изучение бактериальных l-форм s. aureus для диагностики

Дальневосточный Журнал Инфекционной Патологии ● №16 – 2010 г.
УДК 57.086.3:579.23+579.22:612.118.22:579.8.
ИЗУЧЕНИЕ БАКТЕРИАЛЬНЫХ L-ФОРМ S. AUREUS
ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ЭНДОТОКСИКОЗА
ПРИ ОСТРЫХ АБСЦЕССАХ ЛЕГКИХ
К.В. Самсонов, В.М. Катола
Учреждение РАМН Дальневосточный научный центр физиологии
и патологии дыхания СО РАМН, г.Благовещенск
Методом прямой электронно-микроскопической диагностики, в плазме крови 39 больных с
острым абсцессом легких, констатирована бактериемия в виде микроскопических и субмикроскопических бактериальных структур, относящихся к L-формамm S. aureus. По количеству и качеству этих бактерий дифференцированы три степени бактериального эндотоксикоза.
Ключевые слова: бактериальные L-формы S. aureus, эндотоксикоз, острые абсцессы легких.
THE STUDY OF BACTERIAL L-SHAPED STRUCTURES IN BLOOD FOR DIAGNOSTIC ENDOTOXICOSIS AT ACUTES LUNGS ABSCESSES
K.V.Samsonov, V.M.Katola
Public institution, Far Eastern Scientific Center of Physiology and Pathology SB RAMS, Blagoveschensk
We used method of direct electron microscopic diagnostics to examine 39 patients with acute lung
abscess. The method enabled us to show microscopic and submicroscopic S. aureus L-shaped
structures. This lead us to diagnose bacteriemia. Depending on the amount and character of the
bacteria we diagnosed three degrees of bacterial endotoxicosis.
Key words: S. aureus L-shaped structures, endotoxicosis, acutes lungs abscesses.
Введение
Бактериальный эндотоксикоз всегда развивается при острых абсцессах легких. Его обусловливают бактериальные токсины, токсические продукты распада белковых молекул, клеток, тканей,
нарушения детоксикационной функции легких, печени, почек и др. [3].
Для диагностики эндотоксикоза и степени его выраженности используются клинические признаки, гематологические, биохимические маркеры и биологические тесты на экспериментальных животных или простейших. Однако при всех значимых достоинствах эти методы относительны, несопоставимы, порою громоздки. Кроме того, из-за небольшого количества бактерий, находящихся в крови,
с помощью этих методов не всегда можно диагностировать бактериемию, следовательно, определить
наличие эндотоксикоза. Так, при бактериальных пневмониях гемокультура выделяется в 10-40% случаев [1], при сепсисе - в 90% [1]. Более того, даже по выделенной гемокультуре невозможно судить о
всех изменениях, которые происходят с бактериями непосредственно во внутренней среде макроорганизма. Мы предполагаем, что редкая высеваемость бактерий из крови при бактериальном эндотоксикозе может быть связана не только с их малым количеством, но и, в первую очередь, морфологической изменчивостью под влиянием продуктов деструкции тканевых белков, свободнорадикального
окисления, биологически активных аминов и других веществ [2].
В настоящей работе представлены результаты исследования плазмы у пациентов с острыми
стафилококковыми абсцессами легких и здоровых лиц с помощью прямой электронной микроскопии и
бактериологическим методом с целью выявления бактериемии, обусловленной S. aureus и диагностики бактериального эндотоксикоза.
Материал и методы исследования
Обследовано 39 взрослых мужчин и женщин, находящихся на лечении по поводу острых абсцессов лёгких, и 15 здоровых людей (контрольная группа).
Плазму крови, взятую у пациентов и здоровых лиц в количестве 0,1 мл (одна капля) наносили
на торцовую поверхность объектного столика сканирующего электронного микроскопа JEOL jsm-35C
(Япония) и подсушивали в стерильной чашке Петри. Подсохшую плазму напыляли углеродом в вакуумной установке ВУП-4, затем просматривали в указанном микроскопе. Для обработки и интерпрета-
82
Дальневосточный Журнал Инфекционной Патологии ● №16 – 2010 г.
ции результатов в 7-12 полях зрения подсчитывали количество визуализированных бактериальных
форм, определяли их размеры и функциональное состояние (способ размножения, образование
конгломератов и элементарных телец). Степень надежности полученных данных оценивали статистическим анализом, сопоставляя с тяжестью клинического течения и исходом заболевания, показателями крови (молекулами средней массы – МСМ) [4] и «парамецийным временем». Последнее указывает на продолжительность жизни инфузорий Paramecium caudatum в плазме крови здоровых лиц
и пациентов [5].
Одновременно для выявления S. aureus осуществляли посевы цельной крови и плазмы (отдельно) на питательную среду, посевы инкубировали в термостате при 37°.
Результаты исследований и обсуждение
Сразу же отметим, что в плазме крови, взятой у лиц контрольной группы, каких-либо изменений, видимых в электронном микроскопе, не обнаружено. У всех больных острыми абсцессами легких, помимо клинических признаков интоксикации (гипертермия, тахикардия, одышка, слабость, потливость и др.), выявлялись показатели крови, типичные для эндотоксикоза (лейкоцитоз, токсическая
зернистость нейтрофилов, лейкоцитарный индекс интоксикации и др.) и изменения времени жизнеспособности парамеций. У всех пациентов опытной группы, еще до получения результатов бактериального исследования крови, в процессе просмотра плазмы в электронном микроскопе констатирована бактериемия. В плазме больных острыми абсцессами легких обнаруживались клетки овальной либо сферической формы (чаще всего в стадии деления), но при этом дочерние клетки не расходились
и образовывали клеточные группы в состоянии несбалансированного роста (НРК), что присуще начальным этапам L-трансформации бактерий [6]. Встречались также деформированные шаровидные
клетки (ДШК), небольшие конгломераты (К), сформированные шаровидными клетками и элементарные тельца (ЭТ) диаметром 0,3-0,15 мкм.
В отличие от электронно-микроскопического бактериологическое исследование крови (плазмы) не всегда давало положительную информацию. Через 48 часов инкубации посевов получен рост
монокультуры Staphylococcus aureus лишь у 24 (61,5%) больных с острыми абсцессами легких. Поэтому выявить бактериемию, которая подтверждала бы сопутствующий основному заболеванию бактериальный эндотоксикоз, удается не всегда. При абсцессе легких распознание бактериемии облегчается гораздо более частым выделением гемокультуры. Но и гемокультура имеет ограниченную
ценность, поскольку отражает далеко не все свойства, присущие многоклеточной популяции, циркулирующей непосредственно в крови, например, не определяет форму ее клеток, целостность клеточной стенки бактерий и др. В организме больных острыми абсцессами легких стафилококковой этиологии бактерии испытывают влияние иммунобиологических сил, продуктов распада тканей, ферментов (лизоцим), некоторых аминокислот (аргинин, глицин, фенилаланин), избирательно действующих
лекарственных средств (например, пенициллин) и других веществ. В итоге прямо или косвенно могут
блокироваться звенья биосинтеза клеточной стенки [6,7]. Именно от состояния клеточной стенки бактерий часто зависит выбор антибактериальных препаратов и эффективность лечения. Таким образом, электронномикроскопический просмотр плазмы крови у больных при гнойно-некротических процессах в легких более информативен, чем ее исследование известными микробиологическими методами, в том числе применяемыми для диагностики микробного эндотоксикоза.
При острых абсцессах легких наблюдалась четкая корреляция между бактериальными морфотипами, циркулирующими в крови (их количеством, формой, размерами, функциональным состоянием) и выраженностью эндотоксикоза. На основании этого нами предложен способ диагностики эндотоксикоза (патент РФ №2291431 от 10 января 2007г.), позволяющий дифференцировать три степени тяжести бактериального эндотоксикоза (Рис.1).
Степени тяжести эндотоксикоза имели следующие характеристики:
1 степень – легкая. При остром стафилококковом абсцессе легких в плазме крови выявлялись (рис.1а) овальные клетки стафилококка на стадии НРК (2,0 ± 0,06,n=10, р <0,001) и ЭТ (14,0 ±
1,87, n=10, р <0,001); (n – количество просмотренных полей зрения).
2 степень – средней тяжести. В плазме крови просматриваются (рис. 1б): мелкие К – 5,0 ±
0,46 (n= 8, p <0,001) и ЭТ – 6,0 ± 0,7 (n= 8, p <0,001).
3 степень – тяжелая. В плазме крови обнаруживаются (рис. 1в) конгломераты величиною до
5 мкм, деформированные шаровидные клетки и различных размеров ЭТ. Количество К составляет 3,0
± 0,21 (n= 10, р <0,001), ДШК – 2,0 ± 0,042 (n= 10, р <0,001), ЭТ – 6,0 ± 0,63 (n= 10, p <0,001).
83
Дальневосточный Журнал Инфекционной Патологии ● №16 – 2010 г.
а
б
в
Рис.1. Бактериальные формы, характеризующие степени тяжести эндотоксикоза при
острых абсцессах легких, выявленные при сканирующей электронной микроскопии: а – 1 степень (легкая) –неразделившиеся клетки стафилококка и мелкие ЭТ. Ув. 9400; б – 2 степень
(средней тяжести) – мелкие L-конгломераты и ЭТ стафилококка. Ув. 8600; в – 3 степень (тяжелая) – L-конгломераты, деформированные шаровидные клетки и ЭТ стафилоккока. Ув. 8600.
Для сравнения у всех больных в крови исследовали ряд показателей, свидетельствующих, по
данным литературы, об эндотоксикозе: молекулы средней массы (МСМ) в единицах оптической плотности, жизнеспособность парамеций («парамецийное время») в минутах. Результаты исследований
представлены в табл.1.
Таким образом, с помощью прямой сканирующей электронной микроскопии плазмы крови у
всех больных острыми абсцессами легких (100%) была констатирована бактериемия. Её маркерами и
признаками бактериального эндотоксикоза служили микроскопические и субмикроскопические бактериальные структуры, проникшие в кровеносное русло из очага первичного гнойно-некротического
воспаления.
Большинство этих структур соответствуют известным вариантам L-форм бактерий - деформированным шаровидным клеткам, их конгломератам и элементарным тельцам.
Морфологическое разнообразие и количественные соотношения циркулирующих в крови бактериальных форм при ГНЗЛ позволяют дифференцировать степень тяжести бактериального эндотоксикоза.
84
Дальневосточный Журнал Инфекционной Патологии ● №16 – 2010 г.
Таблица 1
Биологические, биохимические и бактериальные показатели степени тяжести эндотоксикоза у
больных острыми абсцессами легких
Показатели эндотоксикоза в плазме
крови
«Парамеций-ное
время» в минутах
МСМ в единицах
оптической плотности
НРК
Степени тяжести эндотоксикоза
Контрольная
группа
(n=15)
22,5±0,10
Легкая
(n=17)
13,9±0,60 р<0,001
Средняя (n=12)
Тяжелая (n=11)
9,9±0,46
р<0,001
0,450±0,02
р<0,001
7,9±0,45 р<0,001
0,280±0,007
0,350±0,019
р<0,01
0,530±0,02
р<0,001
-
2,0±0,06
р<0,001
-
-
К
-
-
3,0±0,21
р<0,001
5,0±0,46
р<0,001
ДШК
-
-
-
2,0±0,042
р<0,001
ЭТ
14,0±1,4
6,0±0,7
6,0±0,63
р<0,001
р<0,001
р<0,001
Примечание: - тест-показатели не обнаружены; НРК-несбалансированный рост клеток стафилококка; К-конгломераты L-форм бактерий; ДШК-деформированные шаровидные клетки; ЭТ- элементарные тельца L-форм бактерий.
Выводы
1. С помощью прямой сканирующей электронной микроскопии плазмы крови у всех больных
(100%), принимавших лечение по поводу острого стафилококкового абсцесса легких, констатирована
бактериемия. Ее маркерами и признаками бактериального эндотоксикоза были микроскопические и
субмикроскопические бактериальные структуры, проникающие в кровяное русло из очага первичного
воспаления. Большинство этих структур соответствуют известным вариантам L-форм бактерий – деформированным шаровидным клеткам, их конгломератам и элементарным тельцам.
2. Морфологическое разнообразие циркулирующих в крови бактериальных форм при острых
абсцессах легких позволяет дифференцировать три степени (фазы) тяжести бактериального эндотоксикоза: 1-ю степень (легкую), 2-ю степень (средней тяжести) и 3-ю степень (тяжелую).
3. Предлагаемый способ диагностики бактериального эндотоксикоза посредством выявления
бактериемии с помощью прямой сканирующей электронной микроскопии наиболее эффективен, объективен, позволяет уменьшать количество и объем исследуемого материала, материальные и временные затраты.
Литература
1. Гостищев В.К. Общая хирургия. // М.: Медицина, 1993. – С.349-350.
2. Дорохин К.М., Спасс В.В. Патофизиологические аспекты синдрома эндогенной интоксикации. // Анестезиол. и реаниматол. - 1994. -№1. – С.56-60.
3. Костюченко А.Л., Белоцерковский М.В., Соколов А.А. Острый эндотоксикоз. // Медиц. лаб.
диагностика. – СПб.: Интермедика, 1997. – С.246-264.
4. Матвеев С.Б., Давыдов Б.В., Теселкин Ю.О. и др. Критерии оценки эндогенной интоксикации у больных пельвиоперитонитом. // Клин. лабор. диагностика. - 2009. - №4. – С.15-16.
5. Пафомов Г.А., Бурдыго Ф.А., Широнова М.А. Экспресс-метод определения токсических
свойств крови и лимфы с помощью парамеций при экзо- и эндотоксикозе. // Сов. мед. – 1980. - №1. –
С.42-45.
6. Прозоровский С.В., Кац Л.Н., Коган Г.Я. L-формы бактерий (Механизм образования, структура, роль в патологии). // М.: Медицина, 1984. – 236с.
7. Тимаков В.Д., Коган Г.Я. L-формы бактерий и семейство Mycoplasmataceae в патологии. //
М.: Медицина, 1973. – 371с.
85