пищевых продуктах особенно важно для гарантии их безопасности, поскольку считается, что его инфицирующая доза составляет менее 10 бактерий.
Селективное обогащение перед посевом на чашки с селективной средой для выделения является общепринятой частью большинства методов обнаружения E. coli 0157. К селективным агентам обычно относят новобиоцин или акрифлавин
(для ингибирования роста грамотрицательных микроорганизмов) и сочетание ванкомицина, цефсулодина и цефиксима (для
торможения роста Aeromonas и Proteus spp.). Вместе с тем некоторые селективные агенты могут ингибировать рост поврежденных клеток. Так, пробы пищевых продуктов с E. coli 0157, поврежденных при замораживании, перед селективным обогащением рекомендуется выдерживать при комнатной температуре в течение 3 ч. Кроме того, для выявления клеток испытавших тепловой, холодовой, кислотный или солевой стресс, может понадобиться предварительное обогащение в неселективном
бульоне типа BPW или универсальном бульоне.
Наиболее чувствительным и экономически эффективным методом выделения E. coli 0157 из пищевого сырья является, по всей видимости, иммуномагнитная сепарация (ИМС) после селективного обогащения с последующим поверхностным посевом концентрированных клеток-мишеней на чашки с селективной средой. Метод разделения на основе иммунозахвата и концентрации включает иммунологическое связывание (захват) с последующим физическим отделением
микроорганизмов-мишеней от смешанной обогатительной культуры, после чего происходит повышение концентрации клеток. Чувствительность ИМС можно повысить путем увеличения концентрации Е. coli 0157 относительно фоновых микроорганизмов, которые могут маскировать или покрывать целевые клетки на твердой селективной среде. Отличительными
признаками данного штамма Е. coli по сравнению с другими являются отсутствие сбраживания сорбитола в течение 24 ч и
отсутствие β-глюкуронидазной (GUD-) активности. Обнаружение этого микроорганизма значительно упростилось с использованием агара Мак-Конки с сорбитолом (�������������������������������������������������������������������������
S������������������������������������������������������������������������
�����������������������������������������������������������������������
A����������������������������������������������������������������������
С-агара), причем селективность SMAC-агара была повышена путем добавления цефиксима и теллурита (СT-SМAС-агар). Сорбитол-отрицательные колонии, свидетельствующие о наличии типичных
штаммов Е. coli 0157, на этой среде бесцветны. Поскольку некоторые штаммы чувствительны к теллуриту и/или сбраживают
сорбитол, рекомендуется использовать вторую среду для выделения — например, одну из современных хромогенных сред.
Такие среды основаны на характерном отсутствии GUD-активности почти у всех штаммов серогруппы 0157.
Основным недостатком традиционных культуральных методов является то, что они занимают много времени (для
получения результатов требуется несколько суток), поэтому в ускоренных методах обнаружения патогенных микроорганизмов в пищевых продуктах существует огромная потребность. Данные методы делятся на две основные категории: иммунологические и молекулярные (или генетические) методы. Благодаря повышенной чувствительности широко распространены
ДНК-методы со стадией амплификации (образование множественных копий определенной нуклеотидной последовательности). Наиболее используемым методом амплификации является полимеразная цепная реакция. С помощью ПЦР можно быстро и с высокой степенью чувствительности обнаруживать пищевые патогены.
Следует отметить, что потенциальной проблемой методов ПЦР является присутствие в некоторых пищевых продуктах ингибиторов реакции, что может дать ложноотрицательные результаты. Степень ингибирования существенно зависит
от типа пищевого продукта. Описано множество способов приготовления образцов, включая фильтрацию, центрифугирование, ферментную обработку, разведение, иммуномагнитное разделение и флотацию. Поскольку различных пищевых матриц
очень много, довольно трудно предложить универсальный метод экстракции нуклеиновых кислот, который подходил бы для
всех типов пищевых продуктов. Еще одним потенциальным ограничением применения ПЦР-методов является возможность
обнаружения генетического материала, принадлежащего нежизнеспособным микроорганизмам. Обогащение пищевых образцов перед ПЦР-амплификацией значительно снижает вероятность их обнаружения и, кроме того, увеличивает численность живых целевых микроорганизмов, одновременно уменьшая ингибирующее воздействие пищевого матрикса.
Цель работы — разработать методические подходы, позволяющие проводить ускоренную идентификацию патогенных микроорганизмов в различных видах пищевых продуктов с использованием высокоспецифичных комбинированных
схем бактериологического и молекулярно-генетического анализа.
Для достижения поставленной цели были проведены сравнительные исследования иммуноферментного и ПЦРметодов для выделения энтерогеморрагической E. coli с традиционными стандартизованными методами анализа.
Материал и методы. Объектами исследования явились образцы сырья и пищевых продуктов, а также смывы с объектов среды технологического окружения пищевых и иммунохимических производств. Выделение и идентификацию эмерджентных патогенов проводили с использованием стандартных методов микробиологических исследований. Для оценки
эффективности выявления энтерогеморрагических E. coli (O157:H7) в пищевых продуктах проводили контаминацию проб
обезжиренного сухого молока следующими коллекционными штаммами:
47
E. coli (O157:H7) NCTC 12900 (5×108)
E. coli К-12 RS 5064 ВКПМВ-4310 (5×108)
Salmonella paratyphi ATCC 9150 (5×108)
Shigella flexnery ATCC 12022 (5×108)
Готовили рабочие смеси, содержащие разные виды микроорганизмов.
Рабочая смесь 1: 1,0 мл E. coli (O157:H7), 0,333 мл E. coli К-12, 0,333 Salmonella paratyphi, 0,333 мл Shigella flexnery.
Рабочая смесь 2: 1,0 мл E. coli (O157:H7).
Рабочая смесь 3: 0,333 мкл Escherichia coli К-12, 0,333 мкл Salmonella paratyphi, 0,333 мкл Shigella flexnery.
Для выполнения экспериментального определения бактерий E. coli (O157:H7) готовили десятикратные разведения
каждой смеси микроорганизмов. Рабочие десятикратные разведения вносили в восстановленное сухое обезжиренное молоко, не содержащие E. coli (O157:H7). Контаминированные пробы тщательно перемешивали. После чего 25 мл каждой пробы
переносили в среды накопления в соответствии с указанными ниже методическими рекомендациями для каждого способа
определения. После чего проводили идентификацию микроорганизмов.
Для выявления бактерий E. coli (O157:H7) в продуктах питания использовали культуральные, иммуноферментные и
молекулярно-генетические (ПЦР) методы.
Выявление
бактерий
E. coli
(�����������������������������������������������������
O����������������������������������������������������
157:������������������������������������������������
H�����������������������������������������������
7)
с
применением
культуральных
методов
проводили в соответствии с протоколами исследования по ГОСТ 30726-2001. «Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества бактерий вида E. coli», ИСО 16649-1. Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Горизонтальный метод подсчета β-глюкуронидаза-положительных E. coli
(кишечная палочка)». Часть 1. ИСО 16649 —2:2001. «Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Горизонтальный метод подсчета β-глюкуронидаза-положительных E. coli (кишечная палочка)». Часть 2. Иммуноферментное определение бактерий E. coli (O157:H7) проводили в соответствии с инструкцией по применению к набору реагентов «E. coli (O157:H7)
ELISA» (BioScientific).
Детекция ДНК E. coli (����������������������������������������������������������������������������������
O���������������������������������������������������������������������������������
157:�����������������������������������������������������������������������������
H����������������������������������������������������������������������������
7) в продуктах питания методом ПЦР с гибридизационно-флюоресцентной детекцией включала три этапа: экстракция (выделение) ДНК из исследуемых образцов, ПЦР-амплификация участка ДНК данного
микроорганизма и гибридизационно-флюоресцентная детекция непосредственно в ходе ПЦР.
Экстракцию ДНК из исследуемого материала проводили в присутствии внутреннего контрольного образца, который
позволил контролировать выполнение процедуры исследования для каждого образца. Пробы ДНК использовали для амплификации участка ДНК перечисленных выше возбудителей при помощи специфичных к этому участку ДНК праймеров и фермента
Taq-полимеразы. В составе реакционной смеси присутствовали флюоресцентно-меченные олигонуклеотидные зонды, которые
гибридизировались с комплементарным участком амплифицируемой ДНК-мишени, в результате чего происходило нарастание
интенсивности флюоресценции. Это позволяло регистрировать накопление специфичного продукта амплификации путем измерения интенсивности флуоресцентного сигнала, детекцию которого осуществляли непосредственно в ходе ПЦР с помощью
амплификатора с системой детекции результатов в режиме «реального времени» (RotorGene 6000, CorbettResearch).
Исследования выполняли в соответствии с инструкцией по применению набора реагентов для выявления ДНК E. coli
(O157:H7) в продуктах питания методом ПЦР с гибридизационно-флюоресцентной детекцией «АмплиСенс® EHEC-FL».
Для сравнительных испытаний методов ПЦР, ИФА и традиционных культуральных методов использовали отрицательный контрольный образец — не содержащее бактерии E. coli восстановленное сухое молоко — ОКО, и положительный
(сухое молоко, содержащее E. coli NCTC 12900 в концентрациях 5×108 КОЕ/мл соответственно) контрольный образец —
ПКО.
Результаты и их обсуждение. Результаты определения энтерогеморрагической E. coli представлены в таблице 1.
Таблица 1 — Результаты определения бактерий энтерогеморрагической E. coli в контрольных образцах
Культуральный метод
Культуральный метод
ИФА
ПЦР-детекция в режиме
КОЕ/25 г
(ГОСТ 30726-2001)
(ISO 16649-1; 16649-2:2001)
(ELISA)
реального времени
ОКО
0/6
0/6
0/6
0/6
ПКО
6/6
6/6
6/6
6/6
П
6
6
6
6
Культуральный метод
Культуральный метод
ИФА
ПЦР-детекция в режиме
КОЕ/25 г
(ГОСТ 30726-2001)
(ISO 16649-1; 16649-2:2001)
(ELISA)
реального времени
О
6
6
6
6
ЛП
0
0
0
0
ЛО
0
0
0
0
Точность
1,0
1,0
1,0
1,0
Чувствительность
1,0
1,0
1,0
1,0
Специфичность
1,0
1,0
1,0
1,0
Примечание (здесь и в таблицах 2–4) — П — положительные; О — отрицательные; ЛП — ложноположительные; ЛО����������
—��������
ложноотрицательные.
Полученные данные свидетельствуют, что используемые методы обладают одинаковой высокой точностью, чувствительностью и специфичностью в отношении контрольных образцов.
При оценке чувствительности методов с использованием референс-штамма энтерогеморрагической E. coli (NCTC
12900) показано, что достоверная детекция возбудителя (до уровня единичных колоний) достигается при использовании
ИФА и ПЦР с гибридизационно-флюоресцентной детекцией в режиме реального времени (ПЦР-�������������������������
FRT����������������������
). Результаты исследования представлены в таблице 2.
48
Таблица 2 — Идентификация бактерий энтерогеморрагической E. coli в смешанной культуре микроорганизмов (рабочая
смесь 2)
КОЕ/25 г
0
Контроль
500000000
50000000
5000000
500000
50000
5000
500
50
5
Единичные колонии
П
О
ЛП
ЛО
Точность
Чувствительность
Культуральный метод
(ГОСТ 30726-2001)
0/6
6/6
6/6
6/6
6/6
5/6
4/6
3/6
2/6
1/6
0/6
0/6
39
6
0
27
0,63
0,59
Культуральный метод (ISO
16649-1; 16649-2:2001)
0/6
6/6
6/6
6/6
6/6
6/6
5/6
4/6
3/6
2/6
0/6
0/6
44
6
0
22
0,69
0,67
ИФА
(ELISA)
0/6
6/6
6/6
6/6
6/6
6/6
6/6
5/6
5/6
5/6
3/6
2/6
56
6
0
10
0,86
0,85
ПЦР-детекция в режиме
реального времени
0/6
6/6
6/6
6/6
6/6
6/6
6/6
6/6
6/6
6/6
5/6
5/6
64
6
0
2
0,97
0,97
Для оценки чувствительности и специфичности сравниваемых методов проведены исследования по идентификации
энтерогеморрагической E. coli с использованием референсного штамма как в монокультуре, так и смесях различных представителей микроорганизмов других родов. Результаты исследований представлены в таблице 3.
Таблица 3 — Идентификация энтерогеморрагической E. coli в смешанной культуре микроорганизмов (рабочая смесь 1)
КОЕ/25 г
Культуральный метод
(ГОСТ 30726-2001)
0
Контроль
500000000
50000000
5000000
500000
50000
5000
500
50
5
Единичные колонии
П
О
ЛП
ЛО
Точность
Чувствительность
0/6
6/6
6/6
6/6
6/6
6/6
6/6
4/6
3/6
1/6
0/6
0/6
44
6
0
22
0,69
0,67
Культуральный метод
(ISO 16649-1; 166492:2001)
0/6
6/6
6/6
6/6
6/6
6/6
6/6
4/6
3/6
2/6
0/6
0/6
45
6
0
21
0,71
0,68
ИФА
(ELISA)
ПЦР-детекция в режиме
реального времени
0/6
6/6
6/6
6/6
6/6
6/6
6/6
5/6
4/6
3/6
2/6
2/6
52
6
0
14
0,81
0,90
0/6
6/6
6/6
6/6
6/6
6/6
6/6
6/6
6/6
6/6
5/6
5/6
64
6
0
2
0,97
0,97
Результаты показали высокую специфичность (100%) и наибольшую чувствительность в отношении полимеразной
цепной реакции с гибридизационно-флюоресцентной детекцией в режиме реального времени (ПЦР-���������������������
FRT������������������
) в отношении единичных клеток внесенных штаммов энтерогеморрагической E. coli.
Для оценки специфичности сравниваемых методов в отношении получения ложноположительных результатов использовали следующие штаммы микроорганизмов: E. coli К-12, Salmonella paratyphi, Shigella flexnery. Полученные результаты показали перекрестную реакцию ложноположительного определения E. coli К-12, Salmonella paratyphi, Shigella flexnery
как энтерогеморрагической E. coli для культуральных методов. Для иммуноферментного метода и метода полимеразной
цепной реакции с гибридизационно-флюоресцентной детекцией в режиме реального времени (ПЦР-FRT) неспецифических
реакций не было выявлено. Результаты исследований представлены в таблице 4.
49
Таблица 4 — Результаты оценки специфичности сравниваемых методов в отношении штаммов E. coli К-12, ����������������
Salmonella������
�����
paratyphi, Shigella flexnery (рабочая смесь 3)
Культуральный метод
Культуральный метод
ИФА
ПЦР-детекция в режиме
КОЕ/25 г
(ISO 16649-1; 16649(ГОСТ 30726-2001)
(ELISA)
реального времени
2:2001)
0
0/6
0/6
0/6
0/6
Контроль
6/6
6/6
0/6
0/6
500000000
6/6
6/6
1/6
0/6
50000000
6/6
6/6
0/6
0/6
5000000
5/6
5/6
0/6
0/6
500000
4/6
5/6
0/6
0/6
50000
3/6
4/6
0/6
0/6
5000
2/6
3/6
0/6
0/6
500
2/6
2/6
0/6
0/6
50
1/6
1/6
0/6
0/6
5
0/6
0/6
0/6
0/6
Единичные колонии
0/6
0/6
0/6
0/6
П
0
0
0
0
О
72
72
72
72
ЛП
35
0
1
0
ЛО
0
0
0
0
Специфичность
0,67
0,64
0,98
1,0
Полученные данные показывают, что применение комбинированного подхода к идентификации энтерогеморрагической E. coli на основе ПЦР-анализа и ИФА позволило сократить число культур, изначально признанных как энтерогеморрагическая E. coli по комплексу биохимических признаков.
Литература
1. Ефимочкина, Н.Р. Эмерджентные бактериальные патогены в пищевой микробиологии / Н.Р. Ефимочкина. – М.: Издательство
РАМН, 2008. – 256 с.
2. О санитарно-эпидемической обстановке в Республике Беларусь в 2009 г.: гос. доклад. – Минск, 2010.
3. Blackburn, C. De W. Modifications to methods for the enumeration and detection of injured Escherichia coli O157:H7 in foods / C. De W.
Вlackburn, J.D. Mccarthy. // Intern. J. Of Food Microbiology. – 2000. – № 55. – Р. 285–290.
CHARACTERISTICS OF MOLECULAR GENETIC METHODS
OF ENTEROHAEMORRHAGIC E. COLI IDENTIFICATION
Dudchik N.V.1, Kanashkova T.A.2, Treshkova T.S.1, Uskova L.L.1, Grishchenkova T.V.1
1Republican
Scientific and Practical Centre of Hygiene;
State Medical University, Minsk, Belarus
2Belarusian
The objectives of this study are to compare different methods (culture, ELISA, real-time PCR-based) for detection of E. coli
with respect to sensitivity, precision and accuracy. The performances of different E. coli detection methods were evaluated. The
PCR assay is proved to be a highly specific and sensitive method for E. coli detecting and the incorporation of a routine PCR test
in conjunction with standard culture techniques could be effective in providing a more accurate profile of the prevalence of this
pathogen.
Keywords: food pathogens, emergent food borne infections, E. coli, detection methods.
Поступила 18.06.2013
САНИТАРНО-МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
ДЕРМАТОЛОГИЧЕСКИХ СРЕДСТВ ИНДИВИДУАЛЬНОЙ ЗАЩИТЫ
Дудчик Н.В., Трейлиб В.В., Будкина Е.А., Козлова Т.О., Ушкова Л.Л., Науменко С.А.
Республиканский научно-практический центр гигиены, Минск, Беларусь
Резюме. Проведен анализ образцов дерматологических средств индивидуальной защиты (кремы, гели, мази, аэрозоли) по следующим показателям: определение мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов; выявление бактерий группы кишечных палочек методом мембранных фильтров и титрационным методами; выявление бактерий
Pseudomonas aeruginosa; выявление бактерий рода Salmonella; определение дрожжей и плесневых грибов.
Ключевые слова: минеральные воды, мезофильные аэробные и факультативно-анаэробные микроорганизмы, бактерии группы кишечных палочек, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella.
Введение. Технический регламент Таможенного союза ТР ТС 019/2011 «О безопасности средств индивидуальной защиты» принят в целях обеспечения на территории Таможенного союза защиты жизни и здоро50