Особенности биологических свойств и факторов патогенности

ÔÓÍÄÀÌÅÍÒÀËÜÍÀß ÌÅÄÈÖÈÍÀ
УДК 579.841.11
А.В. ЛЯМИН
Самарский государственный медицинский университет
Кафедра общей и клинической микробиологии, иммунологии и аллергологии
ОСОБЕННОСТИ БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ И ФАКТОРОВ
ПАТОГЕННОСТИ ШТАММОВ PSEUDOMONAS AERUGINOSA,
ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ РАЗНЫХ ИСТОЧНИКОВ
Научный руководитель – профессор А.В. Жестков
В работе проводилось изучение биологических свойств и факторов патогенности
штаммов Pseudomonas aeruginosa, выделенных от пациентов с муковисцидозом, наружным диффузным отитом, с хирургической патологией, от здоровых носителей.
Особенности культуральных свойств, наличие пигментообразования, гемолитической, лецитиназной и протеолитической активности проявляются в зависимости от источника выделения. Полученные данные позволяют определить наиболее значимые
биологические и патогенетические признаки для идентификации культур.
Ключевые слова: pseudomonas aeruginosa, биологические свойства, факторы патогенности
In the research work of biological properties and factors of pathogenic strains of
Pseudomonas aeruginosa, isolated from patients with cystic fibrosis, diffuse external otitis,
with surgical pathology, from healthy carriers are studied. Revealed features of cultural
properties, the presence of formation of pigment, hemolytic, phospholipase and proteolytic
activity occur depending on the source selection. These data reveals the most significant
biological and pathogenic features for identification of cultures.
Key words: pseudomonas aeruginosa, biological properties, pathogenicity factors
В последние годы произошли значительные изменения в структуре возбудителей инфекционных заболеваний у человека. Возросла роль условно патогенных
микроорганизмов, в частности грамотрицательных неферментирующих бактерий,
среди которых ведущее место занимает
Pseudomonas aeruginosa. Основной проблемой, связанной с синегнойной инфекцией,
является высокая резистентность возбудителя к антимикробным химиопрепаратам1.
Помимо этого, важной и менее изученной
особенностью P.aeruginosa является значительное разнообразие биологических
свойств и факторов патогенности, проявление которых влияет на идентификацию
данного микроорганизма и течение заболевания.
P. aeruginosa – грамотрицательная подвижная палочка с 1-2 полярно расположенными жгутиками. При определенных
условиях культивирования продуцирует
капсулоподобное вещество – внеклеточную слизь, тонким слоем покрывающую
микробную клетку. Одним из характерных
биологических признаков, отличающих
синегнойную палочку от других микроорганизмов, является способность синтезировать водорастворимый пигмент – пиоциа1
Практическое руководство по антиинфекционной химиотерапии / Под ред. Л.С. Страчунского, Ю.Б. Белоусова, С.Н. Козлова. – Смоленск: МАКМАХ, 2007. – 464 с.
220
нин, окрашивающий питательную среду и
колонии в сине-зеленый цвет. По данным
ряда авторов таким свойством обладают 7080% штаммов2. Кроме достаточно широко
распространенного пигмента сине-зеленого цвета, известны штаммы, продуцирующие желто-зеленый флюоресцирующий
пигмент – пиовердин, красный пигмент
– пиорубин, черный пигмент – пиомеланин, а также штаммы, не продуцирующие
пигментов. Последнее свойство объясняется действием сопутствующей микрофлоры,
антибиотиков, недостатком кислорода3.
На плотных питательных средах P.
aeruginosa может давать 5 типов колоний:
плоские неправильной формы; гладкие с
глянцевой поверхностью; складчатые в виде
«цветков маргариток»; слизистые; карликовые или точечные. Некоторые штаммы при
росте на плотных питательных средах дают
феномен «радужного роста» – спонтанный
лизис культуры без воздействия каких-либо
дополнительных факторов. Некоторые авторы связывают развитие этого феномена
2
В.А. Галынкин, Н.А. Заикина, К.А. Каграманова, В.В. Карцев, Т.С. Потехина. Санитарно-микробиологический
контроль в пищевой и фармацевтической промышленности. – СПб.: 2004. – 248 с.
3
Бухарин О.В., Валышев А.В., Гильмутдинова Ф.Г., Гриценко В.А., Карташова О.Л., Кузьмина М.Д., Усвяцов Б.Я.,
Черкасов С.В. Экология микроорганизмов человека.
Екатеринбург: УрО РАН, 2006. – 480с.
Íàó÷íî-èíôîðìàöèîííûé ìåæâóçîâñêèé æóðíàë
ÔÓÍÄÀÌÅÍÒÀËÜÍÀß ÌÅÄÈÖÈÍÀ
с воздействием бактериофага, которым
изначально инфицирована культура4.
Среди факторов патогенности практически у всех штаммов . aeruginosa выделяют
экзотоксин А, вызывающий глубокое нарушение клеточного метаболизма. Большинство штаммов синегнойной палочки
продуцируют вещества с гемолитической
активностью – фосфолипазу С и собственно гемолизины. Известно, что наиболее
активными продуцентами фосфолипазы
С являются штаммы, выделенные от пациентов с патологией бронхолегочной системы и мочевыводящих путей. Активность
протеолитических ферментов значительно
зависит от источника выделения штамма.
Синегнойная палочка выделяет ряд протеаз,
способных расщеплять казеин, гемоглобин,
фибрин, коллаген. Наличие внеклеточной
слизи у некоторых штаммов P. aeruginosa
также является важным фактором патогенности микроорганизма. Известно, что гликолипопротеид слизи обладает летальной
активностью и вызывает лейкоцитопению.
Продукция слизи некоторыми авторами относится к характерным видовым признакам
синегнойной палочки5.
Цель исследования: выявить наиболее
значимые биологические свойства и факторы патогенности штаммов Pseudomonas
aeruginosa, выделенных из разных источников.
Материалы и методы исследования
В работе изучались биологические
свойства и факторы патогенности у 54 штаммов синегнойной палочки: выделенных от
пациентов с муковисцидозом – 35 штаммов
(64,81%), наружным диффузным отитом – 9
штаммов (16,67%), хирургической патологией – 6 штаммов (11,11%), здоровых носителей и из окружающей среды 4 (7,41%). У
всех штаммов оценивали характер роста на
плотных питательных средах по морфологии колоний, выявляли наличие пигментообразования, феномен «радужного лизиса».
Принадлежность микроорганизмов к виду
P. aeruginosa определяли с использованием
тест-систем коммерческого производства
по биохимическим свойствам. Первичный
посев проводили на среды, стимулирующие выработку пигмента пиоционина,
мясопептонный и кровяной агары. Оценку
культуральных свойств проводили через
24-48 часов инкубации в термостате при
температуре 37,0±0,50С. Затем суточные
культуры пересевали на желточный агар
4
Поздеев О.К. Медицинская микробиология / Под ред.
акад. РАМН В.И. Покровского. – М.: ГЭОТАР-МЕД, 2001.
– 768с.
5
Частная микробиология с техникой микробиологических исследований / Под ред. А.С. Лабинской, Л.П.
Блинковой, А.С. Ещиной. – М.: ОАО «Издательство «Медицина», 2005. – 600с.
для выявления фосфолипазной активности,
кровяной агар – для определения гемолизинов, в желатиновый столбик – для оценки
протеолитической активности. Оценку гемолитической активности проводили через
24-48 часов, фосфолипазной активности
– через 24-48-72 часа, протеолитическую
активность - ежедневно до разжижения желатины (максимально до 14 суток).
Результаты и их обсуждение
Среди штаммов, выделенных от пациентов с муковисцидозом, преобладали культуры с плоскими неправильной формой
(34,29%) и слизистыми колониями (31,43%).
Реже встречались колонии в виде «цветков
маргаритки» - у 25,71% штаммов и точечные
колонии – у 8,57% штаммов. У 25 выделенных штаммов (71,43%) была выявлена
продукция зеленого пигмента, 8 штаммов
(22,86%) выделяли красный пигмент, 2
штамма не выделяли пигментов. Гемолитическую активность показали 26 (74,28%)
из 35 штаммов, выделенных от пациентов с
муковисцидозом; 6 штаммов (17,14%) проявили лецитиназную активность в первые
сутки культивирования; 32 штамма (91,43%)
– на вторые сутки культивирования. У 3
культур не было выявлено лецитиназной
активности. Все культуры, выделенные от
пациентов с муковисцидозом, обладали
протеолитической активностью. При
этом 82,86% штаммов разжижали столбик
с желатином в течение 24 часов, 17,14%
культур вызывали разжижение желатина
через 7 суток культивирования. Ни у одного штамма, выделенного от пациентов с
муковисцидозом, не был выявлен феномен
«радужного лизиса», в связи с этим можно
предположить, что культуры не были инфицированы умеренными бактериофагами.
Таким образом, штаммы, выделенные от
пациентов с муковисцидозом, обладают
выраженной протеолитической активностью (в первые сутки культивирования),
большинство штаммов обладают лецитиназной активностью, которая проявляется
через 24 часа, и гемолитической активностью. Наличие дополнительных факторов
патогенности - внеклеточной слизи было
выявлено более чем у 30% штаммов. Данный
признак нельзя отнести к характерным видовым особенностям синегнойной палочки, но его наличие необходимо учитывать
при идентификации культур, особенно, от
пациентов с муковисцидозом.
Штаммы, выделенные от пациентов с
наружным диффузным отитом, обладали
следующими свойствами. Преобладали
культуры с формой колоний в виде «цветков
маргаритки» - 4 штамма (44,45%). Плоские
колонии с неровным краем и точечные
колонии выявлены у 2 штаммов. Одна куль-
Àñïèðàíòñêèé âåñòíèê Ïîâîëæüÿ ¹ 3-4, 2010
221
ÔÓÍÄÀÌÅÍÒÀËÜÍÀß ÌÅÄÈÖÈÍÀ
тура оказалась мукоидной; 100% штаммов
выделяли зеленый пигмент пиоционин. У
77,78% культур была выявлена гемолитическая активность (7 штаммов). Лецитиназную
активность в первые сутки культивирования проявили 2 штамма, 7 штаммов – на
вторые сутки культивирования. Разжижение желатины в течение 24 часов было
выявлено у одного штамма, 4 культуры
проявляли протеолитическую активность
на 7 день культивирования, 4 культуры не
обладали протеолитической активностью
(культивирование в течение 14 суток).
Спонтанный лизис был выявлен у 6 культур
(66,67%), 3 штамма не обладали феноменом
«радужного лизиса». Штаммы, выделенные
от пациентов с отитами, обладали менее
выраженной протеолитической активностью, чем штаммы, выделенные от пациентов с муковисцидозом; часть штаммов
не разжижали желатин в течение 14 дней
культивирования. Большинство штаммов
обладали гемолитической и лецитиназной
активностью, проявляли спонтанный лизис.
Отличительной особенностью культур, выделенных от пациентов с отитами, является
выделение пиоционина – данный признак
выявлен у всех культур.
Из 6 штаммов синегнойной палочки,
выделенных от пациентов с хирургической
патологией, 5 дали рост в виде плоских
колоний с неровным краем, выделяли зеленый пигмент, спонтанно лизировались,
обладали протеолитической активностью
(на 7-й день культивирования). Один штамм
выделял пигмент красного цвета, не обладал феноменом «радужного лизиса», имел
гладкие колонии и обладал способностью
разжижать желатин в течение 24 часов.
Все штаммы, выделенные от пациентов с
хирургической патологией, обладали выраженной гемолитической активностью
и лецитиназной активностью на вторые
сутки культивирования, 4 штамма проявляли лецитиназную активность в первые
сутки культивирования. Преобладающим
патогенетическим признаком штаммов,
выделенных от пациентов с хирургической
патологией, было наличие выраженной гемолитической активности. Протеолитическая и лецитиназная активность проявлялись
позже и в меньшей степени. Практически
все культуры спонтанно лизировались, что
свидетельствует об их инфицированности
бактериофагами.
Штаммы, выделенные от здоровых носителей и из окружающей среды, давали рост
в виде плоских колоний с неровным краем
(2 культуры) и точечных колоний (2 культуры), один штамм был непигментирован,
2 выделяли пигмент зеленого цвета, один
– красного цвета. Все штаммы проявляли
222
умеренную гемолитическую активность и
лецитиназную активность на вторые сутки
культивирования, разжижали желатину на
7-е сутки культивирования и давали феномен «радужного лизиса». Отличительной
особенностью штаммов, выделенных от
здоровых носителей и из окружающей
среды, является умеренное проявление
факторов патогенности, разнообразие пигментов, спонтанный лизис культур.
Выводы
В работе выявлены особенности биологических и патогенетических свойств
штаммов P.aeruginosa, в зависимости от
источника выделения. Для штаммов, выделенных от пациентов с муковисцидозом,
характерна выраженная протеолитическая
активность, которая проявляется в первые
сутки культивирования, более трети культур
обладали способностью образовывать внеклеточную слизь. Практически все штаммы
выделяли фосфолипазу и гемолизины. Культуральные свойства выделенных штаммов
не имели выраженной тенденции. Был выявлен низкий уровень инфицированности
культур бактериофагами.
Среди штаммов, выделенных от пациентов с наружными диффузными отитами,
преобладали культуры с типичными культуральными свойствами – пигментообразованием и спонтанным лизисом. Протеолитическая активность данных штаммов
была умеренной, практически все штаммы
обладали фосфолипазной и гемолитической активностью.
Основным патогенетическим признаком штаммов, выделенных от пациентов с
хирургической патологией, оказалась выраженная гемолитическая активность при
умеренном проявлении протеолитических
свойств и лецитиназной активности. Большинство штаммов обладали способностью
продуцировать пигмент и были инфицированы бактериофагами. Штаммы, выделенные от здоровых носителей и из окружающей среды обладали разнообразными
биологическими свойствами и умеренной
патогенетической активностью.
Анализируя полученные данные, можно
сделать заключение о нецелесообразности
ограничения предварительной идентификации культур синегнойной палочки по
рутинным признакам (выделение пиоционина, образование внеклеточной слизи,
спонтанный лизис культуры). Для каждой
группы источников характерны свои
особенности биологических и патогенетических свойств, которые необходимо
учитывать при выделении и идентификации культур, полученных от пациентов с
различными заболеваниями и из окружающей среды.
Íàó÷íî-èíôîðìàöèîííûé ìåæâóçîâñêèé æóðíàë