Документ 2296714
реклама
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения РАН Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Новосибирский национальный исследовательский государственный университет» На правах рукописи Тюменцев Александр Игоревич Молекулярно-генетическая характеристика бокавирусов, циркулирующих в Новосибирске 03.01.03 – молекулярная биология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель д.б.н., доцент Н.В. Тикунова Новосибирск-2015 1 ОГЛАВЛЕНИЕ ОГЛАВЛЕНИЕ .............................................................................................................................. 2 СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ ........................................................................4 ВВЕДЕНИЕ ....................................................................................................................................5 ГЛАВА 1. Обзор литературы .....................................................................................................10 1.1. История открытия бокавирусов .......................................................................................... 10 1.2. Таксономия семейства Parvoviridae ....................................................................................11 1.3. Организация генома HBoV ..................................................................................................13 1.4. Свойства и функции белков парвовирусов ........................................................................15 1.5. Структура вириона бокавирусов человека .........................................................................19 1.6. Репликация HBoV.................................................................................................................23 1.7. Транскриптом парвовирусов ............................................................................................... 28 1.8. Жизненный цикл HBoV .......................................................................................................30 1.9. Генетическая дивергенция бокавирусов человека ............................................................ 32 1.10. Патогенез бокавирусной инфекции ..................................................................................33 1.11. Персистенция бокавирусов в организме человека .......................................................... 34 1.12. Пути передачи бокавирусов человека ..............................................................................35 1.13. Лечение и профилактика HBoV инфекции ......................................................................35 1.14. Диагностика бокавирусной инфекции .............................................................................37 1.15. Эпидемиология бокавирусной инфекции ........................................................................38 1.16. Заключение.........................................................................................................................43 ГЛАВА 2. Пациенты, материалы и методы ..............................................................................45 2.1. Основная характеристика обследованных больных .........................................................45 2.2. Материалы ............................................................................................................................. 46 2.3. Основные методы .................................................................................................................47 2.3.1. Сбор образцов ....................................................................................................................47 2.3.2. Осветление экстракта фекалий......................................................................................47 2.3.3. Выделение вирусной ДНК..................................................................................................47 2.3.4. Проведение полимеразной цепной реакции (ПЦР) .........................................................48 2.3.5. Электрофоретический анализ образцов .........................................................................49 2.3.6. Проведение полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентной детекцией «по конечной точке» ................................................................................................ 49 2.3.7. Очистка продуктов ПЦР .................................................................................................50 2.3.8. Постановка реакции Сэнгера........................................................................................... 50 2.3.9. Очистка продуктов реакции Сэнгера .............................................................................50 2 2.3.10. Филогенетический анализ............................................................................................... 51 2.3.11. Статистический анализ ................................................................................................ 51 2.3.12. Анализ нуклеотидных последовательностей ............................................................... 52 2.3.13. Определение скорости молекулярой эволюции ............................................................. 53 ГЛАВА 3. Результаты .................................................................................................................54 3.1. Исследование эпидемических особенностей бокавирусной инфекции человека в Новосибирске ............................................................................................................................... 54 3.2. Генотипирование изолятов бокавирусов, выявленных в Новосибирске ........................57 3.3. Секвенирование геномов изолятов бокавирусов, выявленных в Новосибирске ...........62 3.4. Анализ рекомбинационных событий в геномах HBoV ....................................................71 3.5. Оценка скорости молекулярной эволюции HBoV ............................................................ 74 3.6. Исследование особенностей репликации HBoV ............................................................... 80 ГЛАВА 4. Обсуждение результатов .......................................................................................... 92 ВЫВОДЫ ...................................................................................................................................105 СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ..................................................................107 ПРИЛОЖЕНИЕ 1 ......................................................................................................................130 3 СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ АТФ - аденозинтрифосфат ВПЧ - вирусоподобные частицы ГБУЗ НСО- Государственное бюджетное учреждение здравоохранения Новосибирской области дНТФ- дезоксирибонуклеозидтрифосфат кДа-килодальтон н.о. – нуклеотидный остаток ОКИ – острые кишечные инфекции ОРТ – открытая рамка трансляции ОТ-ПЦР – обратная транскрипция – полимеразная цепная реакция ПЦР - полимеразная цепная реакция ФСБР- фосфатно-солевой буферный раствор ЭДТА- этилендиаминтетрауксусная кислота AAV-аденоассоциированный вирус CnMV-мельчайший вирус собак dNTP-дезоксирибонуклеозидтрифосфат GBoV-бокавирус гориллы HBoV-бокавирус человека HMG- хромосомальные белки HMPV - метапневмовируса человека IRF- интерферон-регулирующий фактор MVMp- мельчайший вирус мышей NP- нуклефосфопротеин PBoV- парвовирус свиней RPA- репликативный белок А TAE- трис-ацетатный буфер TBE- трис-боратный буфер UP – уникальный белок 4 ВВЕДЕНИЕ Бокавирус человека (HBoV), семейство Parvoviridae, был открыт в 2005 году в Швеции в носоглоточных смывах, полученных от детей с острыми респираторными заболеваниями верхних и нижних дыхательных путей [Allander et al., 2005]. Это небольшой (18-26 нм) вирус, геном которого представлен одноцепочечной (+)ДНК [Gurda et al., 2010; Schildgen et al., 2013]. В 2007 г. HBoV был обнаружен и в образцах фекалий детей с гастроэнтеритами [Lee et al., 2007; Vicente et al., 2007; Albuquerque et al., 2007; Lau et al., 2007; Chieochansin et al., 2008]. В 2009-2010 гг. в образцах фекалий были обнаружены генетически отличающиеся варианты HBoV, названные HBoV2, HBoV3 и HBoV4, а открытый ранее вирус стали обозначать HBoV1 [Arthur et al., 2009; Kapoor et al., 2009; Kapoor et al., 2010b]. В 2014 г. была предложена новая таксономия семейства Parvoviridae, согласно которой HBoV1-HBoV4 наряду с Gorilla bocavirus входят в род Bocaparvovirus, в котором HBoV1 и HBoV3 принадлежат к одному виду, а HBoV2 и HBoV4 – к другому [Cotmore et al., 2014]. В связи с тем, что HBoV3 и HBoV4 встречаются значительно реже, чем HBoV1 и HBoV2, особенности структуры геномов этих вирусов исследованы недостаточно. Так, к моменту настоящего исследования в международной базе данных GenBank было представлено 7 геномов HBoV3 и лишь 1 полногеномная последовательность HBoV4. Кроме того, до сих пор нет единого мнения о происхождении HBoV и его генетических вариантов, мало изучены особенности молекулярной эволюции этого вируса. Не все известно об особенностях жизненного цикла HBoV, механизмах репликации его генома, что связано с отсутствием воспроизводимой системы культивирования HBoV и животных моделей заболеваний, вызываемых этим вирусом. 5 Молекулярно-эпидемиологические исследования HBоV интенсивно проводятся во многих странах. Накопленные клинические данные показали, что HBoV1 является возбудителем заболеваний дыхательных путей, хотя он обнаруживается и в образцах фекалий больных гастроэнтеритом [Jartti et al., 2011]. HBoV2, HBoV3 и HBoV4 в основном выявляются в образцах фекалий [Jartti et al., 2011], но также могут выявляться и в носоглоточных смывах. Несмотря на множество проведенных исследований, до сих пор нет единого мнения об этиологической роли HBoV, в частности HBoV2, HBoV3 и HBoV4, в гастроэнтеритах. Разная встречаемость HBoV в различных регионах и частое выявление HBoV одновременно с другими вирусами, вызывающими острые кишечные инфекции (ОКИ), не позволяют сделать однозначных выводов [Wang et al., 2011; Khamrin et al., 2012a]. В Российской Федерации до начала наших исследований встречаемость и генетическое разнообразие HBoV, ассоциированных с гастроэнтеритами, детально не изучали, поэтому не был известен вклад HBoV в этиологию этих заболеваний, отсутствовали данные об эпидемиологических особенностях инфекций, вызываемых HBoV, не были известны сведения о генетическом разнообразии штаммов, циркулирующих на территории РФ, в международной базе данных GenBank не были представлены геномные последовательности изолятов HBoV, выявленных в РФ. Исходя из вышесказанного, целью настоящей диссертационной работы являлось изучение встречаемости и генетического разнообразия изолятов HBoV у детей, госпитализированных с гастроэнтеритами, а также исследование особенностей молекулярной эволюции и репликации этого вируса. Для выполнения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи: 1) оценить встречаемость ДНК HBoV в образцах фекалий детей раннего возраста, госпитализированных с гастроэнтеритами в 2010-2012 гг. в Новосибирске, и у здоровых детей; 6 2) генотипировать филогенетический выявленные анализ изоляты полученных HBoV данных, и в провести частности проанализировать эпидемиологические особенности инфекций, вызываемых HBoV1 и HBoV2; 3) определить полногеномные последовательности новосибирских изолятов HBoV, принадлежащих к различным генотипам; 4) исследовать особенности молекулярной эволюции HBoV; 5) исследовать особенности репликации HBoV. Научная новизна полученных результатов. Впервые в Российской Федерации исследована встречаемость HBoV у детей раннего возраста, госпитализированных с гастроэнтеритами, и здоровых детей и показано, что вклад этого вируса в этиологию этих заболеваний невысок. Впервые изучено генетическое разнообразие циркулирующих в Российской Федерации штаммов HBoV. Определены полногеномные последовательности новосибирских изолятов HBoV, принадлежащих к различным генотипам, в том числе и редко встречающихся HBoV4 и рекомбинантного HBoV3/HBoV4. Исследованы особенности молекулярной эволюции HBoV и впервые установлено, что скорость накопления мутаций в геноме HBoV составляет 8.6 × 10-4 замен/сайт/год, являясь высокой для вирусов с ДНКгеномом. Впервые проведена датировка формирования современных генетических вариантов HBoV. Практическая значимость. Проводившееся оперативное выявление этиологической причины ОКИ у детей раннего возраста, госпитализированных в специализированную клинику, позволило врачам этой клиники оптимизировать курс лечения. Результаты проведенного исследования позволили определить этиологическую причину в случаях, ранее относившихся к кишечным инфекциям неустановленной этиологии. Полученные данные включены в статистические отчеты детской городской клинической больницы №3 и 7 вошли в Государственные доклады о санитарно-эпидемиологической обстановке на территории Новосибирской области. Многолетний мониторинг генетического спектра циркулирующих бокавирусов является актуальным ввиду социальной значимости острых кишечных инфекций, а исследование изменчивости геномов этого патогена важно для прогнозирования появления новых эпидемически значимых вариантов бокавируса. Результаты проведенных исследований будут использованы для подготовки практических рекомендаций для клиницистов, специалистов СЭС и эпидемиологов по контролю и профилактике вирусных кишечных инфекций и внедрению современных методов диагностики. В рамках работы были получены 62 последовательности участка гена, кодирующего неструктурный белок (NS1), длиной 495 н.о. Определены полные нуклеотидные последовательности, за исключением 5'- и 3'нетранслируемых областей, 6 изолятов HBoV, из которых три изолята являются редко встречающимися. Полученные нуклеотидные последовательности депонированы в международной базе данных GenBank NCBI и являются важным дополнением к существующим в этой базе последовательностям, что может способствовать изучению роли HBoV в ОКИ у детей раннего возраста. Апробация работы и публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи в журналах, цитируемых в базах данных Web of Science и SCOPUS. Материалы диссертации были представлены на Российских конференциях с международным участием: VII Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «МОЛЕКУЛЯРНАЯ ДИАГНОСТИКА - 2010» (Москва, Россия, 2010); XLIX Международная научная студенческая конференция «Студент и научнотехнический прогресс» (Новосибирск, Россия, 2011); Научно-практическая конференция «Диагностика и профилактика инфекционных болезней» (Новосибирск, Россия, 2013); VIII Всероссийская научно-практическая 8 конференция с международным участием «МОЛЕКУЛЯРНАЯ ДИАГНОСТИКА 2014» (Новосибирск, Россия, 2014). Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов работы, обсуждения полученных результатов, выводов и списка литературы; содержит одно приложение. Работа изложена на 131 странице текста, содержит 30 рисунков и 6 таблиц. Список литературы состоит из 193 ссылок. Вклад автора. Все эксперименты и анализ полученных данных сделаны лично автором, за исключением определения нуклеотидных последовательностей 5'- и 3'- нетранслируемых областей, скорости молекулярной эволюции HBoV и рекомбинационных событий HBoV, которые проводились совместно с с.н.с. ЛММБ ИХБФМ СО РАН И.В. Бабкиным. 9 ГЛАВА 1. Обзор литературы Бокавирус человека: структурно-функциональная организация, генетическое разнообразие, эпидемиология 1.1. История открытия бокавирусов В течение долгого времени исследователям не удавалось обнаружить вирусного возбудителя респираторных инфекций с клиническими симптомами. Разработка метода «молекулярно-вирусного скрининга» и открытие с его помощью в конце 2001 г. в Нидерландах метапневмовируса человека (HMPV) Hoogen и его коллегами [van den Hoogen et al., 2001] послужило отправной точкой для поиска новых инфекционных агентов, что привело к увеличению числа вновь выявленных вирусных агентов, один из которых - бокавирус человека (HBoV). HBoV был открыт в сентябре 2005 года Tobias Allander и его коллегами в Каролинском медицинском университете, Стокгольм, Швеция [Allander et al., 2005], c помощью метода «молекулярно-вирусного скрининга», который основан на обработке клинических образцов из носоглотки ДНКазой, с последующей амплификацией, клонированием полученных случайных нуклеотидных sequencing) и последовательностей, биоинформатическим их секвенированием анализом (large-scale полученных данных. Нуклеотидная последовательность, соответствующая новому парвовирусу была идентифицирована после исключения человеческой, бактериальной и известных вирусных последовательностей. Дальнейший анализ выведенной аминокислотной последовательности показал, что наиболее близкими родственниками нового парвовируса являются два парвовируса животных из рода Bocaparvovirus: парвовирус быков (bovine parvovirus, BPV) и мельчайший вирус собак (canine minute virus, CnMV). Поэтому новый вирус получил название бокавирус человека - в результате комбинации первых двух букв «bo» из слова «bovine» и «ca» из слова «canine». 10 До 2007 года HBoV выявляли только у детей с острыми респираторными заболеваниями верхних и нижних дыхательных путей, и этот вирус впоследствии был назван HBoV1 [Allander et al., 2005]. После того, как в 2007 году HBoV впервые был обнаружен в образцах фекалий больных с ОКИ [Vicente et al., 2007], последовал ряд исследований, направленных на выявление HBoV в образцах от больных ОКИ в различных регионах мира [Albuquerque et al., 2007; Lau et al., 2007; Campe et al., 2008; Kapoor et al., 2009; Han et al., 2009; Jin et al., 2011; Pham et al., 2011; Jartti et al., 2012; Khamrin et al., 2012a; Khamrin et al., 2012b; Peltola et al., 2013]. Благодаря этому, в период с 2009 по 2010 года род Bocaparvovirus расширился тремя новыми вирусными вариантами HBoV: в 2009 году при проведении метагеномного исследования фекалий детей с острой кишечной инфекцией (ОКИ) в Австралии был обнаружен бокавирус человека 2-го генотипа (HBoV2) [Arthur et al., 2009]; в этом же году был идентифицирован бокавирус человека 3-го генотипа (HBoV3) [Kapoor et al., 2009]; в 2010 году был описан HBoV4 [Kapoor et al., 2010b]. Позднее, на основе выявленной высокой генетической дивергенции HBoV2 разделили на три субгенотипа: HBoV2A, HBoV2B и HBoV2C [Kapoor et al., 2010b; Cotmore et al., 2014]. 1.2. Таксономия семейства Parvoviridae Семейство Parvoviridae, содержащее HBoV, входит в группу вирусов с одноцепочечным ДНК-геномом, не имеющих липополисахаридной (липидной) оболочки. Cемейство Parvoviridae состоит из двух подсемейств: Parvovirinae, члены которого инфицируют позвоночных, и Densovirinae парвовирусы беспозвоночных, при этом представители обоих подсемейств вызывают болезни желудочно-кишечного тракта и дыхательных путей (рисунок 1). В подсемейство Parvovirinae, входит восемь родов (рисунок 1), из которых роды Bocaparvovirus, Dependoparvovirus и Erythroparvovirus включают вирусы, инфицирующие человека [Cotmore et al., 2014]. В течение 11 длительного времени были известны только два представителя подсемейства Parvovirinae, инфицирующих человека. Один из них, обнаруженный в 1967 г. непатогенный для человека аденоассоциированный вирус (adeno-associated virus, AAV), относится к роду Dependoparvovirus [Blacklow et al., 1967; Berns et al., 2007]. Другим является открытый в 1975 г., патогенный для человека парвовирус В19, относящийся к роду Erythroparvovirus, размножающийся в эритроидных клетках-предшественниках и вызывающий их гибель [Cossart et al., 1975; Bonvicini et al., 2006; Berns et al., 2007]. Рисунок 1. Таксономия семейства Parvoviridae В последнее время появились новые данные о биоразнообразии парвовирусов, инфицирующих человека. Недавно были открыты парвовирусы PARV4 и PARV5, которые было предложено отнести к новому роду Tetraparvovirus [Fryer et al., 2007]. Эти вирусы были получены от пациентов с энцефалитом неустановленной этиологии, а также от пациентов с респираторными заболеваниями [Drexler et al., 2012; Benjamin et al., 2011]. Позднее при анализе образцов фекалий, полученных от детей, страдающих 12 острой диареей в Буркина-Фасо, были обнаружены парвовирусы, относящиеся к потенциально новому роду Bufavirus [Phan et al., 2012]. Однако связь данных двух вирусных родов с заболеваниями человека требует дальнейших доказательств. HBoV, наряду с другими вирусами, инфицирующими животных, входит в род Bocaparvovirus (рисунок 1). Согласно новой таксономии HBoV разделяются на два вида: Primate bocaparvovirus 1, включающий в себя HBoV1, HBoV3 и бокавирус гориллы (GBoV), и Primate bocaparvovirus 2, состоящий из HBoV2 (A, B, C) и HBoV4 (рисунок 1) [Cotmore et al., 2014]. 1.3. Организация генома HBoV Геном представлен HBoV линейной одноцепочечной ДНК, положительной или отрицательной полярности, длина генома составляет около 5,3 тыс. нуклеотидов. С помощью изотермического способа амплификации (NASBA), который способен обнаружить и дифференцировать одноцепочечные ДНК-матрицы, было показано, что у HBoV в капсид упакована преимущественно одноцепочечная ДНК отрицательной полярности [Böhmer et al., 2009]. Геном HBoV содержит три открытые рамки трансляции (ОРТ), кодирующие с 5′ конца генома неструктурный белок NS1, который играет важную роль в репликации ДНК парвовирусов; нуклефосфопротен NP1, уникальный белок бокапарвовирусов, не имеющий сходства с другими белками парвовирусов; и два структурных белка: VP1 и VP2 (рисунок 2). Кодирующая последовательность фланкирована неполными концевыми палиндромами или инвертированными повторами, которые образуют шпилько-подобные структуры, необходимые для репликации вирусного генома [Tattersall et al., 1973; Cotmore et al., 1984; Cotmore et al., 1993; Tattersall et al., 1976]. На 3'-конце генома располагается последовательность TAAAAAT, характерная Parvoviridae. 13 для членов семейства ОРТ1. Первая, большая открытая рамка трансляции кодирует неструктурный белок NS1 массой 70-80 кДа, который во время цикла репликации парвовирусов действует как многофункциональный белок: участвует в остановке клеточного цикла, а также в генной трансактивации. Белок NS1 выполняет роль геликазы; служит эндонуклеазой и интерферирует с репликацией клеточной ДНК [Christensen et al., 1995; Hsu et al., 2004; Nakashima et al., 2004; Sun et al., 2009]. ОРТ1 ОРТ2 ОРТ3 Рисунок 2. Схематическое изображение организации геномов представителей рода Bocaparvovirus с указанием расположения ОРТ и концевых повторов [Arthur et al., 2009] ОРТ2. Особенностью, отличающей бокапарвовирусы от остальных парвовирусов, является наличие в геноме дополнительной второй открытой рамки трансляции, кодирующей дополнительный неструктурный белок нуклеофосфопротеин – NP1 (массой 26 кДа), который, как было показано, является неотъемлемой частью аппарата репликации у CnMV. Известно, что белок NP1 играет важную роль в репликации, а также индуцирует остановку 14 клеточного цикла и апоптоз в раковых клетках человека линии HeLa [Sun et al., 2013; Sun et al., 2009]. ОРТ3.Третья большая открытая рамка трансляции расположена на 3’конце генома и содержит последовательность, кодирующую два структурных белка: VP1 (84 кДа) и VP2 (65 кДа) [Sun et al., 2009; Dijkman et al., 2009; Gurda et al., 2010]. 1.4. Свойства и функции белков парвовирусов Неструктурный белок NS1, играет важнейшую роль в репликации ДНК парвовирусов [Christensen et al., 1995; Cotmore et al., 1995; Hsu et al., 2004; Nakashima et al., 2004; Morita et al., 2003]. Белок NS1 принадлежит к III суперсемейству геликаз, которые перемещаются по ДНК в направлении от 3′к 5′-концу. Для геликаз этого суперсемейства характерно наличие четырех консервативных мотивов - A, B, B′ и C, которые образуют полость связывания нуклеозидтрифосфата, координационный сайт иона металла, ДНК-связывающий сайт и сенсорный элемент. Эти мотивы расположены на участке протяженностью около 100 аминокислотных остатков в середине NS1. У парвовируса В19 этот белок участвует в активации промотора p6 [Brown et al., 1994] и имеет положительный эффект обратной связи на активность промотора p6 [Doerig et al., 1990]. Raab c коллегами [Raab et al., 2002] показали, что белок NS1 вируса B19 взаимодействует с промотором p6 с помощью прямого ДНК-связывания с клеточными транскрипционными факторами Sp1 и Sp3. Неструктурный белок NS1 автономного парвовируса мельчайшего вируса мышей (MVMp), который взаимодействует с клеточными факторами транскрипции SP1, TFIIA (α/β) и TBP in vitro сильно транс-активирует промотор P38 [Doerig et al., 1988; Gavin et al., 1990; Lorson et al., 1996; Lorson et al., 1998; Krady and Ward, 1995]. У HBoV белок NS1 связывается с левым и правым ориджинами репликации. Справа комплекс образуется хромосомальными белками человека (HMG), которые участвуют в процессах транскрипции, репликации, 15 рекомбинации и связывающими репарации, и модулирующие вирусным элементы NS1; слева - белками, глюкокортикостероидных гормонов, и вирусным NS1. Распознавание ориджина репликации приводит к образованию цепь- и сайт-специфичных разрывов вирусной ДНК. Данный процесс требует затраты энергии - молекулы АТФ, для обеспечения прочного связывания и внесения разрыва. После внесения разрыва, NS1 остается ковалентно связанным с 5′-концом никированной ДНК, 3′-гидроксильная группа которой используется для синтеза дочерней цепи. Предполагают, что репликацию генома HBoV осуществляет ДНК-полимераза δ, которая обычно участвует в процессах эксцизионной репарации. Для репликации помимо вирусного белка NS1 также необходимы белки клетки-хозяина -PCNA (фактор процессивности ДНК-полимеразы δ) и RPA (репликативный белок А), связывающий одноцепочечную ДНК в эукариотических клетках. В процессе репликации белок NS1 действует как АТФ-зависимая геликаза, которая расплетает концевые шпилечные структуры вирусного генома. В дополнение к важной роли в репликации NS1 способен усиливать транскрипцию с вирусного промотора, может участвовать в упаковке ДНК в сформированные капсиды, а также отвечает за цитопатический эффект парвовирусов [Li et al., 2013]. Белок модулируя NP1 путь является сигнальной антагонистом трансдукции, продукции интерферона-β, опосредуемый действием интерферон-регулирующего фактора -IRF-3. Интересно, что NP1 не ингибирует активацию IRF-3 и не запускает его деградацию, что, как правило, характерно для других вирусных антагонистов IRF-3. NP1 супрессирует продукцию интерферона по уникальному механизму: он взаимодействует с ДНК-связывающим доменом IRF-3 после его активации, что приводит к блокированию связывания IRF-3 с промотором гена, кодирующего интерферона-β. Это потенциальный механизм, с помощью которого HBoV противодействует врожденному иммунитету человека [Zhang et al., 2012]. 16 Способность ингибировать продукцию интерферона-β показана для белков NP1 HBoV1, HBoV2 и HBoV3. В настоящее время выясняется, обладают ли такой способностью белки NP1 HBoV4 и бокавирусов животных. Несмотря на то, что NP1 блокирует продукцию интерферона-β, делеция гена, кодирующего этот белок, не приводит к потере этой способности репликативно-компетентным клоном HBoV, содержащим геном без концевых повторов, что означает, что другие белки HBoV могут ингибировать продукцию интерферона-β. В подтверждение этого, не так давно было показано, высококонсервативен в что неструктурный семействе белок парвовирусов, который NS1, также способен ингибировать продукцию интерферона-β, однако механизмы, которые лежат в основе этого процесса, до сих пор не выяснены [Zhang et al., 2012]. Помимо способности ингибировать продукцию интерферона-β, белок NP1 ингибирует RLR-трансдукцию (передачу сигнала от внутриклеточного рецептора, отвечающего за распознавание вирусов системой врожденного иммунитета) и влияет на экспрессию VP2 [Zhang et al., 2012]. Два структурных белка VP1 и VP2, кодируемые ОРТ3, расположенной на 3'-конце генома, имеют общий С-конец, но белок VP1 длиннее на 129 аминокислотных остатков [Allander et al., 2005; Chieochansin et al., 2007]. N-конец белка VP1 получил название VP1U (от англ. unique уникальный). Домен VP1U белка VP1 HBoV обладает кальций-зависимой фосфолипазной (PLA2) активностью, чувствительной к специфическим ингибиторам [Lupescu et al., 2006; Canaan et al., 2004; Suikkanen et al., 2003; Dorsch et al., 2002; Zadori et al., 2001; Girod et al., 2002]. Аминокислотные остатки 21Pro, 41His, 42Asp и 63Asp критичны для фосфолипазной активности VP1U HBoV (рисунок 3) [Zadori et al., 2001; Qu et al., 2008]. Было покзано, что фосфолипазная активность PBoV (парвовирус свиней) сходна с таковой для самых активных фосфолипаз А2, а для вирусов AAV2 и B19 она в 1000 раз меньше [Canaan et al., 2004]. В свою очередь, 17 фосфолипазная активность домена VP1U HBoV сопоставима с таковой AAV2(рисунок 3) [Qu et al., 2008]. Рисунок 3. Схематическое изображение области HBoV VP1/VP2. Предполагаемый PLA2-мотив расположен в уникальной области VP1 (VP1U), приведена его аминокислотная последовательность для разных парвовирусов [Qu et al., 2008] Известно, что фосфолипазная активность парвовирусов необходима для эффективного перемещения вирусного генома из поздних эндосом/лизосом в ядро для начала вирусной репликации. Также было показано, что благодаря этой активности парвовирусы могут активировать емкостный кальциевый канал (ICRAC), который участвует в патофизиологическом процессе, вызываемом вирусом B19 [Lupescu et al., 2006]. Кроме того, фосфолипазная активность VP1U вируса В19 может активировать синовиоциты и положительно регулирует экспрессию циклооксигеназы, которая способствуют воспалению синовиальной оболочки [Lu et al., 2006]. Предположительно, VP1U HBoV может иметь сходные функции, играя важную роль в патогенезе инфекции, вызванной HBoV. 18 Мажорный капсидный белок VP2 HBoV, будучи сверхэкспрессирован, способен формировать капсидоподобные структуры (вирусоподобные частицы, ВПЧ), которые внешне напоминают вирусные частицы. Эти капсидоподобные VP2-частицы были использованы для анализа ТХклеточного иммунитета путем оценки HBoV-специфической пролиферации Т-клеток, выделенных от здоровых взрослых доноров. В отличие от парвовируса В19, HBoV индуцирует менее разнообразный ТХ-ответ по отношению к пролиферации и производству интерферона-γ, интерлейкинов10 и -13 [Chung et al., 2008; Kumar et al., 2011; Lindner et al., 2008]. Белок VP2 физически ассоциирован с убиквитин-лигазой E3, которая является продуктом гена rnf125 (E3 ubiquitin-protein ligase rnf125). Как и NP1, VP2 является негативным регулятором RLR-сигнального пути. Учитывая, что экспрессия rnf125 усиливается после индукции интерферонов [Arimoto et al., 2007], предполагают, что взаимодействие между VP2 и убиквитинлигазой E3 влияет на интерфероновый путь [Zhang et al., 2012]. При исследовании внутриклеточной локализации белков HBoV в экспериментах на линии альвеолярных эпителиальных клеток человека линии A549 было показано, что неструктурные белки NS1 и NP1 локализуются в ядре, что еще раз подтверждает их роль в репликации HBoV [Chen et al., 2010]. Капсидные белки VP1 и VP2 в основном имеют ядерную локализацию, но также обнаружены и в цитоплазме трансфицированных клеток [Chen et al., 2010], как и капсидные белки других парвовирусов [Vihinen-Ranta et al., 2006]. 1.5.Структура вириона бокавирусов человека HBoV - безоболочечный вирус, вирион которого представляет икосаэдр с симметрией T=1 диаметром 18 - 26 нм. Капсид бокавирусов состоит из 60 протомеров, каждый из которых содержит по одной копии двух капсидных белков: VP1 и VP2 (рисунок 4, 5) [Gurda et al., 2010]. 19 Рисунок 4. Схематическое изображение вириона бокавирусов человека [http://viralzone.expasy.org/all_by_species/199.html] Рентгеноструктурный анализ кристаллических структур ряда парвовирусов показал, что все белки VP2 содержат консервативную αспираль (αA) и консервативный мотив, представляющий собой восмитяжевую β-бочку (тяжи от βB до βI), который образует кор капсида [Chapman et al., 2006]. Основная часть VP2 состоит из сложных петель между тяжами, образующих поверхности капсида. Например, петля GH между тяжами βG и βH имеет протяженность в ~ 230 аминокислотных остатков. Состав и топология этих петель кодирует несколько важных функций, в том числе тканевой тропизм, патогенность и антигенный ответ, направленный против каждого конкретного парвовируса во время инфекции [AgbandjeMcKenna et al., 2006]. Анализ 3D структуры очищенных вирусоподобных VP2 частиц с разрешением 7,9-Å, полученных с помощью крио-электронной микроскопии с последующей реконструкцией изображения, показали множество общих черт с парвовирусами, таких как выступ в области оси симметрии 3-его порядка, углубление в области оси симметрии 2-ого порядка, и канал, окруженный каньоном в области оси симметрии 5-ого порядка. Было показано, что топология однородного капсида HBoV1 наиболее схожа с капсидом парвовируса человека В19 (рисунок 6) [Gurda et al., 2010]. 20 Рисунок 5. Электронная микрофотография вирионов бокавируса человека. Приведен масштаб - 100 нм [Gurda et al., 2010] Отличительная особенность HBoV возникает из разницы в топологии поверхности на оси 2-ого порядка: ямка на поверхности капсида HBoV мельче, чем у других парвовирусов. Остальные черты на оси 2-ого порядка, характерные для парвовирусов, сохраняются в капсидах HBoV. Так, αAспираль присутствует у HBoV и формирует стабилизирующие взаимодействия в пределах оси 2-ого порядка. Причем считают, что эти взаимодействия играют важную роль в сборке капсидов парвовирусов [Jones et al., 2005; Wu et al., 2000]. Таким образом, сохранение этой структурной особенности у VP2 HBoV предполагает, что она играет центральную роль в сборке капсидов HBoV, как и у других парвовирусов [Gurda et al., 2010]. Выступы на оси 3-его порядка, образуемые петлями EF и GH у HBoV, менее выражены, чем у парвовирусов, AAV2 и Aleutian mink disease virus (Aleutian mink disease virus, AMDV), что может быть результатом более коротких последовательностей и / или конформационных различий в петлях EF и GH у HBoV [Gurda et al., 2010]. 21 Рисунок 6. Крио-реконструкция вириона HBoV. Объемное изображение с указанием осей 2-ого, 3-его и 5-ого порядков (А). Объемное изображение без передней части капсида (В). Центральноепоперечное сечение капсида с указанием областей низкой и высокой электронных плотностей и осей 2-ого, 3-его и 5-ого порядков (С). Увеличенный верхний левый квадрант центрального поперечного сечения капсида, с указанием радиусов, соответствующих проекциям плоскостей (D) [Gurda et al., 2010] Как упоминалось выше, у представителей Parvovirinae на оси 5-ого порядка есть консервативный канал, окруженный каньоном. Этот канал представляет собой β-цилиндр, сформированный пятью симметричными βлентами, расположенными между тяжами D и E, с петлей DE на вершине. В HBoV петли DE образуют пальцеобразные выступы, которые окружают канал и проецируются на ось 5-ого порядка, образуя открытый канал. Считается, что у парвовирусов этот канал может выполнять ряд функций. Вопервых, он может служить сайтом экстернализации части VP2 (как у MVM, представителей рода Protoparvovirus); во-вторых - сайтом экстернализации 22 домена VP1U белка VP1 и его PLA2-мотива, обладающего фосфолипазной активностью; в-третьих, может участвовать в упаковке вирусной геномной ДНК в капсид. У HBoV петля HI лежит внутри каньона и более всего напоминает таковую вируса AAV2, и хотя петля у HBoV короче, она формирует топологию поверхности, сходную с таковой AAV2 [Gurda et al., 2010]. В целом, капсид HBoV сохраняет высококонсервативную структурную основу, характерную для других парвовирусов, несмотря на низкое сходство последовательности основного белка его капсида и белков капсида других парвовирусов. Сохранение основных структурных особенностей главного поверхностного белка, в том числе восьмицепочечной β-складки, αА-спирали, петель DE и HI, согласуется с их вкладом в сборку капсида и его стабильность. Сохранение β-цилиндрового канала, образованного петлей DE, предполагает, что этот канал имеет важное значение для продуктивной инфекции HBoV, вероятно являясь «порталом» для экстернализации VP1U и упаковки ДНК, что описано для других парвовирусов [Gurda et al., 2010]. 1.6. Репликация HBoV HBoV являются мелкими ДНК-содержащие вирусами, которые в большой степени зависимы от функционировании клетки-хозяина. Геномный анализ человеческих штаммов HBoV является сложной процедурой, в основном из-за технического ограничения, связанного с трудностью наработки вируса в культуре клеток, о которой сообщалось только один раз [Dijkman et al., 2009], а также из-за недостаточного количества полных последовательностей, включающих 5'- и 3'- нетранслируемые области. Согласно современной модели репликации парвовирусов эти вирусы реплицируют свой геном, используя концевые шпилько-подобные структуры в качестве праймеров, по так называемой модели репликации «сдвига 23 шпильки», которая является производной от классического механизма репликации по модели «катящегося кольца» [Tattersall et al., 1973; Cotmore et al., 1984; Cotmore et al., 1993; Tattersall et al., 1976; Berns, 1990]. Шпилька на 3'-конце выполняет функцию праймера, необходимого клеточной полимеразе для удлинения комплементарной цепи вирусного генома, что делает его двухцепочечным – эта форма необходима для транскрипции. Этот начальный дуплекс мономерной репликативной формы, имеющий одну ковалентно замкнутую последовательность на левом конце генома, затем замыкается «сам на себя», чтобы закрыть и правый конец генома, после чего необходим белок NS1 для «раскрытия» ковалентного дуплекса в месте ориджина репликации, примыкающего к правой шпильке. Образовавшийся на 3'-конце разрыв в родительской (исходной) цепи ДНК заполняется с использованием новой (дочерней) цепи в качестве матрицы. Белок NS1 остается ковалентно связанным со свободным 5′-концом, включая участок длиной 18-26 нуклеотидов, и играет важную роль в разворачивании и перемещении шпильки [Cotmore et al., 1988]. Эта шпилька, перемещаясь, замещает последовательность исходной шпильки ее инвертированным комплементом в каждом раунде репликации, образуя две чередующиеся формы шпильки, называемые "флип" и "флоп". В результате реализации этого механизма «сдвига-шпильки» кодирующая последовательность реплицируется последовательности, и образуются вдвое чаще, мультимерные чем концевые конкатемеры ДНК («голова-к-голове» или «хвост-к-хвосту»), что означает, что интермедиаты репликации образуют большие зеркальные последовательности (рисунок 7) [Schildgen et al., 2012]. 24 Рисунок 7. Схематическое изображение предполагаемой модели репликации бокавируса человека [Schildgen et al. 2012] До начала 2012 года концевые последовательности HBoV не были расшифрованы. Lüsebrink и соавторы идентифицировали неизвестную последовательность HBoV1 в образцах от разных доноров (пациентов) и в культивируемом изоляте Bonn 1 [Lüsebrink et al., 2011; Kapoor et al., 2011; Dijkman et al., 2009]. Эта вновь идентифицированная последовательность представляла собой ранее описанные концевые геномные последовательности, не образующие шпильку, ориентированные «голова-кхвосту» (рисунок 8), ковалентно связанные последовательностью, которая схожа с частями концевых шпилек бокавирусов-прототипов BPV1 и MVC [Lüsebrink et al., 2011]. Правая часть («хвост») этой последовательности HBoV1 [Lüsebrink et al., 2011] содержит последовательность, идентичную правой концевой шпильке MVC [Sun et al., 2009]; левая часть - «голова» этой последовательности имеет в своем составе две последовательности, сходные с последовательностью левой концевой шпильки BPV1 [Sun et al., 2009; Chen et al., 1986]. Предполагают, что концевые повторы HBoV1 скорее всего являются гибридными последовательностями предшественников HBoV (рисунок 8) [Schildgen et al., 2012]. 25 Рисунок 8. Структуры палиндромных повторов на концах геномов бокавирусов человека. В структурах правого концевого повтора MVC (REH) и левого концевого повтора BPV1 (LEH) обведены последовательности, идентичные таковым у HBoV (А). Линкерная последовательность «голова к хвосту» HBoV1 показана между вертикальными стрелками (В), обведены последовательности, идентичные концевым повторам MVC (REH) и BPV1 (LEH). Линкерная последовательность «голова к хвосту» HBoV3 показана между вертикальными стрелками (C). Последовательности, идентиченые таковым для HBoV1, подчеркнуты [Schildgen et al., 2012] Последовательности, обнаруженные Lüsebrink и соавторами [Lüsebrink et al., 2011], противоречили существующей модели репликации «сдвига-шпильки», поэтому возникла гипотеза о том, что бокавирусы человека используют альтернативный способ репликации - репликацию по классической модели «катящегося кольца» (рисунок 7). Открытие Lüsebrink и соавторов нашло подтверждение в недавнем исследовании Kapoor и коллег, которые также обнаружили последовательности, ориентированные «голова26 к-хвосту» в образцах биопсии из кишечного тракта пациентов, инфицированных HBoV3 [Kapoor et al., 2011]. Однако обнаруженная Kapoor и соавторами последовательность отличалась от таковой HBoV1 и содержала только два участка последовательностей, идентичных MVC, в пределах правой концевой шпильки (рисунок 8) [Kapoor et al., 2011]. В случае если репликация происходила бы по классической модели «катящегося кольца», большинство дочерних геномов были бы синтезированы из эписомы в едином направлении. Тем не менее, было показано, что в вирионы HBoV1 упаковывается в основном ДНК отрицательной полярности, и только 10% изученных изолятов имеют ДНК положительной полярности [Böhmer et al., 2009]. Эти геномы положительной направленности могут продуцироваться 10% эписом, реплицирующих другую цепь ДНК по модели «катящегося кольца» в направлении «против часовой стрелки» (отличном от направления, в котором реплицируется большинство эписом), или, возможно, являются продуктом репликации, происходящей по менее эффективной модели «сдвига-шпильки», зависящей от структуры концевых последовательностей. Предположительно, в случае верности гипотезы о репликации по модели «катящегося конкатемеров кольца», может сайт рестрикции располагаться для в разделения пределах дочерних линкерной последовательности. Однако, репликация по этой модели не доказана для парвовирусов, и требует дополнительных исследований. Эта концевая «линкерная» последовательность [Lüsebrink et al., 2011] отсутствовала у HBoV1 [Allander et al., 2005], не была протяженной у HBoV3 [Kapoor et al., 2011], и была вариабельной для AAV [Schnepp et al., 2005]. Для установления классического вида шпилек и репликативных моделей для парвовирусов, необходимо установить другие, пока неизвестные, последовательности, способные формировать шпильки типа «заячье ухо», которые могут содержаться в пределах левой концевой шпильки, но могут быть исключены при формировании и амплификации эписом. Известно, что шпильки парвовирусов тяжело амплифицировать и клонировать [Schildgen et al., 2012]. 27 По-видимому, структуры правых и левых концевых шпилек требуют дополнительных исследований. В исследовании нового вируса PPV4 (porcine bocavirus-like virusсвиного бокавирус-подобного вируса), до сих пор не отнесенного ни к одному роду, были обнаружены последовательности в ориентации «голова-кхвосту», сходные с описанными выше последовательностями [Cheung et al., 2010]. Кроме того, в ДНК AAV2 дикого типа, были обнаружены последовательности в ориентации «голова-к-хвосту», как в составе эписом в тканях человека [Schnepp et al., 2005], так и в виде интегрированных провирусов в клеточных культурах [Yang et al., 1997]. Эти последовательности содержали большое количество перестановок и делеций в участках концевых повторов. Скорее всего, эписомы HBoV1 и HBoV3 могут быть как интермедиатами репликации этих вирусов, так и формами, отвечающими за хранение персистирующих вирусных геномов в тканях [Schildgen et al., 2012]. 1.7. Транскриптом парвовирусов Два недавних исследования показали, что транскриптом HBoV сходен с транскриптомами парвовирусов животных (CPV, BPV) [Dijkman et al., 2009; Chen et al., 2010]. Путем альтернативного сплайсинга и альтернативного полиаденилирования с промотора, располагающегося на 3'-конце генома, образуются несколько различных мРНК (как минимум шесть). Длина полиАхвоста у этих молекул достигает 150 нуклеотидов. Эти мРНК были определены с помощью метода обратной транскрипции с последующей ПЦРамплификацией. Поэтому количество и значимость каждого вида мРНК транскрипта остается неизвестной [Dijkman et al., 2009]. Вероятнее всего, эти мРНК кодируют белки NS1, NP1, VP1/VP2, гипотетические белки UP1/NP1 и UP2/VP1/VP2, а также предполагаемый дополнительный белок, кодируемый областью ОРТx (рисунок 9) [Dijkman et al., 2009]. 28 Предсказанный Dijkman и соавторами укороченный вариант белка NS1 имеет длину всего 639 аминокислотных остатков, что намного меньше, чем длина белков NS1 вирусов MVC [Sun et al., 2009] и BPV [Qiu et al., 2007]. При этом укороченный вариант NS1 бокавирусов человека не имеет гомологии в районе С-конца с NS1 белками этих вирусов. Белок NS1 большего размера (781 аминокислотных остатков) предположительно закодирован сплайсированным вариантом мРНК. Экспрессию NS1 исследовали путем трансфекции эукариотических клеток линии HEK 293 репликативно-компетентным геномом HBoV1 [Chen et al., 2010]. При этом NS1 HBoV1 имеет 2 консервативных С-концевых мотива с NS1 MVC и BPV- 740WGERLGLI747 и 757PIVLXCFE764, которые, по-видимому, являются трансактивационными доменами [Legendre et al., 1994]. Трансфицированные репликативно-компетентным геномом HBoV1 клетки экспрессируют как большой, так и укороченный варианты NS1 [Chen et al., 2010]. После переноса генома в ядро одноцепочечная ДНК преобразуется в двухцепочечную, и начинается наработка вирусного белка NS1. Трансфекция клеток репликативно-компетентным геномом HBoV2 продемонстрировала сходный с HBoV1 транскрипционный профиль. Были обнаружены белки NS1, укороченный NS1, NP1, VP1 и VP2, размеры которых близки к таковым HBoV1 [Chen et al., 2010]. Вышесказанное позволяет предположить, что HBoV1 и HBoV2 сходны генетически, и что HBoV3 и HBoV4 скорее всего имеют похожий профиль экспрессии. Гипотетический белок UP1, содержащий весь С-конец белка NS1, не был обнаружен после трансфекции клеток [Chen et al., 2010]. Примечательно, что стартовый кодон AUG для предполагаемого белка UP1 консервативен среди всех генотипов бокавирусов человека. 29 Рисунок 9. Схематическое изображение предполагаемого транскриптома бокавирусов человека [Dijkman et al., 2009] 1.8. Жизненный цикл HBoV Прикрепление вируса к рецептору на поверхности клетки-хозяина (рецептором для BPV1 является сиаловая кислота [Abdel-Latif et al., 2006]) приводит к клатрин-опосредованному эндоцитозу вириона в клетку-хозяина. После этого, вирион проникает в цитоплазму за счет пермеабилизации (увеличения проницаемости) эндосомальной мембраны в клетке-хозяина. Из цитоплазмы по системе микротрубочек вирион транспортируется к ядру клетки-хозяина, и вирусный одноцепочечный геном проникает в ядро, где белки клетки-хозяина превращают его в двуцепочечную молекулу. Когда клетка входит в S-фазу происходит транскрипция двуцепочечной ДНК в вирусные мРНК, затем начинается репликация вирусного генома. Дочерние одноцепочечные ДНК могут быть превращены в двуцепочечные и участвовать в новых актах транскрипции и/или репликации, а также могут 30 быть упакованы в новые вирионы, которые высвобождаются из клеткихозяина (рисунок 10). Хорошо известно, что вирусы способны подавлять интерфероновый ответ системы врожденного иммунитета организма. Более того, для улучшения репликации вирусы также способны тонко его регулировать. Недавние исследования показали, что бокавирусы человека могут персистировать в клетках-хозяина, формируя эписомы [Babady et al., 2012]. Возможно, интерферон может способствовать переходу бокавирусной инфекции в латентную форму. Известно, что интерферон-регулирующий фактор IRF-7 является ключевым медиатором в переходе инфекции вирусом Эпштейна-Барр в латентную форму [De Vos et al., 2009; Lassauniere et al., 2010], поэтому возник вопрос, может ли IRF-7 играть сходную роль в персистенции бокавирусов человека. Так, было показано, что в геноме HBoV присутствует потенциальный участок связывания IRF-7 [Loeffelholz et al., 2011], и вполне вероятно, что хронизация HBoV-инфекции может проходить по механизму, сходному с таковым для вируса Эпштейна-Барр [De Vos et al., 2009; Lassauniere et al., 2010]. Хотя жизненный цикл HBoV не до конца установлен, исследования Huanle Luo и соавторов, а также Sukhu и соавторов позволяют предположить, что ген, кодирующий белок NP1, является ранним геном, а ген, кодирующий белок VP2 - поздним геном в жизненном цикле HBoV [Luo et al., 2013; Sukhu et al., 2013]. Учитывая различные роли белков NP1 и VP2 в интерфероновых сигнальных путях, Huanle Luo и соавторы сделали вывод, что HBoV могут уклоняться от интерферонового иммунного ответа, благодаря действию белка NP1 на ранней стадии инфекции, в то время как на поздней стадии инфекции, экспрессия VP2 может способствовать переходу инфекции HBoV в хроническую форму за счет положительной регуляции экспрессии интерферона. Скорее всего, HBoV использует различные вирусные белки, чтобы регулировать уровень интерферонов, для усиления инфекции или репликации на разных стадиях жизненного цикла вируса. 31 Рисунок 10. Схематическое изображение жизненного цикла бокавирусов человека 1.9. Генетическая дивергенция бокавирусов человека На основе данных филогенетического анализа аминокислотных последовательностей, кодируемых ОРТ3 (ген VP1/2), стало известно, что наибольшие отличия существуют в аминокислотных последовательностях VP1/2 HBoV1 и HBoV2-4 (~ 20%), а отличия аминокислотных последовательностей, закодированных в других ОРТ, составляют ~ 10%. Таким образом, Volz и коллеги пришли к выводу, что, возможно, HBoV1 эволюционировал от основного кишечного патогена к респираторному патогену [Volz et al., 2007]. Генетическое внутривидовое разнообразие кишечных вирусов (HBoV2-4) намного больше, чем у HBoV1. Кроме того, HBoV2-4, вероятно, произошли в результате рекомбинации. На основе выявленной высокой генетической дивергенции HBoV2 разделили на три субгенотипа: HBoV2A, HBoV2B и HBoV2C [Kapoor et al., 2010b; Volz et al., 32 2007; Cotmore et al., 2014]. Более подробные анализы геномов HBoV показали очень высокую вероятность того, что HBoV3 произошел в результате рекомбинации между HBoV1 и HBoV4 (рисунок 11) [van den Brand et al., 2011]. Рисунок 11. Филогенетическое дерево, построенное по частичным аминокислотным последовательностям белка VP2 представителей подсемейства Parvovirinae 1.10. Патогенез бокавирусной инфекции В отличие от других вирусов, HBoV зачастую обнаруживается совместно с другими инфекционными агентами, которые являются либо возбудителями ОКИ, либо возбудителями острой респираторной вирусной инфекции (ОРВИ). Этот факт привел к гипотезе, о том, что HBoV является «безвредным наблюдателем», т.е. этот вирус возможно не патогенен для человека [Schildgen et al., 2008]. Также, в подтверждение этой гипотезы выступает тот факт, что для HBoV невозможно применить постулаты Коха, что связанно с техническими ограничениями, то есть, до сих пор не установлена ни универсальная система культуры клеток, ни животная модель для этого вируса. До настоящего времени не было зафиксировано случаев передачи HBoV от человека к человеку [Jartti et al., 2011; Schildgen et al., 2013]. Информация о патогенезе HBoV-инфекции на сегодняшний день сильно ограничена. ДНК HBoV можно найти в мокроте [Allander et al., 2007] 33 и стуле (в фекалиях), слюне, в сточных водах и т.д. [Campe et al., 2008; Han et al., 2009; Kapoor et al., 2009]. HBoV также вызывают виремию (т.е. во время активной репликации, вирус обнаруживается в крови/сыворотке инфицированных пациентов [Kantola et al., 2011; Don et al., 2011; Don et al., 2010; Hedman et al., 2010; Kantola et al., 2008; Korner et al., 2011; Korppi et al., 2010; Nascimento–Carvalho et al., 2012]. Кроме того, HBoV можно найти в двенадцатиперстной кишке [Streiter et al., 2011], слизистой околоносовых пазух [Falcone et al., 2011], образцах кишечной биопсии [Kapoor et al., 2011]. Учитывая, что на поверхности (границе) орган-специфической воздушножидкостной клеточной культуры [Dijkman et al., 2009], частицы HBoV (выделяются) секретируется как апикально (т.е. на поверхности), так и дистально (внутри), то наиболее вероятная модель патогенности для HBoV аналогична модели для мельчайшего вируса собак (MVC). Этот вирус проникает в хозяина через дыхательные пути, достигает кровотока и поступает в желудочно-кишечный тракт через кровоток или при приеме пищи. В конечном счете, выделение вируса из организма происходит во время кашля, либо дефекации [Tijssen et al., 1999]. Эта модель патогенеза поддерживается тем, что HBoV-серопозитивность наиболее высока для дыхательного подтипа HBoV1, в то время как антитела, специфичные к HBoV2-4, встречаются менее часто [Kantola et al., 2011]. 1.11. Персистенция бокавирусов в организме человека Было показано, что два других парвовируса человека, вирус В19 и адено-ассоциированный вирус (AAV), обычно сохраняются в течение многих десятилетий в самых разных типах тканей здоровых людей [Söderlund et al., 1997; Norja et al., 2006; Söderlund-Venermo et al., 2002; Schnepp et al., 2005; Manning et al., 2007; Kuethe et al., 2009]. Механизм персистенции в тканях до сих пор обсуждается. Возможно, вирусная ДНК интегрируется в хромосомы человека или хранится в виде эписом, или даже может быть упакована в капсид и присоединена к поверхности фолликулярных дендритных клеток в 34 виде полноценных вирионов или переносится к тканям внутри макрофагов и других циркулирующих клеток [Jartti et al., 2012]. ДНК HBoV1 может находиться в верхних дыхательных путях в течение нескольких месяцев после острой инфекции вследствие задержки в носоглотке или загрязнения слизистой вирусными частицами из вдыхаемого воздуха [Martin et al., 2010; von Linstow et al., 2008; Don et al., 2011; Blessing et al., 2009]. Однако персистенция HBoV отличается от таковой для вирусов В19 и AAV [Manning et al., 2007; Falcone et al., 2011; Lu et al., 2008; Kuethe et al., 2009]. Несмотря на то, что HBoV1 способен вызвать системную инфекцию [Kantola et al., 2008], персистенцию этого вируса, возможно, следует искать в тканях дыхательных путей или кишечного тракта. 1.12. Пути передачи бокавирусов человека Пути передачи бокавирусов человека неизвестны. Вероятно, как и другие парвовирусы, он может передаваться воздушно-капельным путем или при контакте с инфицированными фекалиями, мочой и т.д. [Berns et al., 2007]. Внутриутробное инфицирование маловероятно в связи с высокой иммунизацией беременных [Enders et al., 2009; Riipinen et al., 2010]. 1.13. Лечение и профилактика HBoV инфекции В настоящее время нет утвержденных методов лечения HBoV инфекции [Martin et al., 2010; Jartti et al., 2011]. Симптоматическое лечение может потребоваться в тяжелых случаях, и оно аналогично лечению других инфекций дыхательных путей. На сегодняшний день известен единственный клинический случай, в котором противовирусное лечение было связано с устранением HBoV у пациента с сочетанной инфекцией HBoV и HHV-6 [Streiter et al., 2011]. Мальчик страдал от иммунодефицита и утратил возможность продуцировать антитела во время иммунного ответа. Во время лечения цидофовиром, который является препаратом, специфичным для герпесвируса, HHV-6 виремия уменьшилась, и инфекция HBoV была успешно устранена. В этом случае исход согласуется с результатами другого 35 клинического случая, в котором HBoV виремия снизилась во время лечения, хотя, по другим причинам этот случай имел смертельный исход [Klinkenberg et al., 2012]. Также следует отметить, что из-за отсутствия животной модели и универсальной клеточной культуры, разработка вакцины чрезвычайно трудна. Методы профилактики для HBoV инфекции аналогичны методам, применяемым при других респираторных вирусных инфекциях. И для лабораторных исследований методы изучения вируса аналогичны методам, используемых для изучения других членов семейства Parvoviridae. Учитывая важную роль фосфолипазной активности в патогенезе парвовирусной инфекции, VP1U HBoV может стать мишенью при разработке противовирусных препаратов для лечения бокавирусной инфекции. Deng и соавторы исследовали иммуногенность вирусоподобных частиц (ВПЧ) HBoV1 и HBoV2 на мышах в качестве вакцинных кандидатов. Они показали, что HBoV ВПЧ, вводимые в сочетании с алюминиевым адъювантом, индуцируют продукцию иммуноглобулинов класса G (IgG), и, таким образом, способствуют более эффективному выведению вируса и защите от инфекции. Оценка кросс-реактивности сывороток, полученных в результате иммунизации HBoV1 и HBoV2 ВПЧ, продемонстрировала, что сыворотки, полученные при иммунизации HBoV1 ВПЧ, в большей степени кросс-реактивны в отношении HBoV2 ВПЧ и, предположительно, смогут обеспечить лучшую защиту при введении в соответствующих дозах. Оценка продукции интерферона-γ спленоцитами мышей, иммунизированных HBoV1 и HBoV2 ВПЧ, показала, что эти ВПЧ способны активировать Т-клетки и стимулировать клеточный иммунный ответ. Причем более сильный клеточный иммунный ответ был показан при иммунизации HBoV ВПЧ в отсутствие алюминиевого адъюванта. Deng и соавторы обнаружили, что HBoV1 ВПЧ индуцировали сбалансированный ТХ1/ТХ2 иммунный ответ, тогда как HBoV2 ВПЧ индуцируют более сильный ТХ2 иммунный ответ [Deng et al., 2014]. 36 Таким образом, HBoV VP2 ВПЧ достаточно иммуногенны и индуцируют сильный гуморальный и клеточный иммунный ответ у мышей. Поэтому HBoV VP2 ВПЧ являются перспективными кандидатами для разработки на их основе вакцин против HBoV. 1.14. Диагностика бокавирусной инфекции В связи с отсутствием системы культивирования клеток, диагностика HBoV инфекции основывается исключительно на методах молекулярной детекции. В настоящее время большинство лабораторий для выявления генов NP1, NS1 или VP1/2 используют ПЦР-анализ, а также ПЦР-анализ в реальном времени [Jartti et al., 2011]. Были разработаны и доведены до рынка ряд коммерчески-доступных мультиплексных тест-систем. Некоторые из этих тест-систем также способны детектировать бокавирус человека, в том числе Luminex RVP тест-система (Luminex, США) и тест-система RespiFinder (Pathofinder, Нидерланды). Вероятно, будут разработаны и другие тестсистемы для выявления HBoV, хотя во многих доступных в настоящее время диагностических наборах, таких как FilmArray (Айдахо Diagnostics, США) и RespID (Luminex, США), пренебрегают этим возбудителем. Следует отметить, что для тех лабораторий, которые следуют правилам FDA, важно иметь в виду, что Luminex RVP×TAG тест-система получила одобрение FDA. Чтобы правильно диагностировать HBoV инфекцию, необходимо провести скрининг клинических образцов от пациентов с ОРВИ или с ОКИ (в зависимости от того, какие первичные симптомы наблюдаются) и соответствующие образцы сыворотки [Don et al., 2010; Don et al., 2011; Hedman et al., 2010; Kantola et al., 2008; Korppi et al., 2010]. Последнее (т.е. скрининг образцов сыворотки) имеет большое значение, так как виремия (распространение вируса) наблюдается только во время активной инфекции [Don et al., 2010; Hedman et al., 2010; Kantola et al., 2008; Korppi et al., 2010; Bonvicini et al., 2011; Martin et al., 2009], в то время как HBoV может быть распространен среди здоровых пациентов, что, скорее всего, связанно с 37 хронической инфекцией, протекающей без виремии [Bonvicini et al., 2011; Martin et al., 2009]. 1.15. Эпидемиология бокавирусной инфекции В определенной степени клинические симптомы, вызванные бокавирусами человека (HBoV), зависят от конкретного вида HBoV. Клинические данные, накопленные за последние годы, показали, что HBoV1 является возбудителем заболеваний нижних дыхательных путей, хотя он также обнаруживается в образцах фекалий больных с ОКИ [Allander et al., 2005; Vicente et al., 2007; Albuquerque et al., 2007; Lee et al., 2007; Lau et al., 2007; Santos et al., 2010; Allander et al., 2008; Jartti et al., 2012]. Встречаемость ДНК HBoV1 в назофарингеальных образцах варьирует от 2 до 19%, наиболее типичный возраст для HBoV1 инфекции 6-24 месяцев [Kesebir et al., 2006; Fry et al., 2007; Allander et al., 2007]. В то же время, HBoV2-4 преимущественно обнаруживаются в образцах фекалий, хотя они также выявляются и в назофарингеальных аспиратах [Song et al., 2010; Koseki et al., 2012; Kantola et al., 2010; Chieochansin et al., 2009; Chow et al., 2010; Cheng et al., 2011; Santos et al., 2010; Wang et al., 2011]. В 2009 году была показана связь HBoV2 с ОКИ у детей в Австралии [Arthur et al., 2009]. Несмотря на множество проведенных исследований, до сих пор нет единого мнения об этиологической роли HBoV2, HBoV3, и HBoV4 в ОКИ. Разная встречаемость HBoV в различных регионах и частое выявление HBoV совместно с другими вирусами, вызывающими ОКИ (от 20% до 80%), не позволяет сделать однозначных выводов об этиологической значимости HBoV [Albuquerque et al., 2007; Wang et al., 2010; Wang et al., 2011; Khamrin et al., 2012a]. HBoV2-4 до сих пор не были обнаружены в крови, в то время как HBoV1 вызывает системную инфекцию, ведущую к кратковременной виремии и индукции специфических антител [Kantola et al., 2008; Lindner et al., 2008; Kahn, 2008; Soderlund-Venermo et al., 2009; Lin et al., 2008; Wang et al., 2010; Kantola et al., 2011]. Однако ДНК HBoV2-4 не искали в образцах сыворотки пациентов с 38 ОКИ, только у детей с острой респираторной вирусной инфекцией (ОРВИ) [Kantola et al., 2011]. По данным серологических исследований, HBoV1 инфекция чрезвычайно распространена, об этом свидетельствует тот факт, что процент HBoV-серопозитивных взрослых пациентов приближается к 100%. Следует, однако, учесть, что перекрестно-реагирующие антитела против других бокавирусов человека могут сильно влиять на этот показатель [Kantola et al., 2011]. На основе данных о серопозитивности, измеренных в реакции конкуренции с гетерологичными вирусоподобными частицами, виды (генотипы) HBoV, часто поражающие людей, распологались в порядке убывания следующим образом: HBoV1 > HBoV2 > HBoV3 > HBoV4 [Kantola et al., 2011]. В Российской Федерации в медицинских учреждениях в настоящее время для установления диагноза ОКИ исследование клинических образцов обычно проводится на наличие патогенной и условно-патогенной флоры с использованием стандартных микробиологических методик. В некоторых диагностических лабораториях образцы тестируют также и на присутствие маркеров ротавирусов с помощью иммуноферментных тест-систем. Такая ограниченность средств диагностики обусловливает высокую долю так называемых кишечных инфекций неустановленной этиологии (КИНЭ), когда в пробах не выявляется ни один из тестируемых патогенов. Так, по данным официальной статистики в период с 2010 г. по 2012 г. в России было зарегистрировано 1404855 случаев острых кишечных заболеваний (включая сальмонеллезы и шигеллезы) среди детей до 14 лет, причем 63,4% из них зарегистрированы как ОКИ, вызванные неустановленными возбудителями, и пищевые токсикоинфекции неустановленной [http://www.fcgsen.ru]. 39 этиологии Таблица 1. Встречаемость бокавирусов человека в разных регионах мира HBoV генотип HBoV HBoV+, n (%) коинфекция n (%) Количество образцов Возраст (года) Года Страна HBoV2 5 (5%) 3 (0,4%) - 699 Все возраста 1998 Пакистан, Соединенное Королевство HBoV2 HBoV3 32 (17%) - 186 ˂17 2001 Австралия HBoV1 13 (10%) 5 (2%) 3 (23%) 1 (20%) 136 239 Дети и взрослые 2003-04 Австралия HBoV1 4 (0,5%) 1 (25%) 877 ˂15 2003-05 Япония HBoV1 14 (2%) 3 (21%) 705 ˂15 2003-05 Бразилия HBoV1 8 (1%) 3 (38%) 962 ˂6 2005-06 Корея HBoV1 2 (1%) 1 (50%) 225 0,3-4 2005-06 Тайланд HBoV1 30 (2%) 14/25 (56%) 1435 ˂6 2005-06 Корея HBoV1 48 (9%) 28 (58%) 527 ˂3 2005-06 Испания 40 Первые авторы Kapoor [Kapoor et al., 2009] Arthur [Arthur et al., 2009] Tozer [Tozer et al., 2009] Nakanishi [Nakanishi et al., 2009] Albuquerque [Albuquerque et al., 2007] Lee [Lee et al., 2007] Chieochansin [Chieochansin et al., 2008] Lau [Lau et al., 2007] Vicente [Vicente et al., 2007] HBoV генотип HBoV HBoV+, n (%) коинфекция n (%) Количество образцов Возраст (года) Года Страна HBoV1 67 (6%) 52 (78%) 1216 ˂5 2006-07 Китай HBoV1 14 (4%) 9 (64%) 397 ˂5 2006-07 Китай HBoV1 5 (8%) 3 (60%) 64 ˂15 2006-07 Германия HBoV1 6 (13%) 47 ˂17 2006-08 Иран HBoV1 14 (5%) 8 (57%) 307 Все возраста 2007 Германия HBoV1 4 (8%) 3 (75%) 50 ˂15 2007 Финляндия HBoV1 3 (1%) 2 (67%) 247 0,2-15 2007-08 Япония HBoV2 HBoV3 HBoV1 HBoV2 HBoV3 30 (21%) 5 (1%) 9 (2%) 6 (1%) 0(0%) 13 (43%) 2 (0.2%) 479 151 ребенок 328 взрослых 2007-08 США HBoV1 2 (3%) HBoV1 2 (0,5%) 2 (100%) 61 ˂5 2007-08 Венгрия 358 ˂17 2008-09 Корея 41 Первые авторы Yu [Yu et al., 2008] Cheng [Cheng et al., 2008] Karalar [Karalar et al., 2010] Nadji [Nadji et al., 2010] Campe [Campe et al., 2008] Räsänen [Räsänen et al., 2010] Pham [Pham et al., 2011] Chow[Chow et al., 2010] Szomor [Szomor et al., 2009] Han [Han et HBoV генотип HBoV2 HBoV1 HBoV2 HBoV3 HBoV4 HBoV1 HBoV2A HBoV2B HBoV3 HBoV4 HBoV HBoV+, n (%) коинфекция n (%) 13 (10%) 3 (23%) 0 (0%) 0 (0%) 4 (2%) 2 (50%) 1 (0.4%) 1 (100%) 0 (0%) 0 (0%) 4 (1%) 4 (1%) 76 (12%) 11 (2%) 6 (1%) Количество образцов Возраст (года) Года Страна Первые авторы al., 2009] 250 33 ребенка 217 взрослых Финляндия Kantola [Kantola et al., 2010] Дети взрослые Непал Нигерия Тунис США Kapoor [Kapoor et al., 2010b] 641 42 1.16. Заключение Таким образом, недавнее выявление того факта, что бокавирус 2-го генотипа может являться этиологическим агентом, вызывающим ОКИ, потребовало проведение молекулярно-эпидемиологических исследований этого вируса. Однако, в Российской Федерации систематические исследования этиологической значимости HBoV, вызывающих ОКИ, а также их генотипическая характеристика до 2010 года не проводились. В связи с этим, целью данной работы являлось оценка этиологической значимости HBoV в структуре ОКИ у детей раннего возраста и исследование молекулярно-генетического разнообразия циркулирующих изолятов HBoV в Новосибирске. Начиная с 2003 г., в Новосибирске проводится детальное молекулярно-эпидемиологическое изучение основных этиологических агентов, вызывающих ОКИ (ротавирус А, норовирус II, астровирус) [Боднев и др., 2010, Горбунова и др., 2008, Жираковская и др., 2008, Боднев и др., 2008, Жираковская и др., 2007] и накоплена большая коллекция клинических образцов, поэтому часть исследований базировалась на коллекции 2010 г. Поскольку отсутствуют данные и о встречаемости бокавирусов у здоровых детей, в ходе исследования была собрана коллекция фекалий и исследована встречаемость бокавирусов у здоровых детей. Известно, что скорость накопления мутаций в геноме бокавируса человека сравнима с изменчивостью вирусов с РНК-геномом [Babkin et al., 2013; Malecki et al., 2011; Zehender et al., 2010]. Кроме этого обнаружено, что в возникновение новых генетических вариантов HBoV существенный вклад вносят процессы рекомбинации между различными штаммами этого вируса. Так, ряд исследователей полагает, что генотип HBoV2 произошел в результате рекомбинации между HBoV1 и HBoV4, осложненной рекомбинацией внутри генотипа среди вариантов HBoV2 [Babkin et al., 2013; Fu et al., 2011; Kapoor et al., 2009; Kapoor et al., 2010a; Song et al., 2010]. Считается также, что HBoV3 произошел в результате рекомбинации других генотипов HBoV [Kapoor et al., 2010a; Cheng et al., 2011]. Однако, этот вопрос 43 является не до конца изученным. Например, не ясно, на основе каких генотипов сформировался генотип HBoV3 – как результат рекомбинации HBoV1 и HBoV2 [Kapoor et al., 2010a] или HBoV1 и HBoV4 [Cheng et al., 2011]. Все это требует дополнительных исследований. К настоящему времени показано, что геномы HBoV1, HBoV 2 HBoV3 имеют кольцевую форму [Zhao et al., 2012; Kapoor et al., 2011]. Существование этой формы генома поднимает вопрос о том, почему структуры шпилек различны у HBoV разных генотипов, и формируются ли эти структуры в клетке или они иного происхождения. На сегодняшний день было сделано предположение, что репликация генома HBoV, происходит таким же образом, как и репликации генома парвовируса животных, то есть с помощью механизма «скользящей шпильки». В этой модели промежуточными продуктами репликации являются конкатемеры, которые формируют последовательность либо «голова к голове» («head-to-head») либо «хвост к хвосту» («tail-to-tail»). Недавно было показано, что при репликации HBoV1-3 образуется последовательность «голова к хвосту» («head–to–tail»), что соответствует модели «катящегося кольца» [Lusebrink et al., 2011; Kapoor et al., 2011], модель репликации HBoV4 до сих пор не известна. Учитывая тот факт, что репликация парвовирусов другого подсемейства - Dependoviruses, может происходить исключительно в присутствии вирусов-помощников (helper-viruses), таких как вирусы герпеса, аденовирусы и других вирусов [Ward et al., 2001], требуется исследование модели репликации HBoV4. 44 ГЛАВА 2. Пациенты, материалы и методы 2.1. Основная характеристика обследованных больных Проведено обследование 5264 пациентов, детей раннего возраста, находившихся на лечении в 3-ем инфекционном отделении МУЗ Детской городской клинической больницы №3 г. Новосибирска с февраля 2010 г. по декабрь 2012 г. В эту специализированную клинику поступают дети из всех районов города и части Новосибирского сельского района. Следует отметить, что в это отделение поступает большинство детей раннего возраста, госпитализированных с диареей в г. Новосибирске, что позволяет рассматривать выявленные закономерности в качестве общих для Новосибирска. Также проведено исследование 339 образцов фекалий, полученных от здоровых детей, проходивших диспансеризацию, с января по декабрь 2012 г. в ГБУЗ НСО Новосибирской районной больницы № 1. У этих детей отсутствовали признаки ОКИ, респираторных и других инфекционных заболеваний в течение 14 дней до сбора образцов. Возраст детей с диареей варьировал от 3 дней до 60 месяцев, 85.2% пациентов составляли дети первого года жизни. Соотношение мальчиков и девочек составило 1.2:1. Возраст здоровых детей варьировал от 1 до 60 месяцев, большинство детей (64.6%) были дети первых полутора лет жизни. Соотношение мальчиков и девочек составило 1.1:1. На проведение этих исследований было получено одобрение Этического комитета Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии "Вектор" (ГНЦ ВБ "Вектор") (регистрационный номер IRB0001360). регламентирующим Согласно проведение нормативно-правовым научно-исследовательских документам, работ с привлечением человека в качестве объекта биомедицинского исследования, мы получали письменное информированное согласие пациентов. В случае обследования детей получали письменное информированное согласие законных представителей детей, включенных в данное исследование. В 45 исследование не вошли дети, родители или опекуны которых не дали информированного согласия на участие в данном обследовании. Каждому участнику исследования присваивался уникальный идентификационный номер, с помощью которого он идентифицировался во всех документах исследования. Конфиденциальная информация не использовалась в публикациях и отчетах. Данные из медицинских карт пациентов вносились в единую базу данных, структура которой была разработана на основе Microsoft Office Access. В структуру базы данных входило несколько связанных таблиц, что позволяло при использовании запросов Access производить анализ имеющейся информации. 2.2. Материалы Реактивы: бромистый этидий, бромфеноловый синий, агароза (“BioRad”, США), GTG-агароза (SeaKem GTG Agarose, Lonza), глицерин (“Sigma”, CША), азид натрия, ацетат натрия, этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), трис(гидроксиметил)аминометан-HCl, уксусная кислота, хлорид натрия, хлорид калия, дигидрофосфат калия, гидрофосфат натрия, Sephadex G50 superfine (GE Healthcare, Швеция), маркер молекулярных весов ДНК 100bp (СибЭнзим, Россия). Готовые коммерческие наборы: «РИБО-сорб» производства ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, комплект «ЭФ» производства ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, Taq ДНК-полимераза Dream™ (Fermentas, Латвия), 10-ти кратный буфер DreamTaq™ Green (Fermentas, Латвия), дНТФ производства ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, “BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit” (Applied Biosystems, США). Буферы и растворы: ТЕ: 10мМ Трис-HCl, 1мМ ЭДТА, рН 8,0 TBE: 2мМ ЭДТА, 89мМ Трис-HCl, 0,9мМ борная кислота, рН 8,3 46 TAE: 20мМ ацетата натрия, 1мМ ЭДТА, 40мМ Трис, рН 8.0 доводили ледяной уксусной кислотой. 2.3. Основные методы 2.3.1. Сбор образцов Материалом исследования служили пробы фекалий детей раннего возраста, находившихся на стационарном лечении в 3-ем инфекционном отделении МУЗ Детская городская клиническая больница №3 г. Новосибирска, с диагнозом ОКИ. Образцы фекалий собирали сотрудники 3го инфекционного отделения в одноразовые стерильные пластиковые контейнеры объемом 5 мл при поступлении пациентов в стационар и хранили при -200C. Длительное хранение материала осуществляли при -700С. Врачи отделения заполняли медицинские карты, данные из которых переносились в базу данных для дальнейшей статистической обработки. 2.3.2. Осветление экстракта фекалий В стерильные 2 мл пробирки с плотно закрывающейся крышкой вносили стерильный ФСБР, содержащий глицерин (15%) и азид натрия (0,05%), в количестве 1,2 мл. Пробирки маркировали согласно порядковому номеру в базе данных. Образцы проб фекалий объемом до 300 мкл переносили из контейнеров в пробирки с буфером. Взвесь фекалий встряхивали на вортексе до образования суспензии. Полученную суспензию центрифугировали в течение 5 мин с угловым ускорением 9700 g. Супернатант (10-20% осветленный экстракт фекалий) использовали при выделении нуклеиновых кислот. Оставшуюся суспензию фекалий хранили при -700С. 2.3.3. Выделение вирусной ДНК Выделение ДНК вирусов производили из фекалий, осветленных ФСБРглицериновым буфером, методом аффинной сорбции с использованием 47 набора для выделения «РибоСорб» (ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, Россия). Для этого в пробирку вносили 450 мкл лизирующего раствора, нагретого до 65ºС, после чего добавляли 100 мкл фекальных экстрактов. Плотно закрытые пробы тщательно перемешивали на вортексе и, сбросив капли на центрифуге, добавляли к пробе 25 мкл сорбента. Пробу перемешивали 3 раза на вортексе всего 5 мин, а потом инкубировали 5 мин при комнатной температуре. Для осаждения сорбента пробу центрифугировали в течение 30 сек с угловым ускорением 6700 g, потом из пробы удаляли супернатант. К осадку добавляли 400 мкл раствора для отмывки, ресуспендировали осадок на вортексе и центрифугировали в течение 30 сек с угловым ускорением 6700 g, потом удаляли супернатант. К полученному осадку добавляли 500 мкл 70% этанола, ресуспендировали осадок на вортексе и центрифугировали в течение 30 сек с угловым ускорением 6700 g, после чего удаляли супернатант. Отмывку этанолом повторяли 2 раза. К осадку добавляли 400 мкл ацетона, ресуспендировали осадок на вортексе и центрифугировали в течение 30 сек с угловым ускорением 6700 g, потом удаляли супернатант. Окончательно высушивали осадок в термостате при 65ºС. После этого осадок ресуспендировали в 60 мкл ДНК-элюента, перемешивали, затем прогревали 2-3 мин в термостате при 65ºС и центрифугировали 90 сек с угловым ускорением 12000 g. Супернатант, содержащий очищенную ДНК в объеме 50 мкл, переносили в новую пробирку. 2.3.4. Проведение полимеразной цепной реакции (ПЦР) Тестирование на наличие в пробах бокавирусов человека проводили в одностадийной ПЦР на амплификаторе «BIO-RAD». ПЦР-смесь (объем 30 мкл) состояла из Taq ДНК-полимеразы Dream™, 10-ти кратного буфера DreamTaq™ Green, дНТФ, специфичных праймеров (HBoV2-sf2 5’TGCTTCAACAGGCAAAACAA-3’, HBoV2-sr2 5’- TCCAAGAGGAAATGAGTTTGG-3’) [Kapoor et al., 2009], воды без нуклеаз и 48 ДНК-матрицы. Перед началом первого цикла осуществляли денатурацию матричной ДНК при 950С в течение 5 минут, по окончании последнего цикла проводили финальную достройку амплифицированных фрагментов при 72 0С в течение 1 минуты. Температурный профиль ПЦР имел следующий вид: 950С – 10 сек; 520С –10сек; 720С –10 сек.; всего проводили 41 цикл амплификации. 2.3.5. Электрофоретический анализ образцов Для анализа продуктов ПЦР использовали метод гель-электрофореза. Электрофорез проводили в 1,5% горизонтальном агарозном геле в буфере ТБЕ (комплект «ЭФ» производства ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора). Оценку длины фрагментов ДНК проводили, сравнивая положения зон проб с зонами маркерной ДНК известной длины. 2.3.6. Проведение полимеразной цепной реакции с гибридизационнофлуоресцентной детекцией «по конечной точке» Тестирование образцов на наличие ДНК бактерий Salmonella spp., Campylobacter spp., Shigella spp. и энтероинвазивных Escherichia coli (EIEC) детектировали методом ПЦР с использованием наборов реагентов «АмплиСенс® Shigella spp. and EIEC/Salmonella spp./Campylobacter spp.-FL» (ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, Россия) на амплификаторе «BIO-RAD». Подготовка реакционных смесей и проведение амплификации проводилась согласно инструкции производителя. ПЦР-смесь (в объеме 15 мкл, без ДНК матрицы) состояла из Taq ДНК-полимеразы, ПЦР-смеси-1 FEP/FRT Campylobacter spp. / STI или ПЦР-смеси-1 FEP/FRT Shigella spp. / Salmonella spp. (в зависимости на какие группы бактерий тестируется образец), и ПЦР-смеси-2. Поверх ПЦР-смеси наслаивали минеральное масло, а потом вносили 10 мкл раствора ДНК. Перед началом первого цикла осуществляли денатурацию матричной ДНК при 950С в течение 5 минут, по окончании последнего амплифицированных цикла фрагментов проводили при 49 720С финальную в течение достройку 1 минуты. Температурный профиль ПЦР имел следующий вид: 950С – 15 сек; 600С –10 сек; 720С –10 сек.; всего проводили 42 цикла амплификации. Детекцию продуктов амплификации проводили с помощью флуоресцентного ПЦР детектора «Джин» (ДНК-Технология, Россия), согласно протоколу, описанному в инструкции производителя тест-системы. 2.3.7. Очистка продуктов ПЦР Фрагменты ДНК разделяли электрофоретически в 0,6% GTG агарозе. ДНК наносили в модифицированном трис-ацетатном буфере (40 мМ трис, 0,1 мМ ЭДТА, 0,0014% уксусная кислота), содержащем 0,05% кристаллического фиолетового и 30% глицерина. Фрагмент геля, содержащий ДНК, вырезали, переносили на колонку, центрифугировали 5 мин при 13000 об/мин. Концентрацию очищенных продуктов ПЦР измеряли с использованием спектрофотометра SmartSpec Plus (Bio-Rad, США). 2.3.8. Постановка реакции Сэнгера Для постановки реакции Сэнгера в стерильную пробирку вносили 50 нг ампликона и 3,3 пмоль праймера, затем полученную смесь высушивали в вакуумном концентраторе Concentrator 5301 (Eppendorf, Германия) при 600С. В пробирку с сухим остатком вносили 1 мкл смеси “BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit” (Applied Biosystems, США), 6 мкл “BigDye Terminator 5X Sequencing Buffer” бидистиллированной воды. (Applied Biosystems, Температурный США) профиль и 23 реакции мкл имел следующий вид: 980С - 10 сек, 500С - 5 сек, 600С - 4 мин в течение 25 циклов, затем финальный прогрев при 980С в течение 3 мин и хранение при 200С. 2.3.9. Очистка продуктов реакции Сэнгера Очистку продуктов реакции Сэнгера от невключившейся метки проводили с помощью гель-фильтрации через колонки с сорбентом Sephadex G50 superfine (GE Healthcare, Швеция). Для этого сорбент предварительно оставляли набухать в воде в течение 3 часов, из расчета 50 мг сорбента на 50 одну реакцию в 1 мл бидистиллированной воды. Затем набухший сорбент в количестве 1 мл вносили в чистый корпус колонки и центрифугировали в течение 5 мин при угловом ускорении 900 g. После этого сорбент промывали 150 мкл бидистиллированой воды и центрифугировали в течение 5 мин при угловом ускорении 900 g. В центр столбика сформированного геля наносили всю реакционную смесь, помещали колонку в стерильную пробирку объемом 1,5 мл и центрифугировали в течение 5 мин при угловом ускорении 900 g. Очищенные продукты концентраторе Высушенные реакции Concentrator продукты Межинститутский Центр 5301 реакции Сэнгера высушивали (Eppendorf, Сэнгера Секвенирования на в Германия) анализ ДНК, вакуумном при 600С. передавали откуда в приходили результаты в виде секвенограмм, а также в ЛММБ ИХБФМ СО РАН м.н.с. к.б.н. Тикунову А. Ю. 2.3.10. Филогенетический анализ Филогенетический анализ проводили с использованием программных продуктов MEGA версия 5.03 [Tamura et al., 2013]. Филогенетические деревья строили методом объединения ближайших соседей с использованием перестановочного анализа статистической значимости сконструированного дерева по 500 репликам. Сравнение полученных нуклеотидных последовательностей с ранее опубликованными выполняли с использованием сервера Национального центра биотехнологической информации (NCBI, США), включающего базы данных GenBank (США), EMBL (Европа) и DDBJ (Япония), с помощью алгоритма BLAST 2.2.24. 2.3.11. Статистический анализ Для статистической обработки полученных данных использовались стандартные методы вариационной статистики программы Microsoft Excel. Статистическое оценивание данных эпидемиологического исследования 51 проводилось согласно опубликованным рекомендациям [Armitage et al., 2002]. Сравнение частоты встречаемости HBoV инфекции среди опытной и контрольной групп проводили с использованием теста Хи-квадрат для таблиц 2×2 с поправкой Йеитса или, при необходимости, с использованием точного теста Фишера. Сравнение возрастного распределения HBoV инфекции среди детей с ОКИ проводили с использованием t-теста Стьюдента. Значения p ≤ 0,05 считались значимыми. 2.3.12. Анализ нуклеотидных последовательностей Расчет отношения числа несинонимичных к числу синонимичных замещений (ω) выполняли установлением попарного числа несинонимичных и синонимичных замещений, нормализованного к числу потенциальных участков. Затем определяли их отношения с помощью метода максимального правдоподобия в пакете программ Paml. Анализ рекомбинации проводили с помощью программы GARD (Genetic Algorithms for Recombination Detection) [Pond and Frost, 2005], используя малый информационный критерий Акаики (c-AIC) [Sugiura, 1978] и тест Кишино-Хасегава (KH) [Kishino and Hasegawa, 1989]. Модель эволюции рассчитывали автоматически до поиска сайтов рекомбинации. Предсказанные точки картировали на стопке выровненных нуклеотидных последовательностей и для них установливали значения вероятностей. Полученные районы, свободные от рекомбинационных событий, дополнительно исследовали на наличие единичных точек рекомбинации методом SBP [Kosakovsky Pond and Frost, 2005]. Для каждого набора выровненных последовательностей была проведена проверка гипотезы молекулярных часов с помощью теста отношения правдоподобий [Huelsenbeck and Rannala, 1997]. Вычисление генетической дивергенции (π) геномов проводили, используя программу DNAsp версия 4.10.9 [Librado and Rozas, 2009] в окне длиной 50 нуклеотидов, с шагом 10 нуклеотидов. 52 Расчет вторичной структуры концевых некодирующих районов и свободной энергии вторичной структуры этих районов изолятов HBoV, выявленных в Новосибирске, проводили с помощью онлайн ресурса mfold (http://mfold.rit.albany.edu/?q=mfold/DNA-Folding-Form). 2.3.13. Определение скорости молекулярой эволюции Скорость нуклеотидных замен на сайт и времена дивергенции от предшественников были рассчитаны методом Байеса, применяя марковские цепи моделирования по Монте-Карло (MCMC), в пакете программ BEAST [Drummond and Rambaut, 2007]. 53 ГЛАВА 3. Результаты 3.1. Исследование эпидемических особенностей бокавирусной инфекции человека в Новосибирске На первом этапе были изучены эпидемические особенности бокавирусной инфекции в Новосибирске. Для этого на наличие ДНК HBoV исследовали образцы фекалий, полученных от всех детей раннего возраста, госпитализированных с диагнозом ОКИ в 3-е отделение МУЗ Детская городская клиническая больница №3 г. Новосибирска в 2010-2012 гг. Аналогично исследовали образцы фекалий от здоровых детей, проходивших диспансеризацию в ГБУЗ НСО Новосибирской районной больницы № 1 в 2012 г. На каждого ребенка, участвовавшего в исследовании, составлялась карта пациента, где указывались клинические и эпидемиологические данные. На основании этих карт данные переносились в специально разработанную базу данных на базе Microsoft Access. Всего за исследуемый период было протестировано на наличие ДНК HBoV 5264 образца фекалий, полученных от детей с диагнозом ОКИ, и 339 образцов фекалий от здоровых доноров. ДНК HBoV выявляли методом ПЦР, визуализацию продукта реакции проводили электрофоретически. Примеры таких электрофореграмм приведены на рисунке 12. ДНК HBoV была обнаружена в 62 пробах, полученных от детей с диагнозом ОКИ, что составило 1,2% от общего числа образцов, и в одном образце от здоровых детей, что составило 0,3%. Встречаемость ДНК HBoV отличалась в разные годы исследований: в 2010 г. она составила 1,2% (19/1467), в 2011 г. - 1,7% (34/1980), а в 2012 - 0,5% (9/1817). Данные приведены в таблице 2. Все исследуемые образцы фекалий от больных с диагнозом ОКИ и от здоровых доноров были протестированы на наличие не только ДНК HBoV, но и на наличие РНК ротавирусов группы А (HRVA), норовирусов II 54 1 2 М 3 500 н.о. Рисунок 12. Электрофореграмма ПЦР-фрагментов, полученных при использовании образцов содержащих бокавирус (дорожки 1, 2). М – маркер молекулярных масс (100 bp) Таблица 2. Распределение HBoV, выявленных у детей с ОКИ в Новосибирске (февраль 2010- декабрь 2012) Вирусы/Бактерии Количество образцов HBoV HBoV1 HBoV2 HBoV3 HBoV4 HBoV alone 34 11 21 1 1 HBoV с др. агентами ОКИ 28 13 14 0 1 HBoV, HNoVGII 10 6 4 0 0 HBoV, HRVA 9 4 5 0 0 HBoV, Shigella spp. и EIEC 1 0 1 0 0 HBoV, Campylobacter spp. 3 2 1 0 0 HBoV, HRVA, HNoVGII 2 0 2 0 0 HBoV, HNoVGII, HAstV 1 0 1 0 0 HBoV, HRVA, Campylobacter spp. HBoV, HNoVGII, Shigella spp. и EIEC Всего 1 1 0 0 0 1 0 0 0 1 62 24 35 1 2 55 геногруппы (HNoVII) и астровирусов человека (HAstV). Кроме того, все HBoV-положительные образцы были исследованы на наличие ДНК аденовирусов F и ДНК патогенных бактерий: сальмонелл, кампилобактерий, шигелл и энтероэнвазивных E. coli. В связи с этим можно было оценить вклад HBoV в этиологию ОКИ в составе моноинфекций и инфекций сочетанной этиологии. За весь исследуемый период ОКИ, вызванные моноинфекцией HBoV, были выявлены в 54,8% образцов от всех обнаруженных случаев бокавирусной инфекции (таблица 2), однако этот показатель варьировал в разные годы. Так, в 2010 г. HBoV встречались в виде моноинфекций почти в 52,6% случаев от обнаруженных за этот год (10/19), в 2011 г. произошло увеличение доли моноинфекций до 53,8% (21/34), а в 2012 г. HBoV встречались в виде моноинфекций в приблизительно в половине случаев (5/9). В HBoV-положительном образце от здорового ребенка нуклеиновых кислот других возможных возбудителей ОКИ обнаружено не было. В 44,9% случаях HBoV были зарегистрированы при ОКИ сочетанной этиологии: в 32,2% случаев они встречались в сочетании с одним инфекционным агентом, преимущественно с наиболее распространенными HNoVII и HRVA, в 13% случаев - в сочетании более чем с одним патогеном. При этом более 10% выявленных случаев бокавирусной инфекции были обнаружены в сочетании с бактериальными патогенами. Данные представлены в таблице 2. Анализ сезонной встречаемости бокавирусов показал, что они выявлялись в течение всего периода исследования, кроме марта месяца. Выявляемость бокавирусов по отношению к общему числу поступивших с диагнозом ОКИ в различные месяцы варьировала от 0% до 6,5% (рисунок 13). Наибольшее число выявленных бокавирусов было обнаружено в феврале 2011 г., причем в этом месяце бокавирусы встречались чаще, чем астровирусы, которые являются третьей причиной ОКИ среди вирусных 56 Рисунок 13. Сезонное распределение HBoV инфекции у детей с ОКИ патогенов, уступая ротавирусам и норовирусам [Babkin et al., 2013]. Анализ помесячной динамики выявления показал, что HBoV преимущественно встречались в осеннее-зимние месяцы: в октябре – ноябре и в январе – феврале (рисунок 13). Стоит отметить, что изолят HBoV от здорового ребенка был выявлен в феврале 2012. При анализе возрастного распределения больных с бокавирусной инфекцией за весь исследуемый период были выявлены следующие особенности. Чаще всего бокавирусы выявлялись у детей в возрасте от 6 до 8 месяцев, при этом 87% (54/62) заболевших были младше одного года и более 96% заболевших были младше полутора лет. В этом исследовании не была обнаружена зависимость частоты выявления HBoV от пола ребенка. 3.2. Генотипирование изолятов бокавирусов, выявленных в Новосибирске Для определения генетического разнообразия HBoV, циркулирующих в Новосибирске, все ПЦР-фрагменты, обнаруженные при детекции HBoV, 57 были секвенированы. Все секвенированные последовательности были депонированы в базе данных GenBank, номера доступа JX046072 - JX046105 и KJ492895 -KJ492923 (Приложение 1). Филогенетический анализ определенных нуклеотидных последовательностей показал, что из описанных к настоящему времени четырех генетических вариантов HBoV в Новосибирске были обнаружены: HBoV1 – 24 изолята (38,7%), HBoV2 – 36 изолятов (56,4%), HBoV3 – один изолят (1,6%) и HBoV4 – два изолята (3,2%) (рисунок 14). Выявленная нуклеотидная последовательность в образце от здорового ребенка принадлежала к HBoV2 (рисунок 14). Большинство последовательностей фрагмента ОРТ1 изолятов HBoV1, обнаруженных в 2010-2012 гг., были полностью идентичны между собой, а также изолятам, выявленным ранее в Нидерландах (2007), США (2009), Японии (2009) и Тунисе (2010). Только три последовательности фрагментов ОРТ1 изолятов N4932, N5042 и N5274, обнаруженных в октябре и декабре 2012 г., отличались от них на 1-2 н.о. (рисунок 14). Нуклеотидные последовательности фрагмента ОРТ1 изолятов HBoV2 разделились на две клады, соответствующие субгенотипам HBoV2А и HBoV2В (рисунок 14). В первой кладе, HBoV2А, находилось 7 последовательностей, четыре из которых (все обнаружены в 2010 г.) были идентичны последовательности изолята GQ281567, выделенного в Корее в 2009 г., а остальные группировались с последовательностями, выделенными в Китае (FJ911565, GU301645), Тайланде (GU048662) и Нигерии (FJ973560) в 2009 г. [Cheng et al., 2011; Chieochansin et al., 2010; Kapoor et al.,2010b]. 58 Рисунок 14. Филограмма нуклеотидных последовательностей фрагментов ОРТ1 изолятов бокавирусов, построенная методом максимального правдоподобия, в узлах указаны статистические индексы поддержки. Черными кружками отмечены изоляты бокавирусов, выявленных в Новосибирске у детей с ОКИ, белым кружком отмечен бокавирус, выявленный у здорового ребенка в Новосибирске 59 Во второй кладе, HBoV2В, находилось 29 последовательностей, 24 из которых, включая последовательность, полученную из образца от здорового ребенка, были идентичны соответствующим последовательностям из Тайланда (GU048663) [Chieochansin et al., 2010] и Ирана (JN091181), а также кластеризовались с изолятами из Великобритании (GU048664, FJ170280) [Chieochansin et al., 2010; Kapoor et al., 2009] и Австралии (EU082213, EU082214) [Arthur et al., 2009]. Нуклеотидная последовательность фрагмента ОРТ1 HBoV3, обнаруженная в образце ребенка, госпитализированного в июле 2011 года, была полностью идентична соответствующим последовательностям изолятов HBoV3, выявленных в различных регионах мира в 2008-2011 гг. (рисунок 14). Две нуклеотидные последовательности фрагментов ОРТ1 HBoV4, обнаруженные нами в августе 2011, различались на 5 н.о. между собой и отличались от ближайшей последовательности изолята HBoV4-NI385-07 из Нигерии (FJ973561) на 14 и 9 н.о., а от последовательности таиландского изолята HBoV4-CMH-S011-11 (KC461233) на 26 и 21 н.о. соответственно (рисунок 14). Таким образом, в Новосибирске за весь исследуемый период были обнаружены изоляты всех четырех генетических вариантов HBoV, описанных к настоящему времени, причем чаще всего выявлялись изоляты HBoV2, хотя встречаемость каждого генетического варианта в различные годы отличалась. Большинство изолятов HBoV1 были обнаружены в 2010 г. – 54% (13/24), в 2011 г. было выявлено 6 изолятов HBoV1, в 2012 г. – 5 изолятов (рисунок 13). Анализ помесячной динамики выявления показал, что изоляты HBoV1 обнаруживались в образцах стула от детей, госпитализированных с ОКИ с июня по декабрь; встречаемость HBoV1 варьировала от 1 образца в сентябре 2011 г. до 5 образцов в октябре и ноябре 2010 г. Статистически значимые отличия были выявлены при 60 сравнении встречаемости HBoV1 в 2010 г. и 2011 г., в 2011 г. и 2012 г. (χ2=12,04, p=0,05 и χ2=4,58, p=0,05 соответственно). Большинство изолятов HBoV2 были выявлены в 2011 г. - 71,4% (25/35), в 2010 г. было выявлено лишь 6 изолятов HBoV2, в 2012 г. – еще 4 (рисунок 13). Изоляты HBoV2 выявлялись круглогодично с увеличением частоты встречаемости в зимние месяцы: в январе – феврале. Статистически значимые отличия были обнаружены при сравнении данных встречаемости HBoV2 в 2010 г. и 2011 г., в 2011 г. и 2012 г. (χ2=12,04, p=0,05 и χ2=4,58, p=0,05 соответственно). Изолят HBoV2 от здорового ребенка был выявлен в феврале 2012 г. Анализ зависимости возрастного распределения пациентов от генотипа HBoV показал, что встречаемость HBoV1 у детей первого года жизни составила 91,7% (22/24), а встречаемость HBoV2 – 83,8% (30/35) (рисунок 15). Средний возраст пациентов с HBoV1 в образцах составил 8,3 месяца, а с HBoV2 – 8 месяцев. Не было статистически значимых отличий во встречаемости HBoV1 и HBoV2 у детей первого года жизни - 40,7% (22/54) и 55,6% (30/54), соответственно (χ2=2,37, p=0,05). Изоляты HBoV3 и HBoV4 были обнаружены у детей возраста 14 месяцев (HBoV3) и 10 месяцев (оба изолята HBoV4). В коллекции образцов от здоровых детей изолят HBoV был обнаружен у ребенка возраста 2 месяца. Мы сравнили встречаемость HBoV1 и HBoV2 в виде моноинфекций и инфекций сочетанной этиологии, статистически значимых отличий обнаружено не было (χ2=1,15, p=0,05). Из 35 образцов с HBoV2 в 21 образце (60%) присутствовала только ДНК HBoV2; в 14 образцах (40%) ДНК HBoV2 выявлялась вместе с РНК и/или ДНК других вероятных возбудителей ОКИ, (в основном с РНК HRVA или HNoVGII), из которых в 3-х образцах ДНК HBoV2 присутствовала совместно с нуклеиновыми кислотами двух и более вирусных и/или бактериальных агентов (таблица 2). Встречаемость HBoV1 в виде моноинфекции составила 45,8% 61 Рисунок 15. Возрастное распределение (среди положительных образцов на HBoV) у детей с ОКИ (11/24); в 13 образцах (54,2%) наряду с ДНК HBoV1 присутствовали нуклеиновые кислоты других энтеропатогенных вирусов или бактерий, в основном HRVA или HNoVGII (таблица 2). 3.3. Секвенирование геномов изолятов бокавирусов, выявленных в Новосибирске Всего к началу данного исследования в международной базе данных GenBank было зарегистрировано 134 полных нуклеотидных последовательностей геномов HBoV. Из них 117 – это последовательности изолятов HBoV1, 9 – изолятов HBoV2, 7 - изолятов HBoV3 и одна последовательность изолята HBoV4. Было принято решение определить геномные последовательности новосибирских изолятов HBoV, принадлежащих ко всем известным генетическим вариантам, и провести сравнительный анализ этих последовательностей с известными. В ходе работы были определены полные нуклеотидные последовательности изолята HBoV1 RUS-NSC10-N1117 выявленного в Новосибирске в октябре 2010 г., изолятов HBoV2 RUS-NSC10-N386 и RUS62 NSC10-N751, выявленных в мае и июле 2010 г., изолята HBoV3 RUS-NSC11N2512, выявленного в Новосибирске в июле 2011 г., и изолятов HBoV4 RUSNSC11-N2655 и RUS-NSC11-N2657, выявленных в Новосибирске в августе 2011 г. Нуклеотидные последовательности депонированы в базе данных GenBank под номерами JQ964114, JQ964116, JQ964115, KJ710645, KJ649741 и KJ649742 соответственно. Для определения нуклеотидной последовательности изолятов HBoV, был разработан набор из 31 оригинального праймера (таблица 3). Кроме того, использовали два ранее описанных праймера: HBoV sf2 и HBoV sr2 [Kapoor et al., 2009]. Схема амплификации фрагментов геномов HBoV и использованные сочетания праймеров приведены в таблице 3. Чтобы профиль программы амплификации был универсальным, использовали на первых восьми циклах понижение температуры отжига праймеров на 1 ОС с каждым циклом, начиная с 57ОС. Последующие циклы амплификации проводили при температуре отжига праймеров 55ОС. При сборке полногеномных последовательностей из отдельных фрагментов последовательности перекрывающиеся области. праймеров Таким удаляли образом, и были сопоставляли получены последовательности шести геномов изолятов HBoV, в которых отсутствовали части 5’- и 3’-нетранслируемых участков геномов, содержащие фрагменты концевых инвертированных повторов. Шесть определенных и 25 референсных (как наиболее близкие к полученным последовательностям, так и наиболее от них отдаленные) нуклеотидные последовательности (таблица 4) были выровнены в программе Clustal. Созданное выравнивание было вручную верифицировано. Затем был выполнен филогенетический анализ данных методами максимального правдоподобия(рисунок 16). 63 Таблица 3. Последовательности праймеров и их сочетания для амплификации фрагментов геномов изолятов бокавирусов человека HBoV1 HBoV2 Сочетание праймеров Расположение фрагмента на геноме (н.о.)* Длина фрагмента Сочетание праймеров Расположение фрагмента на геноме (н.о.)* Длина фрагмента HBov1- HBov2 28-637 609 HBov1- HBov2 27-635 608 HBov23- HBov4 561-1135 574 HBov3- HBov4 540-1130 590 HBov5- HBov6 1071-1728 657 HBov5- HBov6 1069-1724 655 HBov7- HBov24 1674-2270 596 HBov7- HBov8 1672-2265 593 HBov25- HBov10 2148-2768 620 HBov9- HBov10 2225-2751 526 HBov11- HBov12 2721-3295 574 HBov11- HBov12 2704-3275 571 HBov26- HBov27 3154-3729 575 HBov13- HBov14 3145-3709 564 HBov28- HBov16 3584-4223 639 HBov15- HBov16 3549-4191 642 HBov29- HBov30 4046-4635 589 HBov17- HBov18 4026-4621 595 HBov31- HBov32 4567-5278 711 HBov19- HBov22 4562-5175 613 HBoV3 HBoV4 Сочетание праймеров Расположение фрагмента на геноме (н.о.)* Длина фрагмента Сочетание праймеров Расположение фрагмента на геноме (н.о.)* Длина фрагмента HBov1 - HBov2 5-613 608 HBov1- HBov2 5-614 609 HBov23- HBov4 538-1112 574 HBov3- HBov4 519-1112 593 HBov5- HBov6 1048-1705 657 HBov5- HBov6 1048-1705 657 HBov7– Hbov8 1651-2249 598 HBov7- HBov8 1651-2249 598 HBov25- HBov10 2125-2747 622 HBov9- HBov10 2206-2748 542 HBov11- HBov12 2700-3274 574 HBov11- HBov12 2701-3275 574 HBov13 – Hbov14 3144-3711 567 HBov13- HBov14 3145-3709 564 HBov15 - HBov16 3551-4205 654 HBov15- HBov16 3552-4206 654 HBov17 – Hbov18 4028-4635 607 HBov17- HBov18 4029-4642 613 HBov19 - HBov32 4595-5189 594 HBov19- HBov22 4583-5196 613 *Позиции на геноме указаны для соответственного генотипа. Референсным для HBoV1 является FJ858259, HBoV2 – GU048663, HBoV3 – EU918736, HBoV4 – FJ973561 64 Таблица 4. Список анализируемых HBoV No. Штамм Генотип 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 HK4 HK10 HK7 TW2715_06 TW2717_06 TW141_07 JPOC07-511 LWK TUN2207 TUN4134 SH3 W298 W208 HBoV2A-TU-A-114-06 HBoV2B-NI-213 HBoV2B-NI-327 W471 W855 HBoV3 MC8 25 IM10 HBoV3B-TU-A-210-07 46-BJ07 HBoV4-NI-385 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 3 4 Дата коллекции 2005 2005 2005 2006 2006 2007 2007 2009 2010 2010 2008 2001 2001 2006 2007 2007 2001 2002 2003 2003 2004 2007 2007 2007 25* HBoV1 RUS-Nsc10-N1117 1 2010 26* HBoV2 RUS-Nsc10-N386 2 2010 27* HBoV2 RUS-Nsc10-N751 2 2010 28* HBoV3 RUS-NSC11-N2512 3 2011 29* HBoV4 RUS-NSC11-N2655 4 2011 30* HBoV4 RUS-NSC11-N2657 4 2011 31 GBoV1 Bocavirus gorilla 2009 Страна Номер GenBank Гонконг Гонконг Гонконг Тайвань Тайвань Тайвань Япония Китай Тунис Тунис Китай Австралия Австралия Тунис Нигерия Нигерия Австралия Австралия США Бразилия Бразилия Тунис Китай Нигерия Россия, Новосибир ск Россия, Новосибир ск Россия, Новосибир ск Россия, Новосибир ск Россия, Новосибир ск Россия, Новосибир ск EF450720 EF450726 EF450723 EU984232 EU984233 EU984242 AB481080 GU338055 JF327786 JF327788 FJ375129 FJ948860 EU082214 FJ973558 FJ973560 FJ973559 NC_012564 FJ948861 JN086998 GQ867666 GQ867667 FJ973562 HM132056 NC_012729 США NC_014358 JQ964114 JQ964116 JQ964115 KJ710645 KJ649741 KJ649742 *Полногеномные последовательности Новосибирских изолятов HBoV 65 Рисунок 16. Филограмма полногеномных последовательностей (не включающих нетранслируемые 5'- и 3' – области) изолятов бокавирусов, построенная методом максимального правдоподобия, в узлах указаны статистические индексы поддержки. Черными кружками отмечены изоляты бокавирусов, выявленных в Новосибирске 66 Из филогенетического дерева (рисунок 16) следует, что нуклеотидная последовательность новосибирского изолята HBoV1 RUS-NSC10-N1117 образует общий кластер с изолятами HK10 (EF450726) и TUN2207 (JF327786), выделенными соответственно в 2005 г. в Гонконге и в 2010 г. в Тунисе. Новосибирские изоляты HBoV2 (RUS-Nsc10-N386 и RUS-Nsc10N751) группируются со штаммами W298 (FJ948860) и W208 (EU082214), выделенными в 2001 г. в Австралии [Arthur et al., 2009]. Филогенетический анализ полногеномной последовательности изолята HBoV3 (RUS-NSC11N2512) подтвердил ее принадлежность к HBoV3, однако эта последовательность находится на отдельной ветке. Наиболее близкой к геномной последовательности новосибирских изолятов HBoV4 (RUS NSC11N2655 и RUS-NSC11-N2657) является геномная последовательность HBoV4NI-385 (FJ973561), выделенная в 2007 г. в Нигерии. Приведенная на рисунке 16 топология филогенетического дерева подтвердилась и при его построении с помощью метода ближайших соседей [Saitou et al., 1987] (данные не приведены). Изолят HBoV1 RUS-NSC10-N1117 имеет наименьшее генетическое отличие (0,001 замен на сайт) от изолятов TUN2207 и HK10 при исследовании всех последовательности 117 изолятов изолята HBoV1. RUS-NSC10-N1117, В нуклеотидной выявленного в Новосибирске в октябре 2010 г., было обнаружено 9 замен относительно последовательности наиболее генетически близкого изолята TUN2207, выявленного в феврале 2010 г. в Тунисе. Можно отметить, что одна значимая замена присутствует в ОРТ1 (His115 → Pro), три значимых замены имеются в ОРТ2 (Glu46 → Gln, Ile58 → Val, Ser79 → Asp), в ОРТ3 обнаружена одна значимая замена (Trp173 → Gly). Самыми консервативными были последовательности ОРТ1 и ОРТ3, с показателем изменчивости 0,05×10 -2 замен/сайт. Наименее консервативной 67 последовательностью оказалась последовательность ОРТ2 с показателем изменчивости 0,75×10 -2 замен/сайт (таблица 5). При сравнении нуклеотидных последовательностей изолятов HBoV2, выявленных в Новосибирске, последовательностью изолята с наиболее W208 генетически HBoV2 выявлено, близкой что в последовательности изолята HBoV2 RUS-NSC10-N386 имеются 24 замены относительно W208, при этом только 2 из них, находящиеся в ОРТ3, являются значимыми: Asp68→Asn и Glu494→Ala в VP1, что приводит к изменению заряда в данных сайтах. Нуклеотидная последовательность изолята HBoV2 RUS-NSC10-N751 содержит 26 замен, из которых 3 являются значимыми. Таблица 5. Показатели попарной изменчивости нуклеотидных последовательностей изолятов HBoV, выявленных в Новосибирске, относительно наиболее гомологичных последовательностей HBoV соответствующих генотипов Изолят ОРТ1 ОРТ2 ОРТ3 Вся послед-ть Сравнение с HBoV1 (JF327786) HBoV1 RUSNSC10-N1117 0,05 ×10-2 0,75×10-2 0,05×10-2 замен/сайт замен/сайт замен/сайт Сравнение с HBoV2 (EU082214) 0,17×10-2 замен/сайт HBoV2 RUSNSC10-N386 HBoV-2_RUSNSC10-N751 0,36×10-2 0,31×10-2 0,55×10-2 замен/сайт замен/сайт замен/сайт -2 -2 0,26×10 0,77×10 0,60×10-2 замен/сайт замен/сайт замен/сайт Сравнение с HBoV3 W471 (EU918736) 0,47×10-2 замен/сайт 0,51×10-2 замен/сайт HBoV3_RUSNSC11-N2512 0,52×10-2 замен/сайт 9,76×10-2 замен/сайт 4,32×10-2 замен/сайт HBoV3 RUSNSC11-N2512 HBoV4 RUSNSC11-N2655 HBoV4 RUSNSC11-N2657 Сравнение с HBoV4 NI385 (FJ973561) 5,94×10-2 замен/сайт -2 -2 2,44×10 2,97×10-2 2,03×10 замен/сайт замен/сайт замен/сайт 2,14×10-2 2,28×10-2 4,31×10-2 замен/сайт замен/сайт замен/сайт 2,68×10-2 замен/сайт 3,46×10-2 замен/сайт 0,46×10-2 замен/сайт 68 В дополнение к двум заменам в ОРТ3, аналогичным вышеописанным, имеется замена в ОРТ1: Cys82→Tyr в белке NS1. Для изолята HBoV2 RUSNSC10-N386 самой консервативной была последовательность ОРТ2 с показателем изменчивости 0,31×10-2 замен/сайт, в то время как для изолята HBoV2 RUS-NSC10-N751 этот показатель составил 0,77×10-2 замен/сайт (таблица 5). Самой консервативной последовательностью для изолята HBoV2 RUS-NSC10-N751 была последовательность ОРТ1, с показателем изменчивости 0,26×10-2 замен/сайт, а для изолята HBoV2 RUS-NSC10-N386 этот показатель был выше и составил 0,36×10-2 замен/сайт. В аминокислотных последовательностях ОРТ1 и ОРТ2 изолята HBoV-3 RUS-NSC11-N2512 было обнаружено последовательности наиболее 4 генетически замены близкого относительно изолята W471, выявленного в июле 2008 г. в Австралии, при этом все они являются значимыми: Ala637→Thr в NS1 (ОРТ1), His32→Arg, Ser59,146→Asn в NP1 (ОРТ2). В аминокислотной последовательности ОРТ3 было обнаружено 19 замен относительно последовательности изолята HBoV4-NI-385, выявленного в апреле 2007 года в Нигерии. Можно отметить, что 12 замен в ОРТ3 являются значимыми: Ala40→Ser, Asp142→Gly, Met144→Ala, Gly146→Glu, Tyr386→Phe, Asn409→Gly, Ala421→Gln, Ala450→Ser, Phe519→Tyr, Asn593→Thr и Thr653→Val в VP1. Изоляты Новосибирска HBoV4 и RUS-NSC11-N2655 продемострировали 99% RUS-NSC11-N2657 идентичность из нуклеотидных последовательностей между собой, и 96%-97% идентичность с изолятом HBoV4-NI-385 из Нигерии. Изолят HBoV4 CMH-S011-11 из Тайланда обнаружил 95% сходство с новосибирскими изолятами, принадлежащими к HBoV4 по геномной последовательности и 98%-99% идентичность по последовательности ОРТ3. Для новосибирских изолятов HBoV4 самыми консервативными были последовательности ОРТ1 с показателями изменчивости относительно референсного изолята HBoV4-NI-385 2,0×10-2 замен/сайт и 2,14×10-2 замен/сайт соответственно (таблица 5). 69 Анализ нуклеотидного состава показал, что во всех геномах наблюдалось значительное преобладание аденина (среднее значение равно 33%) и низкое содержание гуанина (среднее значение – 21,4%). Содержание цитозина близко к гуанину (среднее значение – 20,1%). Содержание тимина близко к 26% (среднее значение – 25,5%). Различия нуклеотидного состава среди представителей четырех анализируемых генетических вариантов вируса обнаружены не были (рисунок 17). GC-содержание для всех 6 геномов варьировало в пределах от 40,4% до 42,3%, что характерно для всех генотипов HBoV. Рисунок 17. Нуклеотидный состав анализируемых геномов HBoV Для всех ОРТ вариантов HBoV было определено количество транзиций, трансверсий, а также подсчитано их отношение. Проводилась статистическая транзиций к обработка трансверсиям коэффициента (рисунок 18). R=Si/Sv отношения Среднее значение числа этого коэффициента составляло 3,3. Среди всех секвенированных ОРТ HBoV 70 ближе всех к этой величине было значение коэффициента R=Si/Sv, определенное для ОРТ1. Рисунок 18. Отношение числа транзиций и трансверсий в ОРТ исследуемых геномов HBoV 3.4. Анализ рекомбинационных событий в геномах HBoV При построении деревьев на основе аминокислотных последовательностей вирусных белков изучаемых изолятов HBoV были отмечены отличия в топологии деревьев, построенных для разных ОРТ в случае изолятов HBoV2 и HBoV3 (рисунок 19), что можно объяснить их 71 А Б В Рисунок 19. Филограммы нуклеотидных последовательностей (А – ОРТ1, Б – ОРТ2, В – ОРТ3) изолятов бокавирусов, построенные методом максимального правдоподобия, в узлах указаны статистические индексы поддержки. Черными кружками отмечены изоляты бокавирусов выявленных в Новосибирске 72 происхождением в результате рекомбинации [Fu et al., 2011; Kapoor et al., 2009; Kapoor et al., 2010; Cheng et al., 2011; Babkin et al., 2013]. Так, хотя филогенетический анализ полногеномной последовательности подтвердил принадлежность новосибирского изолята RUS-NSC11-N2512 к HBoV3 (рисунок 16), при филогенетическом анализе отдельных ОРТ наблюдалась сложная картина. На деревьях, построенных на основе ОРТ1 и ОРТ2, этот изолят показывал значительное сходство с шестью близкородственными штаммами генотипа HBoV3, в то время как при анализе ОРТ3 он с высокой достоверностью кластеризовался с изолятами HBoV4 (рисунок 19). Для ОРТ1 уровень идентичности изолята RUS-NSC11-N2512 с изолятом TU-A-210-07 HBoV3 составил 99,5%, с остальными пятью изолятами кластера – 99,3%-99,4%. Для ОРТ2 значения идентичности составили 99,6% между изучаемым новосибирским изолятом и TU-A-210-07, и 99,5% в случае остальных пяти изолятов. Уровень идентичности ОРТ3 между изолятами HBoV3 RUS-NSC11-N2512 и TU-A-210-07 HBoV3 составил всего 89,9%, а наибольшее сходство изучаемого изолята наблюдалось с изолятом HBoV4 CMH-S011-11 – 96,4%. Этот факт свидетельствует о рекомбинанационном происхождении изолята HBoV3 RUS-NSC11-N2512. Для исследования новосибирских рекомбинационных изолятов был проведен событий анализ их в геномах геномных последовательностей в пакете программ RDP, при использовании различных методов - RDP, GeneConv, BootScan, SiScan и др. Анализ не выявил значимых рекомбинационных событий в геномах новосибирских изолятов HBoV4. Отдельные методы показывали возможность рекомбинации в этих изолятах, но надежность этих событий была невысока и не поддерживалась анализом, проведенным другими методами. Проведенный анализ точек рекомбинации в геноме изолята HBoV3 RUS-NSC11-N2512 в пакете программ RDP при использовании метода BootScan с высокой надежностью 73 выявил существование сайта рекомбинации в районе 3270 н.о. в геноме этого изолята. Этот район имеет координаты 3250-3290 при отсечении 70% и расположен в начале гена, кодирующего белок VP1. Проведенное исследование выявило еще один небольшой район 4150-4260 н.о. в центральной части гена, кодирующего Bootstrap support (%) белок VP1, имеющий значимое сходство с геномом HBoV3 (рисунок 20). HBoV3 RUS-Nsc11-N2512 scanned against HBoV4CMH-S011-11 HBoV3TU-A-210-07 100 HBoV1LWK 75 Bootstrap cutoff of -70% 50 NS1* VP1 NP1 NS1 25 VP2 FJ973562 1 4972 bp 1236 2473 3710 4946 Позиция в выравнивании Рисунок 20. Bootscan анализ генома изолята RUS-NSC11-N2512 с референсными изолятами HBoV генотипов 1, 2 и 3. Серые стрелки показывают ОРТ HBoV 3.5. Оценка скорости молекулярной эволюции HBoV Для дальнейшего анализа кроме полных геномных последовательностей шести изолятов HBoV, выделенных в Новосибирске, также использовали полные геномные последовательности девяти штаммов HBoV разных генотипов с известными данными о времени их изоляции (таблица 4). В анализ не вошли последовательности штаммов, точное время изоляции которых не известно. Кроме того, из анализа были исключены последовательности изолятов HBoV2 и HBoV3, поскольку при формировании этих генотипов важную роль играли рекомбинационные процессы. Таким образом, эволюционную историю бокавирусов реконструировали на основе последовательностей HBoV1, HBoV4 и GBoV1. 74 Вначале полные геномные последовательности этих бокавирусов были проверены на наличие сайтов рекомбинации в пакете программ RDP3, при этом вероятность потенциальных рекомбинационных событий оказалась низкой. Средние значения отношения dN/dS (ω) составили 0.14 в случае ОРТ1, 0.33 - для ОРТ2 и 0.13 - для ОРТ3. Анализ выявил, что все гены находятся под действием консервативной селекции, так как во всех случаях ω < 1. Более того, методы SLAC и PARRIS, использованные для обнаружения посайтового селективного давления, не выявили позитивной селекции (p< 0.1). Полученные результаты свидетельствуют о возможности проведения эволюционного анализа на основе данных последовательностей. Реконструкция молекулярной эволюции осуществлялась с использованием программы Beast на основе известных дат изоляции штаммов бокавирусов. В качестве изначальной была использована скорость эволюции данных вирусов 8.6×10-4 замен на сайт в год (95% HPD: 3.5– 15.0×10-4), ранее установленная в работе Zehender и др. [Zehender et al., 2010] на основе фрагмента ОРТ3. На первом этапе была оценена приемлемость гипотезы строгих молекулярных часов для проводимого эволюционного анализа бокавирусов с помощью теста отношения правдоподобия [Huelsenbeck and Rannala, 1997]. На его основе был сделан вывод о необходимости использования релаксированных лог-нормальных часов для датирования молекулярной эволюции бокавирусов. Поэтому для анализа была использована HKY+Γ модель эволюции, предварительно выбранная в программе Modeltest 3.7. Известно, что эта модель наиболее четко описывает изменчивость в кодирующих последовательностях геномов [Shapiro et al., 2006]. При анализе хронограммы, основанной на полногеномных нуклеотидных последовательностях бокавирусов (рисунок 21), можно заключить, что HBoV4 отделился от HBoV1 около 200 лет назад, а GBoV1, изолированный от гориллы, содержащейся в неволе, в США, дивергировал от HBoV1 позднее. К сожалению, надежность положения ветви GBoV1 весьма 75 низка (апостериорная вероятность около 60%) в отличие от остальных узлов, для которых значения апостериорной вероятности более 95%. При анализе скоростей эволюции можно отметить, что для разных ветвей она варьирует в пределах одного порядка величины и составляет от 1.6×10 -4 до 1.6×10-3 замен на сайт в год. Эти величины соответствуют скоростям накопления мутаций, ранее полученным в работе Zehender и др. [Zehender et al., 2010]. В работе [Sharp et al., 2010] авторы выявили бокавирусы в образцах фекалий диких горилл и шимпанзе из Камеруна в 2009 году. Были получены данные о нуклеотидной структуре "бокавирус-подобных" вирусов: Рисунок 21. Хронограмма, построенная на основе нуклеотидных последовательностей полных геномов различных генотипов HBoV (обозначения штаммов приведены в таблице 4). Времена дивергенции оценены с использованием программы Beast. Значения времен дивергенции в годах приведены в узлах дерева четырех фрагментов ОРТ1 (два от горилл – GG-GB2155, GG-CP1426 и два от шимпанзе – PT-BQ2392, PT-LM1861) и трех фрагментов ОРТ3 (для тех же изолятов, за последовательности исключением также были 76 изолята использованы GG-GB2155). в Эти эволюционном исследовании HBoV. С учетом этих последовательностей, последовательностей всех генотипов HBoV и бокавируса гориллы GBoV1 [Kapoor et al., 2010a] (таблица 4) были построены выравнивания для изучаемых фрагментов ОРТ1 и ОРТ3. Полученные выравнивания были протестированы на наличие потенциальных сайтов рекомбинации в пакете программ RDP3. Было показано, что в случае фрагмента ОРТ3 рекомбинация не выявляется, а для фрагмента ОРТ1 она детектируется с низкой надежностью только одной из девяти программ пакета RDP3. Дополнительно данные фрагменты тестировались на возможность адаптивной селекции. Не было обнаружено ни одного сайта, находящегося под позитивным отбором. Данный факт, а также отсутствие достоверных сайтов рекомбинации в изучаемых геномных фрагментах позволили провести реконструкцию эволюционной истории бокавирусов. Для этого были построены хронограммы при использовании метода Байеса и Марковских цепей по методу Монте-Карло в пакете программ Beast (рисунки 22 и 23). Исследование было основано на известных датах изоляции штаммов и скорости эволюции данных вирусов как описано выше. Были использованы релаксированные лог-нормальные молекулярные часы. Установлено, что средняя скорость эволюции для обоих деревьев составила около 9×10-4 замен на сайт в год. При анализе построенных хронограмм можно заключить, что на обоих деревьях изоляты HBoV кластеризуются в соответствии с их генотипом с высокой надежностью. При этом HBoV3 на дереве, построенном на основе фрагмента ОРТ1 (рисунок 22), группируется с 77 Рисунок 22. Хронограмма, построенная на основе нуклеотидных последовательностей фрагмента ОРТ1, кодирующего NS1, различных генотипов HBoV (обозначения штаммов приведены в таблице 4). Времена дивергенции оценены с использованием программы Beast. Значения времен дивергенции в годах приведены в узлах дерева. Апостериорные вероятности группировки в клады, отмеченные звездочкой, больше 98%. Штаммы бокавирусов шимпанзе отмечены треугольниками, а бокавирусов горилл – кружками 78 Рисунок 23. Хронограмма, построенная на основе нуклеотидных последовательностей фрагмента ОРТ3, кодирующего VP1, различных генотипов HBoV (обозначения штаммов приведены в таблице 4). Времена дивергенции оценены с использованием программы Beast. Значения времен дивергенции в годах приведены в узлах дерева. Апостериорные вероятности группировки в клады, отмеченные звездочкой, больше 90%. Штаммы бокавирусов шимпанзе отмечены треугольниками, а бокавирусов горилл – кружками HBoV1, а для дерева, построенного на основе фрагмента ОРТ3 (рисунок 23), с HBoV4. Необходимо отметить, что апостериорные вероятности этих 79 группирований ниже 90%. Все последовательности изолятов бокавируса гориллы из США и из Камеруна показывают высокую гомологию между собой и образуют общую кладу с HBoV1 на обоих деревьях. В то же время изоляты бокавируса шимпанзе значительно отличаются друг от друга. Изолят PT-BQ2392 в обоих случаях группируется с HBoV1 с высокой надежностью, в то время как штамм PT-LM1861 с высокой достоверностью кластеризуется с HBoV1 только на хронограмме, созданной на основе фрагмента ОРТ1. Достоверность его положения на другом дереве низкая. Анализируя времена дивергенции предков современных генотипов бокавирусов приматов, можно отметить, что времена дивергенции HBoV1 и HBoV4, а также изолятов бокавируса горилл и HBoV1 от общих предков хорошо согласуются между собой на обеих полученных хронограммах. 3.6. Исследование особенностей репликации HBoV Ранее при изучении особенностей репликации HBoV были обнаружены структуры интермедиатов типа «голова к хвосту» у HBoV1, HBoV2 и HBoV3, porcine bocaviruses и canine bocavirus, при этом структуры типа «голова к голове» или «хвост к хвосту» у этих вирусов обнаружены не были, что могло свидетельствовать о механизме репликации бокавирусов, отличающимся от других парвовирусов [Cheung et al., 2010; Cheng et al., 2010; Kapoor et al., 2011; Lüsebrink et al., 2011; Zhao et al., 2012; Huang et al., 2012]. Для изучения возможных механизмов репликации бокавирусов, включая HBoV4, репликационные интермедиаты которого не исследовались, мы попытались получить репликативные интермедиаты HBoV4 и других HBoV. Для секвенирования концевых районов новосибирских изолятов HBoV4 и обнаружения возможных конкатомерных и эписомальных форм геномов вирусов мы использовали набор праймеров, рассчитанный на основе последовательностей новосибирских изолятов HBoV4 (таблица 6) и консервативный для всех генотипов HBoV. Прямые праймеры были 80 рассчитаны на основе 3’-конца HBoV4, а обратные – 5’-концевой последовательности генома. Цифры в названии праймера соответствуют шагам гнездового ПЦР. Таблица 6. Праймеры, используемые для обнаружения предполагаемых промежуточных структур Праймеры Последовательности (5’–3’) Первый раунд гнездовой ПЦР F1+ GGGTGACTGTAATCCCGAGCTCAT F1ACGAATATTCAAGGAGAGGTTACCTGTT R1+ AGTCTGACGAGATGCGGAAGTGC R1GGTCTCTACAAGTGAGCGGCCTCT Второй раунд гнездовой ПЦР F2+ GTGTTGCCGTCTCGAACCTAGC F2TCCGATGTCAGGCTACCGTCAC R2+ TACGTCACTTCCTGGGCGTGTT R2ATATATCCGATATACGAGTTACGACTAACC «+» - прямой праймер; «-» - обратный праймер; «F» - последовательность праймера, соответствующая ориентации «голова»; «R» - последовательность праймера, соответствующая ориентации «хвост» Праймеры были проверены во всех возможных сочетаниях «голова»/«хвост» методом гнездовой ПЦР с использованием в качестве матрицы ДНК изолятов HBoV4 RUS-NSC11-N2655 и RUS-NSC11-N2657. В результате было показано, что ПЦР-продукт нарабатывается только при использовании праймеров F+/R+ на матрице RUS-NSC11-N2657, что соответствует кольцевой последовательности отрицательной полярности в ориентации «голова к хвосту» (рисунок 24). Все минорные фрагменты, полученные в ходе ПЦР, также были секвенированы. Обнаружено, что они образуются вследствие ошибочного праймирования и не содержат концевых последовательностей генома HBoV. Дополнительно аналогично были проанализированы новосибирские изоляты других генотипов HBoV - HBoV1 (RUS-NSC10-N1117), HBoV3 81 1kb «хвост к хвосту», R(+)/R(-) «голова к хвосту», F(-)/R(-) «голова к хвосту», F(-)/R(+) «голова к хвосту», F(+)/R(-) «голова к хвосту», F(+)/R(+) «голова к голове», F(+)/F(-) 100bp 2000 1500 1000 750 1000 800 700 600 500 400 300 500 250 200 100 Рисунок 24. Пример продуктов гнездовойПЦРсо всеми возможными комбинациями пар праймерами. Стрелка указывает на фрагмент, который содержал последовательность HBoV4 «голова к хвосту» (RUS-NSC11-N2512) и два изолята HBoV2 (RUS-NSC10-N386 и RUS-NSC10N751 с использованием вышеописанных праймеров (таблица 6). ПЦРфрагменты, соотетствующие формам вирусного генома в ориентации «голова к голове» или «хвост к хвосту»для всех проанализированных изолятов выявлены не были. При использовании в ПЦР ДНК изолята HBoV2 RUSNSC10-N386 и праймеров F+/R+(«голова»/«хвост») были обнаружены структуры, соответствующие форме с ориентацией «голова-к-хвосту» (данные не приводятся). На следующем этапе ампликон, полученный на ДНК матрице изолята HBoV4 RUS-NSC11-N2657 и содержащий последовательность «голова к хвосту» (рисунок 24), был клонирован в pGEM-T вектор. Затем было проведено определение нуклеотидной последовательности полученных 82 клонов (рисунок 25). Полученные последовательности некодирующих районов вирусных геномов, включающие структуры «голова к хвосту» и имеющие длину 542 н., демонстрируют высокий уровень гомологии - 99, 2% (были обнаружены 6 нуклеотидных замен). Аналогичным способом были получены рекомбинантные клоны, содержащие последовательности некодирующих районов эписомальной формы изолята HBoV2 RUS_NSC_10-N386. Нуклеотидные последовательности шести клонов №13, 21, 22, 23, 24 и 25 были секвенированы. Протяженность полученных фрагментов составила 579 н. (рисунок 26). В случае клонов №13, 22 и 25 не было обнаружено различий в нуклеотидных последовательностях, в трех других клонах были выявлены единичные нуклеотидные замены (SNP), и уровень идентичности между ними варьировал от 99,1% до 99,6%. При сравнении последовательностей некодирующих районов изолята HBoV2 RUS_NSC_10-N386 и ранее описанного для изолята HBoV2 BJQ435 [Zhao et al., 2012] можно отметить их значительные отличия. Уровень идентичности составил от 83,6 % до 83,9% (рисунок 26). Для сравнительного изучения свойств концевых последовательностей HBoV было построено выравнивание некодирующих районов вирусных геномов двух изучаемых последовательностей клонов 10 и 13 изолята HBoV4 RUS-NSC11-N2657, а также последовательностей HBoV1, HBoV2, и HBoV3. (Последовательности концевых участков геномов других изолятов HBoV4, кроме определенных в данной работе, отсутствуют.) При филогентическом анализе можно заключить, что концевые некодирующие районы генома исследуемого изолята HBoV4 RUS-NSC11-N2657, с высокой надежностью группируются с таковыми HBoV2 (рисунок 27). 83 Tail Clone TTTCTTAAGCCTCTTTATTGCTTACGCTTATAAGTTCCCCCCCAATGGACAAGTGGAAAAС ............................................................. ............................................................. ............................................................. 10 13 27 26 CCAGGGTGACTGTAATCCCGAGCTCATGAGTTCGAGGATAGGGGCCGATGGCAGTGGTGТT ............................................................. ............................................................. ............................................................. 10 13 27 26 GCCGTCTCGAACCTAGCCGTTACACCCTTGTGCATTGTGGGAGGAGCTGTTTTGCTTACGC .................................T........................... ............................................................. ............................................................. 10 13 27 26 AACCGCGAAATTTTATATATTTAGTGTAGTGTTGTACTACGTCGGCCATCTTAGTTATATA ................................................C............ ............................................................. ............................................................. 10 13 27 26 TCAGGCGCCGCCTTAGTTACGTCACGATAAAATGTTATATAACTAAGGCGGCGCATGATAT ...T.............................................T........... ............................................................. ............................................................. 10 13 27 26 ATAACTAAGATGGCCGACGTAGTACGACACTACACTAAATATATAAATATTCACAAGGAGG .........................A................................... .........................A..G................................ .........................A................................... 10 13 27 26 AGTGGCTACGTATGGGGTGATCATAAACACGCCCAGGAAGTGACATATGTCAACCAATCAG ............................................................. ............................................................. ............................................................. 10 13 27 26 CATCGAGCATATATCCTATATAAGCCGATGCACTTCCGCATCTCGTCAGACTGCATCCGAT ............................................................. ............................................................. ............................................................. 10 13 27 26 CTCCGGCGAGTGAACATCTCTGGGAAGAGCTCCACGCACGTGGTGAGTGACACT ...................................................... ...................................................... ...................................................... Head 10 13 27 26 Рисунок 25. Выравнивание нуклеотидных последовательностей нетранслируемых концевых регионов геномов отдельных клонов изолята HBoV4 RUS-NSC11-N2657 84 Tail Clone Tctcttaagcccgttcattgcttatgcttataagttcctctccaatggacaagaggaaagagaag BJQ435 ...........t.................................................a... 25 ...........t.................................................a... 21 ...........t.................................................a... 23 ...........t.................................................a... 24 Ggtgactgtaatcccgagctcataagttcgagactacagtccgatggcagtggtgttgccgtctc BJQ435 ......................g........g................................. 25 ......................g........g................................. 21 ......................g........g................................. 23 ......................g........g................................. 24 Gaacctagccgttacacccttgtgcattgtgggaggagctgttttgcttacgcaatcgcgaaatt BJQ435 .......................................................c......... 25 .......................................................c......... 21 .......................................................c......... 23 .......................................................c......... 24 ttatatatttaatgtagtgt----------------------attagatcatgcgc--------- BJQ435 ....................tgtattattttatatgtgacgctg...ca.tga...catcttgga 25 ....................tgtattattttatatgtgacgttg...ca.tga...catcttgga 21 ....................tgtattattttatatgtaacgttg..aca.tga...catcttgga 23 ....................tgtattattttatatgtgacgctg...ca.tga...catcttgga 24 ---------------------------gcgcgcagcg-cgctgcgcgaagcgcaggcatgactga BJQ435 atccaatatgtccgccggctcagtcat..ct..gctt-..ac.....ct..--gc......tct. 25 atccaatatgtccgccggctcagtcat..ct..gctt-..ac.....ct..--gc......tct. 21 atccaatatgtccgccggctcagtcat..ct..gctt-..ac.....ct..--gc......tct. 23 atccaatatgtccgccggctcagtcat..ct..gcttg.agc.....ct..--gc......tct. 24 ---gccggcggacatattggattccaagatggcgtcagtgctacaacgtcacatataaaataata BJQ435 atc.............................................................. 25 atc...............................................g.............. 21 atc.............................................................. 23 atc.............................................................. 24 aatattcacaaggaggagtggctacgtatggggtgatcataaacacgcccaggaagtgacgtatg BJQ435 ................................................................. 25 ................................................................. 21 ..................................a.............................. 23 ................................................................. 24 tcaaccaatcagcatcgagcatatatcctatataagccgatgcacttccgcatctcgtcagactg BJQ435 ...................................a............................. 25 ...................................a............................. 21 ...................................a............................. 23 ...................................a............................. 24 catccggtctccggcgagtgaacatctctaggaagagctccacgcgcgtggtgagtgacact .............................g...............a................ .............................g...............a................ .............................g...............a................ .............................g...............a................ Head BJQ435 25 21 23 24 Рисунок 26. Выравнивание нуклеотидных последовательностей нетранслируемых концевых регионов отдельных клонов изолята HBoV2 RUS_NSC_10-N386 85 HBoV2 RUS NSC 10-N386/13 HBoV2 RUS NSC 10-N386/22 100 HBoV2 RUS NSC 10-N386/25 HBoV2 RUS NSC 10-N386/21 93 HBoV2 RUS NSC 10-N386/23 HBoV2 RUS NSC 10-N386/24 99 HBoV2 BJQ435 HBoV4 RUS NSC 11-N2657/27 HBoV4 RUS NSC 11-N2657/26 100 HBoV4 RUS NSC 11-N2657/10 HBoV4 RUS NSC 11-N2657/13 HBoV3 (JN086998) HBoV1 Salvador HBoV1 Helsinki2 100 HBoV1 Bonn3 79 HBoV1 Bonn2 0.02 Рисунок 27. Филогенетическое дерево, построенное методом максимального правдоподобия на основе выравнивания нуклеотидных последовательностей концевых некодирующих районов отдельных клонов новосибирских изолятов HBoV2 RUS_NSC_10-N386, HBoV4 RUS-NSC11-N2657 и референсных изолятов HBoV. Статистическая значимость показана в узлах дерева, количество замен на сайт указанно в нижней части Важную роль в репликации HBoV играют концевые шпилечные структуры некодирующих районов, поэтому были проанализированы их вторичные структуры. Ранее были рассчитаны вторичные структуры концевых некодирующих районов HBoV2 и HBoV3 и проведено их сравнение [Zhao et al., 2012; Kapoor et al., 2011]. Аналогичным способом мы провели предсказание вторичных структур всех генотипов HBoV, включая новосибирские изоляты HBoV2 RUS_NSC_10-N386 и HBoV4 RUS-NSC11N2657. Сравнительный анализ показал, что вторичные структуры концевых некодирующих районов клонов HBoV2 RUS_NSC_10-N386 и клонов HBoV4 86 RUS-NSC11-N2657 оказалась идентичными (данные не приводятся), и поэтому далее мы приводим только структуры концевых районов клонов №25 и №10 изолятов HBoV2 RUS_NSC_10-N386 и HBoV4 RUS-NSC11N2657 соответственно (рисунок 28). Можно заключить, что наблюдаются сходные черты между всеми структурами концевых некодирующих районов четырех генотипов HBoV (рисунки 28, 29, 30). Во всех структурах выявляются протяженные шпильки, 3' концевой стебель с петлей и 5' концевой кластер стеблей и петель. Сравнительный анализ показал, что шпилька-1, имеющая структуру типа «заячье ухо» и расположенная близко к 3' концу кодирующей части генома (ген VP1), демонстрирует значительное сходство для всех четырех генотипов HBoV (рисунки 28, 29, 30). 5' концевая область различных генотипов HBoV содержит 5-8 стеблей с петлями. Между шпилькой-1 и кластером в области 5' расположена шпилька-2 у HBoV2, HBoV3 и HBoV4, в случае HBoV2 эта шпилька имеет структуру типа «заячье ухо». У изолята HBoV1 Salvador в этом районе расположены две протяженные шпильки: шпилька-2 и шпилька3 (рисунок 28). Другие изоляты HBoV1 – Bonn2, Bonn3 и Helsinki2 [Lüsebrink et al., 2011] не имеют нуклеотидных замен относительно штамма HBoV1 Salvador, однако содержат протяженные нуклеотидные делеции, расположенные в районе шпильки-2 - шпильки-3 изолята HBoV1 Salvador (рисунок 30). Это приводит к значительному уменьшению шпильки-2 и исчезновению шпильки-3 у изолятов Bonn2 и Bonn3, при этом вторичные структуры NCRs изолятов Bonn2 и Bonn3 оказались идентичными. В случае изолята Helsinki2 нуклеотидная делеция относительно изолята HBoV1 Salvador привела к исчезновению протяженных шпилек - шпильки-2 и шпильки-3 соответственно (рисунок 30). 87 Рисунок 28. Предсказанные структуры концевых некодирующих районов HBoV1 Salvador (А), HBoV4 RUS-NSC11-N2657 клон 10 (B) и HBoV2 RUS-NSC10-N386 клон 25 (C). Стрелка указывает на расположение области, содержащей гены, кодирующие NS, NP, и VP 88 Hairpin-1 Hairpin-2 5' концевая структура А Hairpin-1 Hairpin-2 5' концевая структура Б Рисунок 29. Предсказанные структуры концевых некодирующих районов HBoV3 (JN086998) (А) и HBoV2 BJQ435(Б). Стрелка указывает на расположение области, содержащей гены, кодирующие NS, NP, и VP 89 A Hairpin-1 Hairpin-2 5' концевая структура Б Hairpin-1 Рисунок 30. Предсказанные структуры концевых некодирующих районов HBoV1 Bonn3 (А) и HBoV1 Helsinki2 (Б). Стрелка указывает на расположение области, содержащей гены, кодирующие NS, NP, и VP 5' концевая структура 90 Вторичная структура NCR новосибирского изолята HBoV4 наиболее сходна с таковой HBoV3 (JN086998). При этом свободная энергия вторичной структуры dG составила -157,5 ед для HBoV4 RUS-NSC11-N2657-10; -97,3 ед для HBoV3 (JN086998); -105,6 для изолята BJQ435 HBoV2 и достигает значений -288,1 для изолята HBoV1 Salvador. Для изолятов HBoV1 Bonn и Helsinki2 показатели свободной энергии вторичной структуры значительно ниже и составляют -75,4 и -49,9. 91 ГЛАВА 4. Обсуждение результатов Клинические данные, накопленные после открытия HBoV показали, что HBoV1 является возбудителем заболеваний дыхательных путей, хотя он обнаруживается и в образцах фекалий больных с ОКИ [Allander et al., 2005; Allander et al., 2008; Vicente et al., 2007; Albuquerque et al., 2007; Santos et al., 2010; Jartti et al., 2012]. HBoV2, HBoV3, и HBoV4 в основном обнаруживаются в образцах фекалий [Jartti et al., 2012], но также могут выявляться и в назофарингальных аспиратах [Neske et al., 2007; Vicente et al., 2007]. Несмотря на множество проведенных исследований, до сих пор нет единого мнения об этиологической роли HBoV, в частности HBoV2, HBoV3, и HBoV4 в ОКИ. Разная встречаемость HBoV в различных регионах и частое выявление HBoV одновременно с другими вирусами, вызывающими ОКИ (от 20% до 80%), не позволяет сделать однозначных выводов [Albuquerque et al., 2007; Cheng et al., 2008; Wang et al., 2011; Khamrin et al., 2012a; Khamrin et al., 2012b]. В данной работе мы оценили эпидемические особенности бокавирусной инфекции в Новосибирске, генетическое разнообразие изолятов, циркулирующих в этом регионе, а также вклад рекомбинации и нуклеотидной изменчивости в молекулярную эволюцию различных генотипов бокавируса человека. По нашим результатам средняя встречаемость ДНК HBoV в образцах фекалий от Новосибирских детей с ОКИ составила 1,2%, варьируя в разные годы от 0,5% до 1,7%. Похожие результаты были получены в Таиланде и Корее, где встречаемость ДНК HBoV составила 1,2% и 2% соответственно [Phan et al., 2011]. Наиболее часто у детей в Новосибирске HBoV выявлялись в осенне-зимний период: октябре и ноябре, январе и феврале, что согласуется с результатами исследования, проведенного в Японии, где сообщается о более высокой встречаемости случаев инфицирования HBoV в зимний период [Nakanishi et al., 2009]. 92 Встречаемость ДНК HBoV в коллекции образцов от здоровых детей составила 0.3%. Следует отметить, что средний возраст в группе здоровых детей статистически значимо превышал средний возраст детей, госпитализированных с ОКИ, а известно, что чем старше пациенты, тем реже у них обнаруживается HBoV [Allander et al., 2005; Allander et al., 2007; Fry et al., 2007; Lau et al., 2007; Han et al., 2009; Noh et al., 2013; Ahn et al., 2014]. Статистически достоверных отличий встречаемости HBoV в коллекциях образцов от здоровых детей и детей, госпитализированных с ОКИ, не обнаружено (χ2=0,25, p=0,05). Отсутствие достоверно более частой встречаемости HBoV у детей с ОКИ по сравнению со здоровыми детьми также было описано ранее; в исследовании, проведенном в США, было показано, что встречаемость HBoV в коллекциях фекалий от детей с ОКИ и здоровых детей доноров составила 1,4% и 2,4% соответственно [Cheng et al., 2008]. В ходе 3-х летнего наблюдения в Новосибирске были обнаружены все известные генетические варианты HBoV, хотя и с разной встречаемостью: HBoV2B>HBoV1 >HBoV2A>HBoV4 >HBoV3, причем встречаемость HBoV2B составила 80% от общего количества HBoV2 (таблица 2). Распределение встречаемости различных генетических вариантов HBoV в разных регионах несколько отличается. Так, в аналогичном эпидемиологическом исследовании, проведенном в Японии (с января 2009 г. по январь 2010 г.), преобладающим был HBoV1, его встречаемость составила 63,6% от общего количества выявленных изолятов HBoV, а из HBoV2 был выявлен только HBoV2A [Khamrin et al., 2012b]. Большая встречаемость HBoV1 у детей с ОКИ была зафиксирована и в Таиланде: HBoV1 >HBoV2A>HBoV3 >HBoV4 [Khamrin et al., 2012a], а также в других исследованиях, проведенных в Австралии, Южной Корее, Китае [Arthur et al., 2009; Han et al., 2009; Jin et al., 2011; Wang et al., 2011]. Интересно, что в Новосибирске в 2010 г. также доминировал HBoV1, а из HBoV2 преимущественно выявлялся 93 HBoV2A (только 1 изолят, выявленный в 2010 г., принадлежал к HBoV2B). Тем не менее, в большинстве исследований показана более высокая распространенность HBoV2 у детей с ОКИ [Arthur et al., 2009; Han et al., 2009; Jartti et al., 2012]. Можно предположить, что встречаемость различных вариантов HBoV варьирует в зависимости от региона исследования и времени. Вероятно, эти различия обусловлены очень большим количеством разнообразных факторов, влияющих на распространенность инфекции (различия в климате, в иммунитете населения и др.). В начале 2011 г. в Новосибирске произошла смена доминирующего вирусного варианта HBoV: HBoV1 на HBoV2. Интересно, что одновременно HBoV2A, выявляемый в единичных случаях в 2010 г., заменился на HBoV2B, преобладавший в 2011 г., более 70% изолятов которого были выявлены в январе-феврале 2011 г. Для того, чтобы оценить вклад HBoV в этиологию ОКИ у детей, все HBoV-положительные образцы были протестированы на присутствие основных возможных возбудителей ОКИ, вирусных и бактериальных, HRVA, NoVGII, HAstV, Adenovirus F, Salmonella spp., Campylobacter spp., Shigella spp. и EIEC. Было показано, что больше половины образцов с HBoV1 содержали и другой инфекционный агент, а в более, чем половине образцов с HBoV2 других возбудителей обнаружено не было. Однако, различия во встречаемости HBoV1 и HBoV2 в качестве единственного инфекционного агента не были статистически значимыми. Следует подчеркнуть, что HBoV-положительные образцы были проверены на присутствие лишь основных возбудителей ОКИ, однако дополнительная проверка на присутствие других более редких вероятных возбудителей ОКИ скорее всего незначительно уменьшила бы количество образцов, в которых HBoV присутствует в виде единственного инфекционного агента. Поэтому мы полагаем, что и HBoV1, и HBoV2 способны вызвать ОКИ у детей в Новосибирске, хотя, в целом, вклад HBoV в этиологию ОКИ у 94 детей в этом регионе достаточно низкий. HBoV3 и HBoV4 были обнаружены в Новосибирске в единичных случаях, и, следовательно, никаких закономерностей обнаружить не удалось. Данные о возрастном распределении HBoV1 и HBoV2 у детей, госпитализированных с ОКИ, не имели статистически значимых отличий. В нашем исследовании наблюдалась практически аналогичная частота выявления HBoV у детей независимо от пола, и преимущественно этот вирус был обнаружен у детей первого года жизни, из которых более половины дети в возрасте 6-11 месяцев. Это согласуется с результатами других исследований, проведенных в разных странах мира [Yu et al., 2008; Han et al., 2009; Campe et al., 2008; Huang et al., 2009; Karalar et al., 2009; Tozer et al., 2009; Albuquerque et al., 2007]. Также это подтверждают результаты сероэпидемиологического исследования, которые показали, что у 90,5% детей в возрасте до 3-х месяцев и только у 5,6% детей в возрасте 6-8 месяцев выявляются антитела против HBoV, вероятно это связано с уменьшением количества приобретенных от матери антител [Endo et al., 2007; Kahn et al., 2008]. Однако, начиная с возраста 1 год, процент HBoV - серопозитивных пациентов увеличивается с возрастом, что, вероятно, связанно с тем, что все дети в возрасте до шести лет переносят HBoV инфекцию. Для более детального исследования молекулярно-генетических особенностей HBoV, циркулирующих в данном регионе, мы провели полногеномное секвенирование изолятов различным генетическим вариантам. HBoV, принадлежащих к Поскольку полногеномные последовательности HBoV2, HBoV3 и HBoV4 представлены в базе данных GenBank в единичных количествах, мы секвенировали полногеномные последовательности всех обнаруженных изолятов HBoV3 и HBoV4 и 2-х изолятов HBoV2. Была определена лишь одна полногеномная последовательность HBoV1, поскольку в базе данных GenBank таковых депонировано более сотни, и все они относительно консервативны. 95 Проведенное секвенирование полных геномов изолятов HBoV, выявленных в Новосибирске в 2010 г., позволило провести сравнительный генетический анализ с использованием 26 изолятов, представляющих все четыре генотипа HBoV, а также GBoV1. GBoV1 был включен в молекулярное изучение ввиду его высокой гомологии с HBoV [Kapoor et al., 2010a]. Построенный элаймент нуклеотидных последовательностей позволил установить филогенетические взаимоотношения между изолятами в изучаемом роде Bocaparvovirus. Филогения геномных последовательностей изолятов HBoV1, HBoV2 и HBoV4 выявила высокое сходство нуклеотидных последовательностей изолятов из различных географических областей, относящихся к одному генотипу HBoV бокавируса. Изолят HBoV3 RUS_NSC_11-N2512, как оказалось, является рекомбинантным, возникшим в результате рекомбинации между генотипами HBoV3 и HBoV4. Известно, что накопление мутаций в геноме являются одним из основных механизмов, обеспечивающих генетическую изменчивость вирусов. Скорость накопления мутаций в геномах изучаемых HBoV оказалась сравнительно высокой, сходной со скоростью накопления мутаций в геномах РНК-содержащих вирусов [Duffy et al., 2008]. Этот факт также был отмечен ранее [Zehender et al., 2010]. Показатели попарной изменчивости нуклеотидных последовательностей изолятов HBoV, выявленных в Новосибирске, оказались наименьшими у изолята HBoV1, а наибольшими – у изолятов HBoV3 и HBoV4. На основе выравнивания последовательностей были определены значения отношений (ω) числа несинонимичных замен к числу синонимичных замен. Анализ выявил, что все ОРТ проанализированных изолятов HBoV находятся под действием консервативной селекции, так как во всех случаях ω<1. Вместе с тем, некоторые из несинонимичных замен привели к смене класса аминокислотного остатка и, следовательно, могли привести и к изменению физико-химических свойств вирусных 96 белков в данных сайтах. Однако, этот вопрос нуждается в дополнительных исследованиях. Другим основным механизмом, обеспечивающим генетическую изменчивость вирусов, является рекомбинация. При этом рекомбинация позволяет вирусам быстро изменить свои свойства и обеспечивает быструю эволюционную приспособляемость, невозможную в случае только мутационной изменчивости. Поиск возможных рекомбинационных событий в эволюции HBoV с помощью программ, входящих в пакет RDP3, показал, что все они с высокой вероятностью выявили сайты рекомбинации в геномах HBoV2 и HBoV3. Это подтверждает ранее сделанное другими исследователями заключение, что HBoV3 представляет собой рекомбинант HBoV1 и HBoV2 (с использованием программы SimPlot) [Kapoor et al., 2010b] или по другим данным - изолятами HBoV1 и HBoV4 (при помощи программ SimPlot, RDP3 и GARD) [Cheng et al., 2011]. Происхождение HBoV2 ряд исследователей связывает с рекомбинации между изолятами HBoV1 и HBoV4 [Fu et al., 2011; Kapoor et al., 2009; Kapoor et al., 2010a; Song et al., 2010]. При полногеномном секвенировании новосибирских изолятов HBoV было обнаружено, что изолят HBoV3 RUS_NSC_11-N2512 с высокой долей вероятности возник в результате рекомбинации между геномной ДНК HBoV, принадлежащих к генотипам HBoV3 и HBoV4 (координата сайта рекомбинации - около 3270 н.). Было установлено, что геном изолята RUS_NSC_11-N2512 относится к HBoV3, однако значительную часть гена, кодирующего VP1 белок, этот изолят приобрел от генотипа HBoV4. При исследовании последовательности генома в районе сайта рекомбинации было обнаружено, что перед ним находится район (координаты 3133-3223 н.) с самым низким содержанием GC в геноме, которое составляет 20.8%. На протяжении следующих 90 н. (координаты 3224-3313) находится область с высоким GC-составом: содержание 97 GCсоставляет 47,7%; эти значения достикают самых больших по геному величин – 80.0% сразу за точкой рекомбинации в районе 3272-3291. Для исследования природы «горячей» точки рекомбинации мы рассчитали вторичную структуру геномов различных бокавирусов с помощью онлайн ресурса mfold (http://mfold.rit.albany.edu/?q=mfold/DNAFolding-Form). При этом в данном районе не было найдено заметных отличий во вторичной структуре генома от других районов вирусного генома. Проведенный дополнительный анализ двадцати полногеномных последовательностей различных изолятов HBoV, относящихся к четырем генотипам, выявил сходную картину распределения GC-состава в районе горячей точки рекомбинации. Возможно данные последовательности, сначала с низким, а затем с высоким GC-составом, провоцируют диссоциацию ДНК-полимеразы от генома и переключение на другую матрицу. Рекомбинация в данном районе вирусного генома происходит вне генов, кодирующих белки NS1 и NP1, что также может быть следствием селективного отбора. Ранее было показано, что генотип HBoV3 возник в результате рекомбинации между HBoV1 и HBoV4, произошедшей в том же районе генома [Cheng et al., 2011]. В случае новосибирского изолята произошла повторная рекомбинация, «обновившая» фрагмент ОРТ3, кодирующий VP1, от генотипа HBoV4. Сходная картина наблюдалась и в случае других изолятов, для которых было показано недавнее происхождение в ходе рекомбинации. Так, изолят HBoV4 CMH-S011-11 из Тайланда произошел в результате недавней рекомбинации между HBoV2 и HBoV4 [Fu et al., 2011]. При этом рекомбинация произошла в том же районе вирусного генома, что и в случае новосибирского изолята и привела к захвату ОРТ3 от генотипа HBoV4. Можно предположить, что стратегия заимствования ОРТ, кодирующей структурные белки, от редкого генотипа способствует закреплению рекомбинантного изолята в популяции, т.к. при этом вирусы получают преимущество в преодолении иммунного барьера хозяина. 98 При сравнении полученных данных с ранее опубликованными можно заключить, что обнаруженная точка рекомбинации является «горячей» точкой, наиболее часто встречающейся у других бокавирусов [Cheng et al., 2011; Fu et al., 2011; Kapoor et al., 2009; Kapoor et al., 2010; Khamrin et al., 2013]. Ранее Lefeuvre и др. провели анализ вирусов из семейства Parvoviridae, относящихся к родам Parvovirus, Dependovirus и Erythrovirus [Lefeuvre et al., 2009], при этом были обнаружены две «горячие» точки рекомбинации – одна в конце гена, кодирующего белок NS1, а другая в 5'-области гена, кодирующего белок VP1. Вторая точка рекомбинации совпадает с доминирующей точкой рекомбинации бокавирусов. Однако бокапарвовирусы, к которым принадлежит HBoV, отличаются от других членов семейства Parvoviridae наличием между генами NS1 и VP1 дополнительной ОРТ, кодирующей белок NP1. Повидимому, это обусловило исчезновение точки рекомбинации в конце гена, кодирующего белок NS1, в случае бокавирусов. Уникальный белок NP1 бокавирусов не имеет какого-либо сходства с другими белками парвовирусов. Более того, С-конец белка NS1 бокавирусов не имеет сходства соответствующими c последовательностями других парвовирусов. Наличие бόльшего числа полногеномных последовательностей изолятов HBoV с известными датами обнаружения позволило проанализировать скорости накопления мутаций в геноме Известно, что рекомбинационные события могут HBoV. мешать филогенетической реконструкции и изучению эволюции вирусного генома, поэтому анализ скорости накопления мутаций был проведен на основе полногеномных нуклеотидных последовательностей HBoV1, HBoV4 и GBoV1, поскольку в геномах HBoV2 и HBoV3 были обнаружены рекомбинационные перестройки. Анализ построенной хронограммы показал, что разделение современных штаммов HBoV1 произошло за последние 3 десятилетия. Например, новосибирский изолят HBoV1 99 RUS_NSC_10-N1117 отделился от изолята TUN2207 из Туниса сравнительно недавно, лишь несколько лет назад. Можно отметить, что наибольшие значения скорости накопления мутаций наблюдаются в узлах дивергенции новых генотипов HBoV, что совпадает с рассчитанными нами величинами показателей попарной изменчивости нуклеотидных последовательностей изолятов HBoV, выявленных в Новосибирске. Интересным представляется факт высокого уровня гомологии последовательности генома GBoV1 и HBoV. Следует отметить, что одновременно с публикацией наших результатов вышла публикация, авторы которой предложили включить HBoV (бокавирус гориллы) в один вид, Primate bocaparvovirus 1, наряду с HBoV1 и HBoV3 [Cotmore et al., 2014]. В целом, вопрос о происхождении HBoV остается открытым. Произошли ли 1-й и 4-й генотипы независимо от бокавирусов обезьян, или, наоборот, HBoV адаптировался к приматам путем заноса в дикую природу от человека остается неясным. В первом случае можно предположить, что HBoV - сравнительно молодой вирус, появившийся от 30 до 80 лет назад. Во втором случае мы можем только постулировать, что HBoV возник более 200 лет назад. В любом случае можно предположить, что этот вирус имеет зоонозное происхождение. Недавно были установлены нуклеотидные структуры бокавирусов свиней (PBoV), выделенные от домашних свиней [Cheng et al., 2010]. Оказалось, что по одному из районов геном PBoV имеет более высокую гомологию с геномом HBoV, чем с другими известными бокавирусами [Malecki et al., 2011; Zeng et al., 2011]. При анализе различных локусов вирусного генома оказалось, что двумя другими ближайшими родственными вирусами к HBoV являются бокавирусы собак и быков [Kapoor et al., 2009; Kapoor et al., 2010a; Kapoor et al., 2011; Schildgen et al., 2012]. Данные факты служат подтверждением зоонозной теории возникновения HBoV. 100 Бокавирусы, включая HBoV, являются мало изученными на сегодняшний день. Так, остается также открытым вопрос о механизме репликации как HBoV, так и других бокавирусов. Репликация представителей других родов, входящих в семейства Parvoviridae (Erythrovirus, Parvovirus и Dependovirus) происходит по механизму катящейся шпильки (rolling hairpin mechanism) с образованием соединенных интермедиатов, имеющих структуру «голова к голове» или «хвост к хвосту». Однако в случае AAV (Dependovirus), для репликации которого требуется вирус-помощник, было также показано образование эписомальных кольцевых форм ДНК вируса [Musatov et al., 2002a; Musatov et al., 2002b; Chen et al., 2005]. В случае бокавирусов существует много свидетельств обнаружения эписомальных «голова к хвосту» форм вирусного генома. Впервые это было показано в работе Lüsebrink с соавторами [Lüsebrink et al., 2011], авторы которой обнаружили кольцевые формы для штаммов Bonn и Helsinki, принадлежащих к HBoV1, вскоре эписомальные структуры были найдены у штамма HBoV3 (JN086998) [Kapoor et al., 2011], штамма BJQ435 HBoV2 [Zhao et al., 2012], и у штамма HBoV1 Salvador [Huang et al., 2012]. Кроме того, кольцевые формы геномной ДНК были найдены у других членов рода Bocaparvovirus: PBoV [Cheung et al., 2010; Yang et al., 2012] и CnBoV3 [Li et al., 2013]. В связи с этим возник вопрос – являются ли эти данные свидетельством отличного от других парвовирусов механизма репликации бокавирусов, или эписомальные формы возникают по иному пути, наряду с репликацией по модели катящейся шпильки, и обеспечивают персистенцию вируса в тканях хозяина. Единственная попытка обнаружить интермедиаты голова к голове» или «хвост к хвосту» была предпринята в работе Lüsebrink и соавторов [Lüsebrink et al., 2011], в ней были тестированы штаммы HBoV1 Bonn и HBoV1 Helsinki с использованием всех возможных сочетаний праймеров и показано отсутствие таких структур. В других работах искали только формы «голова к хвосту». 101 Следует отметить, что репликация по механизму катящейся шпильки предполагает образование (+)ДНК- и (-)ДНК-геномов в равном соотношении. Факт о преимущественном обнаружении (-)ДНК-геномов у бокавирусов является свидетельством в пользу отличного от данного механизма репликации. Впервые превалирование геномов отрицательной полярности было показано в работе Chen и соавторов и затем подтверждено в ряде исследований [Chen et al., 1986; Böhmer et al., 2009], впоследствии во всех исследованиях по поиску эписомальных форм ковалентно замкнутых ДНК бокавирусов были открыты структуры, соответствующие именно (-)ДНК-геномам. Известно, что геномы вирусов, относящихся к родам Amdovirus, Dependovirus, Erythrovirus и Partetravirus представлены в равной степени цепями обеих полярностей [Berns et al., 2007; Fryer et al., 2007; Ozawa et al., 1986; Bonvicini et al., 2006]. Однако, геномы MVM и Aleutian disease virus, относящихся к роду Parvovirus, в основном обнаруживаются в виде (-)ДНК [Cotmore et al., 2003; Li et al., 2013]. Этот факт объясняется специфической укладкой (-)ДНК молекул в вирионы [Corsini et al., 2001; Willwand et al., 1991; Willwand et al., 1990]. В статье Chen и соавторов было предложено пересмотреть модель репликации катящейся шпильки бокавирусов на основе наблюдаемой ориентации концевых шпилечных структур парвовируса быков. При этом постулировалось, селективной что данный укладки, а феномен скорее не является специфическим результатом распределением репликативных форм [Chen et al., 1988]. В нашей работе впервые была предпринята попытка обнаружить репликативные формы генома редкого генотипа HBoV4, продемонстрировавшего значительные геномные отличия от ранее изученного HBoV1, и определить структуру концевых районов генома этого вируса. Уровень идентичности нуклеотидных последовательностей геномов HBoV4 и HBoV1 составляет 75%, а таковой для аминокислотных последовательностей варьирует от 68% до 80%. Ранее концевые структуры 102 были определены также для HBoV2 [Zhao et al., 2012] и HBoV3 [Kapoor et al., 2011], но эти генотипы, по-видимому, произошли в результате рекомбинации HBoV1 и HBoV4 [Fu et al., 2011; Kapoor et al., 2009; Kapoor et al., 2010; Cheng et al., 2011; Babkin et al., 2013]. По нашим данным HBoV1 дивергировал от бокавируса шимпанзе около 60-80 лет назад, а HBoV4 независимо отделился от бокавируса высших обезьян около 200300 лет назад. В связи с этим представляет интерес изучение нерекомбинантных геномных последовательностей HBoV4, включающих концевые шпилечные структуры, и сравнение их с известными последовательностями других генотипов HBoV. В ходе работы были впервые определены полные геномы двух новосибирских изолятов HBoV4. Протяженность их геномов составила 5095 н. Для поиска потенциальных репликативных интермедиатов бокавирусов мы разработали набор праймеров, позволяющий их выявить. С использованием этого набора были тестированы оба изолята HBoV4, а также изоляты, принадлежащие к другим генотипам HBoV. Этот подход не выявил ни в одном случае структур «голова к голове» или «хвост к хвосту», характерных для репликации по механизму катящейся шпильки. При этом, в случае изолятов HBoV4 RUS_NSC_11-N2657 и изолята HBoV2 RUS_NSC_10-N386 были детектированы структуры «голова к хвосту», соответствующие кольцевой форме вирусной ДНК. Клонирование полученных ампликонов, содержащих концевые нетранслируемые участки генома изолятов HBoV2 RUS_NSC_10-N386 и HBoV4 RUS_NSC_11-N2657 с последующим секвенированием ПЦРфрагментов из индивидуальных клонов позволило установить нуклеотидные последовательности полных геномов этих изолятов, включая концевые шпилечные структуры. При этом выявилась гетерогенность терминальных последовательностей HBoV2 и HBoV4, что, возможно, является следствием сложной вторичной структуры этого района вирусного генома. 103 Гетерогенность терминальных последовательностей также была обнаружена ранее при секвенировании концевых районов генома CnBoV3 был открыт в работе [Li et al., 2013]. Был проведен расчет вторичной структуры концевых нетранслируемых участков изучаемых новосибирских изолятов HBoV4 и HBoV2 и опубликованных ранее гомологичных последовательностей других генотипов HBoV. При сравнениии выведенных вторичных структур можно заключить, что, несмотря на значительные отличия в нуклеотидных последовательностях, наблюдается сходство их вторичных структур. Во всех случаях присутствуют 3' концевой стебель с петлей, шпилька-1, имеющая «структуру кроличьих ушей», и 5' концевой кластер стеблей и петель. Можно отметить, что в большинстве случаев образуются протяженные шпильки, характеризующиеся высокими значениями свободной энергии, особенно для новосибирских изолятов HBoV4, HBoV2 и штамма HBoV1 Salvador. Возможно, эти шпильки стабилизируют вторичную структуру концевых участков генома HBoV. Вместе с тем, отсутствие структур, присущих механизму репликации по принципу катящейся шпильки, обнаруживаемых у других парвовирусов, и выявление ковалентно замкнутых кольцевых структур генома негативной полярности для всех генотипов HBoV ставит вопрос о небходимости более детального изучения репликации бокавирусов. Кроме того, отсутствие достоверных отличий во встречаемости HBoV у больных и здоровых детей в Новосибирске, подтверждаемое результатами исследований и в других регионах мира, обнаружение резкой, трудно объяснимой смены генетических вариантов циркулирующих HBoV и ряд других вопросов исследований делает необходимым молекулярно-генетических относительно недавно открытого вируса. 104 проведение дальнейших особенностей этого ВЫВОДЫ 1. Впервые проведено комплексное исследование молекулярно- эпидемиологических особенностей бокавирусной инфекции у детей раннего возраста, госпитализированных с диагнозом ОКИ в 2010-2012 гг. в Новосибирске и показано, что бокавирусы человека, выявленные в среднем в 1,2 % (62/5264) клинических образцов от больных детей, не являются высоко значимой этиологической причиной этих заболеваний; выраженной сезонной зависимости бокавирусной инфекции в исследуемый период не обнаружено; чаще всего бокавирусы выявлялись у детей в возрасте от 6 до 8 месяцев, 87 % детей с бокавирусной инфекцией были младше одного года и более 96 % заболевших бокавирусами были младше полутора лет; бокавирусы выявлялись в виде моноинфекций приблизительно в половине случаев (54,8 %), при инфекциях смешанной этиологии чаще всего они встречались в сочетании с ротавирусами группы А и норовирусами II геногруппы. 2. Исследование молекулярно-генетического разнообразия изолятов бокавирусов человека, выявленных в 2010-2012 гг. продемонстрировало, что в Новосибирске доминировали изоляты бокавируса второго генотипа (HВоV2, 56,4 %), при этом встречаемость HBoV2B составила 80 % от общего количества HBoV2; изоляты бокавируса первого генотипа (HВоV1) встречались в 38,7 % случаев, изоляты HВоV3 и HВоV4 обнаруживались в единичных образцах (1 - HBoV3, 2 - HBoV4); с течением времени происходило изменение спектра генетических вариантов HBoV. 3. Определены нуклеотидные последовательности геномов шести изолятов HВоV (1 изолят HВоV1, 2 – HВоV2, 1 – HВоV3 и 2 изолята HВоV4), выявленных в Новосибирске, и показано, что геномные последовательности 105 изолятов HBoV1, HBoV2 и HBoV4 кластеризовались с таковыми изолятов из различных географических областей, относящихся к соответствующиму генотипу. Новосибирский изолят HBoV3 возник в результате рекомбинации между генотипами HBoV3 и HBoV4; сайт рекомбинации (в позиции 3270 н. о.), совпадающий с «горячей» точкой рекомбинации бокавирусов, расположен между районами с аномально низким и аномально высоким GCсоставом генома. 4. Установлено, что скорость изменчивости генома HBoV составляет около 9×10-4 замен на сайт в год. Показано, что дивергенция генотипов HBoV от общего предшественника произошла несколько сотен лет назад, а современные изоляты HBoV дивергировали внутри генотипов в течение последних 50 лет. 5. Впервые установлено, что репликативные интермедиаты HBoV4 имеют структуру «голова к хвосту», что свидетельствует о использовании этим вирусом механизма репликации по принципу «катящегося кольца»; впервые обнаружен полиморфизм нуклеотидных концевых районов у HBoV. 106 последовательностей СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 1. Боднев C.А., Малеев В.В., Жираковская Е.В., Тикунов А.Ю., Никифорова Н.А., Корсакова Т.Г., Нетесев С.В., Тикунова Н.В. Этиологическая значимость ротавирусов, норовирусов и астровирусов в структуре острых кишечных инфекций у детей раннего возраста Новосибирска в период сезонного подъема заболеваемости // Инфекц. Болезни - 2008. - № 6. - С. 61-64. 2. Боднев С.А., Малеев В.В., Жираковская Е.В., Юн Т.Э., Тикунов А.Ю., Никифорова Н.А., Корсакова Т.Г., Клемешева В.В., Качко А.В., Подколзин А.Т., Тикунова Н.В. Нововирусы как этиологический фактор острых кишечных инфекций у детей раннего возраста в Новосибирске // Эпидемиология инфекц. Болезни - 2010. - № 1. -C. 40- 45. 3. Горбунова М.Г., Тикунова Н.В., Жираковская Е.В., Стасенко В.Л., Ерофеев Ю.А., Вайтович М.А., Миленина В.М., Логиновских Н.В. Эпидемиологическая характеристика и особенности этиологии ротавирусной инфекции в Омской области // Эпидемиология и инфекц. болезни - 2008. - № 6. -P. 36-39. 4. Жираковская Е.В., Никифорова Н.А., Корсакова Т.Г., Юн Н.Э., Тикунова Н.В. Ротавирусная инфекция у детей раннего возраста в г. Новосибирске. Генотипирование циркулирующих изолятов // Эпидемиология и инфекц. Болезни - 2007. - № 3. - С. 32-36. 5. Жираковская Е., Малеев В., Клемешева В., Боднев С., Корсакова Т., Тикунов А., Юн Т., Никифорова Н., Нетесов С., Тикунова Н. Ротавирусы у детей раннего возраста в г. Новосибирске в 2005-2007 гг.: выявление и генотипирование // Ж. микробиол. эпидемиол. иммунол. - 2008. - № 4. - С. 12-16. 6. Сведения об инфекционных и паразитарных заболевания (форма 1) за январь-декабрь 2010 г ФГУ Федеральный центр гигиены и эпидемиологии [Электронный ресурс]: Режим доступа: http://www.fcgsen.ru. 107 7. Abdel-Latif L., Murray B.K., Renberg R.L., O'Neill K.L., Porter H., Jensen J.B., Johnson F.B. Cell death in bovine parvovirus-infected embryonic bovine tracheal cells is mediated by necrosis rather than apoptosis // J. Gen. Virol. – 2006. – V. 87. – P. 2539-2548. 8. Agbandje-McKenna M. and Chapman M. S. 2006. Corrleating structure with function in the viral capsid, pp. 125-139. In J. R. Kerr, S. F. Cotmore, M. E. Bloom, R. M. Linden, and C. R. Parrish (ed.), Parvoviruses. Edward Arnold, Ltd., New York, NY. 9. Ahn J.G., Choi S.Y., Kim D.S., Kim K.H. Human bocavirus isolated from children with acute respiratory tract infections in Korea, 2010-2011 // J. Med. Virol. – 2014. – V. 86. – P. 2011-2018. 10. Albuquerque M.C., Rocha L.N., Benati F.J., Soares C.C., Maranhão A.G., Ramírez M.L., Erdman D., Santos N. Human bocavirus infection in children with gastroenteritis, Brazil // Emerg. Infect. Dis. – 2007. – V. 13. – P. 1756-1758. 11. Allander T., Tammi M.T., Eriksson M., Bjerkner A., Tiveljung- Lindell A., Andersson B. Cloning of a human parvovirus by molecular screening of respiratory tract samples // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 2005. – V. 102. – P. 12891-12896. 12. Allander T., Jartti T., Gupta S., Niesters H.G., Lehtinen P., Osterback R., Vuorinen T., Waris M., Bjerkner A., Tiveljung-Lindell A., van den Hoogen B.G., Hyypiä T., Ruuskanen O. Human bocavirus and acute wheezing in children // Clin. Infect. Dis. – 2007. – V. 44. – P. 904-910. 13. Allander T. Human bocavirus // J. Clin. Virol. – 2008. – V. 41. – P. 29-33. 14. Arimoto K., Takahashi H., Hishiki T., Konishi H., Fujita T., Shimotohno K. Negative regulation of the RIG-I signaling by the ubiquitin ligase RNF125 // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 2007. – V. 104. – P. 7500-7505. 15. Armitage P., Berry G., Matthews J.N.S. 2002 Statistical Methods in Medical Research, Fourth Edition. Blackwell Science Ltd., Osney Mead, Oxford OX2 0EL, UK, P. 817. 108 16. Arthur J.L., Higgins G.D., Davidson G.P., Givney R.C., Ratcliff R.M. A novel bocavirus associated with acute gastroenteritis in Australian children // PLoS Pathog. – 2009. – V. 5. – P. e1000391. 17. Babady N.E., Mead P., Stiles J., Brennan C., Li H., Shuptar S., Stratton C.W., Tang Y.W., Kamboj M. Comparison of the Luminex xTAG RVP Fast assay and the Idaho Technology FilmArray RP assay for detection of respiratory viruses in pediatric patients at a cancer hospital // J. Clin. Microbiol. – 2012. – V. 50. – P. 2282-2288. 18. Babkin I.V., Tyumentsev A.I., Tikunov A.Y., Kurilshikov A.M, Ryabchikova E.I., Zhirakovskaya E.V., Netesov S.V., Tikunova N.V. Evolutionary time-scale of primate bocaviruses // Infect. Genet. Evol. – 2013. – V. 14. – P. 265274. 19. Benjamin L.A., Lewthwaite P., Vasanthapuram R., Zhao G., Sharp C., Simmonds P., Wang D., Solomon T. Human parvovirus 4 as potential cause of encephalitis in children, India // Emerg. Infect. Dis. – 2011. – V. 17. – P. 14841487. 20. Berns K.I. Parvovirus replication // Microbiol. Rev. – 1990. – V. 54. – P. 316-329. 21. Berns K., Parrish C.R. 2007. Parvoviridae. In: Knipe D.M., Howley P.M., Griffin D.E., Lamb R.A., Martin M.A., Roizman B., Straus S.E. (Eds.), Fields virology, 5th Ed. Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA, pp. 2437-2477. 22. Blacklow N.R., Hoggan M.D., Rowe W.P. Isolation of adenovirus- associated viruses from man // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1967. – V. 58. – P. 1410-1415. 23. Blessing K., Neske F., Herre U., Kreth H.W., Weissbrich B. Prolonged detection of human bocavirus DNA in nasopharyngeal aspirates of children with respiratory tract disease // Pediatr. Infect. Dis. J. – 2009. – V. 28. – P. 1018-1019. 109 24. Böhmer A., Schildgen V., Lüsebrink J., Ziegler S., Tillmann R.L., Kleines M., Schildgen O. Novel application for isothermal nucleic acid sequencebased amplification (NASBA) // J. Virol. Methods. – 2009. – V. 158. – P. 199-201. 25. Bonvicini F., Filippone C., Delbarba S., Manaresi E., Zerbini M., Musiani M., Gallinella G. Parvovirus B19 genome as a single, two-state replicative and transcriptional unit // Virology. – 2006. – V. 347. – P. 447-454. 26. Bonvicini F., Manaresi E., Gentilomi G.A., Di Furio F., Zerbini M., Musiani M., Gallinella G. Evidence of human bocavirus viremia in healthy blood donors // Diagn. Microbiol. Infect. Dis. – 2011. – V. 71. – P. 460-462. 27. Brown K.E., Young N.S., Liu J.M. Molecular, cellular and clinical aspects of parvovirus B19 infection // Crit. Rev. Oncol. Hematol. – 1994. – V. 16. – P. 1-31. 28. Campe H., Hartberger C., Sing A. Role of Human Bocavirus infections in outbreaks of gastroenteritis // J. Clin. Virol. – 2008. – V. 43. – P. 340342. 29. Canaan S., Zádori Z., Ghomashchi F., Bollinger J., Sadilek M., Moreau M.E., Tijssen P., Gelb M.H. Interfacial enzymology of parvovirus phospholipases A2 // J. Biol. Chem. – 2004. – V. 279. – P. 14502-14508. 30. Chapman M. S. and M. Agbandje-McKenna. 2006. Atomic structures of viral particles, pp. 107-123. In J. R. Kerr, S. F. Cotmore, M. E. Bloom, R. L. Linden, and C. R. Parrish (ed.), Parvoviruses. Edward Arnold, Ltd., New York, NY. 31. Chen C.L., Jensen R.L., Schnepp B.C., Connell M.J., Shell R., Sferra T.J., Bartlett J.S., Clark K.R., Johnson P.R. Molecular characterization of adenoassociated viruses infecting children // J. Virol. – 2005. – V. 79. – P. 14781-14792. 32. Chen A.Y., Cheng F., Lou S., Luo Y., Liu Z., Delwart E., Pintel D., Qiu J. Characterization of the gene expression profile of human bocavirus // Virology. – 2010. – V. 403. – P. 145-154. 110 33. Chen K.C., Shull B.C., Moses E.A., Lederman M., Stout E.R., Bates R.C. Complete nucleotide sequence and genome organization of bovine parvovirus // J. Virol. – 1986. – V. 60. – P. 1085-1097. 34. Chen K.C., Shull B.C., Lederman M., Stout E.R., Bates R.C. Analysis of the termini of the DNA of bovine parvovirus: demonstration of sequence inversion at the left terminus and its implication for the replication model // J. Virol. – 1988. – V. 62. – P. 3807-3813. 35. Cheng F., Chen A.Y., Best S.M., Bloom M.E., Pintel D., Qiu J. The capsid proteins of Aleutian mink disease virus (AMDV) activate caspases and are specifically cleaved during infection // J. Virol. – 2010. – V. 84. – P. 2687–2696. 36. Cheng W.X., Jin Y., Duan Z.J., Xu Z.Q., Qi H.M., Zhang Q., Yu J.M., Zhu L., Jin M., Liu N., Cui S.X., Li H.Y., Fang Z.Y. Human bocavirus in children hospitalized for acute gastroenteritis: a case-control study // Clin. Infect. Dis. – 2008. – V. 47. – P. 161-167. 37. Cheng W.X., Li J.S., Huang C.P., Yao D.P., Liu N., Cui S.X., Jin Y., Duan Z.J. Identification and nearly full-length genome characterization of novel porcine bocaviruses // PLoS One. – 2010. – V. 5. – P. e13583. 38. Cheng W., Chen J., Xu Z., Yu J., Huang C., Jin M., Li H., Zhang M., Jin Y., Duan Z.J. Phylogenetic and recombination analysis of human bocavirus 2 // BMC Infect. Dis. – 2011. – V. 11. – P. 50. 39. Cheung A.K., Wu G., Wang D., Bayles D.O., Lager K.M., Vincent A.L. Identification and molecular cloning of a novel porcine parvovirus // Arch. Virol. – 2010. – V. 155. – P. 801-806. 40. Chieochansin T., Chutinimitkul S., Payungporn S., Hiranras T., Samransamruajkit R., Theamboolers A., Poovorawan Y. Complete coding sequences and phylogenetic analysis of Human Bocavirus (HBoV) // Virus Res. – 2007. – V. 129. – P. 54-57. 41. Chieochansin T., Thongmee C., Vimolket L., Theamboonlers A., Poovorawan Y. Human bocavirus infection in children with acute gastroenteritis and healthy controls // Jpn. J. Infect. Dis. – 2008. – V. 61. – P. 479-481. 111 42. Chieochansin T., Kapoor A., Delwart E., Poovorawan Y., Simmonds P. Absence of detectable replication of human bocavirus species 2 in respiratory tract // Emerg. Infect. Dis. – 2009. – V. 15. – P. 1503-1505. 43. Chieochansin T., Simmonds P., Poovorawan Y. Determination and analysis of complete coding sequence regions of new discovered human bocavirus types 2 and 3 // Arch. Virol. – 2010. – V. 155. – P. 2023-2028. 44. Chow B.D., Ou Z., Esper F.P. Newly recognized bocaviruses (HBoV, HBoV2) in children and adults with gastrointestinal illness in the United States // J. Clin. Virol. – 2010. – V. 47. – P. 143-147. 45. Christensen J., Pedersen M., Aasted B., Alexandersen S. Purification and characterization of the major nonstructural protein (NS-1) of Aleutian mink disease parvovirus // J. Virol. – 1995. – V. 69. – P. 1802-1809. 46. Chung J.Y., Han T.H., Kim J.S., Kim S.W., Park C.G., Hwang E.S. Th1 and Th2 cytokine levels in nasopharyngeal aspirates from children with human bocavirus bronchiolitis // J. Clin. Virol. – 2008. – V. 43. – P. 223-225. 47. Corsini J., Cotmore S.F., Tattersall P., Winocour E. The left-end and right-end origins of minute virus of mice DNA differ in their capacity to direct episomal amplification and integration in vivo // Virology. – 2001. – V. 288. – P. 154-163. 48. Cossart Y.E., Field A.M., Cant B., Widdows D. Parvovirus-like particles in human sera // Lancet. – 1975. – V. 1. – P. 72-73. 49. Cotmore S.F., Tattersall P. Characterization and molecular cloning of a human parvovirus genome // Science. – 1984. – V. 226. – P. 1161-1165. 50. Cotmore S.F., Tattersall P. The NS-1 polypeptide of minute virus of mice is covalently attached to the 5' termini of duplex replicative-form DNA and progeny single strands // J. Virol. – 1988. – V. 62. – P. 851-860. 51. Cotmore S.F., Nüesch J.P., Tattersall P. Asymmetric resolution of a parvovirus palindrome in vitro // J. Virol. – 1993. – V. 67. – P. 1579-1589. 52. Cotmore S.F., Christensen J., Nüesch J.P., Tattersall P. The NS1 polypeptide of the murine parvovirus minute virus of mice binds to DNA 112 sequences containing the motif [ACCA] 2-3 // J. Virol. – 1995. – V. 69. – P. 16521660. 53. Cotmore S.F., Tattersall P. Resolution of parvovirus dimer junctions proceeds through a novel heterocruciform intermediate // J. Virol. – 2003. – V. 77. – P. 6245-6254. 54. Cotmore S.F., Agbandje-McKenna M., Chiorini J.A., Mukha D.V., Pintel D.J., Qiu J., Soderlund-Venermo M., Tattersall P., Tijssen P., Gatherer D., Davison A.J. The family Parvoviridae // Arch. Virol. – 2014. – V. 159. – P. 12391247. 55. De Vos N., Vankeerberghen A., Vaeyens F., Van Vaerenbergh K., Boel A., De Beenhouwer H. Simultaneous detection of human bocavirus and adenovirus by multiplex real-time PCR in a Belgian paediatric population // Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. – 2009. – V. 28. – P. 1305-1310. 56. Deng Z.H., Hao Y.X., Yao L.H., Xie Z.P., Gao H.C., Xie L.Y., Zhong L.L., Zhang B., Cao Y.D., Duan Z.J. Immunogenicity of recombinant human bocavirus-1,2 VP2 gene virus-like particles in mice // Immunology. – 2014. – V. 142. – P. 58-66. 57. Dijkman R., Koekkoek S.M., Molenkamp R., Schildgen O., van der Hoek L. Human bocavirus can be cultured in differentiated human airway epithelial cells // J. Virol. – 2009. – V. 83. – P. 7739-7748. 58. Doerig C., Hirt B., Beard P., Antonietti J.P. Minute virus of mice non- structural protein NS-1 is necessary and sufficient for trans-activation of the viral P39 promoter // J. Gen. Virol. – 1988. – V. 69. – P. 2563-2573. 59. Doerig C., Hirt B., Antonietti J.P., Beard P. Nonstructural protein of parvoviruses B19 and minute virus of mice controls transcription // J. Virol. – 1990. – V. 64. – P. 387-396. 60. Don M., Söderlund-Venermo M., Valent F., Lahtinen A., Hedman L., Canciani M., Hedman K., Korppi M. Serologically verified human bocavirus pneumonia in children // Pediatr. Pulmonol. – 2010. – V. 45. – P. 120-126. 113 61. Don M., Söderlund-Venermo M., Hedman K., Ruuskanen O., Allander T., Korppi M. Don't forget serum in the diagnosis of human bocavirus infection // J. Infect. Dis. – 2011. – V. 203. – P. 1031-1032. 62. Dorsch S., Liebisch G., Kaufmann B., von Landenberg P., Hoffmann J.H., Drobnik W., Modrow S. The VP1 unique region of parvovirus B19 and its constituent phospholipase A2-like activity // J. Virol. – 2002. – V. 76. – P. 20142018. 63. Drexler J.F., Reber U., Muth D., Herzog P., Annan A., Ebach F., Sarpong N., Acquah S., Adlkofer J., Adu-Sarkodie Y., Panning M., Tannich E., May J., Drosten C., Eis-Hübinger A.M. Human parvovirus 4 in nasal and fecal specimens from children, Ghana // Emerg. Infect. Dis. – 2012. – V. 18. – P. 16501653. 64. Drummond A.J., Rambaut A. BEAST: Bayesian evolutionary analysis by sampling trees // BMC Evol. Biol. – 2007. – V. 7. P. 214. 65. Duffy S., Shackelton L.A., Holmes E.C. Rates of evolutionary change in viruses: patterns and determinants // Nat. Rev. Genet. – 2008. – V. 9. – P. 267276. 66. Enders M., Lindner J., Wenzel J.J., Baisch C., Schalasta G., Enders G., Modrow S. No detection of human bocavirus in amniotic fluid samples from fetuses with hydrops or isolated effusions // J. Clin. Virol. – 2009. – V. 45. – P. 300-303. 67. Endo R., Ishiguro N., Kikuta H., Teramoto S., Shirkoohi R., Ma X., Ebihara T., Ishiko H., Ariga T. Seroepidemiology of human bocavirus in Hokkaido prefecture, Japan // J. Clin. Microbiol. – 2007. – V. 45. – P. 3218-3223. 68. Falcone V., Ridder G.J., Panning M., Bierbaum S., Neumann-Haefelin D., Huzly D. Human bocavirus DNA in paranasal sinus mucosa // Emerg. Infect. Dis. – 2011. – V. 17. – P. 1564-1565. 69. Fry A.M., Lu X., Chittaganpitch M., Peret T., Fischer J., Dowell S.F., Anderson L.J., Erdman D., Olsen S.J. Human bocavirus: a novel parvovirus 114 epidemiologically associated with pneumonia requiring hospitalization in Thailand // J. Infect. Dis. – 2007. – V. 195. – P. 1038-1045. 70. Fryer J.F., Delwart E., Bernardin F., Tuke P.W., Lukashov V.V., Baylis S.A. Analysis of two human parvovirus PARV4 genotypes identified in human plasma for fractionation // J. Gen. Virol. – 2007. – V. 88. – P. 2162-2167. 71. Fu X., Wang X., Ni B., Shen H., Wang H., Zhang X., Chen S., Shao S., Zhang W. Recombination analysis based on the complete genome of bocavirus // Virol. J. – 2011. – V. 8. – P. 182. 72. Gavin B.J., Ward D.C. Positive and negative regulation of the minute virus of mice P38 promoter // J. Virol. – 1990. – V. 64. – P. 2057-2063. 73. Girod A., Wobus C.E., Zádori Z., Ried M., Leike K., Tijssen P., Kleinschmidt J.A., Hallek M. The VP1 capsid protein of adeno-associated virus type 2 is carrying a phospholipase A2 domain required for virus infectivity // J. Gen. Virol. – 2002. – V. 83. – P. 973-978. 74. Gurda B.L., Parent K.N., Bladek H., Sinkovits R.S., DiMattia M.A., Rence C., Castro A., McKenna R., Olson N., Brown K., Baker T.S., AgbandjeMcKenna M. Human bocavirus capsid structure: insights into the structural repertoire of the parvoviridae // J. Virol. – 2010. – V. 84. – P. 5880-5889. 75. Han T.H., Chung J.Y., Hwang E.S. Human bocavirus 2 in children, South Korea // Emerg. Infect. Dis. – 2009. – V. 15. – P. 1698-1700. 76. Hedman L., Söderlund-Venermo M., Jartti T., Ruuskanen O., Hedman K. Dating of human bocavirus infection with protein-denaturing IgG-avidity assays-Secondary immune activations are ubiquitous in immunocompetent adults // J. Clin. Virol. – 2010. – V. 48. – P. 44-48. 77. Hsu T.C., Wu W.J., Chen M.C., Tsay G.J. Human parvovirus B19 non-structural protein (NS1) induces apoptosis through mitochondria cell death pathway in COS-7 cells // Scand. J. Infect. Dis. – 2004. – V. 36. – P. 570-577. 78. Huang Q., Deng X., Yan Z., Cheng F., Luo Y., Shen W., Lei-Butters D.C., Chen A.Y., Li Y., Tang L., Söderlund-Venermo M., Engelhardt J.F., Qiu J. 115 Establishment of a reverse genetics system for studying human bocavirus in human airway epithelia // PLoS Pathog. – 2012. – V. 8. – P. e1002899. 79. Huelsenbeck J.P., Rannala B. Phylogenetic methods come of age: testing hypotheses in an evolutionary context // Science. – 1997. – V. 276. – P. 227-232. 80. Jartti T., Söderlund-Venermo M., Allander T., Vuorinen T., Hedman K., Ruuskanen O. No efficacy of prednisolone in acute wheezing associated with human bocavirus infection // Pediatr. Infect. Dis. J. – 2011. – V. 30. – P. 521-523. 81. Jartti T., Hedman K., Jartti L., Ruuskanen O., Allander T., Söderlund- Venermo M. Human bocavirus-the first 5 years // Rev. Med. Virol. – 2012. – V. 22. – P. 46-64. 82. Jin Y., Cheng W.X., Xu Z.Q., Liu N., Yu J.M., Li H.Y., Jin M., Li D.D., Zhang Q., Duan Z.J. High prevalence of human bocavirus 2 and its role in childhood acute gastroenteritis in China // J. Clin. Virol. – 2011. – V. 52. – P. 251253. 83. Jones M.S., Kapoor A., Lukashov V.V., Simmonds P., Hecht F., Delwart E. New DNA viruses identified in patients with acute viral infection syndrome // J. Virol. – 2005. – V. 79. – P. 8230-8236. 84. Kahn J. Human bocavirus: clinical significance and implications // Curr. Opin. Pediatr. – 2008. – V. 20. – P. 62-66. 85. Kahn J.S., Kesebir D., Cotmore S.F., D'Abramo A. Jr., Cosby C., Weibel C., Tattersall P. Seroepidemiology of human bocavirus defined using recombinant virus-like particles // J. Infect. Dis. – 2008. – V. 198. – P. 41-50. 86. Kantola K., Hedman L., Allander T., Jartti T., Lehtinen P., Ruuskanen O., Hedman K., Söderlund-Venermo M. Serodiagnosis of human bocavirus infection // Clin. Infect. Dis. – 2008. – V. 46. – P. 540-546. 87. Kantola K., Sadeghi M., Antikainen J., Kirveskari J., Delwart E., Hedman K., Söderlund-Venermo M. Real-time quantitative PCR detection of four human bocaviruses // J. Clin. Microbiol. – 2010. – V. 48. – P. 4044-4050. 116 88. Kantola K., Hedman L., Arthur J., Alibeto A., Delwart E., Jartti T., Ruuskanen O., Hedman K., Söderlund-Venermo M. Seroepidemiology of human bocaviruses 1-4 // J. Infect. Dis. – 2011. – V. 204. – P. 1403-1412. 89. Kapoor A., Slikas E., Simmonds P., Chieochansin T., Naeem A., Shaukat S., Alam M.M., Sharif S., Angez M., Zaidi S., Delwart E. A newly identified bocavirus species in human stool // J. Infect. Dis. – 2009. – V. 199. – P. 196-200. 90. Kapoor A., Mehta N., Esper F., Poljsak-Prijatelj M., Quan P.L., Qaisar N., Delwart E., Lipkin W.I. Identification and characterization of a new bocavirus species in gorillas // PLoS One. – 2010a. – V. 5. – P. e11948. 91. Kapoor A., Simmonds P., Slikas E., Li L., Bodhidatta L., Sethabutr O., Triki H., Bahri O., Oderinde B.S., Baba M.M., Bukbuk D.N., Besser J., Bartkus J., Delwart E. Human bocaviruses are highly diverse, dispersed, recombination prone, and prevalent in enteric infections // J. Infect. Dis. – 2010b. – V. 201. – P. 1633-1643. 92. Kapoor A., Hornig M., Asokan A., Williams B., Henriquez J.A., Lipkin W.I. Bocavirus episome in infected human tissue contains non-identical termini // PLoS One. – 2011. – V. 6. – P. e21362. 93. Karalar L., Lindner J., Schimanski S., Kertai M., Segerer H., Modrow S. Prevalence and clinical aspects of human bocavirus infection in children // Clin. Microbiol. Infect. – 2010. – V. 16. – P. 633-639. 94. Kesebir D., Vazquez M., Weibel C., Shapiro E.D., Ferguson D., Landry M.L., Kahn J.S. Human bocavirus infection in young children in the United States: molecular epidemiological profile and clinical characteristics of a newly emerging respiratory virus // J. Infect. Dis. – 2006. – V. 194. – P. 1276-1282. 95. Khamrin P., Malasao R., Chaimongkol N., Ukarapol N., Kongsricharoern T., Okitsu S., Hayakawa S., Ushijima H., Maneekarn N. Circulating of human bocavirus 1, 2, 3, and 4 in pediatric patients with acute gastroenteritis in Thailand // Infect. Genet. Evol. – 2012a. – V. 12. – P. 565-569. 117 96. Khamrin P., Thongprachum A., Shimizu H., Okitsu S., Mizuguchi M., Hayakawa S., Maneekarn N., Ushijima H. Detection of human bocavirus 1 and 2 from children with acute gastroenteritis in Japan // J. Med. Virol. – 2012b. – V. 84. – P. 901-905. 97. Khamrin P., Okitsu S., Ushijima H., Maneekarn N. Complete genome sequence analysis of novel human bocavirus reveals genetic recombination between human bocavirus 2 and human bocavirus 4 // Infect. Genet. Evol. – 2013. – V. 17. – P. 132-136. 98. Kishino H., Hasegawa M. Evaluation of the maximum likelihood estimate of the evolutionary tree topologies from DNA sequence data, and the branching order in hominoidea // J. Mol. Evol. – 1989. – V. 29. – P. 170-179. 99. Klinkenberg D.; Schneppenheim R.; Müller I.; Blohm M.; Malecki M.; Schildgen V.;Schildgen O. Fatal human bocavirus infection in a boy with ipexlike syndrome and vaccineacquired rotavirus enteritis awaiting stem cell transplantation // Arch. Dis. Child. – 2012. – V. 97. – P. A274. 100. Körner R.W., Söderlund-Venermo M., van Koningsbruggen-Rietschel S., Kaiser R., Malecki M., Schildgen O. Severe human bocavirus infection, Germany // Emerg. Infect. Dis. – 2011. – V. 17. – P. 2303-2305. 101. Korppi M., Jartti T., Hedman K., Söderlund-Venermo M. Serologic diagnosis of human bocavirus infection in children // Pediatr. Infect. Dis. J. – 2010. – V. 29. – P. 387. 102. Kosakovsky Pond SL., Frost SD. Not so different after all: a comparison of methods for detecting amino acid sites under selection // Mol. Biol. Evol. - 2005. – V. 22. – P. 1208–1222. 103. Koseki N., Teramoto S., Kaiho M., Gomi-Endo R., Yoshioka M., Takahashi Y., Nakayama T., Sawada H., Konno M., Ushijima H., Kikuta H., Ariga T., Ishiguro N. Detection of human bocaviruses 1 to 4 from nasopharyngeal swab samples collected from patients with respiratory tract infections // J. Clin. Microbiol. – 2012. – V. 50. – P. 2118-2121. 118 104. Krady J.K., Ward D.C. Transcriptional activation by the parvoviral nonstructural protein NS-1 is mediated via a direct interaction with Sp1 // Mol. Cell. Biol. – 1995. – V. 15. – P. 524-533. 105. Kuethe F., Lindner J., Matschke K., Wenzel J.J., Norja P., Ploetze K., Schaal S., Kamvissi V., Bornstein S.R., Schwanebeck U., Modrow S. Prevalence of parvovirus B19 and human bocavirus DNA in the heart of patients with no evidence of dilated cardiomyopathy or myocarditis // Clin. Infect. Dis. – 2009. – V. 49. – P. 1660-1666. 106. Kumar A., Filippone C., Lahtinen A., Hedman L., SöderlundVenermo M., Hedman K., Franssila R. Comparison of Th-cell immunity against human bocavirus and parvovirus B19: proliferation and cytokine responses are similar in magnitude but more closely interrelated with human bocavirus // Scand. J. Immunol. – 2011. – V. 73. – P. 135-140. 107. Lassaunière R., Kresfelder T., Venter M. A novel multiplex real-time RT-PCR assay with FRET hybridization probes for the detection and quantitation of 13 respiratory viruses // J. Virol. Methods. – 2010. – V. 165. – P. 254-260. 108. Lau S.K., Yip C.C., Que T.L., Lee R.A., Au-Yeung R.K., Zhou B., So L.Y., Lau Y.L., Chan K.H., Woo P.C., Yuen K.Y. Clinical and molecular epidemiology of human bocavirus in respiratory and fecal samples from children in Hong Kong // J. Infect. Dis. – 2007. – V. 196. – P. 986-993. 109. Lee J.I., Chung J.Y., Han T.H., Song M.O., Hwang E.S. Detection of human bocavirus in children hospitalized because of acute gastroenteritis // J. Infect. Dis. – 2007. – V. 196. – P. 994-997. 110. Lefeuvre P., Lett J.M., Varsani A., Martin D.P. Widely conserved recombination patterns among single-stranded DNA viruses // J. Virol. – 2009. – V. 83. – P. 2697-2707. 111. Legendre D., Rommelaere J. Targeting of promoters for trans activation by a carboxy-terminal domain of the NS-1 protein of the parvovirus minute virus of mice // J. Virol. – 1994. – V. 68. – P. 7974-7985. 119 112. Li L., Cotmore S.F., Tattersall P. Parvoviral left-end hairpin ears are essential during infection for establishing a functional intranuclear transcription template and for efficient progeny genome encapsidation // J. Virol. – 2013. – V. 87. – P. 10501-10514. 113. Librado P., Rozas J. DnaSP v5: a software for comprehensive analysis of DNA polymorphism data // Bioinformatics. – 2009. – V. 25. – P. 1451-1452. 114. Lin F., Guan W., Cheng F., Yang N., Pintel D., Qiu J. ELISAs using human bocavirus VP2 virus-like particles for detection of antibodies against HBoV // J. Virol. Methods. – 2008. – V. 149. – P. 110-117. 115. Lindner J., Karalar L., Zehentmeier S., Plentz A., Pfister H., Struff W., et al. Humoral immune response against human bocavirus VP2 virus-like particles // Viral. Immunol. – 2008. – V. 21. – P. 443–449. 116. Loeffelholz M.J., Pong D.L, Pyles R.B., Xiong Y., Miller A.L., Bufton K.K., Chonmaitree T. Comparison of the FilmArray Respiratory Panel and Prodesse real-time PCR assays for detection of respiratory pathogens // J. Clin. Microbiol. – 2011. – V. 49. – P. 4083-4088. 117. Lorson C., Burger L.R., Mouw M., Pintel D.J. Efficient transactivation of the minute virus of mice P38 promoter requires upstream binding of NS1 // J. Virol. – 1996. – V. 70. – P. 834-842. 118. Lorson C., Pearson J., Burger L., Pintel D.J. An Sp1-binding site and TATA element are sufficient to support full transactivation by proximally bound NS1 protein of minute virus of mice // Virology. – 1998. – V. 240. – P. 326-337. 119. Lu X., Chittaganpitch M., Olsen S.J., Mackay I.M., Sloots T.P., Fry A.M., Erdman D.D. Real-time PCR assays for detection of bocavirus in human specimens // J. Clin. Microbiol. – 2006. – V. 44. – P. 3231-3235. 120. Lu X., Gooding L.R., Erdman D.D. Human bocavirus in tonsillar lymphocytes // Emerg. Infect. Dis. – 2008. – V. 14. – P. 1332-1334. 121. Luo H., Zhang Z., Zheng Z., Ke X., Zhang X., Li Q., Liu Y., Bai B., Mao P., Hu Q., Wang H. Human bocavirus VP2 upregulates IFN-β pathway by 120 inhibiting ring finger protein 125-mediated ubiquitination of retinoic acidinducible gene-I // J. Immunol. – 2013. – V. 191. – P. 660-669. 122. Lupescu A., Bock C.T., Lang P.A., Aberle S., Kaiser H., Kandolf R., Lang F. Phospholipase A2 activity-dependent stimulation of Ca2+ entry by human parvovirus B19 capsid protein VP1 // J. Virol. – 2006. – V. 80. – P. 11370-11380. 123. Lusebrink I., Evenden M.L., Blanchet F.G., Cooke J.E., Erbilgin N. Effect of water stress and fungal inoculation on monoterpene emission from an historical and a new pine host of the mountain pine beetle // J. Chem. Ecol. – 2011. – V. 37. – P. 1013-1026. 124. Lüsebrink J., Schildgen V., Tillmann R.L., Wittleben F., Böhmer A., Müller A., Schildgen O. Detection of head-to-tail DNA sequences of human bocavirus in clinical samples // PLoS One. – 2011. – V. 6. – P. e19457. 125. Malecki M., Schildgen V., Schildgen O. Human bocavirus: still more questions than answers // Future Virol. – 2011. – V. 9. - P. 1107-1114. 126. Manning A., Willey S.J., Bell J.E., Simmonds P. Comparison of tissue distribution, persistence, and molecular epidemiology of parvovirus B19 and novel human parvoviruses PARV4 and human bocavirus // J. Infect. Dis. – 2007. – V. 195. – P. 1345-1352. 127. Martin E.T., Taylor J., Kuypers J., Magaret A., Wald A., Zerr D., Englund J.A. Detection of bocavirus in saliva of children with and without respiratory illness // J. Clin. Microbiol. – 2009. – V. 47. – P. 4131-4132. 128. Martin E.T., Fairchok M.P., Kuypers J., Magaret A., Zerr D.M., Wald A., Englund J.A. Frequent and prolonged shedding of bocavirus in young children attending daycare // J. Infect. Dis. – 2010. – V. 201. – P. 1625-1632. 129. Morita E., Nakashima A., Asao H., Sato H., Sugamura K. Human parvovirus B19 nonstructural protein (NS1) induces cell cycle arrest at G(1) phase // J. Virol. – 2003. – V. 77. – P. 2915-2921. 130. Musatov S., Roberts J., Pfaff D., Kaplitt M. A cis-acting element that directs circular adeno-associated virus replication and packaging // J. Virol. – 2002. – V. 76. – P. 12792-12802. 121 131. Musatov S.A., Dudus L., Parrish C.M., Scully T.A., Fisher K.J. Spontaneous mobilization of integrated recombinant adenoassociated virus in a cell culture model of virus latency // Virology. – 2002. – V. 294. – P. 151-169. 132. Nadji S.A., Poos-Ashkan L., Khalilzadeh S., Baghaie N., Shiraghaei M.J., Hassanzad M., Bolursaz M.R. Phylogenetic analysis of human bocavirus isolated from children with acute respiratory illnesses and gastroenteritis in Iran // Scand. J. Infect. Dis. – 2010. – V. 42. – P. 598-603. 133. Nakanishi K., Tsugawa T., Honma S., Nakata S., Tatsumi M., Yoto Y., Tsutsumi H. Detection of enteric viruses in rectal swabs from children with acute gastroenteritis attending the pediatric outpatient clinics in Sapporo, Japan // J. Clin. Virol. – 2009. – V. 46. – P. 94-97. 134. Nakashima A., Morita E., Saito S., Sugamura K. Human Parvovirus B19 nonstructural protein transactivates the p21/WAF1 through Sp1 // Virology. – 2004. – V. 329. – P. 493-504. 135. Nascimento-Carvalho C.M., Cardoso M.R., Meriluoto M., Kemppainen K., Kantola K., Ruuskanen O., Hedman K., Söderlund-Venermo M. Human bocavirus infection diagnosed serologically among children admitted to hospital with community-acquired pneumonia in a tropical region // J. Med. Virol. – 2012. – V. 84. – P. 253-258. 136. Neske F., Blessing K., Tollmann F., Schubert J., Rethwilm A., Kreth H.W., Weissbrich B. Real-time PCR for diagnosis of human bocavirus infections and phylogenetic analysis // J. Clin. Microbiol. – 2007. – V. 45. – P. 2116-2122. 137. Noh J.Y., Song J.Y., Cheong H.J., Choi W.S., Lee J., Lee J.S., Wie S.H., Jeong H.W., Kim Y.K., Choi S.H., Han S.B., So B.H., Kim H., Kim W.J. Laboratory surveillance of influenza-like illness in seven teaching hospitals, South Korea: 2011-2012 season // PLoS One. – 2013. – V. 8. – P. e64295. 138. Norja P., Hokynar K., Aaltonen L.M., Chen R., Ranki A., Partio E.K., Kiviluoto O., Davidkin I., Leivo T., Eis-Hübinger A.M., Schneider B., Fischer H.P., Tolba R., Vapalahti O., Vaheri A., Söderlund-Venermo M., Hedman K. Bioportfolio: lifelong persistence of variant and prototypic erythrovirus DNA 122 genomes in human tissue // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 2006. – V. 103. – P. 7450-7453. 139. Ozawa K., Kurtzman G., Young N. Replication of the B19 parvovirus in human bone marrow cell cultures // Science. – 1986. – V. 233. – P. 883-886. 140. Peltola V., Söderlund-Venermo M., Jartti T. Human bocavirus infections // Pediatr. Infect. Dis. J. – 2013. – V. 32. – P. 178-179. 141. Pham N.T., Trinh Q.D., Chan-It W., Khamrin P., Nishimura S., Sugita K., Maneekarn N., Okitsu S., Mizuguchi M., Ushijima H. Human bocavirus infection in children with acute gastroenteritis in Japan and Thailand // J. Med. Virol. – 2011. – V. 83. – P. 286-290. 142. Phan T.G., Vo N.P., Bonkoungou I.J., Kapoor A., Barro N., O'Ryan M., Kapusinszky B., Wang C., Delwart E. Acute diarrhea in West African children: diverse enteric viruses and a novel parvovirus genus // J. Virol. – 2012. – V. 86. – P. 11024-11030. 143. Pond S.L., Frost S.D. Datamonkey: rapid detection of selective pressure on individual sites of codon alignments // Bioinformatics. – 2005. – V. 21. – P. 2531-2533. 144. Qiu J., Cheng F., Johnson F.B., Pintel D. The transcription profile of the bocavirus bovine parvovirus is unlike those of previously characterized parvoviruses // J. Virol. – 2007. – V. 81. – P. 12080-12085. 145. Qu X.W., Liu W.P., Qi Z.Y., Duan Z.J., Zheng L.S., Kuang Z.Z., Zhang W.J., Hou Y.D. Phospholipase A2-like activity of human bocavirus VP1 unique region // Biochem. Biophys. Res. Commun. – 2008. – V. 365. – P. 158-163. 146. Raab U., Beckenlehner K., Lowin T., Niller H.H., Doyle S., Modrow S. NS1 protein of parvovirus B19 interacts directly with DNA sequences of the p6 promoter and with the cellular transcription factors Sp1/Sp3 // Virology. – 2002. – V. 293. – P. 86-93. 147. Räsänen S., Lappalainen S., Kaikkonen S., Hämäläinen M., Salminen M., Vesikari T. Mixed viral infections causing acute gastroenteritis in children in a waterborne outbreak // Epidemiol. Infect. – 2010. – V. 138. – P. 1227-1234. 123 148. Riipinen A., Väisänen E., Lahtinen A., Karikoski R., Nuutila M., Surcel H.M., Taskinen H., Hedman K., Söderlund-Venermo M. Absence of human bocavirus from deceased fetuses and their mothers // J. Clin. Virol. – 2010. – V. 47. – P. 186-188. 149. Saitou N., Nei M. The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees // Mol. Biol. Evol. – 1987. – V. 4. – P. 406-425. 150. Santos N., Peret T.C., Humphrey C.D., Albuquerque M.C., Silva R.C., Benati F.J., Lu X., Erdman D.D. Human bocavirus species 2 and 3 in Brazil // J. Clin. Virol. – 2010. – V. 48. – P. 127-130. 151. Schildgen O., Müller A., Allander T., Mackay I.M., Völz S., Kupfer B., Simon A. Human bocavirus: passenger or pathogen in acute respiratory tract infections? // Clin. Microbiol. Rev. – 2008. – V. 21. – P. 291-304. 152. Schildgen O., Qiu J., Söderlund-Venermo M. Genomic features of the human bocaviruses // Future Virol. – 2012. – V. 7. – P. 31-39. 153. Schildgen V., Malecki M., Tillmann R.L., Brockmann M., Schildgen O. The Human Bocavirus Is Associated with Some Lung and Colorectal Cancers and Persists in Solid Tumors // PLoS One. – 2013. – V. 8. – P. e68020. 154. Schnepp B.C., Jensen R.L., Chen C.L., Johnson P.R., Clark K.R. Characterization of adeno-associated virus genomes isolated from human tissues // J. Virol. – 2005. – V. 79. – P. 14793-14803. 155. Shapiro B., Rambaut A., Drummond A.J. Choosing appropriate substitution models for the phylogenetic analysis of protein-coding sequences // Mol. Biol. Evol. – 2006. – V. 23. – P. 7-9. 156. Sharp C.P., LeBreton M., Kantola K., Nana A., Diffo Jle D., Djoko C.F., Tamoufe U., Kiyang J.A., Babila T.G., Ngole E.M., Pybus O.G., Delwart E., Delaporte E., Peeters M., Soderlund-Venermo M., Hedman K., Wolfe N.D., Simmonds P. Widespread infection with homologues of human parvoviruses B19, PARV4, and human bocavirus of chimpanzees and gorillas in the wild // J. Virol. – 2010. – V. 84. – P. 10289-10296. 124 157. Söderlund M., von Essen R., Haapasaari J., Kiistala U., Kiviluoto O., Hedman K. Persistence of parvovirus B19 DNA in synovial membranes of young patients with and without chronic arthropathy // Lancet. – 1997. – V. 349. – P. 1063-1065. 158. Söderlund-Venermo M., Hokynar K., Nieminen J., Rautakorpi H., Hedman K. Persistence of human parvovirus B19 in human tissues // Pathol. Biol. (Paris). – 2002. – V. 50. – P. 307-316. 159. Söderlund-Venermo M., Lahtinen A., Jartti T., Hedman L., Kemppainen K., Lehtinen P., Allander T., Ruuskanen O., Hedman K. Clinical assessment and improved diagnosis of bocavirus-induced wheezing in children, Finland // Emerg. Infect. Dis. – 2009. – V. 15. – P. 1423-1430. 160. Song J.R., Jin Y., Xie Z.P., Gao H.C., Xiao N.G., Chen W.X., Xu Z.Q., Yan K.L., Zhao Y., Hou Y.D., Duan Z.J. Novel human bocavirus in children with acute respiratory tract infection // Emerg. Infect. Dis. – 2010. – V. 16. – P. 324-327. 161. Streiter M., Malecki M., Prokop A., Schildgen V., Lüsebrink J., Guggemos A., Wisskirchen M., Weiss M., Cremer R., Brockmann M., Schildgen O. Does human bocavirus infection depend on helper viruses? A challenging case report // Virol. J. – 2011. – V. 8. – P. 417. 162. Sugiura N. Further analysis of the data by Akaike's information criterion and the finite corrections // Comm. Statist. - 1978. – V. A7. – P. 13-26. 163. Suikkanen S., Antila M., Jaatinen A., Vihinen-Ranta M., Vuento M. Release of canine parvovirus from endocytic vesicles // Virology. – 2003. – V. 316. – P. 267-280. 164. Sukhu L., Fasina O., Burger L., Rai A., Qiu J., Pintel D.J. Characterization of the nonstructural proteins of the bocavirus minute virus of canines // J. Virol. – 2013. – V. 87. – P. 1098-1104. 165. Sun B., Cai Y., Li Y., Li J., Liu K., Li Y., Yang Y. The nonstructural protein NP1 of human bocavirus 1 induces cell cycle arrest and apoptosis in Hela cells // Virology. – 2013. – V. 440. – P. 75-83. 125 166. Sun Y., Chen A.Y., Cheng F., Guan W., Johnson F.B., Qiu J. Molecular characterization of infectious clones of the minute virus of canines reveals unique features of bocaviruses // J. Virol. – 2009. – V. 83. – P. 3956-3967. 167. Szomor K.N., Kapusinszky B., Rigó Z., Kis Z., Rózsa M., Farkas A., Szilágyi A., Berencsi G., Takács M. Detection of human bocavirus from fecal samples of Hungarian children with acute gastroenteritis // Intervirology. – 2009. – V. 52. – P. 17-21. 168. Tamura K., Stecher G., Peterson D., Filipski A., Kumar S. MEGA6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 6.0 // Mol. Biol. Evol. – 2013. – V. 30. – P. 2725-2729. 169. Tattersall P., Crawford L.V., Shatkin A.J. Replication of the parvovirus MVM. II. Isolation and characterization of intermediates in the replication of the viral deoxyribonucleic acid // J. Virol. – 1973. – V. 12. – P. 1446-1456. 170. Tattersall P., Ward D.C. Rolling hairpin model for replication of parvovirus and linear chromosomal DNA // Nature. – 1976. – V. 263. – P. 106109. 171. Tijssen P. Molecular and structural basis of the evolution of parvovirus tropism // Acta Vet. Hung. – 1999. – V. 47. – P. 379-394. 172. Tozer S.J., Lambert S.B., Whiley D.M., Bialasiewicz S., Lyon M.J., Nissen M.D., Sloots T.P. Detection of human bocavirus in respiratory, fecal, and blood samples by real-time PCR // J. Med. Virol. – 2009. – V. 81. – P. 488-493. 173. van den Brand J.M., van Leeuwen M., Schapendonk C.M., Simon J.H., Haagmans B.L., Osterhaus A.D., Smits S.L. Metagenomic analysis of the viral flora of pine marten and European badger feces // J. Virol. – 2012. – V. 86. – P. 2360-2365. 174. van den Hoogen B.G., de Jong J.C., Groen J., Kuiken T., de Groot R., Fouchier R.A., Osterhaus A.D. A newly discovered human pneumovirus isolated from young children with respiratory tract disease // Nat. Med. – 2001. – V. 7. – P. 719-724. 126 175. Vicente D., Cilla G., Montes M., Pérez-Yarza E.G., Pérez-Trallero E. Human bocavirus, a respiratory and enteric virus // Emerg. Infect. Dis. – 2007. – V. 13. – P. 636-637. 176. Vihinen-Ranta M., Parish C.R. Cell infection process of autonomous parvovirus. In: Kerr J.R., Cotmore S.F., Bloom M.E., Linden M.E., Parrish C.R., editors. Parvoviruses. London: Hodder Arnold; 2006. pp. 157-163. 177. Völz S., Schildgen O., Klinkenberg D., Ditt V., Müller A., Tillmann R.L., Kupfer B., Bode U., Lentze M.J., Simon A. Prospective study of Human Bocavirus (HBoV) infection in a pediatric university hospital in Germany 2005/2006 // J. Clin. Virol. – 2007. – V. 40. – P. 229-235. 178. von Linstow M.L., Høgh M., Høgh B. Clinical and epidemiologic characteristics of human bocavirus in Danish infants: results from a prospective birth cohort study // Pediatr. Infect. Dis. J. – 2008. – V. 27. – P. 897-902. 179. Wang K., Wang W., Yan H., Ren P., Zhang J., Shen J., Deubel V. Correlation between bocavirus infection and humoral response, and co-infection with other respiratory viruses in children with acute respiratory infection // J. Clin. Virol. – 2010. – V. 47. – P. 148-155. 180. Wang W., Cavailler P., Ren P., Zhang J., Dong W., Yan H., Mardy S., Cailhol J., Buchy P., Sheng J., Fontanet A., Deubel V. Molecular monitoring of causative viruses in child acute respiratory infection in endemo-epidemic situations in Shanghai // J. Clin. Virol. – 2010. – V. 49. – P. 211-218. 181. Wang Y., Gonzalez R., Zhou H., Li J., Li Y., Paranhos-Baccalà G., Vernet G., Guo L., Wang J. Detection of human bocavirus 3 in China // Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. – 2011. – V. 30. – P. 799-805. 182. Ward P., Falkenberg M., Elias P., Weitzman M., Linden R.M. Repdependent initiation of adeno-associated virus type 2 DNA replication by a herpes simplex virus type 1 replication complex in a reconstituted system // J. Virol. – 2001. – V. 75. – P. 10250-10258. 183. Willwand K., Kaaden O.R. Proteins of viral and cellular origin bind to the Aleutian disease virus (ADV) DNA 3'-terminal hairpin: presentation of a 127 scheme for encapsidation of ADV DNA // J. Virol. – 1990. – V. 64. – P. 15981605. 184. Willwand K., Hirt B. The minute virus of mice capsid specifically recognizes the 3' hairpin structure of the viral replicative-form DNA: mapping of the binding site by hydroxyl radical footprinting // J. Virol. – 1991. – V. 65. – P. 4629-4635. 185. Wu P., Xiao W., Conlon T., Hughes J., Agbandje-McKenna M., Ferkol T., Flotte T., Muzyczka N. Mutational analysis of the adeno-associated virus type 2 (AAV2) capsid gene and construction of AAV2 vectors with altered tropism // J. Virol. – 2000. – V. 74. – P. 8635-8647. 186. Yang C.C., Xiao X., Zhu X., Ansardi D.C., Epstein N.D., Frey M.R., Matera A.G., Samulski R.J. Cellular recombination pathways and viral terminal repeat hairpin structures are sufficient for adeno-associated virus integration in vivo and in vitro // J. Virol. – 1997. – V. 71. – P. 9231-9247. 187. Yang W.Z., Yu J.M., Li J.S., Cheng W.X., Huang C.P., Duan Z.J. Genome characterization of a novel porcine bocavirus // Arch. Virol. – 2012. – V. 157. – P. 2125-2132. 188. Yu J.M., Li D.D., Xu Z.Q., Cheng W.X., Zhang Q., Li H.Y., Cui S.X., Miao-Jin, Yang S.H., Fang Z.Y., Duan Z.J. Human bocavirus infection in children hospitalized with acute gastroenteritis in China // J. Clin. Virol. – 2008. – V. 42. – P. 280-285. 189. Zádori Z., Szelei J., Lacoste M.C., Li Y., Gariépy S., Raymond P., Allaire M., Nabi I.R., Tijssen P. A viral phospholipase A2 is required for parvovirus infectivity // Dev. Cell. – 2001. – V. 1. – P. 291-302. 190. Zehender G., De Maddalena C., Canuti M., Zappa A., Amendola A., Lai A., Galli M., Tanzi E. Rapid molecular evolution of human bocavirus revealed by Bayesian coalescent inference // Infect. Genet. Evol. – 2010. – V. 10. – P. 215220. 128 191. Zeng S., Wang D., Fang L., Ma J., Song T., Zhang R., Chen H., Xiao S. Complete coding sequences and phylogenetic analysis of porcine bocavirus // J. Gen. Virol. – 2011. – V. 92. – P. 784-788. 192. Zhang Z., Zheng Z., Luo H., Meng J., Li H., Li Q., Zhang X., Ke X., Bai B., Mao P., Hu Q., Wang H. Human bocavirus NP1 inhibits IFN-β production by blocking association of IFN regulatory factor 3 with IFNB promoter // J. Immunol. – 2012. – V. 189. – P. 1144-1153. 193. Zhao H., Zhao L., Sun Y., Qian Y., Liu L., Jia L., Zhang Y., Dong H. Detection of a bocavirus circular genome in fecal specimens from children with acute diarrhea in Beijing, China // PLoS One. – 2012. – V. 7. – P. e48980. 129 ПРИЛОЖЕНИЕ 1 Таблица 1. Номера доступа в базе данных GenBank последовательностей фрагмента ОРТ1 изолятов HBoV, обнаруженных в Новосибирске в 2010-2012 гг. Дата Номер Название изолята Генотип выявления GenBank 1 HBoV2 RUS-NSC10-N386 5.06.2010 HBoV2 JX046077 2 HBoV2 RUS-NSC10-N751 6.09.2010 HBoV2 JX046076 3 HBoV1 RUS-NSC10-N897 6.09.2010 HBoV1 JX046088 4 HBoV1 RUS-NSC10-N1014 30.09.2010 HBoV1 JX046083 5 HBoV2 RUS-NSC10-N1018 30.09.2010 HBoV2 JX046075 6 HBoV1 RUS-NSC10-N1075 20.10.2010 HBoV1 JX046085 7 HBoV1 RUS-NSC10-N1088 20.10.2010 HBoV1 JX046081 8 HBoV1 RUS-NSC10-N1117 28.10.2010 HBoV1 JX046087 9 HBoV1 RUS-NSC10-N1130 7.02.2011 HBoV1 JX046086 10 HBoV1 RUS-NSC10-N1155 7.02.2011 HBoV1 JX046079 11 HBoV2 RUS-NSC10-N1191 7.02.2011 HBoV2 JX046072 12 HBoV1 RUS-NSC10-N1210 9.02.2011 HBoV1 JX046080 13 HBoV1 RUS-NSC10-N1220 9.02.2011 HBoV1 KJ492896 14 HBoV2RUS-NSC10-N1223 9.02.2011 HBoV2 JX046074 15 HBoV1 RUS-NSC10-N1266 9.02.2011 HBoV1 JX046084 16 HBoV1 RUS-NSC10-N1269 11.02.2011 HBoV1 JX046078 17 HBoV1 RUS-NSC10-N1298 11.02.2011 HBoV1 JX046082 18 HBoV1 RUS-NSC10-N1344 15.02.2011 HBoV1 KJ492897 19 HBoV2 RUS-NSC10-N1391 15.02.2011 HBoV2 JX046073 20 HBoV2 RUS-NSC11-N1506 24.02.2011 HBoV2 JX046097 21 HBoV2 RUS-NSC11-N1539 3.03.2011 HBoV2 JX046089 22 HBoV2 RUS-NSC11-N1543 3.03.2011 HBoV2 JX046099 23 HBoV2 RUS-NSC11-N1548 3.03.2011 HBoV2 JX046100 24 HBoV2 RUS-NSC11-N1557 3.03.2011 HBoV2 JX046090 25 HBoV2 RUS-NSC11-N1588 3.03.2011 HBoV2 JX046091 26 HBoV2 RUS-NSC11-N1703 5.04.2011 HBoV2 JX046103 27 HBoV2 RUS-NSC11-N1726 5.04.2011 HBoV2 JX046104 28 HBoV2 RUS-NSC11-N1734 5.04.2011 HBoV2 JX046102 29 HBoV2 RUS-NSC11-N1736 5.04.2011 HBoV2 JX046098 30 HBoV2 RUS-NSC11-N1737 5.04.2011 HBoV2 JX046094 31 HBoV2 RUS-NSC11-N1739 5.04.2011 HBoV2 JX046093 32 HBoV2 RUS-NSC11-N1749 7.04.2011 HBoV2 JX046096 33 HBoV2 RUS-NSC11-N1768 18.04.2011 HBoV2 JX046105 34 HBoV2 RUS-NSC11-N1770 18.04.2011 HBoV2 JX046095 35 HBoV2 RUS-NSC11-N1771 18.04.2011 HBoV2 JX046101 36 HBoV2 RUS-NSC11-N1777 19.04.2011 HBoV2 JX046092 130 Название изолята 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 HBoV1 RUS-NSC11-N2462 HBoV2 RUS-NSC11-N2472 HBoV1 RUS-NSC11-N2473 HBoV1 RUS-NSC11-N2497 HBoV3 RUS-NSC11-N2512 HBoV2 RUS-NSC11-N2596 HBoV2 RUS-NSC11-N2607 HBoV2 RUS-NSC11-N2609 HBoV4 RUS-NSC11-N2655 HBoV4 RUS-NSC11-N2657 HBoV1 RUS-NSC11-N2904 HBoV2 RUS-NSC11-N2935 HBoV1 RUS-NSC11-N3102 HBoV2 RUS-NSC11-N3107 HBoV2 RUS-NSC11-N3187 HBoV1 RUS-NSC11-N3243 HBoV2 RUS-NSC11-N3280 HBoV2 RUS-NSC12-N4062 HBoV2 RUS-NSC12-N4201 HBoV2 RUS-NSC12-N4333 HBoV1 RUS-NSC12-N4932 HBoV1 RUS-NSC12-N5013 HBoV1 RUS-NSC12-N5028 HBoV1 RUS-NSC12-N5042 HBoV2 RUS-NSC12-N5111 HBoV1 RUS-NSC12-N5274 HBoV2 RUS-NSC12-e24 Дата выявления 5.02.2013 5.02.2013 5.02.2013 5.02.2013 14.03.2013 20.03.2013 21.03.2013 21.03.2013 21.05.2013 22.04.2013 20.09.2013 25.09.2013 24.10.2013 24.10.2013 5.11.2013 14.11.2013 21.11.2013 19.12.2013 20.01.2014 27.01.2014 28.02.2014 27.01.2014 4.02.2014 10.04.2014 24.04.2014 12.05.2014 10.04.2014 131 Генотип HBoV1 HBoV2 HBoV1 HBoV1 HBoV3 HBoV2 HBoV2 HBoV2 HBoV4 HBoV4 HBoV1 HBoV2 HBoV1 HBoV2 HBoV2 HBoV1 HBoV2 HBoV2 HBoV2 HBoV2 HBoV1 HBoV1 HBoV1 HBoV1 HBoV2 HBoV1 HBoV2 Номер GenBank KJ492898 KJ492899 KJ492900 KJ492920 KJ492921 KJ492922 KJ492901 KJ492902 KJ492903 KJ492904 KJ492905 KJ492906 KJ492907 KJ492908 KJ492909 KJ492910 KJ492911 KJ492912 KJ492913 KJ492914 KJ492915 KJ492916 KJ492917 KJ492923 KJ492918 KJ492919 KJ492895
