pages 69-73 from Вестник_БГУ_Июнь_2008_Серия2_№2

Биология
УДК 579.222
А.Г. ШУСТЕР, Н.П. МАКСИМОВА
СОСТАВ И АКТИВНОСТЬ ХИТИНОЛИТИЧЕСКОГО КОМПЛЕКСА
БАКТЕРИЙ РОДА BACILLUS
The chitinolytic complex of Bacillus sp. 5 and 57 strains was investigated. It was found out that it consists of three
enzymes: exochitinase, endochitinase and N-acetyl-D-glucosaminidase. The most active is exochitinase, and the level of
its activity is higher than the same of B. thuringiensis and B. cereus. It was demonstrated that alternative substrates and
vitamin complexes, such as dried mycelium of basidiomycetes and yeast extract appropriately, increase the activity of all
the chitinolytic enzymes of Bacillus sp. 5 and 57.
Один из эффективных биологических методов защиты растений – использование препаратов, активным действующим началом которых выступают микроорганизмы, обладающие
способностью подавлять рост и размножение возбудителей заболеваний, – так называемые
штаммы-антагонисты. Важным преимуществом использования бактерий-антагонистов явля-
69
Вестник БГУ. Сер. 2. 2008. № 2
ется их способность существовать длительное время непосредственно в очаге поражения –
филлосфере и ризосфере растений и синтезировать при этом высокоактивные антимикробные вещества, угнетающие рост и развитие патогенов [1].
В связи со сказанным в настоящее время исследования по созданию и усовершенствованию биопестицидных препаратов на основе штаммов-антагонистов весьма актуальны. Эффективность подобных биопрепаратов основывается на способности микроорганизмов,
включаемых в их состав, продуцировать широкий спектр различных биологически активных
веществ – факторов антагонизма, таких как антибиотики, ферменты, бактериоцины [2].
Бактерии рода Вacillus являются перспективными объектами для создания биопрепаратов на основе штаммов-антагонистов, так как благодаря способности к спорообразованию,
свойственной всем бациллам, обладают высокой степенью устойчивости к изменениям условий внешней среды. Кроме того, микроорганизмы данного рода могут существовать в значительном диапазоне температур и использовать в качестве источника углерода и энергии
различные органические и неорганические соединения, что способствует их широкому распространению в природе (почве, воздухе, воде, пищевых продуктах, а также в организме человека и животных) [3].
Одним из факторов антагонизма бактерий Вacillus по отношению к фитопатогенам является их способность синтезировать широкий спектр гидролитических ферментов, в том числе хитинолитических. Хитин – основной структурный компонент клеточной стенки грибов,
многие из которых являются фитопатогенами. Деградацию хитина осуществляют следующие ферменты хитинолитического комплекса бактерий: экзохитиназа (способна отщеплять
димерные звенья полимерной цепи с невосстанавливающего конца), эндохитиназа (расщепляет хитобиозу до N-ацетилглюкозамина) и N-ацетилглюкозаминидаза [4]. В связи с изложенным актуальным представляется проведение скрининга бациллярных штаммов, способных продуцировать хитиназы, и изучение активности хитинолитических ферментов.
Целью данной работы являлся отбор штаммов Bacillus, способных использовать хитин в
качестве источника углерода и энергии, изучение состава и активности их хитинолитического комплекса, а также подбор оптимальных условий для продукции хитинолитических ферментов.
Материал и методика
Объектами изучения являлись бактерии B. subtilis (50 штаммов), Bacillus sp. 5 и 57, а также штамм B. cereus 9 из коллекций кафедры генетики и кафедры микробиологии биологического факультета БГУ. В качестве негативного контроля был взят штамм В. subtilis 494 из
коллекции кафедры генетики, не способный использовать хитин в качестве источника углерода и энергии.
Бактериальные культуры поддерживали на полноценной питательной агаризованной
среде (1,5 %) [5].
Для выявления хитинолитической активности исследуемые бактерии культивировали в
течение 48 ч на агаризованной среде Спицайзена [6], содержащей в качестве источника углерода 0,2 % коллоидный хитин. В зависимости от цели эксперимента добавляли дрожжевой экстракт (0,3 %) или заменяли коллоидный хитин на высушенные измельченные плодовые тела базидиомицетов (0,5 %).
Коллоидный хитин получали из нативного по известной методике [7].
Бактерии культивировали в жидкой среде Спицайзена в течение 96 ч при 37 °С. Штаммы
выращивали в колбах Эрленмейера объемом 250 мл, содержащих 50 мл среды, при
160 об/мин.
Определение активности хитинолитических ферментов с помощью хромогенных
субстратов осуществляли согласно описанной ранее методике [8]. Порции по 100 мкл раствора п-нитрофенил-N-ацетил-β-D-глюкозаминида и п-нитрофенил-N,-N'-диацетил-β-D-хитобиозы (2,5 ммоль) в калий-фосфатном буфере в 96-луночном планшете помещали на лед.
В каждую лунку добавляли 10 мкл освобожденной от клеток культуральной жидкости исследуемого штамма, содержащей фермент. Реакцию запускали путем помещения проб на водяную баню (50 °С), а затем выдерживали в течение 10÷30 мин до появления желто-зеленой
окраски, которая свидетельствовала об образовании п-нитрофенола. Реакцию останавливали добавлением 5 мкл 1 М NaOH в каждую лунку. Измерение оптической плотности D про70
Биология
водили на спектрофотометре «Multiskan Ascent»
при длине волны λ = 405 нм. Концентрацию
С п-нитрофенола определяли по калибровочной
кривой (рис. 1). Нитрофенол готовили в ацетатном
буфере, рН 5,5, в концентрации 0÷500 мкмоль/л.
Конечный объем смеси – 150 мкл. Активность
фермента выражали в миллимолях п-нитрофенола, освободившегося за 1 мин при действии 1 мл раствора, содержащего хитинолитический комплекс.
Определение активности хитинолитических ферментов с помощью флуорогенных
субстратов – аналогов хитина осуществляли
Рис. 1. Калибровочная кривая зависимости
согласно известной методике [9]. 100 мкл преоптической плотности от концентрации
п-нитрофенола
парата (освобожденная от клеток культуральная
жидкость, содержащая фермент, и фосфатноцитратный буфер, рН 7,0, в соотношении 1:1)
инкубировали в течение 5 мин при 37 °С. Реакцию запускали добавлением 5 мкл 4-метилумбеллиферил-β-D-N-N'-N''-триацетилхитотриозы.
Конечная концентрация субстрата – 3,8 мкМ.
Время инкубации – 10÷30 мин. Реакцию останавливали добавлением 120 мкл глицинового
буфера (1 М, рН 10,6). Интенсивность флуоресценции A (λ = 355/460 нм) определяли на флуориметре «Varian Cary Eclipse». Концентрацию
4-метилумбеллиферона определяли по калибровочной кривой (рис. 2). 4-Метилумбеллиферон
Рис. 2. Калибровочная кривая зависимости
приготовлен в фосфатно-цитратном буфере,
интенсивности флуоресценции
рН 7,0, в концентрации 0÷4 мкмоль/л. Конечный
от концентрации 4-метилумбеллиферона
объем смеси – 150 мкл.
Активность фермента выражали в миллимолях 4-метилумбеллиферона, освободившегося за 1 мин при действии 1 мл раствора, содержащего хитинолитический комплекс.
Определение концентрации белка осуществляли методом Бредфорда [10].
Результаты и их обсуждение
В первой серии экспериментов исследована способность 52 штаммов бактерий рода
Bacillus к росту на агаризованной и жидкой средах, содержащих хитин в качестве единственного источника углерода и энергии (табл. 1).
Таблица 1
Интенсивность роста штаммов Bacillus на средах с хитином
Штаммы
Рост
на агаризованной среде
в жидкой среде
1, 2, 4, 8
10, 15, 18
3
19, 23, 27
5
6
29, 30, 31
41, 46, 48
12
49, 53-3
60, 66, 85
104, 115
168, 421
64
422, 424
87
494
–*
–
++ **
–
++
++
–
–
++
–
–
–
–
+
–
+
–
–
–
++
–
+++
++
–
–
++
–
–
–
–
+
–
+
–
Штаммы
Рост
на агаризованной среде
в жидкой среде
AM 076
ПО 322
SHgW
57
112
36
1A-3
4A-3
6A-4
6A-5
7A-1
7A-4
103
1414, 21 Z
72 B/ε
B. cereus
–
–
–
–
++
++
++
–
+
–
–
–
+
++
–
–
++
–
–
–
–
+++
++
++
–
+
–
–
–
+
++
–
–
++
–
П р и м е ч а н и е . * Отсутствие роста «–», ** относительная интенсивность роста – «+», «++», «+++».
71
Вестник БГУ. Сер. 2. 2008. № 2
Наиболее интенсивный рост после 48 ч культивирования на агаризованной среде был
отмечен для штаммов B. subtilis 3, 5, 6, 12, 36, 57, 103, 112 и B. cereus 9; в жидкой среде –
Bacillus sp. 5 и 57. На основании полученных результатов сделано заключение о наличии у
данных бактериальных штаммов комплекса ферментов, деградирующих хитин.
Определение состава хитинолитического комплекса штаммов B. cereus и Bacillus sp. 5
и 57. Следующим этапом работы было выяснение состава хитинолитического комплекса исследуемых штаммов. Для этого измеряли активность отдельных компонентов ферментативного комплекса штаммов Bacillus с помощью хромогенных и флюорогенного субстратов – аналогов хитина (п-нитрофенил-N-ацетил-β-D-глюкозаминид, п-нитрофенил-N,-N'-диацетил-β-D-хитобиоза и 4-метилумбеллиферил-β-D-N-N'-N''-триацетилхитотриоза) (табл. 2).
Таблица 2
Активность хитинолитических ферментов в КЖ штаммов Bacillus после 96 ч культивирования
в среде с 0,2 % коллоидного хитина
Субстрат
п-Нитрофенил-N,N'-диацетилβ-D-хитобиоза
п-Нитрофенил-N-ацетил-β-Dглюкозаминид
4-Метилумбеллиферил-β-D-NN'-N''-триацетилхитотриоза
Удельная активность, ммоль/мин·мг белка
B. subtilis 5
B. subtilis 57
Фермент
Экзохитиназа
2,794+0,002
6,060+0,007
N-ацетилглюкозаминидаза
0,232+0,001
0,236+0,001
Эндохитиназа
0,017+0,0001
0,029+0,0001
При использовании в качестве субстрата 0,2 % коллоидного хитина активность экзохитиназы составила 2,8 ммоль/мин·мг белка для бактерий Bacillus sp. 5 и 6,1 ммоль/мин·мг белка
для бактерий Bacillus sp. 57. Следует отметить, что этот показатель оказался на несколько
порядков выше, чем для экзохитиназы известных в этом отношении бактерий B. thuringiensis
(5,8 мкмоль/мг белка [11]) и B. cereus (60÷85 нмоль/мин·мг белка [12]). Причем экзохитиназная активность у исследуемых бактерий оказалась выше N-ацетилглюкозаминидазной
(0,23 мкмоль/мин·мг белка для штамма Bacillus sp. 5; 0,25 мкмоль/мин·мг белка для штамма
Bacillus sp. 57). Присутствие эндохитиназы было зарегистрировано в следовых количествах.
Все компоненты хитинолитического комплекса бактерии Bacillus sp. 57 проявляют большую активность по сравнению со штаммом Bacillus sp. 5, в частности, это касается экзохитиназы, активность которой у штамма Bacillus sp. 57 превышает аналогичный показатель экзохитиназы Bacillus sp. 5 более чем в два раза.
Зависимость показателей хитинолитической активности бактерий Bacillus sp. 5 и 57
от источника углерода и витаминного комплекса, используемых для культивирования
бактерий. Как видно из табл. 3, источник углерода, взятый для культивирования бактерий
Bacillus sp. 5 и 57, оказывает существенное влияние на активность всех ферментов хитинолитического комплекса. Так, использование в качестве источника углерода и энергии сухого
мицелия базидиомицетов увеличивает показатели активности N-ацетилглюкозаминидазы в
6÷10 раз, экзохитиназы – в 4,5÷7 раз, эндохитиназы – в 4,4÷4,8 раза.
Таблица 3
Влияние различных источников углерода на активность компонентов хитинолитического комплекса
Источники углерода/витаминные комплексы
Сухой мицелий базидиомицетов, 0,5 %
Дрожжевой экстракт, 0,3 %
Коллоидный хитин, 0,2 %
Удельная активность ферментов, ммоль/мин·мг белка
Штамм 5
Штамм 57
Экзохитиназа
12,945+0,004
10,794+0,004
2,794+0,002
43,410+0,004
9,090+0,005
6,060+0,007
N-ацетилглюкозаминидаза
Сухой мицелий базидиомицетов, 0,5 %
Дрожжевой экстракт, 0,3 %
Коллоидный хитин, 0,2 %
1,406+0,004
0,824+0,003
0,232+0,001
2,360+0,004
2,320+0,004
0,236+0,001
Эндохитиназа
Сухой мицелий базидиомицетов, 0,5 %
Дрожжевой экстракт, 0,3 %
Коллоидный хитин, 0,2 %
72
0,083+0,0002
0,034+0,0002
0,017+0,0001
0,128+0,0002
0,100+0,0002
0,029+0,0001
Биология
Добавление к коллоидному хитину в качестве витаминного комплекса дрожжевого экстракта повышает активность N-ацетилглюкозаминидазы в 3,5÷9,8 раза, экзохитиназы – в
1,5÷3,9 раза, эндохитиназы – в 2÷3,5 раза.
Таким образом, в ходе работы были отобраны штаммы Bacillus sp. 5 и 57, обладающие
наибольшей хитиназной активностью. Установлено, что среди ферментов хитинолитического комплекса данных штаммов наибольший показатель активности имеет экзохитиназа по
сравнению с B. thuringiensis и B. cereus. Альтернативные субстраты и витаминные комплексы, такие как сухой мицелий базидиомицетов и дрожжевой экстракт, существенно повышают
показатели хитинолитической активности бактерий Bacillus sp. 5 и 57.
Определенные в работе состав и активность хитинолитического комплекса бактерий Bacillus sp. 5 и 57, а также зависимость показателей активности отдельных групп ферментов от
основного источника углерода могут быть использованы в дальнейшем при выборе подходов клонирования генов, контролирующих синтез хитиназ, а также для получения биопрепаратов для защиты растений.
1. С м и р н о в В . В . , Р е з н и к С . Р . , В ь ю н и ц к а я С . А . и др. // Микробиол. журн. 1993. Т. 55. № 4. С. 68.
2. С м и р н о в В . В . , Р е з н и к С . В . , В а с и л е в с к а я И . А . Аэробные спорообразующие бактерии –
продуценты биологически активных веществ. Киев, 1982. С. 8.
3. К о з а ч к о И . А . , В ь ю н и ц к а я В . А . , Б е р е ж н е ц к а я Т . Г . // Микробиол. журн. 1995. № 5. С. 69.
4. H o w a r d M . B . , E k b o r g N . A . , W e i n e r R . M . , H u t c h e s o n S . W . // J. Ind. Microbiol. Biotechnol.
2003. Vol. 30. P. 627.
5. S a x i l d H . H . , N y g a a r d P . // J. Bacteriol. 1987. Vol. 169. P. 2977.
6. C a n o s i U . , M o r e l l i G . , T r a u t n e r T . A . // Mol. Gen. Genet. 1978. Vol. 166. P. 259.
7. Ч и г а л е й ч и к А . Г . , П и р и е в а Д . А . // Прикл. биотехн. микроб. 1976. Т. 12. № 2. С. 238.
8. R o b e r t s W . K . , S e l i t r e n n i k o f f C . P . // J. General Microb. 1988. Vol. 134. P. 169.
9. M c C r e a t h K . J . , G o o d a y G . W . // J. Microb. Methods. 1992. Vol. 14. P. 229.
10. B r a d f o r d M . M . // Anal. Biochem. 1976. Vol. 72. P. 248.
11. B a r b o z a - C o r o n a J . , N i e t o - M a z z o c c o E . , V e l a z q u e z - R o b l e d o R . et al. // Appl. Environ. Microbiol. 2003. Vol. 69. P. 1023.
12. M a b u c h i N . , H a s h i z u m e I . , A r a k i Y . // Can. J. Microbiol. 2000. Vol. 46. P. 370.
Поступила в редакцию 11.03.08.
Александр Григорьевич Шустер – аспирант кафедры генетики.
Наталья Павловна Максимова – доктор биологических наук, профессор, заведующий кафедрой генетики.
73