Новые аэробные метилотрофные бактерии из солёных биотопов

Федеральное агентство по образованию
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение
Высшего профессионального образования
Пущинский государственный естественно-научный институт
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки
Институт биохимии и физиологии микроорганизмов
им. Г. К. Скрябина РАН
На правах рукописи
ШМАРЕВА (ПОРОШИНА) МАРИЯ НИКОЛАЕВНА
Новые аэробные метилотрофные бактерии из солёных
биотопов
(03.02.03 – Микробиология)
Диссертация на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Научный руководитель
д.б.н., в.н.с., проф. Н. В. Доронина
Пущино 2016
2
Оглавление
ВВЕДЕНИЕ ............................................................................................................................................. 5
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ .......................................................................................................................... 8
1. Метилотрофные бактерии ............................................................................................................. 8
1.1. Таксономия метилотрофных бактерий ................................................................................. 8
1.2. Пути окисления и ассимиляции С1-соединений ................................................................ 19
1.2.1. Окисление метанола........................................................................................................... 19
1.2.2. Окисление формальдегида ................................................................................................ 20
1.2.3. Циклический рибулозомонофосфатный путь ................................................................. 22
1.2.4. Окисление формиата .......................................................................................................... 23
1.2.5. Рибулозомонофосфатный путь ......................................................................................... 24
1.2.6. Рибулозобисфосфатный (РБФ) путь ................................................................................ 25
1.2.7. Сериновый цикл ................................................................................................................. 26
1.3. Центральный метаболизм..................................................................................................... 31
2. Синтез полигидроксибутирата – биодеградабельного ............................................................. 32
и биосовместимого полимера ......................................................................................................... 32
2.1. Продуценты ПГБ ................................................................................................................... 35
2.2. Синтез ПГБ и генетическая организация ............................................................................ 38
2.3. Синтез ПГБ и центральный метаболизм ............................................................................. 40
2.4. Метилотрофные продуценты ПГБ....................................................................................... 42
2.5. Применение ПГБ ................................................................................................................... 44
3. Осмоадаптация ............................................................................................................................. 46
3.1. Осмотическое давление ........................................................................................................ 46
3.2. Физиологические группы микроорганизмов по отношению............................................ 47
к осмотическому давлению ......................................................................................................... 47
3.3. Типы осмоадаптации ............................................................................................................ 48
3.4. Первоначальный этап осмоадаптации ................................................................................ 50
3.5. Осмолиты ............................................................................................................................... 52
3.6. Синтез эктоина и генетическая организация у метилобактерий ...................................... 55
3.7. Применение эктоина ............................................................................................................. 59
3.8. Галофильные метилобактерии ............................................................................................. 60
3.9. Осмопротекторы метилобактерий ....................................................................................... 61
4. Материалы и методы.................................................................................................................... 64
4.1. Объекты исследования ............................................................................................................. 64
4.2. Методы исследования ........................................................................................................... 66
4.2.1. Микроскопия ...................................................................................................................... 66
4.2.2. Методы работы с культурами ........................................................................................... 67
3
4.2.2.1. Состав питательных сред ............................................................................................. 67
4.2.2.2. Получение накопительных культур............................................................................... 68
4.2.2.3. Выделение чистых культур ............................................................................................ 68
4.2.2.4. Культивирование бактерий ........................................................................................... 68
4.2.3. Изучение культуральных и физиолого-биохимических свойств .................................. 71
4.2.4. Экстракция ПГБ/В из биомассы и определение молекулярной массы......................... 73
4.2.5. Аналитические методы ...................................................................................................... 74
4.2.5.1. Выделение и анализ изопреноидных хинонов ................................................................ 74
4.2.5.2. Определение состава жирных кислот ......................................................................... 74
4.2.5.3. Определение состава фосфолипидов ............................................................................ 75
4.2.5.4. Определение осмопротекторов ..................................................................................... 76
1) Определение осмопротекторов методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) ............ 76
2) Анализ аминокислот ................................................................................................................ 77
3) Количественный анализ сахарозы.......................................................................................... 77
4) Определение количества эктоина методом нормально-фазовой высокоэффективной
жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) ...................................................................................... 78
4.2.5.5. Определение количества ПГБ в биомассе и соотношения 3-гидроксибутирата/3гидроксивалерата (3ГБ/3ГВ) методом обращённо-фазовой ВЭЖХ ...................................... 79
4.2.5.6. Определение концентрации азота ................................................................................ 80
4.2.5.7. Спектрофотометрические измерения ......................................................................... 80
4.2.5.8. Количественное определение белка ............................................................................... 80
4.2.5.9. Протеомный МАЛДИ-анализ......................................................................................... 82
4.2.6. Биохимические методы ..................................................................................................... 83
4.2.6.1. Определение активностей ферментов ......................................................................... 83
4.2.6.2. Биохимические тесты .................................................................................................... 87
4.2.7. Радиометрические измерения ........................................................................................... 87
4.2.8. Молекулярно-генетические методы ................................................................................. 88
4.2.8.1. Выделение и анализ ДНК ................................................................................................ 88
4.2.8.2. RAPD-анализ (метод случайной амплификации
полиморфной бактериальной ДНК) ........................................................................................... 89
4.2.8.3. Филогенетический анализ .............................................................................................. 89
5. Результаты..................................................................................................................................... 91
5.1. Характеристика метилобактерий из биотопов Урала ........................................................ 91
5.1.1. Морфология изолятов ........................................................................................................ 91
5.1.2. Культуральные, физиолого-биохимические и хемотаксономические свойства .......... 93
5.1.3. Энзимологический анализ ................................................................................................. 98
5.1.4. Филогенетический анализ ............................................................................................... 100
5.2.Характеристика метилобактерий из парка Памуккале ..................................................... 107
5.2.1. Морфология ...................................................................................................................... 107
4
5.2.2. Культуральные, физиолого-биохимические и хемотаксономические свойства ........ 108
5.2.3. Энзимологический анализ ............................................................................................... 110
5.2.4. Филогенетический анализ ............................................................................................... 113
5.2.5. Дифференцирующие признаки подвида A. kashmirensis subsp. nov. methyliсa. ......... 116
5.3. Биосинтез полигидроксиалканоатов из метанола
метилобактериями ...................................................................................................................... 118
5.3.1. Культивирование штаммов ............................................................................................. 118
5.3.2. Характеристика ПГБ ........................................................................................................ 120
5.3.3. Энзимологический анализ ............................................................................................... 121
5.3.4. Биосинтез ПГБ/В продуцентами M. halotolerans С2T и M. extorquens G10 ................ 122
5.3.5. Биосинтез ПГБ продуцентом Methylobrevis pamukkalensis PK2T ................................ 123
Диагнозы новых таксонов ............................................................................................................. 125
ЗАКЛЮЧЕНИЕ .................................................................................................................................. 132
ВЫВОДЫ ............................................................................................................................................ 134
Список сокращений и условных обозначений ........................................................................ 135
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.............................................................................................................. 136
5
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность проблемы. Аэробные метилобактерии – группа прокариот,
использующих в качестве источников углерода и энергии окисленные или замещённые производные метана, но не метан. Эта таксономически и физиологически
гетерогенная группа включает представителей более 50 родов, относящихся к
классам Alpha-, Beta- и Gammaproteobacteria, Verrucomicrobiae, Firmibacteria, Actinobacteria и Flavobacteriia (Kolb, 2009; Троценко и др., 2010; Доронина и др.,
2015).
В последнее время сформировалось представление о таксономическом и
структурно-функциональном многообразии умеренно галофильных аэробных метилобактерий, их важной экофизиологической роли в различных биотопах и механизмах осмоадаптации. Аэробные умеренно галофильные метилобактерии обнаружены в морской воде, содовых озёрах, засолённых почвах и разрушающемся
мраморе. В природе метилобактерии часто ассоциированы с метанотрофами, поскольку используют продукты неполного окисления метана – метанол, формальдегид и муравьиную кислоту. Кроме того, галофильные метилобактерии образуют
с гетеротрофами и растениями устойчивые метилотрофные сообщества, поставляя
гетеротрофам экзометаболиты и, в свою очередь, получая факторы роста (витамины).
Целенаправленный поиск и изучение метилобактерий, адаптированных к
условиям экстремальных биотопов, актуальны для оценки биоразнообразия и роли этих бактерий в различных природных и техногенных эконишах, а также в связи с перспективами их использования в качестве модельных объектов при исследовании молекулярных механизмов адаптации и реализации биотехнологического
потенциала.
Цель и задачи исследования. Цель данной работы – выделение и характеристика метилобактерий из солёных природных и техногенных биотопов России
и Турции. Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:
1.
Выделить чистые культуры метилобактерий из солёных биотопов Урала и
национального парка Памуккале (Турция);
6
2.
изучить цитофизиологию и хемотаксономические признаки изолятов;
3.
провести энзимологический анализ путей С1-метаболизма новых штаммов;
4.
идентифицировать выделенные штаммы методами полифазной таксономии;
5.
определить
осмопротекторы
и
запасные
вещества
галофильных
и
галотолерантных метилобактерий.
Научная новизна работы. Получены новые данные о биоразнообразии и
метаболическом потенциале аэробных метилобактерий из солёных биотопов. С
использованием методов полифазной таксономии описаны: новый род и вид галотолерантных метилобактерий Methylobrevis pamukkalensis (Poroshina et al., 2015),
новый род умеренных галофилов Methyloligella, включающий два вида:
Methyloligella halotolerans и Methyloligella solikamskensis (Doronina et al., 2013).
Описаны три новых галотолерантных вида: Methylopila oligotropha, Ancylobacter
defluvii и Paracoccus communis (Порошина и др., 2013). Кроме того, три изолята
идентифицированы как представители известных видов: умеренный галофил
Methylophaga thalassica LS, галотолерантный штамм Ancylobacter rudongensis
S3270 и негалофильный штамм Arthrobacter protophormiae 2395В (Порошина и
др., 2013), а один изолят – как подвид вида Advenella kashmirensis – A. kashmirensis
subsp. methylica (Порошина и др., 2015). Полученные данные расширяют представление о биоразнообразии аэробных галофильных/толерантных метилобактерий из техногенных и природных биотопов, а также раскрывают перспективы их
применения в качестве объектов биотехнологии.
Научно-практическое значение работы. Расширен спектр детально охарактеризованных культур аэробных метилобактерий, устойчивых к высоким значениям солёности. Новые изоляты накапливают универсальный биопротектор эктоин (до 20% от веса сухих клеток) и биодеградабельный и биосовместимый полимер – полигидроксибутират (ПГБ) (40–50% от веса сухих клеток), что позволяет считать их потенциальными продуцентами этих соединений на основе непищевого возобновляемого сырья – метанола. Все новые виды представлены в международных коллекциях микроорганизмов и доступны научной общественности для
последующих исследований как в теоретическом, так и в прикладном аспектах.
7
Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на 15–
19-й международных школах-конференциях «Биология – наука 21 века» (Пущино,
2011–2015 гг.), на VIII и IX Молодёжных конференциях с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, ИНМИ РАН,
2012–2013 гг.), на конференциях «Экотоксикология» (Тула, 2010; 2014 гг.), ежегодных конференциях ИБФМ РАН (Пущино, 2011–2014 гг.), международной
конференции «XIII Съезд общества микробиологов Украины им. С.Н. Виноградского» (Ялта, 2013).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 работ, из них 6
статей – в рекомендованных ВАК РФ рецензируемых научных журналах, входящих в международные базы данных.
Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, экспериментальной части, диагнозов новых таксонов, заключения, выводов и списка цитированной литературы. Текст
работы занимает 169 страниц, содержит 21 рисунок и 19 таблиц. Список цитируемой литературы содержит 324 ссылки.
Автор искренне признателен д.б.н. (ИБФМ РАН), проф. (ПущГЕНИ) Дорониной Н.В. и зав. лабораторией радиоактивных изотопов, д.б.н., проф. Троценко
Ю.А. за постоянное внимание и поддержку на всех этапах работы. Автор благодарен к.б.н. Капаруллиной Е.Н., к.т.н. Ежову В.А. и всем коллегам по лаборатории за помощь при выполнении диссертационной работы, а также проф. Х.Ф.
Ферна́ндес-Гарайсаба́лу и д-ру А. Хибельо (Мадридский Университет Комплутенсе, Испания), любезно предоставивших для сравнительных исследований
штаммы Advenella. Работа поддержана грантами: РФФИ № 14-04-31352-мол_а,
РНФ
№14-14-01045,
РФФИ
№13-04-01520-А,
ГЗ
№6.749.2014/к,
ГК
№02.740.11.0296, ГК №1.2-14-512-0025, а также проектом «УМНИК» (2010–2012
гг.).
8
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1. Метилотрофные бактерии
Метилотрофия – это специализированный тип питания микроорганизмов,
растущих на восстановленных одноуглеродных соединениях или соединениях с
несколькими С-атомами, но не имеющих С-С связи (метанол, метиламин, дихлорметан и др.). Впервые бактерии, способные использовать метанол в качестве
источника углерода и энергии, были выделены Лёвом (Loew) в конце XIX в. и
названы Bacillus methylicus; однако метилотрофия как научное направление сформировалось лишь во второй половине XX века, после публикации классических
работ Д. Р. Квейла по расшифровке путей ассимиляции С1-соединений и определению их ключевых ферментов у розовоокрашенной бактерии Pseudomonas sp.
AM1 (Peel and Quayle, 1961). Метилотрофы широко распространены в природе,
играют важную роль в глобальном цикле углерода, в биоремедиации галогенированных углеводородов и представляют интерес для биотехнологического применения из-за относительно недорогого и доступного сырья – метанола (Murrell and
McDonald, 2000). Филогенетически метилотрофные бактерии относятся к Alpha-,
Beta- или Gammaproteobacteria, а также включают грамположительных бактерий.
К настоящему времени известно более 50 родов метилобактерий.
1.1. Таксономия метилотрофных бактерий
Таксономическая информация играет важную роль в обеспечении надёжной
идентификации штаммов микроорганизмов из клинических образцов или окружающей среды. Начало бактериальной таксономии было положено в конце XIX
века. Первоначально бактерии классифицировали на основе базовых фенотипических маркеров, таких как морфология, ростовые требования или патогенность.
Позже для этой цели стали использовать физиологические и биохимические свойства бактерий; с 1960–1980 гг. имели место хемотаксономия, нумерическая таксономия и метод ДНК-ДНК гибридизации. С появлением в 1980-х гг. методов амплификации ДНК и секвенирования генов, в частности гена 16S рРНК, в бактериальной классификации был сделан важный шаг вперёд. Затем, начиная с середины
9
1990-х гг., революционно новый метод полногеномного секвенирования и аннотации геномов позволил получить доступ к полной генетической информации
штаммов (Ramasamy et al., 2014), породив дочерние методы, разработанные и
предложенные для таксономических целей, среди которых – анализ мультилокусной последовательности (MLSA), средней нуклеотидной идентичности (ANI) и
другие (Glaeser and Kämpfer, 2015). В настоящее время общепринято, что значения средней нуклеотидной идентичности (ANI), равные 95–96%, приравниваются
к величине ДНК-ДНК гибридизации, равной 70% (Kim et al., 2014). Несмотря на
общий прогресс в методах на основе полногеномного секвенирования, многие из
них не имеют расчётов корреляции значений с классическими тестами, например,
методами ДНК-ДНК гибридизации и секвенирования гена 16S рРНК, соответственно, требуют верификации традиционными методами и поэтому не приняты в
качестве широко используемого источника таксономической информации.
Таким образом, процедуру идентификации бактериального штамма в настоящее время, как правило, производят путём сравнения его фенотипических, хемотаксономических и генотипических/молекулярных характеристик (Ramasamy et
al., 2014) с описанными ранее типовыми штаммами по надёжным, воспроизводимым и информативным таксономическим схемам (Thompson et al., 2013).
1.1.1. Описание нового вида
Бактериальный вид определяется как «монофилетически и геномно связанная группа индивидуальных организмов, имеющих высокую степень сходства в
отношении многих независимых сравнительных характеристик, полученных в
стандартных условиях, и диагностируется по разделяющим фенотипическим
свойствам» (Rosselló-Móra and Amann, 2001; Stackebrandt et al., 2002). C точки
зрения генотипической идентификации, вид определяется как «группа штаммов, в
том числе типовой штамм, имеющих >70% сходства ДНК-ДНК гибридизации, <5
мол.% отличий содержания Г+Ц в геномной ДНК, >98,65% сходства последовательностей генов 16S рРНК (Kim et al., 2014).
10
В результате идентификации изолят будет либо отнесён к известному виду,
либо классифицирован и описан как представитель нового таксона. Номенклатура, т.е. присвоение классифицируемому организму названия соответствующего
таксономического ранга, проводится согласно правилам Кодекса Номенклатуры
Бактерий (Lapage et al., 1992) (http://www.bacterio.net/-code.html).
Следует отметить, что указанные пороговые значения сходства имеют
определённые исключения. Так, ген 16S рРНК проявляет высокую степень консервативности в некоторых таксонах, как это имеет место для видов рода Brucella
и видов класса Actinobacteria, которые не различаются более чем на 1 и 2%, соответственно. Большинство филогенетически близких видов рода Rickettsia имеют
значения ДНК-ДНК гибридизации ≤70%, что затрудняет определение таксономического статуса этих изолятов (Ramasamy et al., 2014).
Микробиологам рекомендуется основывать описание видов на более чем
одном штамме (Christensen et al., 2001), причём следует подчеркнуть, что типовой
вид рода является обязательным ориентиром, с которым должен быть сравнён новый вид, если он считается членом того же рода. Точно так же виды, помещённые
в новый род, должны быть сравнены с типовыми видами наиболее тесно связанных (см. пороговые значения сходства последовательностей 16S рРНК и ДНКДНК гибридизации) таксонов. В случае сравнения между семействами, должны
быть включены типовые роды, и, соответственно, типовые штаммы типовых видов типовых родов (Tindall et al., 2010). Обязательным требованием для описания
новых видов или подвидов является депонирование типового штамма по крайней
мере в двух разных коллекциях культур, в странах, преимущественно расположенных в разных частях мира (De Smet et al., 2013), а также каталогизация и хранение последовательностей генов 16S рРНК типовых штаммов в Международных
базах данных нуклеотидных последовательностей – INSDC (http://www.insdc.org/),
в том числе GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/).
11
1.1.2. Фенотипическая характеристика
Фенотипические методы включают изучение основных физиологических
характеристик микроорганизмов, к которым относятся морфологиия, размер и подвижность клеток, реакция окрашивания по Граму, ультраструктура, клеточные
включения, наличие и характер поверхностных слоёв, в том числе внеклеточных
капсул, наличие, количество и расположение жгутиков, морфология колоний,
способ питания/источники углерода (ассимиляционный метаболизм) и источники/способ генерации энергии (диссимиляционный метаболизм), источники азота,
зависимость от факторов роста (витаминов, микроэлементов), отношение клеток к
молекулярному кислороду, pH, температуре, потребность и толерантность по отношению к NaCl, метаболический потенциал, биохимические свойства, источник
выделения и многие другие (Rainey and Oren, 2011).
Метилобактерии представлены грамположительными и грамотрицательными клетками, палочками, кокками (делящимися бинарно) или гифообразующими
(почкующиеся формы), подвижными или неподвижными клетками, имеющими
один или более жгутиков, расположенных, как правило, униполярно, а также
пигментированными и неокрашенными клетками.
Метилотрофы обнаруживаются повсеместно, и к настоящему времени исследованы метилобактерии почвенных, пресноводных, морских экосистем, а также ассоциаты с растениями. Такого рода ассоциаты обусловлены, с одной стороны, функционированием «метанольного цикла», т.е. образованием и выделением
метанола в растительных тканях под действием различных физиологических процессов: деметилирования пектина в клеточных стенках под действием пектинметилэстераз, высвобождения спирта как интермедиата ТГФ-пути, действия метилтрансфераз белков (Nemecek-Marshall et al., 1995; Hanson and Roje, 2001), и, с другой стороны, участием метилобактерий в синтезе фитогормонов: ауксинов и цитокининов (Иванова и др., 2000; Madhaiyan et al., 2006), контроле доступности
азота и фосфора, необходимых для роста растений (Доронина и др., 2015), а также
индукцией метилобактериями системной устойчивости к фитопатогенным грибам
12
(Доронина и др., 2009) и защитой проростков в условиях осмотического стресса
(Широких и др., 2013).
Очевидно, что природное разнообразие метилотрофов, легко обнаруживаемых в различных экосистемах, представлено гораздо более широким спектром
таксонов, чем на данный момент известно исследователям.
Особый экологический интерес представляют метилобактерии, выживающие при достаточно высокой солёности. Среди умеренно галофильных метилобактерий охарактеризованы морские представители родов Methylophaga (Boden,
2012; Villeneuve et al., 2013), Methylarcula (Doronina et al., 2000), обитатель осадка
гиперсолёного хлоридно-сульфатного озера – Methylohalomonas (Sorokin et al.,
2007) и Methylonatrum – галотолерант, выделенный одновременно с Methylohalomonas из того же биотопа (Sorokin et al., 2007).
По типу углеродного питания метилобактерии разделены на три физиологические группы: облигатные метилотрофы используют только С1-соединения,
ограниченно-факультативные могут расти только на одном или нескольких полиуглеродных субстратах, тогда как типично факультативные метилотрофы хорошо растут как на С1-, так и на Сn-субстратах (Anthony, 1982; Троценко и др.,
2010) (табл. 1). Многие аэробные метилобактерии ведут факультативнометилотрофный образ жизни. Облигатные и ограниченно-факультативные в отношении одноуглеродных субстратов (метанол, серо- или азотсодержащие С1соединения)
представлены
видами
родов
Methylobacillus,
Methylophaga,
Methylohalomonas, Methylonatrum, Methylophilus, Methylovorus, Methylotenera. Некоторые метилобактерии не используют метанол. Эти организмы являются облигатными или факультативными метилотрофами, обладающими способностью
утилизировать диметилсульфид, диметилсульфоксид, галометаны, моно-, ди- и
триметиламины, тетраметиламмоний, формамид. Однако те же самые С1соединения также потребляются и некоторыми метанол-зависимыми бактериями
(Kolb, 2009).
13
Необходимой специфичной фенотипической характеристикой при описании
нового таксона метилобактерий является определение путей С1-метаболизма, кореллирующих с другими фенотипическими характеристиками метилотрофов.
Метилобактерии способны синтезировать и накапливать природный биополимер – полигидроксибутират (ПГБ), причём бактерии с сериновым путём имеют
общие с синтезом ПГБ интермедиаты и ферменты C1-метаболизма (табл. 1).
Таблица 1. Таксономическое и метаболическое разнообразие метилобактерий.
Рибулозомонофосфатный путь
Сериновый путь
Рибулозобисфосфатный путь
Ограниченно-факультативные/
Факультативные
Облигатные/
Ограниченнофакультативные
Факультативные
Облигатные/
Факультативные
Methylobacillus
Mycobacterium
Methylohalomonas*
Methylovirgula***
Methylophilus
Bacillus
Methylonatrum**
Paracoccus***
Methylovorus
Arthrobacter
Hyphomicrobium***
Angulomicrobium
Methylophaga*
Acidomonas
Aminobacter***
Ancylobacter
Methylotenera
Amycolatopsis
Methylarcula*,***
Albibacter
Burkholderia***
Methylosulfonomonas
Beijerinckia***
Marinosulfonomonas
Xanthobacter
* ***
Ruegeria (Silicibacter)
***
Hansschlegelia
Granulibacter
Methylorhabdus
Methylobacterium***
Methylopila***
Methyloversatilis
Afipia
Labrys
Flavobacterium
Methylibium***
Примечание: *галофильный; **галотолерантный; ***синтезирует ПГБ.
14
1.1.3. Хемотаксономическая характеристика
Хемотаксономическая характеристика включает описание химического состава клеточной стенки и наружной мембраны. Для публикаций, содержащих
описание новых таксонов прокариот, рекомендуется проведение анализа жирных
кислот, состава полярных липидов и анализа дыхательных хинонов (Tindall et al.,
2010).
Жирные кислоты – обязательные компоненты липидов и липополисахаридов большинства микробных клеток, насчитывающие около 200 наименований
обычно встречающихся соединений. Их профили имеют специфические черты у
представителей разных таксонов бактерий. Анализ жирных кислот является простым способом идентификации бактерий и разделения близкородственных видов,
не имеющих явных отличительных фенотипических характеристик. Для получения достоверных результатов сравнительного анализа, условия роста бактерий и
проведения исследования должны быть унифицированы (Da Costa et al., 2011).
Таксономически значимые критерии: длина цепи, положение двойной связи и замещающих групп (Дегтева и др., 2001).
Для РБФ-метилотрофов характерно наиболее высокое содержание жирных
кислот с нечётным количеством атомов углерода. У сериновых метилобактерий
доминируют С18:1 кислоты, составляющие 60–80% от общего содержания жирных
кислот, для РМФ-метилотрофов характерно преобладание С16:0 и С16:1 (Доронина,
1999).
Полярные липиды являются основными компонентами липидного бислоя
мембран бактерий, обладают огромным разнообразием структур и часто используются для целей классификации и идентификации. Наиболее распространённые
полярные липиды бактерий – это фосфолипиды, гликолипиды и гликофосфолипиды, аминолипиды и серосодержащие липиды.
Alpha-, Beta- и Gammaproteobacteria, как правило, обладают тремя основными фосфолипидами (фосфатидилглицерин, фосфатидилэтаноламин и дифосфатидилглицерин, а также, иногда – фосфатидилхолин), которые могут быть визуа-
15
лизированы с помощью метода двумерной ТСХ. Тем не менее, другие группы
бактерий имеют сложную смесь полярных липидов, большинство из которых не
было идентифицировано (Da Costa et al., 2011). Анализ состава фосфолипидов у
представителей различных физиологических групп метилобактерий эффективен
на надродовом уровне и включает коэффициент идентичности, состав и отношение фосфолипидов. Таксономически существенные критерии в фосфолипидном
составе метилобактерий включают отношение концентраций фосфатидилхолина к
фосфатидилэтаноламину, фосфатидилглицерина к дифосфатидилглицерину (кардиолипину), присутствие кардиолипина и минорных компонентов.
Отличительным хемотаксономическим признаком облигатных и ограниченно-факультативных метилобактерий рода Methylophilus является отсутствие кардиолипина (Говорухина и Троценко, 1989). Исследование спектра фосфолипидов
внутри одной физиологической группы с идентичным путём ассимиляции выявляет менее значительные различия, однако кореллирует со степенью генотипического родства сравниваемых штаммов. Убихиноны (коферменты Q) – жирорастворимые (липофильные) коферменты, локализующиеся в липидной фазе мембраны и участвующие в «сборе» и переносе водорода и электронов на цитохромы,
различаются по числу изопреновых единиц в боковой цепи (Q7–Q14).
Быстрая характеристика и/или идентификация изолятов на уровне до рода
была дополнена применением матрично-активированной лазерной десорбции/ионизации с времяпролётной масс-спектрометрией (МАЛДИ, англ. –
MALDI-TOF) (Stackebrandt et al., 2002). Преимущество метода – в его высокой
скорости и возможности автоматизированной идентификации большого количества штаммов; недостаток – в нестабильности при определении до уровня вида,
что особенно характерно для грамположительных бактерий.
1.1.4. Генотипическая характеристика
Генотипическая характеристика в бактериальной таксономии включает
анализ последовательности гена 16S рРНК, ДНК-ДНК гибридизацию и содержание Г+Ц пар в ДНК (Stackebrandt and Ebers, 2006; Tindall et al., 2010). Информация
16
о нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК является ценным инструментом для быстрого размещения любого штамма в схеме классификации, по
крайней мере, на уровнях семейства и рода. Полученные последовательности высокого качества выравнивают с последовательностями филогенетически ближайших
соседей
с
помощью
нескольких
надёжных
программ
(например,
CLUSTAL_X, CLUSTAL W, CLUSTAL X2, CLUSTAL W2, MEGA, T-COFFEE,
MUSCLE), а затем редактируют вручную (Tindall et al., 2010). Для расчёта сходства рекомендуются программы ARB, PHYDIT и jPHYDIT; значения несходства
дают такие программы, как CLUSTAL или PHYLIP. Для расчётов сходства также
применяют
веб-инструмент
EzTaxon
на
сервере
EzBioCloud
[http://www.ezbiocloud.net/] (Tindall et al., 2010), и, кроме того, быстрый поиск
близкородственных штаммов можно реализовать при помощи пакета программ
BLAST [http://blast.st-va.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi]. При классификации бактериальных изолятов как новых таксонов на уровнях рода и вида учитывают пороговые значения сходства последовательностей генов 16S рРНК, равные 95 и 98,65%,
соответственно, по сравнению с их валидно опубликованными филогенетически
наиболее близкими соседями (Tindall et al., 2010; Kim et al., 2014). Таким образом,
генные последовательности 16S рРНК предоставляют первичное свидетельство
того, что выделен новый вид (в том случае, если сходство последовательностей
гена <98,65%). Там, где значения сходства последовательности гена 16S рРНК
>98,65%, должны быть использованы другие методы, например, ДНК-ДНК гибридизация, результаты которой, как правило, коррелируют с результатами анализа гена 16S рРНК (Stackebrandt et al., 2002; Richter and Rosselló-Móra, 2009), или
анализ генных последовательностей с бо́льшим разрешением.
Несмотря на то, что метод ДНК-ДНК гибридизации был разработан эмпирически, он широко применяется как «золотой стандарт» для разделения бактериальных видов, поскольку обеспечивает чёткий и объективный численный порог
для границ вида, косвенно измеряя общее сходство между двумя геномными последовательностями. Термин «сходство» применяют вместо термина «гомология», поскольку неизвестно, в каких именно Г+Ц богатых областях происходит
17
ДНК-ДНК гибридизация цепей ДНК исследуемых штаммов. Значение сходства по
данному методу <70% означает, что тестируемые бактерии принадлежат к различным видам (Wayne et al., 1987; Tindall et al., 2010). Тем не менее, ДНК-ДНК
гибридизация имеет ряд ограничений: 1) пороговые значения не распространяются на все роды прокариот; 2) определение ДНК-ДНК гибридизации требует специальных средств, имеющихся в ограниченном количестве лабораторий; 3) это
трудоёмкий и дорогой способ, имеющий недостаточную воспроизводимость и отсутствие возможности постепенного создания сравнительной справочной базы
данных (Tindall et al., 2010).
Дополнением к ДНК-ДНК гибридизации служит метод секвенирования последовательностей генов, кодирующих белки с консервативными функциями
(«housekeeping»-генов), а также RAPD-ПЦР (от англ. random amplified
polymorphic DNA) анализ – метод случайной амплификации полиморфной ДНК.
Анализ прост и широко применяется в молекулярной генетике. Метод RAPD-ПЦР
заключается в амплификации фрагментов ДНК с использованием единичного короткого, обычно декануклеотидного праймера, с произвольной нуклеотидной последовательностью, содержащей 40–70% Г+Ц в составе праймера и 50–100%
лингвистической сложности нуклеотидной последовательности, с низкой температурой отжига. Полученные продукты разделяют при помощи агарозного электрофореза, получая уникальный для каждого штамма/вида профиль амплифицированных продуктов, на основании которых строят бинарную матрицу и филогенетические деревья с использованием различных программ (TREECONw (Van de
Peer and De Wachter, 1994; 1997).
Полиморфизм продуктов амплификации ДНК включает характеристики
трёх типов: длину фрагментов, наличие/отсутствие полосы и интенсивность свечения. Вариативность в длине продуктов является результатом инсерции/делеции
в амплифицируемом фрагменте между праймер-связывающими сайтами, тогда
как наличие/отсутствие полиморфизма определяется присутствием/отсутствием
самих праймер-связывающих сайтов (Guthrie et al., 1992). К недостаткам метода
следует отнести низкую воспроизводимость результатов, обусловленную повы-
18
шенной чувствительностью к условиям реакции: концентрации ионов магния, соотношению праймер/матрица, температурному режиму. Тем не менее, RAPDанализ может быть использован как экспресс-метод выявления генетического полиморфизма.
Содержание Г+Ц в геномной ДНК определяется как доля пар цитозина и
гуанина к общему количеству нуклеотидов в геноме, и должно быть частью описания типового штамма типового вида нового рода (Stackebrandt et al., 2002). Согласно лиитературным данным, изменение содержания Г+Ц в ДНК в пределах рода составляет не более чем 10 мол.%, в пределах вида – 3–5 мол.% (Rosselló-Móra
and Amann, 2001; Mesbah et al., 2011) либо, по расчётам из геномных последовательностей, не более чем на 1 мол.% (Meier-Kolthoff et al., 2014). Последняя цифра
особенно актуальна для представителей класса Actinobacteria, являющихся исключением для интерпретации результатов на уровне 3–5 мол.%, т.к. пороговое
значение Г+Ц для этой группы бактерий составляет лишь 2 мол.%.
При описании метилобактерий проводят филогенетический анализ аминокислотных последовательностей структурной части маркерного гена метилотрофии, кодирующего большую субъединицу метанодегидрогеназы – mxaF,
ключевого фермента окисления метанола (McDonald and Murrell, 1997), либо его
гомолога – гена xoxF (Beck et al., 2014), в зависимости от обнаруженной системы
окисления метанола. Кроме того, секвенируют структурную часть гена, кодирующего малую субъединицу метиламиндегидрогеназы (Н.Ф. 1.4.9.1) – mauA, наличие
которого
детектировано
у
представителей
родов
Methylobacterium,
Methylopila, Methylorhabdus, Blastobacter, Xanthobacter, Paracoccus, Methylobacillus и Methylophilus (Доронина, 1999). Разработаны вырожденные праймеры на менее консервативные ферменты, являющиеся частью ТГМП-зависимого пути
окисления формальдегида, общего для большинства метилотрофов. Последовательная двухступенчатая амплификация генов формальдегид-активирующего
фермента fae (fae1f-fae1r и fae2f-fae2r), метилен-ТГМП дегидрогеназы mtdB
(mtdB1f-mtdB1r и mtdB2f-mtdB2r) и метенил-ТГМП-циклогидролазы mch (mch-2amch-3 и mc1-mch2) может использоваться для детекции ТГМП-пути у метилотро-
19
фов различных филогенентических групп. Разработаны также специфические
праймеры
на
ген
D-субъединицы
формил-метанофуран:ТГМП-
формилтрансферазы fhcD (Kalyuzhnaya et al., 2004). Эти праймеры могут помочь
выявить обширный спектр филогенетических групп, включая новые, ещё не идентифицированные филумы (Kalyuzhnaya et al., 2005; Nercessian et al., 2005).
Надёжность филогении на основе гена 16S рРНК была подтверждена методами на основе полногеномного секвенирования, а ген 16S рРНК был каталогизирован практически для всех типовых штаммов бактерий и архей (De Smet et al.,
2013). Таким образом, хемотаксономические маркеры (Stackebrandt et al., 2002),
ДНК-ДНК гибридизация и рибосомная филогения останутся важными диагностическими свойствами в описании видов наряду с полногеномным секвенированием, необходимым по современным требованиям при описании нового вида и уже
доступным для повседневной практики (Rosselló-Móra and Amann, 2015).
1.2. Пути окисления и ассимиляции С1-соединений
Общим продуктом первичного окисления восстановленных С1-соединений
метилобактерий является формальдегид (ФА), который непосредственно или после окисления в цитоплазме клеток до CO2 вовлекается в процессы энергетического обмена, а также, в зависимости от штамма, в ассимиляционные пути.
1.2.1. Окисление метанола
Большинство грамотрицательных метилобактерий окисляют метанол классической метанолдегидрогеназой (МДГ), кофактором которой является пирролохинолинхинон – PQQ (Zheng et al., 2001). В совокупности, для образования активной периплазматической МДГ необходимы: синтез и транспорт PQQ, синтез и
транспорт препептидов для α- (66 кДа) и β-субъединиц (8,5 кДа), сборка этих белков в периплазме, изомеризация пролинов, образование дисульфидных связей,
введение Ca2+ и PQQ, закручивание β-цепей вокруг α-субъединиц и ассоциация
αβ-субъединиц с образованием α2β2-тетрамера. Анализ МДГ-дефицитных мутантов выявил, что синтез метанолокисляющей системы – сложный процесс, в котором участвуют около 30 генов (Lidstrom and Stirling, 1990). Три из этих генов ко-
20
дируют структурные белки: mxaF кодирует большую (α), а mxaI – малую (β)
субъединицы МДГ, mxaG кодирует цитохром сL – первичный акцептор электронов, поступающих от МДГ (McDonald and Murrell, 1997). В свою очередь, цитохром cL окисляется цитохромом сH (Anthony, 1986). Показано, что mxaF является
одним из наиболее консервативных структурных генов у метилотрофных бактерий (Троценко и др., 2010), и широко используется для детекции метилотрофных
изолятов в природе.
1.2.2. Окисление формальдегида
Формальдегид (ФА) поступает в первичные биосинтетические пути ассимиляции (РМФ и сериновый) и подвергается дальнейшему окислению с целью получения энергии. Превращение ФА в СО2 происходит в цитоплазме клеток. Большинство метилотрофных бактерий обладают несколькими путями окисления ФА
с целью его детоксикации и вклада в энергетический и/или конструктивный метаболизм (Chistoserdova, 2011).
В принципе, описаны два основных варианта конверсии ФА в CO2: (1) различные линейные пути окисления ФА, которые включают краситель-связанную
формальдегиддегидрогеназу, или конверсию ФА, связанную с кофакторами: тетрагидрофолатом (ТГФ), тетрагидрометаноптерином (ТГМП), глутатионом (GSH),
или микотиолом (MySH), и (2) циклический путь, инициируемый конденсацией
формальдегида с рибулозомонофосфатом (РМФ-путь) (Vorholt, 2002).
Большинство метилотрофов напрямую окисляют формальдегид до формиата различными формами формальдегиддегидрогеназ (ФАДГ):
•
краситель-связанной
формальдегид
дегидрогеназой
(с
дихлорфенолиндофенолом (ДХФИФ) и феназинметосульфатом (ФМС), как
акцепторами электронов, в соответствии с уравнением:
СН2О + ДХФИФ + Н2О → НСООН + ДХФИФН2;
•
НАД+-зависимой ФАДГ, обнаруженной у большинства метилотрофов
и не требующей GSH;
21
•
НАД+-зависимой ФАДГ, требующей GSH у грамотрицательных
метилобактерий
Methylorhabdus
микотиол-зависимой
(MySH)
multivorans
–
у
и
Paracoccus
грамположительной
kondratievae
и
метилобактерии
Brevibacterium fuscum. Этот путь играет роль в детоксикации ФА не только у
метилотрофов и многих других бактерий, но также у дрожжей, растений и
млекопитающих. Все вышеперечисленные пути (за исключением MySHзависимого окисления) объединяет общий интермедиат – формиат, который затем
окисляется до СО2 формиатдегидрогеназой.
Также важное значение для детоксикации и окисления ФА у метилобактерий
имеют птерин-зависимые пути: тетрагидрофолат (ТГФ)- и тетрагидрометаноптерин
(ТГМП)-зависимое окисление формальдегида (Maden, 2000).
ТГФ-зависимое окисление формальдегида
Конверсия C1-единиц, связанных с ТГФ, имеет место практически у всех
организмов, поскольку С1-фрагменты используются для различных существенных
процессов биосинтеза, например, при синтезе пуринов. В то время как ТГФзависимые ферменты, как правило, экспрессируются на низком базальном уровне
для реакций биосинтеза, метилобактерии, использующие сериновый путь для ассимиляции углерода (например, Methylobacterium и Hyphomicrobium), имеют высокие уровни активности ТГФ-зависимого фермента, которые индуцируются при
росте на метаноле и метиламине (Marison and Attwood, 1982). Это объясняется
тем, что конденсация метилен-ТГФ и глицина соответствует ключевой реакции
серинового цикла. Предполагается, что ТГФ-зависимые ферменты обеспечивают
высокий уровень поступления С1-соединений и интермедиатов серинового цикла.
Обратимость реакций данного пути служит в пользу этого предположения (Троценко и др., 2010).
ТГМП-зависимое окисление формальдегида инициируется конденсацией
CH2O и птеринового кофактора до N5, N10-метиленпроизводного по аналогии с
ТГФ-зависимым окислением формальдегида. Реакции, зависящие от ТГМП, первоначально были обнаружены в метаногенных и сульфатвосстанавливающих археях, и считалось, что они характерны только для этих групп строгих анаэробов,
22
однако ферменты, проявляющие сходство с ТГМП-зависимыми ферментами из
архей, обнаружены и охарактеризованы также в М. extorquens АМ1 (Vorholt,
2002). Анализ распределения ТГМП-зависимых ферментов свидетельствует, что
они присутствуют во всех проверенных метилотрофных протеобактериях, которые усваивают ФА через сериновый или РМФ-путь. Филогенетический анализ
одного из ТГМП-зависимых ферментов, метенил-ТГМП-циклогидролазы (Mch),
выявил чёткую связь данного фермента у архей и у бактерий. Метилотрофные
бактерии, вероятно, приобрели ТГМП-зависимые ферменты посредством горизонтального переноса генов от предкового археона (Vorholt et al., 1999).
1.2.3. Циклический рибулозомонофосфатный путь
Циклическое окисление ФА в РМФ-пути не связано с участием дегидрогеназ формальдегида и формиата, а представляет собой последовательность реакций
фосфосахаров с образованием СО2 и 2 моль НАДН2, а также регенерации рибулозо-5-фосфата, первичного акцептора формальдегида (Соколов и Троценко, 1977).
Ключевой реакцией является альдольная конденсация ФА и рибулозо-5-фосфата с
образованием 3-гексулозо-6-фосфата, катализируемая гексулозофосфатсинтазой
(ГФС). Нестабильный 3-гексулозо-6-фосфат далее при помощи фосфогексулоизомеразы (ФГИ) быстро превращается во фруктозо-6-фосфат (рис. 1):
Рис. 1. Диссимиляционный РМФ-цикл окисления формальдегида
23
1.2.4. Окисление формиата – последняя стадия в цепи окисления метанола
до СО2. Является основным источником восстановительных эквивалентов. В
окислении формиата до СО2 участвуют три альтернативных негомологичных
фермента:
1) Мембрансвязанная формиатоксидаза, использующая в качестве акцепторов электронов O2 и ФМС/ДХФИФ (Höpner and Trautwein, 1971).
2) Формиатдегидрогеназа (ФДГ), также связанная с мембранами и проявляющая активность с ДХФИФ или цитохромом с (Deyhle and Barton, 1977).
3) Цитоплазматическая НАД+-зависимая ФДГ, наиболее распространённая
среди не-РМФ-метилотрофов, окисляющих ФА до СО2 циклическим путём и
имеющих низкий уровень активности данного фермента, либо вообще не имеющих его (Johnson and Quayle, 1964). Активность ФДГ стимулируется добавлением
флавинмононуклеотида (ФМН) (КмФМН = 0,015–0,03 мкмоль). Окисление формиата происходит согласно уравнению:
HCOOH + НАД+ → CO2 + НАДН +Н+ (Egorov et al., 1979).
4) ФДГ, высокогомологичный молибдоптерин-зависимый оксидоредуктазоподобный белок (Chistoserdova et al., 2007). Формиатдегидрогеназная реакция является источником восстановленных пиридиннуклеотидов, необходимых для
фиксации СО2.
В соответствии с реализацией одного из возможных путей первичной ассимиляции С1-соединений (сериновый, РМФ или РБФ), метилотрофы классифицируются на три группы (исключение – Arthrobacter globiformis, использующий эти
пути одновременно).
Метилобактерии с сериновым или РБФ-путём получают энергию посредством прямого окисления ФА до формиата и СО2. Напротив, бактерии с РМФпутём реализуют оба способа окисления формальдегида в разных соотношениях
(рис. 2).
24
РМФ-цикл: 3CH2O + АТФ (ФФн)
Сериновый цикл: 2CH2O + CO2 + 4АТФ + 2НАДН2
Триозофосфат (С3)
Цикл Кальвина: 3CO2 + 9АТФ + 6НАДН2
Рис. 2. Энергетические потребности первичных путей С1-ассимиляции у
метилобактерий (Троценко и др., 2010)
1.2.5. Рибулозомонофосфатный путь является шунтированным вариантом
цикла Кальвина. В РМФ-пути синтез триозофосфата осуществляется из трёх молекул ФА.
РМФ-цикл можно условно разделить на три стадии. На первой стадии –
«фиксации» – образуются три молекулы фруктозо-6-фосфата. Этот этап является
общим для всех бактерий, реализующих РМФ-цикл ассимиляции формальдегида:
HCHO + рибулозо-5-фосфат
ГФС
ФГИ
3-гексулозо-6-фосфат
фруктозо-6-фосфат
Mg2+/Mn2+
На второй стадии, «расщепления», из каждой молекулы фруктозо-6-фосфата
образуются две молекулы триоз. Причём на этой стадии возможны два варианта
образования триозофосфатов:
а) фруктозо-6-фосфат фосфорилируется до фруктозо-1,6-бисфосфата (ФБФ),
затем подвергается расщеплению на две молекулы ГАФ в реакции, катализируемой фруктозобисфосфат альдолазой (ФБФА-вариант);
б) фруктозо-6-фосфат через глюкозо-6-фосфат и 6-фосфоглюконат окисляется до 2-кето-3-дезокси-6-фосфоглюконата (КДФГ) ферментами пути ЭнтнераДудорова, и далее расщепляется КДФГ-альдолазой до ГАФ и пирувата (КДФГАвариант).
Именно от активностей глюкозо-6-фосфат ДГ и 6-фосфоглюконат ДГ зависит распределение ФА по ассимиляционной или диссимиляционной ветвям цикла.
ФБФА-вариант, как правило, реализуют факультативные метилобактерии,
тогда как КДФГ-вариант более характерен для облигатных и ограниченнофакультативных метилобактерий родов Methylophilus, Methylobacillus, Methylo-
25
vorus и Methylophaga. Грамположительные метилобактерии родов Arthrobacter,
Mycobacterium и Amycolatopsis реализуют ФБФА-вариант РМФ-цикла.
На третьей стадии («перестроек») происходит регенерация трёх молекул
первичного акцептора, рибулозо-5-фосфата (Strom et al., 1974). При этом также
возможны два варианта: наиболее распространённый – с участием трансальдолазы и транскетолазы; путь с участием седогептулозо-1,7-бисфосфатазы (СБФазы) и
транскетолазы встречается гораздо реже, и, как правило, у ограниченнофакультативных метилотрофов (Colby and Zatman, 1975).
Метилобактерии, реализующие рибулозомонофосфатный путь С1ассимиляции: Methylobacillus (Urakami and Komagata, 1986), Methylophilus
(Madhaiyan et al., 2009), Methylophaga (Doronina et al., 2003a), Methylovorus (Govorukhina and Trotsenko, 1991), Acidomonas (Yamashita et al., 2004), Arthrobacter
(Borodina et al., 2000), Bacillus (Skerman et al., 1980), Mycobacterium (Skerman et al.,
1980; Lehmann and Neumann, 1896), Amycolatopsis (Lechevalier et al., 1986),
Methylotenera (Kalyuzhnaya et al., 2006; 2012).
1.2.6. Рибулозобисфосфатный (РБФ) путь автотрофной ассимиляции CO2
встречается у метилобактерий реже, чем РМФ- и сериновый пути, так как энергетически менее выгоден (Strom et al., 1974): синтез триоз осуществляется из CO2 с
затратой АТФ и восстановителей.
РБФ-цикл можно разделить на три этапа: 1) фиксация СО2; 2) восстановление
3-фосфоглицерата
до
глицеральдегид-3-фосфата,
катализируемое
3-
фосфоглицераткиназой и глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназой; 3) регенерация первичного акцептора СО2 – рибулозо-1,5-бисфосфата. При этом возможны
два варианта, отличающиеся путями превращения пяти молекул глицеральдегид3-фосфата в три молекулы рибулозо-5-фосфата. У метилобактерий реакции перестроек могут проходить с участием трансальдолазы и транскетолазы, либо транскетолазы и СБФазы.
Ключевыми ферментами этого пути являются фосфорибулокиназа, катализирующая реакцию фосфорилирования рибулозо-5-фосфата в рибулозо-1,5-
26
бисфосфат, и рибулозобисфосфаткарбоксилаза (РубисКо), катализирующая реакцию карбоксилирования рибулозо-1,5-бисфосфата:
Рибулозо-1,5-бисфосфат
РубисКо, CO2
вввввв3-фосфоглицерат
В отсутствие СО2 и при наличии кислорода, РубисКо может действовать и
как оксигеназа, катализируя кислород-зависимое расщепление рибулозо-1,5бисфосфата, с образованием фосфоглицерата и фосфогликолата. Последний через
глиоксилат превращается в глицин, который может вовлекаться в сериновый
путь.
Уровни фиксации СО2 у метилотрофов значительно варьируют в зависимости от пути С1-метаболизма и условий культивирования. Показано, что метилобактерии с РБФ и сериновым путём ассимилируют СО2 гораздо активнее, чем метилотрофы с РМФ-путём.
Метилобактерии с рибулозобисфосфатным путём С1-ассимиляции: Albibacter (Doronina et al., 2001), Ancylobacter (Firsova et al., 2009), Angulomicrobium
(Доронина, 2006), Beijerinckia (Dedysh et al., 2005), Hansschlegelia (Ivanova et al.,
2007), Methylonatrum (Sorokin et al., 2007), Methylovirgula (Vorob’ev et al., 2009),
Paracoccus (Urakami et al., 1989), Xanthobacter (Doronina and Trotsenko, 2003).
1.2.7. Сериновый цикл реакций начинается с образования серина из глицина и ФА. Интермедиатами серинового цикла являются органические кислоты и
аминокислоты. Ключевыми ферментами являются сериноксиметилтрансфераза,
серин-глиоксилат-аминотрансфераза (СГАТ), оксипируватредуктаза (ОПР), глицераткиназа и малил-КоА-лиаза. В итоге, одна молекула фосфоглицерата синтезируется из двух молекул ФА и одной молекулы СО2.
Изоцитратлиазоположительный (ицл+) вариант серинового цикла
В целях биосинтеза необходимо компенсировать отток С3- и С4-соединений,
что достигается окислением ацетил-КоА до глиоксилата с участием реакций, катализируемых цитратсинтазой, аконитазой и изоцитратлиазой (рис. 3). Глиокси-
27
лат трансаминируется в глицин при помощи СГАТ. Глицин акцептирует формальдегидную единицу с образованием в серии реакций фосфоглицерата.
Ицл+-вариант
серинового
пути
реализуют
метилобактерии
родов
Aminobacter и Hyphomicrobium. Для них характерно наличие двух изоформ изоцитратлиазы, кодируемых различными генами и индуцируемых С1- или Сnсубстратами, соответственно. Кроме того, существует большая группа метилобактерий, которые реализуют сериновый путь, но изоцитратлиазо-отрицательный вариант (ицл-), сопряжёный с этилмалонатным циклом (Троценко и др., 2010).
Рис. 3. Изоцитратлиазоположительный (ицл+) вариант серинового цикла
28
ИЦЛ-отрицательный вариант серинового пути: этилмалонатный цикл
регенерации глиоксилата. Одно из биохимических свойств многих сериновых
метилотрофов – отсутствие изоцитратлиазы, ключевого фермента глиоксилатного
шунта, и наличие альтернативного пути конверсии ацетил-КоА в глиоксилат (рис.
4). Данное метаболическое свойство было отмечено вскоре после открытия серинового цикла и активно изучалось на модельном метилотрофе M. extorquens AM1
группами Дж. Р. Квейла и К. Энтони. Основным итогом этой работы стало доказательство участия пути также в С2-метаболизме, подтверждённое фенотипами
мутантов, дефектных по росту на С1- и С2-соединениях. Однако рост на обоих
типах субстратов восстанавливался при добавлении глиоксилата (Dunstan et al.,
1972; Anthony, 1982).
Рис. 4. Изоцитратлиазоотрицательный (ицл-) вариант серинового цикла
Подтверждение реальности цикла регенерации глиоксилата (этилмалонилКоА пути) у метилотрофов было получено в классических исследованиях группы
Ю. Ворхолт с использованием M. extorquens АМ1 и высокоразрешающей масс-
29
спектрометрии для демонстрации наличия большинства тиоэфиров, специфичных
для этого пути (Peyraud et al., 2009) (рис. 5).
Рис. 5. Схема этилмалонатного пути у Methylobacterium extorquens AM1
(Erb et al., 2007)
Ферменты, участвующие в синтезе ПГБ.
*
Кроме того, доказательства функционирования данного пути были получены в кратковременных 13С-пульсовых экспериментах, показавших последовательность реакций по порядку включения метки в предсказанные КоА-производные.
30
Из этой работы стало ясно, что выращенные на метаноле клетки превращают метилсукцинил-КоА в глиоксилат и пропионил-КоА через мезаконил-КоА и
метилмалил-КоА (Kiefer et al., 2008; Peyraud et al., 2009).
Общепринятая последовательность реакций этилмалонатного пути почти
вдвое короче ранее предложенного цикла регенерации глиоксилата, что является
дополнительным аргументом в пользу реальности функционирования этилмалонил-КоА пути (Korotkova et al., 2002; 2005).
Ключевой фермент этилмалонатного пути – Кротонил-КоА карбоксилаза/редуктаза, катализирующая реакцию:
Кротонил-КоА + CO2 + НАДФН→ Этилмалонил-КоА + НАДФ+ (Erb et al.,
2007).
Поскольку этилмалонатный путь интегрирует различные метаболические
пути, требующие глиоксилатный цикл, включая реакции серинового пути, ЦТК и
биосинтеза ПГБ – основного запасного материала многих прокариот, катализирующие их ферменты – β-кетотиолаза, ацетоацетил-КоА редуктаза – являются
общими для перечисленных путей (рис. 5).
Метилобактерии с сериновым путём С1-ассимиляции: Afipia (Brenner et
al., 1991), Aminobacter (Urakami et al., 1992), Granulibacter (Greenberg et al., 2006),
Hyphomicrobium (Hirsch, 1989), Labrys (Vasilyeva and Semenov, 1985), Methylarcula
(Doronina et al., 2000), Methylobacterium (Patt et al., 1976), Methylopila (Doronina et
al., 1998), Methylorhabdus (Doronina et al., 1995), ‘Methylosulfonomonas’ (Holmes et
al., 1997), Methyloversatilis (Kalyuzhnaya et al., 2006), Ruegeria (Silicibacter) (Uchino
et al., 1998; Yi et al., 2007), Methylohalomonas (Sorokin et al., 2007).
Тем не менее, путь С1-ассимиляции выяснен не для всех таксонов метилобактерий (Schaefer et al., 2002; Moosvi et al., 2005).
31
1.3. Центральный метаболизм
Между путями первичного и центрального метаболизма С1-соединений у
аэробных метилотрофных бактерий наблюдается определённая корреляция.
Большинство факультативных метилотрофов обладают полным набором ферментов ЦТК, который при метилотрофном росте играет преимущественно биосинтетическую роль (Логинова и Троценко, 1979). Для многих облигатных и ограниченно-факультативных метилотрофов с РМФ-путём характерно отсутствие αкетоглутаратдегидрогеназы (КДГ) и ферментов глиоксилатного шунта (Trotsenko
et al., 1986), вследствие чего предполагается, что цитратный цикл у них разобщён
и представляет собой две ветви, имеющие биосинтетическую направленность.
У метилотрофов с сериновым путём некоторые ферменты углеводного обмена либо отсутствуют (гексокиназа, дегидрогеназы глюкозо-6-фосфата и 6фосфоглюконата), либо имеют крайне низкие активности (фруктозобисфосфат
альдолаза), что объясняет неспособность этих бактерий расти на сахарах. Напротив, у метилотрофных бактерий с РМФ-путём уровни этих ферментов несколько
выше, что связано с их участием в катаболизме гексозофосфатов по гликолитическому и пентозофосфатному путям, а также регенерации первичного акцептора
формальдегида и образовании НАД(Ф)Н.
32
2. Синтез полигидроксибутирата – биодеградабельного
и биосовместимого полимера
Начиная с 50-х гг. XX в., производство полимеров и пластмасс стремительно возросло в связи с востребованностью на рынке, в т.ч. в качестве упаковочных
материалов из полиэтилена, поливинилхлорида и полипропилена, составляющих
40% ТБО. Так как не найдены микроорганизмы и ферменты, способные деградировать материалы из нефтехимических пластиков, утилизация в виде захоронения
на полигонах вызывает отчуждение земель и экспоненциальную потребность в
новых территориях (Gomez et al., 2012). При сжигании синтетических полимеров
образуются крайне токсичные диоксины; таким образом, в настоящее время
накопление синтетических полимеров в окружающей среде стало глобальной экологической проблемой. В данных условиях решающее значение имеет поиск и
разработка альтернативных химических/материальных заменителей, например,
полигидроксиалканоатов (ПГА).
ПГА обладают физическими свойствами, аналогичными свойствам нефтехимических пластиков (полиэтилена, полипропилена), в т.ч. термопластичностью,
водостойкостью, кислородной непроницаемостью, а также выгодно отличаются
от них биосовместимостью, биодеградируемостью в сжатые сроки с образованием
нетоксичных продуктов и получением из возобновляемых ресурсов (Бонарцева и
др., 2002; Tanadchangsaeng and Yu, 2012).
Кроме того, ПГА биосовместимы с клетками и тканями млекопитающих и
могут применяться как средство доставки лекарств к органам, что используется в
медицине и фармацевтике. Известны ПГА различной химической структуры, от
высококристаллических термопластов до термолабильных резиноподобных эластомеров. ПГА подразделяют на три группы: короткоцепочечные (ПГАкц),
среднецепочечные (ПГАсц) и длинноцепочечные (ПГАдц). ПГАкц состоят из мономеров с длиной углеродной цепи от трёх до пяти атомов (C3–C5), ПГАсц – от C6 до
C14 и ПГАдц – свыше C17 и C18. Наиболее широко распространёнными и хорошо
33
охарактеризованными полимерами являются ПГАкц – ПГБ и сополимеры гидроксибутирата (ГБ) с гидроксивалератом (ГВ) (ПГБВ) (Волова и др., 2007) (рис. 6):
Рис. 6. Химическая структура ПГБ (а) и ПГБВ (б)
Поли-3-гидроксибутират (ПГБ) – алифатический линейный полиэфир βоксимасляной кислоты – был впервые обнаружен Lemoigne (1926) у бактерий Bacillus megaterium (рис. 6). Длина цепи полимера, и, следовательно, его молекулярная масса (Мм), определяются как природой микроорганизма-продуцента, так и
условиями биосинтеза и методами выделения полимера. Число молекул в цепи
составляет от 600 до 2500 (Brand, 1990), а Мм – от 200 до 20000 кДа (Peña et al.,
2014). ПГБ – термопластичный материал с точкой плавления при 170–180°С, медленно охлаждающийся из расплава с образованием больших сферолитов. Подвергаясь стеклованию/осаждению из разбавленного раствора, ПГБ выпадает в виде
тонких пластинчатых кристаллов. ПГБ перерабатывается в изделия (различные
формы, нити, пленки и т.д.) из растворов, порошков, расплавов, гелей (Волова и
Шишацкая, 2011). Низкомолекулярный ПГБ (1–103 кДа) характеризуется хрупкостью и ранней термической деструкцией практически при температуре плавления.
Кроме того, так как ПГБ – полимер (R)-3-гидроксибутирата, оптически активное и
хирально чистое соединение, он может быть использован в хиральном синтезе
тонкой химической промышленности (Hölscher et al., 2010; Rai et al., 2011).
Микробиологический синтез ПГБ основан на свойстве некоторых микроорганизмов в условиях физиологического стресса, например, отсутствии одного из
элементов питания (N, P, S, Mg и/или O2) и избытке источника углерода (Galia,
2010), синтезировать и запасать в цитоплазме ПГБ, используемый в условиях го-
34
лодания для поддержания энергетического баланса. Синтез и накопление ПГБ
определяются окислительно-восстановительным состоянием цитоплазмы, внутриклеточной концентрацией пирувата и свободного КоА.
В клетке полимер аморфен и находится внутри липидных гранул (0,2–4,5
мкм), покрытых мембраной. Размер и количество гранул – вариабельные величины, зависящие от природы продуцента, источника углерода и энергии и условий
культивирования. В мембранном слое гранул присутствуют ПГБ-синтазы (ферменты, катализирующие образование эфирных связей между мономерами ПГА),
деполимеразы (участвующие во внутриклеточной деградации ПГА), небольшие
(11–25 кДа) некаталитические амфифильные белки – фазины, связанные с поверхностью гранул гидрофобным доменом и участвующие в регуляции синтеза
ПГБ (Pötter et al., 2004; Grage et al., 2009), а также белковые включения, в том
числе регулятор экспрессии фазинов. После выхода полимера из клетки (например, вследствие лизиса клеток, экстракции растворителем), полимер денатурирует
и переходит в паракристаллическую форму (Handrick et al., 2004). Следует отметить, что изделия из ПГБ при попадании во влажную почву или воду полностью
разлагаются микроорганизмами в течение двух-трёх месяцев.
Сополимер ПГБ – полигидроксибутировалерат (ПГБВ) – впервые был обнаружен в качестве минорного компонента полимера в 1974 г. (Wallen and Rohwedder, 1974). Было показано, что присутствие 3-гидроксивалерата (3ГВ) в сополимере с ПГБ значительно влияет на свойства полимера: способствует увеличению
прочности разрыва, упругости, биоразлагаемости, снижению температуры плавления и кристалличности (Luizier, 1992), при этом увеличивается разница между
температурами плавления и термического разложения. Обычно для синтеза ПГБВ
необходимо добавление в ростовую среду косубстратов – предшественников 3ГВ. Такими предшественниками могут быть пропионат, валерат, н-пропанол и нпентанол (Короткова и др., 1999).
35
2.1. Продуценты ПГБ
Накопление ПГБ широко распространено среди доменов Bacteria и Archaea
и охватывает более чем 70 родов и 300 видов, однако большинство ПГБпродуцентов обнаружено среди грамотрицательных бактерий (Doi et al., 1986; Lu
et al., 2009), но лишь некоторые из них широко используются в промышленном
производстве
ПГБ с
высокой
производительностью:
Cupriavidus necator
(=Alcaligenes eutrophus = Wautersia eutropha = Ralstonia eutropha) (Fukui and Doi,
1998; Tan et al., 2014), Azohydromonas lata (=Alcaligenes latus) (Yamane et al., 1996;
Grothe et al., 1999), Azotobacter vinelandii (Page and Knosp, 1989), A. chroococcum
(Peña et al., 2014). Основными субстратами служат углеводы: глюкоза, фруктоза,
сахароза. Данные штаммы обладают свойствами, необходимыми для промышленного продуцента биопластиков: способностью синтезировать ПОА в плотных
культурах и с высокими выходами при относительно небольших затратах времени, высокая валовая продуктивность на единицу объёма биореактора, способность
усваивать различные источники углерода с высокой степенью конверсии субстрата в продукт, отсутствие трудностей в ходе процедуры экстракции и очистки полимеров, необходимые физико-химические свойства синтезируемого полимера.
Cupriavidus
necator
–
наиболее
изученный
представитель
ПГБ-
синтезирующих микроорганизмов, который при культивировании образует плотную культуру и накапливает до 80–90% ПГБ от веса биомассы на различных субстратах, включая минимальную солевую среду с глюкозой и отходы сельскохозяйственных производств (Kim et al.,1994; Fukui and Doi, 1998). Среди продуцентов, растущих на более дешёвых субстратах – ацетате, метаноле, стоит отметить
Burkholderia sp. (Chee et al., 2010), Methylobacteruim extorquens, Hyphomicrobium
sp. (Kim et al., 1996) и Pseudomonas sp. (Khosravi-Darani et al., 2013) (табл. 2). Для
снижения стоимости биопластика идут разработки биосинтеза полимера на отходах промышленного производства – мелассе, глицерине, крахмале и прочих субстратах (Page, 1989; Haas et al., 2008; Kawata and Aiba, 2010), а также с использованием рекомбинантных организмов.
36
Таблица 2. Синтез ПГБ бактериями на разных источниках углерода.
Организм
Субстрат
Время культивиро- Производитель-
Выход
вания, ч
ность, г/л/ч
ПГБ, %
Литература
Alcaligenes latus
сахароза
16
4,94
88
Wang and Lee, 1997
Cupriavidus necator
глюкоза
50
2,42
76
Kim et al., 1994
глюкоза
32
-
90
Lee et al., 1993
фруктоза
35
0,05
70
Khosravi-Darani et al., 2013
0,23
~89
Там же
CO2
Hyphomicrobium zavarzinii
метанол
54
0,64
40–59
Zhao et al., 1993
Methylobacterium extorquens
метанол
160
-
33
Bourque et al., 1992
метанол
-
0,12
46
Bourque et al., 1995
0,29–0,33
45–53
Там же
1,9
30–70
Kim et al., 1996
57*
Khosravi-Darani et al., 2013
46
Soto et al., 2012
29
Там же
Methylobacterium extorquens
Methylobacterium organophilum
Paracoccus denitrificans
метанол
70
метанол+намиловый спирт
Paracoccus denitrificans
метанол
Pseudomonas methanica
метанол
-
-
Там же
Pseudomonas rhodus
Rhodopseudomonas sphaeroides
Zobellella denitrificans
Protaminobacter rubrum
Примечание: * ПГБВ.
ацетат
96
0,13
88
Sangkharak and Prasertsan, 2008
тех.глицерин
50
1,09
67–80
Ibrahim and Steinbüchel, 2010
80
Там же
метанол
37
Среди рекомбинантных продуцентов ПГБ известны высокопродуктивные
рекомбинантные штаммы, в т.ч. E. coli с генами синтеза ПГА из представителей
родов Alcaligenes, Pseudomonas, Cupriavidus и др. микроорганизмов (Lee and
Chang, 1994; Bhatia et al., 2015), дрожжи (Kocharin and Nielsen, 2013), а также
трансгенные высшие растения с генами синтеза ПГБ – Arabidopsis thaliana
(Poirier, 2001), кукуруза, хлопчатник (Rinehart et al., 1996). Известны штаммы
Pseudomonas с клонированными генами синтазы ПГА из C. necator (Fukui and Doi,
1998), а также M. extorquens ATCC 55366, содержащий ген ПГБ-синтазы из
Pseudomonas fluorescens GK13, что позволяет увеличить выход полимера и улучшить его физико-химические свойства (Höfer et al., 2011). Несмотря на интенсивные исследования и разработки, производство ПГБ и подобных сложных полиэфиров по-прежнему в несколько раз дороже обычных пластиков, и составляет
около 6 долл. США/кг (Chanprateep, 2010).
На сегодняшний день сополимер ПГБВ в промышленных масштабах выпускается компанией “Monsanto” (США) на продуценте Cupriavidus necator под
торговой маркой “Biopol”, ПГБ – компаниями “Monsanto”, “Metabolix Inc.”,
“Tepha”, “Proctor and Gambel”. Исследования по микробиологическому синтезу
ПГА в России пока не получили должного развития, как и по разрушаемым полимерам
в
целом
(Волова
и
Шишацкая,
2011).
38
2.2. Синтез ПГБ и генетическая организация
У A. eutrophus, Zoogloea ramigera (Fukui et al., 1988), Azotobacter beijerinckii
и метилобактерий в синтезе ПГБ участвуют следующие ключевые ферменты: βкетотиолаза (PhaA, Н.Ф. 2.3.1.9), катализирующая конденсацию двух ацетил-КоА
с
образованием
ацетоацетил-КоА,
НАДФН2-зависимая
ацетоацетил-КоА-
редуктаза (PhaB, Н.Ф. 1.1.1.36), восстанавливающая ацетоацетил-КоА до 3гидрокси-3-бутирила-КоА, и ПГБ-синтаза (PhaС, Н.Ф. 2.3.1.B2), полимеризующая
мономеры 3-гидрокси-3-бутирила-КоА в молекулу ПГБ. Микроорганизмы синтезируют ПГБ также и другими путями, Rhodospirillum rubrum-, Pseudomonas oleovorans- и Pseudomonas aeruginosa-подобными (Rehm, 2003), но общая закономерность синтеза – это происхождение полимера из интермедиатов β-окисления и
синтеза de novo жирных кислот.
Гены phaA и phaB у Methylobacterium extorquens организованы в оперон и
локализованы на хромосоме. Они образуют кластер вместе с геном-регулятором
phaR, продукт которого, по-видимому, ответствен за распределение потоков ацетил-КоА либо на С1-ассимиляцию, либо на синтез ПГБ. Ген phaC, кодирующий
ПГБ-синтазу, локализован отдельно и, по-видимому, регулируется независимо от
генов phaAB (Федоров и др., 2014). Недавно этот ген был клонирован и охарактеризован. Проведённая генетическая модификация штамма-продуцента ПГБ M. extorquens G10 показала, что при увеличении копийности генов phaC и phaCAB
происходило повышение активности ПГБ-синтазы и двукратное снижение Мм
(150→79 кДа) синтезируемого ПГБ, тогда как физико-химические свойства пластика изменялись мало (Höfer et al., 2010; Федоров и др., 2014).
В отличие от M. extorquens, у C. necator гены биосинтеза ПГБ организованы
в один оперон phaCAB (Theodorou et al., 2013).
Проведённый скрининг показал, что сериновые метилобактерии накапливают бо́льшее количество биополимера в сравнении с реализующими РБФ-путь
(рис. 7, 8).
39
Рис. 7. Гены и ферменты синтеза ПГБ у метилобактерий
Рис. 8. Связь между биосинтезом ПГБ и сериновым циклом С1-ассимиляции
В процесс деградации ПГБ вовлечены ферменты: деполимераза (depA, depB
– у M. extorquens AM1 (Korotkova and Lidstrom, 2001), PhaZ – у Paracoccus,
Burkholderia или C. necator) (Nierman et al., 2004; Remenant et al., 2010; Lu et al.,
2014), НАДН-зависимая дегидрогеназа (hbd), и ацетоацетат:сукцинил-КоАтрансфераза. ПГБ под действием деполимеразы сначала деградирует до мономе-
40
ров 3-гидроксибутирата (3ГБ) или олигомеров (димеров-тетрамеров) 3ГБ, которые затем гидролизуются посредством 3ГБ-олигомер гидролазы до мономеров
3ГБ, с последующим дегидрированием 3ГБ до ацетоуксусной кислоты, далее превращающейся в ацетил-КоА (рис. 8). Исследования внутриклеточных 3ГБ олигомерных гидролаз проведены у Paracoccus denitrificans и других продуцентов (Lu
et al., 2014).
Все ферменты, участвующие в процессах синтеза и деполимеризации, конститутивны. Следовательно, процесс изначально представляет собой футильный
(холостой) цикл, вопрос только в том, каковы соотношения скоростей синтеза и
деполимеризации. По некоторым оценкам, скорость гидролиза полимера составляет до 10% скорости его синтеза.
На основании данных энзимологического анализа и изотопных экспериментов предложена регуляторная модель биосинтеза ПГБ/В у M. extorquens − типичного представителя сериновых метилобактерий: для поддержания в клетках определённой скорости биосинтеза биополимера необходим соответствующий уровень НАДФН2 (рис. 8).
Синтез ПГБ у метилобактерий с изоцитратлиазоотрицательным сериновым
циклом тесно сопряжён с C1-метаболизмом, поскольку продукты генов phaA и
phaВ, β-кетотиолаза и ацетоацетил-КoA-редуктаза, катализируют, соответственно,
также две первые реакции этилмалонатного пути (рис. 5). Контроль за направлением потоков ацетил-КоА на синтез ПГБ или С1-ассимиляцию, по-видимому,
осуществляет регулятор PhaR (Chistoserdova et al., 2003).
2.3. Синтез ПГБ и центральный метаболизм
Биосинтез ПГБ, помимо серинового цикла, также неразрывно связан с центральными метаболическими путями бактерий, в том числе гликолизом, циклом
Кребса, β-окислением, синтезом de novo жирных кислот, катаболизмом аминокислот и циклом Кальвина (Peplinski et al., 2010; Shimizu et al., 2013).
Между ПГБ и этими метаболическими путями также существует много общих интермедиатов, в первую очередь – ацетил-КоА. У некоторых ПГБ-
41
продуцирующих бактерий, таких как Cupriavidus necator, Chromatium vinosum и
Pseudomonas aeruginosa, метаболический поток от ацетил-КоА до ПГБ сильно зависит от условий питания (Steinbüchel and Hein, 2001).
В условиях достаточного питания восстановительные эквиваленты в виде
НАДН и НАДФН расходуются в ЦТК в основном на образование аминокислот, а
также на преобразование энергии в клетке, при этом сохраняется высокий уровень
свободного КоА, блокирующего синтез ПГБ путём ингибирования синтеза βкетотиолазы (PhaA), и ацетил-СоА направляется в ЦТК для производства энергии
и роста клеток (Ratledge and Kristiansen, 2001). И наоборот, при условиях несбалансированной подачи питательных веществ (когда необходимое питательное
вещество, такое как азот и фосфор, ограничено при избытке углерода), не ингибирующий уровень КоА позволяет направляться ацетил-КоА на синтетические пути
для накопления ПГБ (Jung and Lee, 2000; Ratledge and Kristiansen, 2001). Эта метаболическая
стратегия
регулирования,
в
свою
очередь,
позволяет
ПГБ-
накапливающим микробам оптимизировать питательные ресурсы в адаптации к
условиям окружающей среды.
Анализ с помощью математической модели метаболизма метилотрофов углеродных потоков в СО2, ПГБ и биомассу позволил сравнить скорости образования восстановительных эквивалентов в ЦТК и в пути прямого окисления метанола со скоростью биосинтеза ПГБ. Установлено, что при росте метилобактерий на
метаноле, ЦТК (в частности, изоцитратдегидрогеназа) является дополнительным
поставщиком НАДФН2 для ацетоацетил-КоА-редуктазы. Судя по данным анализа
углеродных потоков, при метилотрофном росте бактерий ЦТК функционирует
менее активно, чем при выращивании на ацетате и бутирате. Возможно, это связано с ингибированием ферментов ЦТК высоким уровнем восстановительных эквивалентов, поставляемых ТГМП-путём. Предложенная модель координированного контроля ЦТК и биосинтеза ПГБ/В при росте продуцента на одно- и полиуглеродных субстратах позволяет получать сополимер с заданным соотношением
мономеров и улучшенными физико-химическими характеристиками (Троценко и
др., 2010).
42
2.4. Метилотрофные продуценты ПГБ
Биополимеры на основе дешёвого непищевого сырья – метанола – являются
перспективными аналогами синтетических полимеров.
В последние годы опубликован ряд работ, описывающих различные микроорганизмы и процессы культивирования для производства ПГБ из метанола (Tan
et al., 2014).
Метанол – один из наиболее дешёвых непищевых возобновляемых субстратов, доступных в больших объёмах при производстве из древесных материалов
или из натурального газа, полученного после анаэробного сбраживания органических веществ. Он обладает малой плотностью и полной смешиваемостью с водой,
высокой химической чистотой, доступен по сравнительно низкой цене, требует
меньше кислорода и образует меньше тепла в процессе культивирования (Mokhtari-Hosseini et al., 2009; Троценко и др., 2010). Использование метанола вместо чистых сахаров для промышленного производства может снизить стоимость ПГБ
(Bourque et al., 1995; Tan et al., 2014). Среди недостатков метанола как субстрата –
дефицит по энергии, так как метанол обусловливает несколько бо́льшие затраты
метаболической энергии на биосинтез, нежели полиуглеродные субстраты.
Общая стратегия синтеза ПГБ – это двухфазный процесс, разделённый на
фазу накопления биомассы и фазу накопления продуктов, стимулируемую лимитированием по азоту. С помощью этой стратегии на метилотрофах были достигнуты уровни ПГБ до 130 г/л. При этом в оптимальных условиях выход ПГБ может
составлять до 60% от общей биомассы (Zhao et al., 1993; Kim et al., 1996). В условиях периодического культивирования различные сериновые метилобактерии
способны накапливать как низко- (~60 кДа), так и высокомолекулярный ПГБ
(1300 кДа).
Наиболее изученным и перспективным в отношении синтеза ПГБ модельным метилотрофом является M. extorquens (Höfer et al., 2011; Delaney et al., 2013),
продуцирующий до 46–53% ПГБ на вес сухой биомассы (табл. 2) (Bourque et al.,
1995). M. organophilum синтезирует до 30–70% ПГБ. Высокий выход ПГБ (до
43
80%) получен при культивировании штамма M. extorquens P14, который наряду с
метанолом был способен утилизировать метиламин, формальдегид, глицерин,
сукцинат и этанол (Ostafin et al., 1999). При периодическом культивировании M.
extorquens K накапливал до 60% ПГБ с выходом 0,2 г/г метанола (Suzuki et al.,
1986).
Hyphomicrobium zavarzinii синтезировал ПГБ на среде с метанолом с выходом 47% и Мм ~1000 кДа. В этом случае наблюдалась довольно высокая степень
конверсии (13%) метанола в полимер (Zhao et al., 1993; Волова и Шишацкая,
2011). При непрерывном культивировании H. zavarzinii накапливал 40–59% ПГБ
(Zhao et al., 1993). Метанотроф Methylosinus trichosporium OB3b продуцировал
30% ПГБ от веса сухой биомассы с Мм 300 кДа (Доронина и др., 2008). С5соединения (пентанол и валерат) более эффективны для биосинтеза сополимера
метилобактериями и метанотрофами, чем С3-субстраты (пропанол и пропионат)
(Короткова, 1997; 1999).
Показано, что увеличение концентрации пентанола до 20% в смеси с метанолом стимулировало M. extorquens к биосинтезу ПГБВ с Мм ~1500 кДа и содержанием валерата до 50%, особенно при добавлении пентанола в логарифмической
фазе роста. Высокие концентрации пентанола токсичны для продуцента и снижают общий выход ПГБВ. Увеличение Мм ПГБВ с 305 до1500 кДа снижает температуру плавления биополимера (с 171 до 162ºС) и степень кристалличности с 55
до 8% (Ежов и др., 2013).
Одной из интересных особенностей М. extorquens и P. denitrificans является
их способность производить сополимер ПГБ/В из смеси метанола и н-амилового
спирта. Так, при добавлении к метанолу н-пентанола содержание сополимера
ПГБВ у P. denitrificans достигало 58%, а выход повышался до 0,97 г/г субстратов
(Ueda et al., 1992); P. denitrificans также синтезирует ПГБ/В из смеси метанола и нпропанола или н-амилового спирта (Ueda et al., 1996), P. methylutens – из метанола, глицерина и гептана (Троценко и др., 2010).
Применение рекомбинантной технологии позволило в 2,5 раза увеличить
содержание полимера у Mycoplana rubra (Föllner et al., 2007). Однако генно-
44
модифицированные метилотрофы с РМФ-путём ассимиляции формальдегида демонстрировали невысокие параметры биосинтеза полимера. Так, рекомбинатные
Methylophilus methylotrophus B115 и Methylobacillus glycogenes B121, содержащие
гены синтеза ПГБ, накапливали не более 15% полимера (Föllner et al., 1993).
Гранулы ПГБ обнаружены в Methylovirgula ligni (Vorob’ev et al., 2009),
Methylarcula spp. (Doronina et al., 2000) и других метилотрофах (табл. 1).
Прежде чем метилотрофы смогут рассматриваться как достойная альтернатива для промышленного производства ПГБ, необходимы дальнейшие исследования для повышения продуктивности и содержания ПГБ (Khanna and Srivastava,
2005).
2.5. Применение ПГБ
Благодаря разнообразию своих свойств, ПГБ может быть адаптирован для
различных областей применения, от биоразлагаемого упаковочного материала до
изготовления нанокомпозитов и полимерных смесей, однако наиболее востребованнной областью является медицина. Биосовместимость ПГБ с тканями млекопитающих объясняется тем, что деградация ПГБ является истинной биологической и происходит клеточным и гуморальными путями; образующиеся при этом
мономеры гидроксимасляной кислоты (естественного метаболита клеток и тканей
организмов) не вызывают резкого закисления тканей и, следовательно, выраженной воспалительной реакции; скоростью деградации ПГБ можно управлять (Волова и Шишацкая, 2011). Благодаря высокой биосовместимости, ПГБ/В апробирован в качестве сырья для производства рассасывающихся шовных нитей,
остеопротезов, хирургических пластин, матриц для получения лекарственных
форм пролонгированного действия, разобщающих биодеградируемых мембран
для предотвращения спаечного процесса в кардиохирургии (Насонова и др.,
2012), а также в качестве каркаса для создания тканей и органов (Насонова и др.,
2015), в том числе нанофибриллярных матриксов для культур клеток сердечной
мышцы (Agladze et al., 2013). Обработка поверхности шовной нити ПГБВ способ-
45
ствовала повышению био- и гемосовместимости шовного материала (Акентьева и
др., 2014).
У бактерий низкомолекулярный ПГБ является частью Ca2+ каналов (Lara
and Huisman, 1999), наравне с его мономером – гидроксибутиратом – является
химическим шапероном и действует как осмолит в галотолерантных и галофильных метилобактериях, т.к. положительно коррелирует с концентрацией NaCl в
Methylarcula marina, Methylarcula terricola (Doronina et al., 2000; Arora et al., 2006).
Кроме того, бактерии, содержащие ПГБ, показали повышенную стрессоустойчивость к временным воздействиям окружающей среды, таким, как УФ-излучение,
тепловой и осмотический шок (Kadouri et al., 2005). В сфере фармацевтической и
медицинской промышленности, тканевой инженерии, ПГБ может быть использован в качестве компонента потенциальных анти-ВИЧ и противоопухолевых препаратов и антибиотиков (De Roo et al., 2002). Показано, что, стабилизируя гидратную оболочку вокруг белков, ПГБ действует как химический шаперон: снижает
степень агрегации белка и протектирует ферментативную активность. Известно,
что некоторые нейродегенеративные расстройства, такие, как болезнь Хантингтона и болезнь Паркинсона, вызваны агрегацией белка (Soto et al., 2012); применение олигомеров гидроксибутирата предложено в качестве эффективного лечения
этих расстройств (Kashiwaya et al., 2000; Tieu et al., 2003).
46
3. Осмоадаптация
3.1. Осмотическое давление
Микроорганизмы обитают в биотопах с различной степенью солёности, от
пресных и морских биотопов до гиперсолёных с высокими концентрациями NaCl,
вплоть до насыщения. Обмен веществ между микроорганизмами и окружающей
их средой идёт через водные растворы. Один из основных параметров экосистем –
осмотическое давление. Вода свободно проникает через полупроницаемую плазматическую мембрану по градиенту растворённых соединений, и неадаптированные организмы быстро теряют воду в присутствии солей. Поэтому для своего существования всем микроорганизмам, независимо от их таксономической принадлежности, требуется поддерживать тургор – равное или избыточное по отношению к окружающей среде осмотическое давление в цитоплазме, считающееся
движущей силой роста, развития и деления клетки. Приблизительные значения
тургора составляют 1–5 атм для грамотрицательных, и 15–25 атм для грамположительных бактерий (Wood et al., 2001).
Галофильные и галотолерантные микроорганизмы находятся во всех трёх
доменах: Archaea, Bacteria и Eucarya (Oren, 1999).
Организмы, живущие в водных средах, сталкиваются с изменениями активности воды, связанными с изменениями уровней диссоциации солей или сахаров.
Чистая вода имеет активность (αw) равную 1, а растворы солей имеют значение αw
меньше 1 (αw – отношение давления водяного пара над раствором к давлению над
дистиллированной водой при испарении). Обитатели ультрапресных вод развиваются при водном потенциале 1, для морской воды этот потенциал равен 0,98,
для гиперсолёных озёр – 0,75. Среды с повышенным содержанием сахара
(αw≈0,61), благоприятны для развития ксерофильных организмов (грибы и
дрожжи) в гиперсолёных местообитаниях. Для приспособления к снижению активности воды в окружающей среде и в результате снижения оводнённости цитоплазмы, микроорганизмы должны накапливать внутриклеточные ионы или совме-
47
стимые растворы для восстановления тургорного давления и/или объёма и сохранения активности ферментов.
3.2. Физиологические группы микроорганизмов по отношению
к осмотическому давлению
По отношению микроорганизмов к осмотическому давлению различают несколько физиологических групп, однако следует отметить, что потребность в соли, также как и галотолерантность, зависит от условий роста: температуры и состава среды (Ventosa et al., 1998).
1. Негалофильные микроорганизмы, к которым относят многочисленные
бактерии, обитающие в пресных и ультрапресных экосистемах, почвах, а также
связанные с организмом человека, животных и растениями.
Эти микробы не нуждаются в NaCl и способны существовать в местах с
крайне низким содержанием солей (≤0,01%). Угнетение их роста начинается
обычно при концентрации около 1,5% NaCl.
2. Галотолерантные бактерии растут как в отсутствие соли, так и при её
значительной концентрации (10–15%), т.е. устойчивы к присутствию соли.
Staphylococcus aureus (растёт при 8% NaCl) и другие стафилококки, некоторые
дрожжи и грибы относятся к экстремально галотолерантнтным микроорганизмам.
3. Слабые галофилы оптимально растут при солёности около 3,5% и, как
правило, развиваются в узком диапазоне концентраций соли (2,5–5% NaCl).
4. Умеренные галофилы, лучше всего растущие на средах, содержащих 3–
15% соли. Умеренные галофилы обычно нуждаются не только в ионах Na+, но и в
ионах К+ и Mg2+ (Троценко и др., 2007). Это гетерогенная физиологическая группа
микроорганизмов, принадлежащих к различным классам про- и эукариот.
5. Экстремальные галофилы растут как при солёности морской воды (~3%
NaCl), так и вплоть до насыщенных растворов соли (>28% NaCl). Примером могут
служить “красные галофилы”, галобактерии и галококки (DasSarma and DasSarma,
2015).
48
Галофилы среди бактерий включают оксигенных и аноксигенных фототрофов, аэробных гетеротрофов, денитрификаторов, сульфатредукторов и метаногенов, аэробных и анаэробных организмов. Разнообразие метаболических типов
уменьшается с солёностью (Oren et al., 2002). В настоящее время известны несколько десятков видов умеренно галофильных бактерий, принадлежащих к разным родам. В целом, можно констатировать, что в домене Bacteria преобладают
умеренные, а не экстремальные галофилы.
Различные филогенетические ветви Proteobacteria содержат галофильных
представителей, часто имеющих близких родственников-негалофилов.
Так как галофилы вынуждены справляться с рядом специфических стрессовых факторов, их энергетика отличается от энергетики негалотолерантных штаммов. Биоэнергетические аспекты галотолерантности клеток включают изменение
ионного транспорта через мембрану, переориентацию метаболических путей на
повышение синтеза осморегуляторов, замену солечувствительных компонентов
на солеустойчивые, а также сигналы, включающие и выключающие эти процессы
при солевом стрессе (Csonka, 1989; Ventosa et al., 1998).
Таким образом, способность адаптироваться к изменениям осмолярности
окружающей среды имеет принципиальное значение для роста и выживания, и
прокариотические клетки эволюционировали в направлении стратегии преодоления изменений этого важного экологического параметра (Sleator and Hill, 2002).
3.3. Типы осмоадаптации
Способность обнаруживать изменения во внешней осмолярности и своевременно реагировать на них через согласованные генетические и физиологические реакции адаптации имеет решающее значение для благополучия и роста
большинства микроорганизмов (Widderich et al., 2014a).
У прокариот идентифицированы два основных типа стратегии адаптации к
высоким значениям осмолярности среды (Da Costa et al., 1998).
Первый тип осмоадаптации известен как «соль внутри», и заключается в
активной откачке из клетки ионов Na+ и селективном притоке неорганических
49
ионов, чаще всего K+, из среды. Иногда ионы K+ достигают очень высоких уровней (Empadinhas and Da Costa, 2008), и могут оказать негативное воздействие на
функции белков и ДНК-белковых взаимодействий. Нейтрализация K+ осуществляется накоплением нескольких органических анионов – среди галофильных архей и галофильных бактерий, адаптированных к средам, содержащим высокие
концентрации солей, в основном, Cl-, в связи с чем этот тип называют KCl--типом.
Представители домена Bacteria, в отличие от экстремальных галофильных организмов домена Archaea, компенсируют входящий заряд K+ накоплением не Сl-, а
некоторых органических анионов – главным образом, аминокислот и их производных, таких, как α-глутамат или его изомеры, которые могут быть синтезированы или транспортированы из среды (Da Costa et al., 1998). Сочетание накопления
K+ и глутамата микроорганизмы используют в качестве ответа при низком уровне
солевого стресса. Так, у Halomonas elongata α-глутамат калия играет ключевую
роль в осмоадаптации при содержании в среде с ≤3% Na+ (при увеличении солёности основным осмолитом становится эктоин), а у Methanothermococcus
thermolithotrophicus глутамат накапливается, когда внешнее содержание NaCl составляет менее 5,6%.
β-глутамат был обнаружен у морских бактерий и некоторых метаногенных
архей (Robertson et al., 1990).
Ионный состав цитоплазмы клеток, величина концентрационных градиентов через цитоплазматическую мембрану определяются слаженным механизмом
действия различных ионных помп, антипортеров и ряда транспортных белков
(Oren, 1999).
Этот подход требует значительных структурных изменений и характерен
для экстремально- и умеренно галофильных анаэробных архей Halobacteria, анаэробных галофильных бактерий Haloanaerobiales, и облигатных аэробных хемоорганотрофных экстремально галофильных бактерий Salinibacter ruber (Oren, 1999;
Oren et al., 2002; Pflüger and Müller, 2004). Особенности их физиологии адаптированы к условиям высокой солёности среды.
50
Второй тип осмоадаптации: осмолиты. Значительную часть микроорганизмов составляют виды, не претерпевшие значительных генетических изменений и потому чувствительные к высоким уровням неорганических ионов внутриклеточные макромолекулы. Вторая стратегия характерна для большинства умеренно галофильных и галотолерантных микроорганизмов. Стратегия осмолитов
предоставляет организмам быструю адаптацию к осмотически флуктуирующей
среде простым регулированием внутреннего пула растворов, противодействующих осмолярности окружающей среды. По этой причине данная стратегия осмоадаптации широко распространена в природе, не только у бактерий, но и у архей,
эукариот, растений, животных и человека (Burg and Ferraris, 2008). Присутствие
данного типа осмоадаптации в трёх различных линиях организмов свидетельствует о независимом развитии этой стратегии, причем трудно представить себе, как
эти древние характеристики сохранились в нескольких рассеянных группах; возможно, их происхождение обусловлено массовым горизонтальным переносом генов (Santos and Da Costa, 2002).
3.4. Первоначальный этап осмоадаптации
Первым ответом на осмотический шок, как у грамположительных, так и у
грамотрицательных бактерий, является активное поглощение ионов калия K+
(Heermann and Jung, 2004).
У грамотрицательной бактерии E. coli осмотический ответ включает две
стадии:
(1) первичный (временный) ответ, приводящий к накоплению K+. У бактерий есть по крайней мере три К+ -транспортирующие системы, различающиеся по
сродству к ионам К+: Kdp, Trk и KtrAB. Две из них, Kdp и Trk, регулируются изменениями в тургорном давлении, и активны при низком (< 1 мМ) и высоком (>1
мМ) содержании калия в среде, соответственно. Kdp работает, когда другие системы
не
способны
поглощать
К+.
Оперон
kdpFABS
кодирует
К+-
трнаспортирующую АТФазу P-типа. Экспрессия оперона регулируется двумя
белками – KdpD и KdpE, которые принадлежат к классу двухкомпонентных регу-
51
ляторных систем. KdpD, локализованный в цитоплазматической мембране, является сенсором тургорного давления и автофосфорилируется по сайту His-673 при
его уменьшении. Затем фосфатная группа KdpD переносится на KdpE-регулятор
ответа (Kempf and Bremer, 1998; Карандашова и Еланская, 2005).
Для функционирования Trk-системы требуются АТФ и протонный потенциал. Основными компонентами Trk-системы являются четыре белка: TrkA,
TrkE, TrkG и TrkH. Для активности Trk-системы необходимо присутствие TrkAпериферического мембранного NAD+-связывающего белка размером 50,4 кДа, а
также наличие либо TrkG, либо TrkH (Карандашова и Еланская, 2005).
Единовременно, в течение 1 мин после осмотического шока, происходит
увеличение синтеза глутамата (Poolman and Glaasker, 1998; Domínguez-Ferreras et
al., 2009; Nanatani et al., 2015), и обеспечивает E. coli противоионами для K+, который, в свою очередь, удаляется из клетки неспецифическими системами оттока.
Таким образом, пара K+/глутамат, как вторичный мессенджер, опосредованно запускает систему и координацию последующего осмотического ответа;
(2) вторичный осмотический ответ – накопление более специфических
растворов, таких как трегалоза, глицин-бетаин или пролин (Roeßler and Müller,
2001). Транспортные системы, принимающие участие в этом процессе – ProP
(первая) и ProU (вторая). ProP –H+/пролиновый симпортер. ProU – ATP-связанный
транспортер, обладающий широкой субстратной специфичностью (Kempf and
Bremer, 1998).
Недавно in vitro было показано, что в осмотическом ответе E. coli происходит термодинамическая ассоциация РНК-полимеразы с ДНК: в ходе первоначальной реакции, когда в цитоплазме временно накапливается К+, РНК-полимераза
быстро диссоциирует в цитоплазму, и одновременно происходит гиперконденсация нуклеоида. Освобождённая РНК-полимераза повторно связывается с ДНК во
время последующей фазы осмоадаптации, когда накапливаются органические
осмопротекторы, а уровень К+ снижается (Cagliero and Jin, 2013).
Система первичного ответа у Bacillus subtilis также включает накопление К+
и также зависит от тургора. Характер противоина для К+ неясен, поскольку, в от-
52
личие от E. сoli, уровень глутамата увеличивается незначительно. Грамположительные бактерии накапливают осмопротекторные соединения, такие как глицинбетаин, а не электролитическую пару K+/глутамат и трегалозу. Транспортные системы OpuA и OpuC соответствуют ProU в E. сoli, но они не свободно диффундируют и не связаны с периплазмой, а являются субстрат-связывающими белками
(Roeßler and Müller, 2001).
Таким образом, основная функция накопления K+ сводится к сигнальной
индукции вторичного ответа, что находит отражение в наблюдаемой зависимости
осмотического ответа от поглощения K+ (Kempf and Bremer, 1998).
3.5. Осмолиты
Осмолиты накапливаются при гипертонических условиях роста либо синтезом de novo, либо транспортом из окружающей среды (Riis et al., 2003).
Осмолиты – небольшие органические, высокорастворимые в воде соединения, защищающие клетки от денатурации уравновешиванием осмотического давления и внутриклеточной среды. Данные соединения совместимы с клеточной
биохимией и физиологией (Street et al., 2006; Ignatova and Gierasch, 2006), не
нарушают жизненно важных клеточных функций, таких как репликация ДНК,
ДНК-белковые взаимодействия и клеточные метаболические механизмы (Kempf
and Bremer, 1998), что нашло отражение в применяемом для них термине «совместимые растворимые вещества» (Brown, 1976).
Тип осморегулятора зависит, главным образом, от бактерии, а также от
условий роста, продолжительности осмотического стресса, уровня солёности,
наличия субстратов и осмолитов, а также источника углерода, используемого в
ростовой среде (Roberts, 2005).
В качестве осмолитов микроорганизмы используют, в основном, представителей нескольких структурных классов (табл. 3):
-аминокислоты (пролин, глутамин и глутамат),
-сахара (сахароза, трегалоза и глюкозилглицерин),
-производные аминокислот (эктоин, гидроксиэктоин),
53
-полиолы (глицерин, арабит, маннит), цвиттерионные соединения,
-бетаины (триметилглицины) (глицин-бетаин и производные). Глицинбетаин – универсальный осмопротектор, обнаруженный во всех трёх доменах
жизни – Bacteria, Archaea и Eucarya.
Таблица 3. Некоторые осмолиты бактерий и архей (Kempf and Bremer, 1998; Roberts, 2005; Empadinhas and Da Costa, 2008).
Осмолит
Организм
Bacteria, Archaea (универсальный осмолит)
Глицин бетаин
Bacillus subtilis spp., негалофильные и слабогалофильные эубактерии, Streptomyces,
Methanomicrobia
Пролин
Бетаин
Галотолеранты: Thioalkalivibrio versutus; Actinopolyspora sp. Галофилы: Actinopolyspora halophila;
Halorhodospira halochloris Methanohalophilus portulcalensis FDF1; Methanosarcina thermophila; Synechococcus sp. DUN 52
Bacteria, Archaea
Пролин-бетаин
Глутамин
L-α-глутамат
Галофилы: Methanohalophilus portucalensis FDF1
Многие галотолерантные бактерии и метаногены.
Галофилы: Halomonas elongata; Methanohalophilus
portucalensis FDF1; Halobacterium sp. NRC-1 и
H. salinarum
54
Продолжение Таблицы 3
Галотолеранты: Methanothermococcus thermolithotrophicus; Methanocaldococcus jannaschii;
Methanotorris igneus
Галофилы: Nocardiopsis halophila
β-глутамат
Галотолеранты: различные цианобактерии (Synechocystis sp. штамм PCC 6803, Anabaena spp.) и
Proteobacteria
Сахароза
Эктоин
Гидроксиэктоин
Галотолеранты: Bacillus spp., Sporosarcina pasteurii;
Brevibacterium epidermidis; Thioalkalimicrobium aerophilum; Vibrio cholerae и V. costociola;
Галофилы: Ectothiorhodospira halochloris, Bacillus
spp., Chromohalobacter israelensis; Chromohalobacter salexigens; Halorhodospira halochloris; Halomonas elongata, H.variabilis и филогенетически соответствующие организмы; Methylarcula marina и M.
terricola; Methylophaga alcalica и M. natronica
Галофилы: Bacillus, Halomonas elongata; Nocardiopsis halophila
Галотолеранты: Bacillus
Галотолерант: Photobacterium profundum
Гидроксибутират
Негалофильные и слабогалофильные эубактерии обычно накапливают глутамат, пролин и другие аминокислоты, ионы K+ и некоторые сахара – сахарозу,
фруктозу, глюкозу, трегалозу.
Умеренно и экстремально галофильные и галотолерантные эубактерии
накапливают, в основном, глицин-бетаин или глутамат-бетаин, гликозил-
55
глицерин, эктоин и, иногда, в качестве минорных компонентов, глутамат, ионы
K+, трегалозу или сахарозу.
Сахароза – невосстанавливающий дисахарид глюкозы и фруктозы, синтезируется в ответ на солевой или температурный стресс и является основным осмолитом для морских и пресноводных цианобактерий и растений, поддерживая осмотический баланс и стабилизируя структуру и функции белков и мембран (Klähn
and Hagemann, 2011; But et al., 2013).
Среди прокариот сахарозу накапливают пресноводные и морские цианобактерии, а также галотолерантные метилотрофные бактерии, накапливающие её в
ответ на повышение солёности среды культивирования, что согласуется с возможной
осмопротекторной
функцией
дисахарида.
Так,
метилобактерия
Methylobacillus flagellatus КТ синтезирует сахарозу в присутствии 0,5–2% NaCl
(Бут и др., 2013). Примечательно, что ранее синтез сахарозы был показан лишь
для представителей Methylophaga (Doronina et al., 2003b).
Известны два различных пути синтеза сахарозы.
1. Двухступенчатый синтез из фруктозо-6-фосфата и нуклеозидов (УДФглюкоза) в два этапа, используя сахарозофосфатсинтазу и сахарозо-фосфатфосфатазу. Этот путь реализуют пресноводные и морские цианобактерии (Klähn
and Hagemann, 2011). В геномах M. flagellatus КТ и облигатного метилотрофа
Methylovorus glucosetrophus были найдены открытые рамки считывания (ОРС),
кодирующие гомологичный сахарозо-фосфат-синтазе растений и цианобактерий
полипептид (Бут и др., 2013).
2. Сахарозо-синтазный (СС) путь, который обратимо преобразует фруктозу
и АДФ-глюкозу (или УДФ-глюкозу) в сахарозу. Его используют нитчатые
цианобактерии (Anabaena) (Roberts, 2005; Бут и др., 2013).
3.6. Синтез эктоина и генетическая организация у метилобактерий
Эктоин и гидроксиэктоин, впервые обнаруженные в экстремально галофильной фототрофной бактерии Ectothiorhodospira halochloris (=Halorhodospira
halochloris, Galinski et al., 1985; Imhoff and Süling, 1996), синтезируются широким
56
спектром бактерий, в основном, Alpha- и Gammaproteobacteria, включающими
многообразие как галотолерантных, так и галофильных бактерий, и могут быть
классифицированы как циклические формы N-ацетилированных аминокислот
(Widderich et al., 2014a). Номенклатурное название эктоина – 2-метил-1,4,5,6тетрагидропиримидин-4-карбоновая кислота; гидроксиэктоин является его 5гидроксипроизводным.
Путь биосинтеза эктоина, идентичный у метилотрофных, автотрофных и гетеротрофных галофилов, является ответвлением в пути синтеза аминокислот аспартатного семейства и включает три ферментативных стадии, катализируемые ферментами
диаминобутират
(ДАБ)-ацетилтрансферазой
(EctА),
ДАБ-
аминотрансферазой (EctB) и эктоинсинтазой (EctС) с получением циклической
молекулы эктоина (Galinski, 1995; Schwibbert et al., 2011). На первой стадии аспартатполуальдегид трансаминируется до 2,4-диаминобутирата (ДАБ) с глутаматом
в
качестве
донора
аминогруппы;
реакцию
катализирует
ДАБ-
аминотрансфераза (EctB). Затем ацетильная группа с ацетил-КоА переносится
ДАБ-ацетилтрансферазой (EctА) на ДАБ с образованием ацетил-2,4-ДАБ. В финальной стадии эктоинсинтаза (EctС) катализирует циклическую конденсацию
ацетил-2,4-ДАБ с образованием эктоина (Schwibbert et al., 2011) (рис. 9).
Рис. 9. Организация генов пути биосинтеза эктоина у гало(алкало)фильных
аэробных метилобактерий: ectA – ДАБ-ацетилтрансфераза, ectB – аминотрансфераза, ectC – эктоинсинтаза, ask – аспартокиназа (Троценко и др., 2010)
Структурные гены ферментов биосинтеза эктоина гетеротрофных галофилов
обычно расположены в одном опероне ectABC (Cánovas et al., 1998). Однако сре-
57
ди умеренно-галофильных метилобактерий Methylophaga alcalica, Methylarcula
marina (Решетников и др., 2010) и Methylophaga thalassica, а также метанотрофа
Methylomicrobium alcaliphilum 20Z, генетическая организация отличается тем, что
в состав ect-оперона входит дополнительный ген аспартокиназы (ask): ectABCask
(Reshetnikov et al., 2006). Транскрипция оперонов ectABC и ectABC-ask активируется в ответ на высокую осмолярность (Louis and Galinski, 1997; Kuhlmann and
Bremer, 2002).
Поглощение эктоина. В случае прямого поглощения из окружающей среды
используется ряд систем поглощения эктоина, принадлежащих к разным семействам транспортеров (Kuhlmann et al., 2008, 2011; Pastor et al., 2010). Большинство
из этих транспортеров работают для нейтрализации эктоинов как осмопротекторов (например, ProU и ProP) или как системы переработки эндогенно синтезированных и затем выведенных из организма эктоинов (например, TeaABC), но некоторые (например, EhuABCD и UehABC) служат в основном для поглощения эктоинов, когда они используются в качестве питательных веществ (Kuhlmann et al.,
2008; Van-Thuoc et al., 2013).
Генная регуляция синтеза эктоина у метилобактерий. Транскрипция
ect-оперона у M. thalassica и M. alcalica начинается с двух промоторов – ectP1 и
ectP2 (Мустахимов и др., 2012). Сайт связывания в области -10 идентичен таковому в Mm. alcaliphilum 20Z; последовательности -10 и -35 промотора ectP1 гомологичны таковым σ70-зависимого промотора E. coli. Напротив, последовательности 35 и -10 промотора ectP2 проявляли низкое сходство с σ70-зависимым промотором
E. coli. Транскрипция регулируется при участии белка-репрессора ЕctR, расположенного выше генов синтеза эктоина и транскрибирующегося конститутивно. Неясно, как осмолярность среды регулирует экспрессию генов биосинтеза эктоина
посредством белка-регулятора ectR. Логично предположить, что регуляция транскрипции ect-оперона происходит за счёт изменения ДНК-связывающей активности ectR, которая, в свою очередь, зависит от внешней солёности. Однако прямая
регуляция активности белка EctR не представляется возможной, так как экспрессия ect-оперона у Mm. alcaliphilum 20Z происходит и при низкой солёности среды.
58
Предположительно, транскрипционная регуляция биосинтеза эктоина осуществляется
за
счёт
посттрансляцинной
модификации
ectR,
(фосфорилирова-
ние/дефосфорилирование), приводящей к изменению его конформации и, соответственно, ДНК-связывающей активности. Аналогичная регуляция в зависимости от осмолярности среды показана для Kdp и OmpC/OmpF транспортных систем
(Sleator and Hill, 2002). Белки EctR метилотрофных и гетеротрофных галофилов
относятся к MarR-семейству транскрипционных регуляторов, но формируют на
филогенетическом древе белков MarR-семейства отдельную ветвь (Мустахимов и
др., 2012). Кроме исследованных метилотрофов, гомолог транскрипционного репрессора EctR присутствует у бактерий других физиологических групп, имеющих
оперон ectABC-ask (Мустахимов и др., 2012). Присутствие EctR характерно для
бактерий с галотолерантностью до 15% NaCl. Напротив, у экстремальных галофилов Chromohalobacter salexigens, Bacillus pasteurii, Marinococcus halophilus и
Salibacillus salexigens, растущих при концентрации NaCl выше 20%, нет геновгомологов ask и ectR.
5-гидроксиэктоин – производное эктоина – синтезируется его продуцентами через селективную и стереоспецифную реакцию гидроксилирования. Этот
осмолит обладает более выраженными протективными свойствами по сравнению
с эктоином, и более распространён среди грамположительных галофильных
/толерантных бактерий.
Кроме того, при повышении температуры эктоин быстро превращается в
гидроксиэктоин, что свидетельствует о термопротекторной роли последнего. Гидроксилирование эктоина осуществляется белком EctD, членом семейства негемовых
(III)
белков
надсемейства
2-оксоглутарат-зависимых
диоксигеназ
(Н.Ф.1.14.11) (Höeppner et al., 2014). Ген ectD может быть либо частью оперона
ectABC, формируя кластер ectABCD, либо отдельной транскрипционной единицей генома. Комплексный анализ базы данных 6428 микробных геномов выявил
наличие генов биосинтеза эктоина у ~7% от количества представленных микроорганизмов, и около четверти из них, по прогнозам, также производят гидроксиэктоин (Garcia-Estepa et al., 2006; Bursy et al., 2007).
59
Так как гидроксиэктоин зачастую обладает более выраженной протектирующей и антистрессовой функцией, чем эктоин (Kurz, 2008), возникает вопрос, почему не все продуценты эктоина синтезируют 5-гидроксиэктоин, ведь его синтез
из эктоина включает лишь один дополнительный биохимический шаг – гидроксилирование (Bursy et al., 2007). Частично ответ на этот вопрос кроется в том, что
физиологические
потребности
продуцента
гидроксиэктоина
и
EctD-
гидроксилирование являются О2-зависимыми ферментативными реакциями
(Bursy et al., 2007; Widderich et al., 2014a), и, следовательно, ни один из предсказанных продуцентов гидроксиэктоина не может быть облигатным анаэробом, в то
время как эктоин могут производить как аэробные, так и анаэробные микроорганизмы (Widderich et al., 2014b).
3.7. Применение эктоина
Области применения эктоинов разнообразны, они являются стабилизаторами не только макромолекул и клеточных компонентов, но и целых клеток и тканей (Lentzen and Schwarz, 2006; Pastor et al., 2010; Widderich et al., 2014a) от замораживания, высыхания, высоких температур, кислородных радикалов и радиации
(Santos and Da Costa, 2001). Влияние эктоина на структуру ДНК таково, что многие эндонуклеазы рестрикции перестают расщеплять её (Pastor et al., 2010). Эктоин находит применение в косметологии, научной практике, медицине и смежных
областях (Buenger and Driller, 2004).
Эктоин перспективен в качестве терапевтического агента для лечения некоторых заболеваний: болезни Альцгеймера, губчатой энцефалопатии, так как они
вызваны неправильным фолдингом белков с образованием высокорегулярных агрегатов – амилоидов (Pastor et al., 2010); эктоин ингибирует их образование, модулируя свойства растворителей и способствуя тем самым более компактной
конформации белков (Göller and Galinski, 1999; Aguzzi and Polymenidou, 2004).
Известно, что эктоин снижает токсичность нейробластомы человека и скорость образования индуцирующих ее инфекционных единиц – прионов
(Kanapathipillai et al., 2005; 2008), а также ингибирует провоспалительные реакции
60
в эпителиальных клетках легких (Sydlik et al., 2009), приводящие к раку
(Donaldson et al., 2005).
Поскольку эктоин является медиатором апоптоза и окислительного стресса,
осмолит защищает слизистую оболочку (Pech et al., 2013) от аллергических реакций организма, например, конъюнктивитов (Скрипник, 2015); микроплёнка из эктоина способствует лечению аллергических ринитов (Рязанцев, 2014). В косметологии эктоин – высококачественное средство для ухода за кожей, ослабляющее
кумулятивный эффект таких факторов её старения, как УФ-излучения (Botta et al.,
2008), ветра, влажности и перепада температур (Buenger et al., 2004; Rabe et al.,
2006; Heinrich et al., 2007); осмолит стабилизирует мембраны (липидный слой)
клеток, увеличивая тем самым гидратацию поверхности и предупреждая обезвоживание кожи (Bunger, 1999; Graf et al., 2008).
Увеличение коммерческого спроса на эктоин привело к интенсификации
усилий в целях улучшения процессов его производства, однако реализованный
синтез этого биопротектора с использованием гетеротрофной бактерии Halomonas
elongata на среде с глюкозой, L-глутаминовой кислотой и 12%-ным NaCl, достаточно дорогостоящий (Oren, 2002). Существенно удешевить производство эктоина может использование непищевого субстрата метанола и продуцентов, не требующих специальных ростовых факторов.
3.8. Галофильные метилобактерии
Умеренно галофильные метилобактерии выживают в среде, содержащей до
15% NaCl. Они принадлежат к классам Alphaproteobacteria (род Methylarcula) и
Gammaproteobacteria (роды Methylophaga, Methylohalomonas, Methylonatrum).
Галофильные и галотолерантые метилобактерии распространены в морской
воде, содовых озёрах, засолённых почвах и других биотопах, включая горные породы (Доронина и др., 1997; Doronina et al., 2003а; Доронина и др., 2005). С1соединения в морских экосистемах образуются анаэробными микроорганизмами,
водорослями, а также попадают в них с осадками. Первыми среди умеренно галофильных метилобактерий, выделенных из морских экосистем и оптимально рас-
61
тущих при 3–5% NaCl, были описаны представители рода Methylophaga – M. marina и M. thalassica (Janvier et al., 1985). В дальнейшем таксономическое разнообразие было расширено описанием новых видов этого рода: M. muralis
(‘Methylophaga murata’) (Доронина и др., 2005; Doronina et al., 2011); M. lonarensis
(Antony et al., 2012), M. thiooxidans (Boden et al., 2010; 2011), M. sulfidovorans (De
Zwart et al., 1996; 1998), M. alcalica (Doronina et al., 2003b), M. aminisulfidivorans
(Kim et al., 2007), M. nitratireducenticrescens и M. frappieri (Villeneuve et al., 2013).
С помощью флуоресцентно-меченных нуклеотидных зондов (FISH) было продемонстрировано широкое распространение умеренно галофильных метилобактерий рода Methylophaga в морских образцах (Janvier et al., 2003).
Умеренно галофильный метилотроф Methylohalomonas lacus (оптимум роста
10% NaCl) и галотолерант Methylonatrum kenyense (оптимум роста 3–5% NaCl) выделены из осадков гиперсолёного хлоридно-сульфатного озера Кулундинской степи (Алтай) и содового озера (Кения), соответственно (Sorokin et al., 2007).
Умеренно-галофильные факультативные метилобактерии рода Methylarcula
(M. marina и M. terricola) изолированы из солёных природных биотопов (Doronina
et al., 2000).
Следует отметить, что ряд видов описан, но их названия валидно не опубликованы:
M.
‘limanica’
(Доронина
и
др.,
1997),
‘Marinosulfonomonas
methylotropha’ (Holmes et al., 1997), ‘Ancylobacter natronum’ (Доронина и др.,
2001), M. ‘natronica’ (Doronina et al., 2003а).
3.9. Осмопротекторы метилобактерий
Показано, что галофильные и галотолерантные метилобактерии родов
Methylophaga и Methylarcula в ответ на повышение солёности окружающей среды
синтезируют de novo эктоин, составляющий до 18–20% от веса сухого вещества
бактерий (Доронина и соавт, 1998; Doronina et al., 2003a, b). Суммарное внутриклеточное содержание эктоина у исследованных штаммов в пересчёте на внутриклеточную воду полностью уравновешивало осмолярность среды (Доронина и
др., 2015). У Methylophaga muralis концентрация эктоина возрастала при сниже-
62
нии температуры культивирования, и при 4°С была вдвое выше, чем при 29°С
(Доронина и др., 2015).
При низких (2–3%) концентрациях соли в свободном пуле аминокислот бактерий родов Methylarcula отмечено достаточно высокое содержание глутамата
(10–20 мкг/мг сухих клеток). Однако при более высоких концентрациях NaCl (10–
12%) у M. marina и M. terricola содержание глутамата не превышало 5 мкг/г сухого вещества, так как в клетках резко возрастало содержание эктоина: 10→80–150
мкг/мг сухих клеток. Следовательно, при повышении в среде концентрации NaCl
от 0,6 до 10–12%, внутриклеточное содержание эктоина увеличивалось на порядок (Доронина и др., 1998.)
В клетках метилобактерий рода Methylophaga, выращенных при низких и
высоких концентрациях соли, наблюдалась аналогичная закономерность, за исключением того, что при высокой солёности также синтезировались небольшие
количества сахарозы (Doronina et al., 2000; Троценко и др., 2007). Это обусловлено, вероятно, образованием предшественников (УДФ-глюкозы и фруктозо-6фосфата) уже в первых реакциях РМФ-цикла. Наибольший выход биопротектора
(20% от веса сухой биомассы) получен у штаммов Methylophaga. Оптимальное
содержание NaCl для биосинтеза эктоина при периодическом культивировании
Methylophaga thalassica MT составляет 90 г/л (Доронина и др., 2010).
Выращенные при солёности 6–9% NaCl клетки M. muralis выдерживали
лиофилизацию без добавления криопротекторов, что, очевидно, связано с высокой концентрацией в клетках осмопротектора эктоина (Доронина и соавт., 1998;
Доронина et al., 2000a; 2003a,b). Methylohalomonas lacus накапливает глицинбетаин (Sorokin et al., 2007), однако основной осмопротектор ‘Marinosulfonomonas
methylotropha’ (оптимум роста 3% NaCl) неизвестен (Holmes et al., 1997).
Метилобактерии из солёных источников являются потенциальными продуцентами ценных метаболитов: осмопротектора эктоина, биополимеров – экзополисахаридов и ПГБ. Галофильные/галотолерантные метилобактерии в условиях
повышенной солёности среды синтезируют в качестве основного осмопротектора
63
эктоин, причём растут на дешёвом непищевом субстрате – метаноле, производимом в РФ крупнотоннажно (>10 млн т/год).
Представляет интерес дальнейшее изучение биоразнообразия метилобактерий из природных и техногенных биотопов.
Таким образом, имеющийся массив данных, включающий характерные особенности биологии метилобактерий и многочисленные методы их изучения, создаёт предпосылки для успешной идентификации штаммов и описания новых таксонов с применением разработанных специфических генотипических, физиологобиохимических и хемотаксономических маркеров. Среди изучаемых организмов
галофильные и галотолерантные представители обнаруживаются лишь в нескольких родах. Запасное вещество ПГБ и осмолит эктоин, синтезируемые метилобактериями, востребованы в медицине в качестве биоразлагаемого импланта и универсального биопротектора, соответственно. Изучение биоразнообразия и прикладных
аспектов применения рассматриваемых метилотрофов вооружит нас знанием, которое, надеемся, дополнит картину мира и послужит на пользу человечеству.
64
4. Материалы и методы
4.1. Объекты исследования
Объектами исследования служили выделенные нами 10 метанолпотребляющих штаммов метилобактерий из солёных биотопов Урала и Памуккале: 7 штаммов умеренно галофильных и галотолерантных аэробных метилобактерий и 3 штамма негалотолерантных метилобактерий.
Пробы. 46 образцов почв, ила и воды на территории Троицкого заказника
Челябинской области и г. Соликамска Пермского края отобраны к.б.н. Н.П. Ковалевской, д.б.н. Н.В. Дорониной и к.б.н. Е.Н. Капаруллиной. Три образца воды и
ризосферы осоки были отобраны в национальном парке Памуккале (Иераполис,
Турция) д.б.н. Н.В. Дорониной (табл. 4).
Таблица 4. Характеристика проб.
Штамм
Солёность,
% NaCl
C2T
5
LS
SK12T
SK15T
S3T
S3270
2395AT
2395B
3
3
2
7
Н.о.**
Н.о.
Н.о.
PК2T
4
PК1
4
Источник выделения
Почва на территории Троицкого заказника Челябинской области (53°56′15″с.ш., 61°13′34″ в.д.)
Биотопы Соликамска (59°38′00″ с.ш., 56°46′00″ в.д.):
Ил, соляной колодец «Людмилинская скважина»
Ил, СКРУ* №1
Почва, СКРУ №1; 5 м от террикона
Ил, сток со шламохранилища в р. Усолка
Ил, СКРУ №3
Почва, 5 м от террикона СКРУ №2
Там же
Вода горячего (37°C) солёного источника, Иераполис, провинция Денизли, Памуккале (37°57′19″с.ш.,
29°4′41″в.д.)
Ризосфера осоки Carex sp., там же
Примечание:
* СКРУ – Соликамское карьерное рудоуправление;
** Не определяли.
65
Определение физико-химических параметров проб проводили in situ с помощью селективных электродов портативного измерителя Экотест 120 (“Эконикс”, Россия).
Характеристика источников выделения
Троицкий заказник Челябинской области является особо охраняемой природной территорией России; был образован в 1927 г. в качестве лесостепного заповедника для охраны уникальных типов почв лесостепного Зауралья и обладает
богатейшим набором почв (до 40 наименований), однако почти половина территории занята засолёнными почвами, подвергающимися техногенному воздействию, связанному, вероятно, с воздушным переносом поллютантов (Еремченко и
Чудинова, 2012).
Город Соликамск расположен в пределах уникального Верхнекамского месторождения калийных и калийно-магниевых солей (сильвины и карналлиты), в
недрах которого также находятся большие запасы хлористых солей натрия
(галиты). Соликамское калийное рудоуправление представляет собой комплекс по
добыче и производству калийных удобрений (с 2011 г. – ОАО «Уралкалий», ранее
– «Сильвинит»). Для размещения технологических отходов на территории предприятия созданы шламохранилища, в состав которых входят твёрдые глинистосолевые шламы и поступающие с ними рассолы, а также рассолы и осадки, поступающие с территории солеотвала. Кроме того, в пределах города по берегу р.
Усолки находится соляной колодец «Людмилинская скважина», который был
пробурен более ста лет назад (Константинов И., 2010). В течение долгого времени
на указанных территориях сохранялись специфические условия повышенной солёности, что могло привести к селективному давлению, способствуя формированию устойчивых к высоким концентрациям соли микробных сообществ, которые,
возможно, включают метилобактерий.
Памуккале (в пер. с турецкого — «Хлопковый замок») представляет собой
уникальный комплекс травертиновых террасных водоёмов с температурой 37–
100°С (Кендиван, 2011). Данный объект включён в список Всемирного наследия
ЮНЕСКО (1988).
66
В качестве референтных штаммов в работе использовали коллекционные
штаммы
Methylophaga
thalassica ВКМ B-2057T, Ancylobacter rudongensis
AS1.1761T, Ancylobacter oerskovii DSM 18746T, Paracoccus denitrificans ВКМ B1320T и Arthrobacter protophormiae ВКМ Ac-2104T, Advenella kashmirensis WT001T,
Advenella incenata CCUG 45225T , а также A. incenata 4GA2008.
4.2. Методы исследования
4.2.1. Микроскопия
Оптическая микроскопия*. Окрашивание по Граму проводили согласно
стандартной методике (Методы общей бактериологии, 1984). Изучение морфологии и подвижности клеток в режиме фазового контраста проводили с помощью
оптического микроскопа Nikon Eclipse Ci (“Nikon”, Япония), оснащённого камерой ProgRes SpeedXT core5 (“Jenoptik”, Германия).
Электронная микроскопия**. Для получения ультратонких срезов клетки
фиксировали в растворе: 1,5%-ный глутаровый альдегид в 0,05 М какодилатном
буфере (pH 7,2) в течение 1 ч при +4°С, трижды отмывали в том же буфере и дополнительно фиксировали в 1% OsO4 в течение 4 ч при +4°С. После обезвоживания в серии спиртов клетки заключали в эпоксидную смолу Epon – 812. Ультратонкие срезы монтировали на опорные сеточки, затем контрастировали уранилацетатом и свинцом. Для негативного контрастирования препаратов клеток использовали 0,3%-ный раствор фосфорно-вольфрамовой кислоты (pH 7,2). Полученные
препараты просматривали в электронном микроскопе JEM 100B (“Jeol”, Япония):
препараты ультратонких срезов – при ускоряющем напряжении 80 кВ, негативно
окрашенные препараты – при 60 кВ (Reynolds, 1963).
__________________
*,**
Световые и электронные фотографии получены с.н.с., к.б.н. Сузиной Н.Е. (ИБФМ РАН, Пу-
щино).
67
4.2.2. Методы работы с культурами
4.2.2.1. Состав питательных сред
Состав сред, растворов микроэлементов и витаминов, использованных в работе, приведён ниже; pH сред 7,2 (для среды РОФМ – pH 7,5) устанавливали раствором 3 М NaOH.
Среда “K” (г/л): КH2PO4 – 2,0; (NH4)2SO4 – 2,0; MgSO4·7H2O – 0,025; NaCl –
0,5; FeSO4·7H2O – 0,002; H2Oдист. – 1 л.
Среда MAMS (Schäfer, 2007) (г/л): NaCl – 20,0; К2HPO4 – 2,34; (NH4)2SO4 –
1,0; MgSO4·7H2O – 1,0; КH2PO4 – 0,36; CaCl2 – 0,15; Na2MoO4·2H2O – 0,02;
Na2WO4·2H2O – 0,003; FeSO4·7H2O – 0,002. H2Oдист. – 1 л.
Среда №5 (г/л): KH2PO4 – 1,0; (NH4)2SO4 – 0,5; MgSO4·7H2O – 0,140; NaCl –
0,5; FeSO4·7H2O – 0,005; H2Oдист. – 1 л.
Среда MAMS VI (г/л): NaCl – 0,5(NH4)2SO4 – 1,0; CaCl2·2H2O – 0,15;
MgSO4·7H2O – 0,2; NaH2PO4 – 0,5; K2HPO4 – 1,0; Раствор микроэлементов “SL-10”
– 5,0 мл. H2Oдист. – 1 л.
Среда РОФМ (г/л): KH2PO4 – 1,0; Na2HPO4·12H2O – 1,0; (NH4)2SO4 – 1,0;
MgSO4·7H2O – 0,1; H2Oдист. – 1 л.
Микроэлементы среды РОФМ (г/л): H3PO4 – 270,0 (=147,5 мл); MgSO4·7H2O
– 80,0; FeSO4·7H2O – 2,3; CaCl2·6H2O – 0,6; MnSO4·H2O – 0,5; ZnSO4·H2O – 0,6;
CuSO4·5H2O – 0,4; H2Oдист. – 1 л.
Среда NV (г/л): KH2PO4 – 1,0; KNO3 – 1,0; MgSO4·7H2O – 0,140; NaCl – 0,5;
FeSO4·7H2O – 0,005; H2Oдист. – 1 л.
Раствор микроэлементов SL-10 (г/л): FeCl2·4H2O – 0,0015; ZnSO4·7H2O –
0,07; MnCl2·4H2O – 0,1; H3BO3 – 0,006; CoCl2·6H2O – 0,19; CuCl2·2H2O – 0,002;
NiCl2·6H2O – 0,024; Na2MoO4·2H2O – 0,036; HClконц – 5 мл; H2Oдист. – до 1 л.
Раствор витаминов V10 (г/л): биотин – 0,02; п-аминобензойная кислота –
0,3; никотиновая кислота – 0,20; липоевая кислота – 0,05; пантетонат кальция –
68
0,10; пиридоксина дигидрохлорид – 0,5; фолиевая кислота – 0,05; цианокобаламин
(В12) – 0,1; тиамин – 0,20; рибофлавин – 0,10; метанол – 1 л.
Среда 5/5 (г/л): бакто-триптон (“Pronadisa”, Испания) – 5,0; соевый пептон
(“Difco”, США) – 5,0; дрожжевой экстракт – 1; аминопептид («Самсон-Мед», Россия) – 60 мл; H2Oдист. – до 1 л.
4.2.2.2. Получение накопительных культур
Для получения накопительных культур использовали среду “K” с добавлением 3% NaCl. После стерилизации (1 атм; 30 мин) к 200 мл среды добавляли метанол (2% об/об), 0,2 мл раствора витаминов и 0,2 мл раствора микроэлементов.
Культивирование проводили в колбах объёмом 750 мл, содержащих 200 мл
среды и 10 мл жидкого или 5 г твёрдого посевного материала на шейкере (180
об/мин) при 29°С в течение 5 дней.
После появления роста, 10 мл накопительной культуры переносили в свежие среды с метанолом и повторно инкубировали в течение 3 сут (Доронина и др.,
2005).
4.2.2.3. Выделение чистых культур
После трёх пассажей в течение 3 сут суспензию накопительной культуры
высевали истощающим посевом на агаризованную (2% “Difco”, США) среду “К”
с метанолом и 3% NaCl. Отдельные колонии пересевали на скошенный агар, переносили в жидкую среду и вновь высевали на агаризованную среду. Реизолированные колонии метилобактерий пересевали на скошенный агар. Чистоту выделенных культур проверяли оптической и электронной микроскопией, а также по
однородности колоний, выросших на агаризованных средах с метанолом или
глюкозой/ пептоном (Доронина и др., 2005).
4.2.2.4. Культивирование бактерий
1) Культивирование в колбах для определения активностей ферментов,
состава фосфолипидов, убихинонов проводили следующим образом: галотолерантные культуры выращивали на среде MAMS, негалотолерантные – на среде
“К” с добавлением 0,5% (об/об) метанола и раствора витаминов (50 мкл/200 мл) в
69
метаноле (V10). Колбы инкубировали на шейкере (140 об/мин) при температуре
29ºС до начала стационарной фазы роста (1–3 сут).
Для проведения API тестов, описания колоний, определения чувствительности к антибиотикам, потребления ДХМ, культуры высевали на агаризованную
(2% “Difco”, США) среду “К” с метанолом и 0,05 или 3% NaCl. Для проведения
анализа жирных кислот сравниваемые штаммы выращивали на среде одинакового
состава в одинаковых условиях; облигатные метилотрофы – на агаризованной
минеральной среде с метанолом, факультативные – на богатой среде 5/5.
Периодическое культивирование для синтеза полимеров проводили в колбах Эрленмейера объёмом 750 мл, содержащих 200 мл среды и метанол (0,5%
об/об) на качалке (180 об/мин) при 29°С в течение 7 сут. Начиная с 3-х сут, в колбы ежедневно вносили по 1 мл метанола. Культуру Methylobacterium extorquens
G10 выращивали на среде РОФМ, к которой добавляли 1 мл метанола и 0,2 мл
раствора микроэлементов. Штамм С2T выращивали на среде MAMS VI, штамм
PK2T – на минеральных средах MAMS и MAMS VI. Микроэлементы и витамины
готовили в виде концентрированного раствора и стерильно добавляли в среду перед посевом.
В качестве посевного материала для ферментёра использовали 2-х суточную культуру в середине логарифмической фазы роста (ОП600 = 1,8), выращенную
в колбах. Инокулят добавляли в среду в соотношении 1:10.
Для подбора оптимальной среды для культивирования штамма PK2T культуру высевали на 5 сред различного состава: MAMS, “К”, РОФМ, NV, №5 с добавлением метанола в среду 1:200 (об/об). Среды разливали в колбы по 200 мл и
100 мл. Инкубирование проводили на качалке (180 об/мин) при температуре 29°С.
Через 72 ч рост культур оценивали спектрофотометрически.
Для определения соответствующего физиологического оптимума культуру
выращивали при разном содержании NaCl. Инкубировали в аналогичных условиях.
2) Культивирование в ферментёре при синтезе штаммами ПГБ.
Культивирование Methylobacterium extorquens G10, штаммов C2T и PK2T проводи-
70
ли на Установке лабораторных ферментёров ИБФМ РАН с использованием ферментёров АНКУМ-2М (НПО «Биоприбор» РАН). По мере потребления растущими культурами метанола его добавляли порциями от 5 до 20 мл. Отсутствие метанола в среде определяли по резкому увеличению уровня растворённого кислорода
(рО2), число оборотов мешалки увеличивали до 1000/мин.
3) Культивирование Methylobacterium extorquens G10 проводили на
среде РОФМ с добавлением 5 мл метанола, 20 мл раствора микроэлементов. В
ферментёр вносили 4,0 л минеральной среды и 200 мл посевного материала. Режим культивирования: t = 30°С; pH 6,85; рО2 = 20–30%; nисх = 350 об/мин. На стадии наращивания биомассы поддерживали pH среды с помощью 20%-го раствора
NH4OH. При достижении культурой ОП600 = 30 (15 г/л сухой биомассы) добавляли
50 мл концентрированной среды (10×среда РОФМ) и для создания лимита по азоту переходили на поддержание pH среды с помощью 10%-го раствора NaOH.
4) Культивирование штамма C2T проводили на среде MAMS VI с добавлением 5 мл метанола, 20 мл раствора микроэлементов и 20 мл дрожжевого
автолизата. Объём среды для культивирования в ферментёре составлял 4 л. Режим
культивирования: t = 30ºС; pH 7,1; рО2 = 10–15%; nисх = 300–350 об/мин. На стадии наращивания биомассы поддерживали pH среды 10%-м раствором NH4OH.
При ОП600 = 40 для создания лимита по азоту переходили на поддержание pH среды с помощью 10%-го раствора NaOH.
5) Культивирование штамма PK2T для синтеза ПГБ проводили аналогично культивированию штамма C2T, за исключением того, что тестировали две
минеральные среды: MAMS и MAMS VI.
При ферментации продуцентов Methylobacterium extorquens G10 и штамма
C2T, направленной на синтез сополимера ПГБВ, при достижении культурами
ОП600 = 50 переходили на подтитровку 10%-м раствором NaOH и начинали подавать в среду смесь метанола и пентанола 98:2(об/об) для синтеза сополимера
ПГБВ.
71
4.2.3. Изучение культуральных и физиолого-биохимических свойств
Определение оптимальных для роста pH, температуры, концентраций
NaCl и метанола
Для определения физиологического оптимума клетки выращивали при рН
от 5,0–10,0 с шагом 0,5 единиц в условиях с оптимальной солёностью. Необходимые значения рН устанавливали добавлением 5 N NaOH; рост культур оценивали
во время экспоненциального роста – на 1–2 сут. Для определения оптимума температуры клетки выращивали в диапазоне от +4 до +40°С (+16; +29; +37°С); для
определения оптимального процентного содержания NaCl: 0–15% в/об (0,05; 0,5;
1; 3; 5; 8; 10; 12; 15%) при оптимальном значении pH; содержания метанола 0,1–
5,0% (0,5; 1 и далее с шагом в 1%). Культуры инкубировали в жидкой среде с метанолом на термостатируемой качалке (140 об/мин). Прирост биомассы оценивали спектрофотометрически через 1, 2 и 3 сут для определения оптимума pH и метанола, через 3 сут для определения температурного и NaCl-оптимумов.
Потребность в витаминах анализировали на среде, содержащей тиамин,
биотин, фолиевую кислоту, B12 (50 мкг/л) или их смесь. Для контроля использовали среду без витаминов.
Устойчивость
к
антибиотикам
определяли
с
помощью
дисков
(“Bioanalyse”, Турция), пропитанных следующими антибиотиками (мкг/диск):
линкомицин (10), эритромицин (15), пенициллин (10), оксациллин (5), налидиксовая кислота (30), гентамицин (10), хлорамфеникол (30), канамицин (30), стрептомицин (10), новобиоцин (30), тетрациклин (30) и неомицин (30). Культуру высевали на чашки Петри с агаризованной минеральной средой и сверху помещали
диски. Влияние антибиотиков на рост клеток и зоны отсутствия роста оценивали
после 1–2 недель инкубации.
Способность изолятов использовать различные органические соединения в качестве источника углерода и энергии определяли в жидкой минеральной среде, в которую вместо метанола вносили 0,3% (в/об) испытуемого вещества, инокулировали суспензией культуры, смытой с агаризованной среды, и ин-
72
кубировали 14 сут на качалке при оптимальной температуре. Летучие вещества
вносили в концентрации 0,5% по объёму.
Кроме того, для определения спектра используемых субстратов исследуемых штаммов использовали также API тесты “20Е” и “20NE” (“BioMe´rieux”,
Франция), согласно инструкции фирмы-производителя.
Способность изолятов использовать различные источники азота определяли, внося в среду “К” вместо (NH4)2SO4 эквимолярные по азоту количества
тестируемых веществ: KNO3, серина, валина, аланина, аспарагина, фенилаланина,
глицина, цистеина, аргинина, глутамата или мочевины.
Способность изолятов образовывать индол определяли, выращивая
культуры на среде “К” с метанолом, заменой (NH4)2SO4 на KNO3 (1 г/л) и добавлением 0,1% (в/об) L-триптофана, используя реактив Сальковского (Gordon and
Weber, 1951), содержащего 0,05 M FeCl3·6H2O в 61,5% HClO4. Калибровочную
кривую строили со стандартными растворами индолилуксусной кислоты (10, 20,
25, 30, 40, 50, 60 и 100 мкг/мл). Штамм S12T, не использующий KNO3 в качестве
источника азота, выращивали на среде “К” с содержанием 0,5 г/л (NH4)2SO4.
Гидролиз крахмала оценивали по реакции с раствором Люголя после выращивания культуры на агаризованной среде “К” с метанолом 0,5% (об/об) и добавлением 0,2% (в/об) растворимого крахмала после 3, 7 и 10 дней инкубации при
29°C.
Гидролиз желатины, активность оксидазы и каталазы определяли, как
описано ранее (Методы общей бактериологии, 1984).
Способность штаммов расти на метане была протестирована в атмосфере метан/воздух 1:1 (об/об) в 750 мл колбах, содержащих 100 мл среды и закрытых резиновыми пробками.
Способность штаммов расти автотрофно проверяли во флаконах в атмосфере H2/O2/CO2 (7:2:1).
Потребление дихлорметана (ДХМ) оценивали по изменению цвета агаризованной среды растущей культурой с синего на жёлтый. Для этого высевали
культуры на агаризованную (2% “Difco”, США) среду “К” с 0,1 г/л бромтиолового
73
синего и инкубировали в эксикаторе в течение недели. В эксикатор добавляли 430
мкл ДХМ. В качестве положительного контроля использовали деструктор ДХМ –
Methylobacterium dichloromethanicum DM4T.
4.2.4. Экстракция ПГБ/В из биомассы и определение молекулярной
массы
Для выделения ПГБ культуральную жидкость центрифугировали при
10 000g 30 мин, навеску сырой биомассы перемешивали с 6 объёмами метанола в
течение 1 ч, затем центрифугировали при 5000g. Из осадка экстрагировали ПГБ 6
объёмами хлороформа в течение 3 ч. Суспензию фильтровали через фильтровальную бумагу (РЕКОМ, Синяя лента). Экстракт осветляли активированным углем
марки А (0,5%, в/об) при перемешивании в течение 1 ч и пропускали через слой
фильтровальной бумаги на воронке Бюхнера под вакуумом. Осветлённый экстракт упаривали на роторном испарителе приблизительно в 5–6 раз (до состояния
жидкого киселя). Концентрат при энергичном перемешивании переносили в 6кратный объём метанола. Выпавший осадок ПГБ отделяли фильтрованием на воронке Бюхнера и высушивали при 105°С (Ежов и др., 2013).
Определение молекулярной массы ПГБ/В. Мм полимеров определяли вискозиметрическим методом, измеряя вязкость раствора ПГБ в хлороформе при
30°С (Ежов и др., 2013), и рассчитывали её значение по уравнению МаркаХаувинка-Куна, используя коэффициент [η]=7,7·10-5·М0,82 (Доронина и др., 2008).
Физико-химические свойства* ПГБ/В, в том числе температуру плавления,
теплоту плавления и степень кристалличности ПГБ определяли методами дифференциального термического анализа на приборе TA-Q100 (“TA Instrument”, США)
и на рентгеноспектрометре D8 ADVANCE (“Bruker”, Германия), соответственно
(Ежов и др., 2013).
__________________
Анализ физико-химических свойств полимеров проведён в лаборатории Физико-химических
*
исследований ИНХС им. А. В.Топчиева РАН, Москва, зав. лабораторией – в.н.с., к.х.н. Герасин
В.А.
74
4.2.5. Аналитические методы
4.2.5.1. Выделение и анализ изопреноидных хинонов
Хиноны экстрагировали и очищали методом ТСХ (Collins, 1985) из сухих
клеток. Клетки выращивали на среде “K”, MAMS (Schäfer, 2007) или, в случае использования типового штамма типового вида рода Advenella, не растущего на метаноле, на богатой среде 5/5. К 2 г лиофилизованной биомассы добавляли 50 мл
смеси хлороформ-метанол 2:1 (об/об) и встряхивали при температуре 12°С в течение 3 ч. Экстракт фильтровали через стекловолокнистый фильтр Whatman GF/А
и упаривали досуха под вакуумом. Остаток растворяли в 0,2 мл смеси хлороформ:метанол 2:1 (об/об), наносили на пластинки “Silufol” F254 (10×20 см,
“Kavalier”, Чехословакия) на старте (отступив по 1 см снизу, слева и справа) в виде полосы шириной ~2 мм, и хроматографировали в системе растворителей гексан-диэтиловый эфир 85:15 (об/об). Убихиноны имеют Rf ~0,4, менахиноны –
~0,7–0,8. Отмеченный в ультрафиолете (254 нм) участок хроматографического
слоя снимали скальпелем и экстрагировали убихиноны 1 мл хлороформа. Экстракт центрифугировали (12 000g, 15 мин), переносили в пробирку и упаривали в
токе азота. Анализ хинонов* проведён на масс-спектрометре “Finnigan” MX–1310
(Германия) в стандартных условиях прямым вводом пробы при температуре испарения образца 160°С.
4.2.5.2. Определение состава жирных кислот проводили**, как описано
ранее (Doronina et al., 2012). Пробу сухой биомассы клеток (3–5 мг) обрабатывали
в 0,4 мл 1,2 N HCl в метаноле при 80°С в течение 1 ч (кислый метанолиз). Образовавшиеся при метанолизе метиловые эфиры жирных кислот и другие липидные
компоненты экстрагировали гексаном. Гексан упаривали, а сухой остаток силилировали в 20 мкл БСТФА [(триметилсилил)трифторацетамидом] 15 мин при 80°С и
разбавляли гексаном до 100 мкл. Для анализа 1 мкл смеси вводили в инжектор
__________________
Анализ хинонов проведён н.с., к.б.н. Баскуновым Б.П. (ИБФМ РАН, Пущино).
*
Анализ жирных кислот проведён в.н.с., д.б.н. Осиповым Г.А. (Международный аналитиче-
**
ский центр ИОХ РАН, Москва).
75
системы газового хроматографа-масс-спектрометра AT-5850/5973 Agillent Technologies (США).
Квадрупольный масс-спектрометр обладал следующими характеристиками:
диапазон регистрируемых масс летучих соединений – 2–950 аем, разрешающая
способность – 0,5 аем во всём рабочем диапазоне, чувствительность – 0,01 нг по
метилстеарату. Ионизацию проводили электронами при ускоряющем напряжении
70 эВ. Для хроматографического разделения пробы использовали капиллярную
колонку из плавленого кварца длиной 25 м и внутренним диаметром 0,25 мм, неподвижная фаза была представлена НР-5ms с толщиной слоя 0,25 мкм. Хроматографирование проводили в режиме программирования температуры от 140 до
320°C со скоростью 7 град/мин. Температура инжектора и интерфейса составляла
280°C. Обработку данных проводили с помощью штатных программ прибора.
Вещества в хроматографических пиках идентифицировали с помощью библиотечных программ с базой данных масс-спектров NIST (Doronina et al., 2012).
4.2.5.3. Определение состава фосфолипидов
Выделение фосфолипидов. Бактерии в конце логарифмической фазы роста
осаждали центрифугированием при 6000g 10 мин. Фосфолипиды экстрагировали
из 2 г сырой биомассы, тщательно перемешивая её с 3 мл смеси хлороформ: метанол 1:2 (об/об) на холоду в течение 1 ч. Суспензию центрифугировали при 6000g
10 мин. Процедуру экстракции повторяли дважды, сокращая время второй экстракции до 15 мин. Супернатанты объединяли, добавляли 2 мл хлороформа и 2 мл
воды, перемешивали в течение 15 мин на холоду. Смесь центрифугировали 20
мин при 6000g, при этом она разделялась на три слоя: верхний содержал аминокислоты и сахара; интерфаза – белки, нижний слой – фосфолипиды, изопреноидные компоненты и т.п. Полученный раствор фосфолипидов отбирали одноразовым шприцем с длинной иглой, выпаривали на вакуумном испарителе при 30°С.
Остаток суспендировали в 200 мкл хлороформа, суспензию разливали по 50 мкл в
пробирки Эппендорфа и хранили плотно закрытыми при -20°С.
Разделение фосфолипидов методом тонкослойной хроматографии проводили на пластинках Kieselgel 60 F254 (“Merck”, Германия) размерами 10×10 см,
76
предварительно отмытых в системе хлороформ: метанол 65:30 (об/об). Для определения состава фосфолипидов на пластинку на старте (отступив по 1 см снизу,
слева и справа) наносили в виде пятна диаметром 2–3 мм такое количество раствора фосфолипидов в хлороформе, которое соответствовало поглощению 0,5 ед.
после реакции с молибдатным реагентом (~5–7 мкл), и высушивали при комнатной температуре. Двумерную хроматографию проводили в системе хлороформ:
метанол: вода: 7 N гидроокись аммония (60:37,5:3,4:1) (об/об/об/об) (или заменяли гидроокись на воду) – для первого направления и хороформ:метанол:уксусная
кислота:вода – для второго направления (85:12,5:12,5:3) (об/об/об/об).
Обнаружение фосфолипидов. Пластинки после извлечения из хроматографической камеры высушивали на воздухе в течение 30 мин и проявляли, осторожно опрыскивая из стеклянного пульверизатора.
Фосфатидилэтаноламин, фосфатидилсерин и другие липиды со свободными
аминогруппами проявляли 0,25%-ным раствором нингидрина в ацетоне. После
опрыскивания пластинки 1–2 мин выдерживали в сушильном шкафу при 80–
100°С до появления пятен. Розово-фиолетовые пятна соответствовали аминосодержащим липидам при окрашивании раствором нингидрина, синие пятна на
жёлтом фоне соответствовали общему профилю фосфолипидов при проявлении
раствором фосфорномолибденовой кислоты. Пятна идентифицировали по результатам разгонки маркерных фосфолипидов в тех же условиях (Говорухина и Троценко, 1989). Кроме того, для визуализации всех липидов сухие пластинки выдерживали в парах йода (под тягой) 10 мин в камере, содержащей кристаллический йод, а также опрыскивали пластинки 10%-ным спиртовым раствором фосфорномолибденовой кислоты.
4.2.5.4. Определение осмопротекторов
1) Определение осмопротекторов методом тонкослойной хроматографии (ТСХ)
Низкомолекулярные органические соединения экстрагировали из клеток,
выросших при различной солёности среды (1–15% NaCl). 30 мг клеток (вес сырой
77
биомассы) ресуспендировали в 1 мл смеси хлороформ-метанола 1:2 (об/об),
встряхивали 1 ч. Повторную экстракцию проводили в течение 15 мин 1 мл той же
смеси. Суспензию центрифугировали (6000 об/мин, 10 мин). Супернатанты объединяли, добавляли 0,2 мл хлороформа и 0,2 мл воды, тщательно перемешивали и
центрифугировали 15 мин при 6000 об/мин. Отбирали верхний слой, содержащий
аминокислоты. Для качественного и количественного определения эктоина образцы гидролизовали 20 ч в 0,1 М КОН при 50°С. Растворы нейтрализовали 0,6 М
НСlО4.
Экстракт наносили на пластинки Kieselgel 60 F254 (“Merck”, Германия). Параллельно с анализируемыми образцами наносили стандартные растворы глутамата, гидролизованного эктоина, глицина, бетаина, саркозина в количестве 0,05–1
мкмоль каждого. Пластины хроматографировали в 0,4 М цитратном буфере (рН
3,3) при 50°С, затем подсушивали и опрыскивали 0,2% раствором нингидрина в
ацетоне. После проявления сравнивали уровень проявившихся метчиков с анализируемыми образцами.
2) Анализ аминокислот проводили на анализаторе Eppendorf Biotronic LC
2000 (Германия) в соответствии со стандартной процедурой.
3) Количественный анализ сахарозы
Определение количества сахарозы проводили антроновым методом (Handel,
1968). Бактерии в конце логарифмической фазы роста осаждали центрифугированием при 5000g 30 мин. Биомассу суспендировали в метаноле (1 мл на 200 мг
биомассы) в течение 2 ч на качалке (120 об/мин) при 29°С. Затем центрифугировали 3 мин при 8000g, отбирали супернатант и упаривали на концентраторе Concentrator 5301 (Германия). Полученный сухой остаток растворяли в 0,5 мл H2O,
добавляли 0,5 мл хлороформа, тщательно перемешивали, центрифугировали и отбирали верхнюю фракцию. Отмывали хлороформом до полного исчезновения интерфазы.
Для исследования брали верхнюю водную фазу. Смешивали 50 мкл образца
с 50 мкл 30%-ной NaOH, инкубировали в термостате при 99°С. Микропробирки
78
охлаждали при комнатной температуре, добавляли 1,5 мл антронового реактива
(60 мг антрона в 28 мл H2SO4конц и 12 мл H2O), выдерживали 15 мин при 45°С. Измеряли оптическую плотность при 620 нм. Калибровочную кривую со стандартными растворами сахарозы (25, 50, 100, 200, 400, 500, 750, 1000 и 2000 мкг/мл,
разведёнными из 1000 мкг/мл) строили в день определения.
4) Определение количества эктоина методом нормально-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ)
Содержание осмопротектора эктоина определяли также методом нормально-фазовой ВЭЖХ (Ешинимаев и др., 2007).
Клетки в конце логарифмической фазы роста осаждали центрифугированием при 6000g в течение 30 мин. Далее отмывали средой и дополнительно осаждали центрифугированием при 6000g в течение 10 мин. Эктоин экстрагировали метанолом из сырой биомассы (5 мл/100 мг) в течение 1 ч при 29°С. Удаляли осадок
центрифугированием в течение 5 мин при 10 000g, к супернатанту добавляли 1 мл
воды и 1 мл хлороформа и встряхивали в течение 5 мин. Полученную смесь центрифугировали 2 мин при 15 000g. Для анализа брали верхнюю водную фазу. Количественное определение эктоина в пробах проводили с использованием жидкостного хроматографа высокого давления (“LKB”, Швеция). Исследуемые образцы пропускали через колонку Separon SGX-NH2 (“Tessek Ltd”, Чехия) 3×150
мм с размером частиц сорбента 5 мкм. Подвижная фаза – ацетонитрил-вода
(80:20), скорость протока 1 мл/мин. Объём петли инжектора составлял 20 мкл.
Детекцию эктоина проводили при 230 нм. Количество эктоина рассчитывали по
площади пика на хроматограмме, построенного прибором путём анализа известных концентраций эктоина. В экспериментах глутамат, сахароза и NaCl, присутствующие в образце, не влияли на количественный анализ эктоина.
79
4.2.5.5. Определение количества ПГБ в биомассе и соотношения 3гидроксибутирата/3-гидроксивалерата
(3ГБ/3ГВ)
методом
обращённо-
фазовой ВЭЖХ
Содержание ПГБ и соотношение 3ГБ/3ГВ в биомассе определяли опосредованно – по образованию кротоновой и метилкротоновой кислот – после гидролиза. Использовали метод обращённо-фазовой ВЭЖХ с применением жидкостного
хроматографа высокого давления (“LKB”, Швеция), оборудованного УФдетектором UVIS 200 (“Linear”, США) с переменной длиной волны. Детекцию
кротоновой и метилкротоновой кислот проводили спектрофотометрически при
228 нм. При этих условиях время удерживания кротоновой кислоты составляло
3,4 мин, а метил-кротоновой – 5,8 мин (определено при анализе стандарта, содержащего 3ГБ/3ГВ (4:1). Содержание гидроксивалерата в сополимере определяли
соотношением площадей пиков кротоновой/метилкротоновой кислот из полученной хроматограммы. Растворы гидролизатов пропускали через обращённофазовую колонку Separon Six C18 (“Tessek Ltd”, Чехия) 3×150 мм с размером частиц сорбента 5 мкм. Скорость протока составляла 0,4 мл/мин, в качестве элюента
использовали смесь метанол-вода 1:1 (об/об). Объём петли инжектора составлял
20 мкл (Короткова и др., 1997; Ежов и др., 2013). Подготовку растворов гидролизатов для анализа ПГБ и соотношения 3ГБ/3ГВ проводили следующим образом.
Для определения количества ПГБ образцы сухой биомассы (10–100 мг)
гидролизовали 1 мл H2SO4конц при 100°С в течение 1 ч для образования кротоновой кислоты из ПГБ, охлаждали до комнатной температуры и нейтрализовали 5
мл 5 N NaOH. Нерастворимый материал удаляли центрифугированием при 5000g
в течение 20 мин. Полученный образец использовали для анализа методом
ВЭЖХ. Количество ПГБ в элюатах определяли, используя калибровочную кривую, для которой брали навески идентифицированного ранее методом ЯМР
(ядерного магнитного резонанса) высокоочищенного ПГБ, синтезированного
Methylobacterium extorquens G10, в количестве 10, 30, 50, 70 и 100 мг, и предварительно гидролизованного, как описано ранее.
80
Для определения соотношения 3-гидроксибутирата/3-гидроксивалерата
(3ГБ/3ГВ) в ПГБВ, использовали щелочной гидролиз. Образцы ПГБВ (10–100 мг)
гидролизовали 2 мл 5 N NaOH при 100°С в течение 1 для образования кротоновой
и метилкротоновой кислот. После охлаждения до комнатной температуры гидролизат нейтрализовали 2 мл 5 N H2SO4 и удаляли нерастворимый материал центрифугированием при 5000g в течение 20 мин. Полученный образец использовали
для анализа методом ВЭЖХ.
4.2.5.6. Определение концентрации азота в культуральной среде проводили на иономере МА-130 (“Mettler Toledo GmbH”, Швейцария) с аммонийным
электродом.
4.2.5.7. Спектрофотометрические измерения оптической плотности
культуральной жидкости проводили на регистрирующих спектрофотометрах
“Shimadzu UV–160” (Япония) и Specol 221 (“Carl Zeiss”, Германия), при 30°С в
кюветах с длиной светового пути 1 см.
Прирост биомассы оценивали по изменению оптической плотности культуральной жидкости при λ=600 нм (ОП600). Оптическую плотность культуральной
жидкости пересчитывали на вес сухой биомассы по калибровочной кривой.
Сухую биомассу получали, высушивая при 105°С до постоянного веса осадок биомассы, полученной центрифугированием (10 000g, 20 мин), 50 мл суспензии клеток с известной оптической плотностью. Содержание ПГБ определяли на
УФ-детекторе UVIS 200 (“Linear”, США) при 228 нм.
4.2.5.8. Количественное определение белка проводили методом Брэдфорда
(Bradford, 1976), а также модифицированным методом Лоури (Lowry et al., 1951).
Концентрацию белка в пробах определяли по калибровочной кривой, для построения которой использовали раствор бычьего сывороточного альбумина (БСА)
“Sigma”, в концентрации 10–2000 мкг/мл, разведённых из стокового раствора 5
мг/мл.
Для определения количества белка по методу Брэдфорда готовили соответствующий реактив:
81
Реактив Брэдфорда. Кумасси бриллиантовый голубой G-250 (100 мг) растворяли в 50 мл 95%-го этанола; к раствору добавляли 100 мл 85% ортофосфорной кислоты. Полученный раствор разбавляли до конечного объёма 1 л MQ, давали отстояться осадку ночь при комнатной температуре и затем фильтровали
через бумажный фильтр. Конечная концентрация реагентов содержала 0,01%
(в/об) кумасси бриллиантового голубого G-250, 4,7% (об/об) этанола, 8,5%
(об/об) ортофосфорной кислоты. К 20 мкл белкового раствора добавляли 980 мкл
реактива Брэдфорда, перемешивали и выдерживали 10–15 мин для развития
окраски, затем измеряли поглощение при 595 нм.
Для определения количества белка по методу Лоури готовили следующие
реактивы:
Реактив Фолина. В 1,5 л колбу помещали 100 г Na2Wo4·2H2O, 25 г NaMoO4,
750 мл H2O, 50 мл 85% H3PO4 и 100 мл HClконц. Смесь нагревали с обратным холодильником при умеренном кипении в течение 10 ч. Затем добавляли 150 г
Li2SO4, 50 мл H2O и несколько капель брома. Избыток брома удаляли кипячением
без холодильника в течение 15 мин. Раствор охлаждали, фильтровали через бумажный фильтр и доводили до 1 л.
Щёлочно-медный реактив. В 1 л H2Oдист растворяли 500 мг CuSO4·5H2O, 1 г
виннокислого калия, 100 г Na2CO3 и 20 г NaOH.
Смешивали 1 мл образца с 1 мл щёлочно-медного реактива и оставляли на
10 мин при комнатной температуре. Затем добавляли 4 мл реактива Фолина (разведённого в 15 раз) и выдерживали 5 минут на водяной бане при 55°С. Охлаждали
водопроводной водой и измеряли оптическую плотность при 650 нм.
82
4.2.5.9. Протеомный МАЛДИ-анализ бактериальных клеток проводили согласно описанной методике (Horneffer et al., 2004) с использованием времяпролетного Autoflex speed масс-спектрометра с матрично-активированной лазерной
десорбцией/ионизацией (“Bruker Daltonik GmbH”, Германия).
Колонии бактерий, выросших на плотных средах (~10 мг сухой биомассы)
стерильно снимали с агаризованной среды и переносили в раствор (50 мкл) свежеприготовленного 50%-го ацетонитрила (“Sigma”), содержащего 2,5% трифторуксусной кислоты, перемешивали. Полученную суспензию (1 мкл) смешивали с
раствором матрицы (1 мкл), в качестве которой использовали насыщенный раствор α-циано-4-гидроксикоричной (HCCA) кислоты в 50% растворе ацетонитрила
и 0,1% трифторуксусной кислоты, высушивали на мишени (MTP 384 target plate
polished steel, “Brucker Daltonik”, Германия) при комнатной температуре.
Спектры регистрировали в линейном режиме с задержанной экстракцией
ионов на приборе Autoflex speed (“Brucker Daltoniks”, Германия), с импульсным
твердотельным Nd:YAG Smartbeam лазером с частотой генерации импульсов 1000
Гц, λ=355 нм, времяпролетным анализатором и рефлектроном.
Для калибровки прибора использовали Бактериальный калибровочный
стандарт “Brucker” (BTS), содержащий типичный профиль пептидов и белков E.
coli DH5 alpha, а также дополнительные белки (Protein Calibration Standard I для
масс-спектрометрии, с диапазоном покрытия масс ~5000–17500 Дa (“Brucker
Daltonik”, Германия). Запись спектров проводили в режиме пложительных ионов;
диапазон регистрируемых масс бактериальных белков составлял 2–20 кДа.
Обработку масс-спектров проводили с помощью программных пакетов
flexAnalysis 3.0 (Build 80) и Biotyper 3.0 (Build 25) (“Brucker Daltonik” GmbH,
Германия), имплементированных в программное обеспечение прибора.
__________________
МАЛДИ-анализ проведён с.н.с., к.б.н. Лауринавичюсом К.С. (ИБФМ РАН, Пущино).
*
83
4.2.6. Биохимические методы
4.2.6.1. Определение активностей ферментов
Для энзимологического анализа путей первичного и центрального метаболизма клетки, выращенные на метаноле, в начале стационарной фазы роста отделяли от среды центрифугированием (6000g, 15 мин), отмывали и ресуспендировали в буфере, соответствующем методике определения активности фермента. Для
энзимологического анализа путей биосинтеза и деградации ПГБ клетки из экспоненциальной фазы роста центрифугировали 1000g, 15 мин и дважды отмывали
0,05 M Трис-HCl буфером (pH 7,4). Отмытые клетки ресуспендировали в том же
буфере.
Дезинтеграцию клеток проводили на ультразвуковом процессоре Misonix
Sonicator S–4000 (“Qsonica”, США) с амплитудой 25 мкм, или на дезинтеграторе
“MSE” (Англия), мощностью 150 Вт при 20 кГц (6×30 сек с одноминутным перерывом) в пробирках, погружённых в лед. Неразрушенные клетки отделяли центрифугированием при 14 000g в течение 40 мин. Полученный супернатант использовали в качестве бесклеточного экстракта для определения активности ферментов.
Метанолдегидрогеназу (Н.Ф. 1.1.1.99) определяли по восстановлению дихлорфенолиндофенола (ДХФИФ) при 600 нм (Anthony and Zatman, 1964). Реакционная смесь в 2 мл содержала (мкмоль): трис-HCl буфер, pH 9,0–50; NH4Cl – 20;
ДХФИФ – 0,075; феназинметосульфат (ФМС) – 0,5; метанол – 10; KCN – 0,5; экстракт. Реакцию начинали добавлением метанола.
Дегидрогеназы формальдегида (Н.Ф. 1.2.1.3) и формиата (Н.Ф. 1.2.1.2)
определяли по восстановлению ДХФИФ (Johnson and Quayle, 1964). Реакционная
смесь в 2 мл содержала (мкмоль): К-фосфатный буфер, рН 7,0 – 50; ДХФИФ –
0,075; ФМС – 0,5; формальдегид – 10 или формиат – 50; экстракт. Реакцию начинали добавлением субстрата.
НАД+-зависимую формальдегиддегидрогеназу (Н.Ф. 1.2.1.1) определяли
по восстановлению НАД+ при 340 нм (Johnson and Quayle, 1964). Реакционная
смесь в 2 мл содержала (мкмоль): К-фосфатный буфер, рН 7,0 – 50; НАД – 0,25;
84
GSH (либо без него) – 10; формальдегид – 2; экстракт. Реакцию начинали добавлением формальдегида.
НАД+-зависимую формиатдегидрогеназу (Н.Ф. 1.2.1.2) определяли по
восстановлению НАД+ при 340 нм (Johnson and Quayle, 1964). Реакционная смесь
в 2 мл содержала (мкмоль): Трис-HCl буфер, рН 7,5 – 50; НАД – 0,25; формиат –
50; экстракт.
Оксипируватредуктазу
(Н.Ф.
1.1.1.29)
определяли
по
окислению
НАД(Ф)Н (Blackmore and Quayle, 1970). Реакционная смесь в 2 мл содержала
(мкмоль): Трис-HCl буфер, рН 7,4 – 100; НАД(Ф)Н – 0,5; экстракт. Реакцию начинали добавлением 5 мкмоль оксипирувата натрия. При наличии НАДН-редуктазы,
полученный результат корректировали на окисление НАДН экстрактом без оксипирувата.
L-серин-глиоксилатаминотрансферазу (Н.Ф. 2.2.6.1) определяли спектрофотометрически, регистрируя глиоксилат-зависимое образование оксипирувата из L-серина (Blackmore and Quayle, 1970). Реакционная смесь в 2 мл содержала
(мкмоль): Трис-HCl буфер, рН 7,5 – 100; пиридоксальфосфат – 0,02; НАДН – 0,5;
глиоксилат – 10; экстракт. Реакцию начинали добавлением 10 мкмоль L-серина.
При наличии в экстрактах активности глиоксилатредуктазы в полученный результат вносили соответствующую поправку.
Гексулозофосфатсинтазу определяли спектрофотометически (Ferenci et al.,
1974) по восстановлению НАДФ+ в опосредованной реакции с использованием
глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы и глюкозофосфатизомеразы. Реакционная смесь
в 2 мл содержала (мкмоль): К-фосфатный буфер, рН 7,0; MgCl2 – 8; НАДФ+ – 0,5;
глюкозофосфатизомеразу из мышцы кролика – 1,68 мкмолярных единиц; глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу (“Sigma”) – 0,15 мкмолярных единиц; рибозо-5фосфат; экстракт. Реакцию начинали добавлением 5 мкмоль формальдегида.
Глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу (Н.Ф. 1.1.1.49) определяли по восстановлению НАДФ или НАД (Kornberg and Horecker, 1955). Реакционная смесь в 2 мл
содержала (мкмоль): К-фосфотный буфер, рН 7,5 – 150; MgCl2 – 10; НАД(Ф)+ –
85
1,0; натриевая соль глюкозо-6-фосфата – 10; экстракт. Реакцию начинали добавлением субстрата.
6-фосфоглюконатдегидрогеназу (Н.Ф. 1.1.1.44) определяли по восстановлению НАДФ+ или НАД (Kornberg and Horecker, 1955). Реакционная смесь в 2 мл
содержала (мкмоль): Трис-HCl буфер, рН 7,5 – 100; MgCl2 – 10; HAД(Ф)+ – 1,0.
Реакцию начинали добавлением 10 мкмоль натриевой соли 6-фосфоглюконата.
Альдолазу фруктозо-1.6-бисфосфата (Н.Ф. 4.1.2.13) определяли с сопрягающим ферментом глицерофосфатдегидрогеназой (Van Dijken and Quayle, 1977).
Реакционная смесь в 2 мл содержала (мкмоль): Трис-HCl буфер, рН 7,5 – 100;
CoCl2 – 2; НАДН – 0,5; глицерофосфатдегидрогеназу – 0,36 ед; экстракт. Реакцию
начинали добавлением 2 мкмоль фруктозо-1,6-бисфосфата.
Альдолазу 2-кето-3-дезокси-6-фосфоглюконата определяли с сопрягающим ферментом лактатдегидрогеназой (Wood, 1971). Реакционная смесь в 2 мл
содержала (мкмоль): имидазольный буфер, рН 8,0 – 50; 6-фосфоглюконат (натриевая соль) – 10; НАДН – 0,5; MgCl2 – 5; дитиотрейтол – 2; лактатдегидрогеназу из
мышцы свиньи (“Sigma”) – 5 ед; экстракт. Реакцию начинали добавлением 6фосфоглюконата. Контролем служила реакционная смесь без 6-фосфоглюконата.
Рибулозобисфосфаткарбоксилазу (Н.Ф. 4.1.1. 39) определяли радиоизотопным методом с использованием NaH14CO3. Реакционная смесь в 1 мл содержала (мкмоль): Трис-HCl буфер, рН 7,6 – 100; MgCl2 – 2,5; GSH – 10; рибулозо-1,5бисфосфат (натриевая соль) – 0,25; NaH14CO3 – 18 (20 мккюри), экстракт. Реакцию
проводили при 30°С, отбирали пробы объёмом 0,02 мл с интервалом в 2 мин,
наносили их на квадраты стекловолокнистой бумаги Whatman GF/F, фиксировали
добавлением 0,05 мл 6 N HCl, высушивали и просчитывали радиоактивность.
α-Кетоглутаратдегидрогеназу (Н.Ф. 1.2.4.2) определяли по восстановлению НАД (Carls and Hanson, 1971). Реакционная смесь в 2 мл содержала (мкмоль):
К-фосфатный буфер, рН 7,0 – 150; КоА – 0,1; НАД – 1; L-цистеин – 10; MgCl2 – 5;
ТПФ – 0,2; α-кетоглутарат – 10; экстракт. Реакцию начинали добавлением αкетоглутарата.
86
Изоцитратлиазу определяли спектрофотометрически – по образованию
фенилгидразона глиоксилата при 324 нм (Dixon and Kornberg, 1959). Реакционная
смесь в 2 мл содержала (мкмоль): К-фосфатный буфер, рН 6,8 – 150; MgCl2 – 10;
фенилгидразин – 6,5; цистеин-HCl – 4; экстракт. Реакцию начинали добавлением
5 мкмоль изоцитрата калия.
Глутаматдегидрогеназу (Н.Ф. 4.1.3.2) определяли в реакционной смеси,
содержащей в 2 мл (мкмоль): Трис-HCl буфер, рН 7,5 – 100; NH4Cl – 80,
НАД(Ф)Н – 0,5, экстракт. Реакцию начинали добавлением 10 мкмоль αкетоглутарата.
Глутаминсинтетазу определяли колориметрически модифицированным
методом (Elliot and Kaplan, 1955) в ɤ-глутаминтрансферазной реакции. Реакционная смесь в 7,52 мл содержала: имидазольный буфер, рН 7,15, MgCl2 – 0,27, арсенат натрия – 12,5, АДФ – 0,18, гидроксиламсин – 20, экстракт. Реакцию начинали
добавлением 20 мкмоль L-глутамина, смесь инкубировали 10 мин при 30°С и добавляли 0,6 мл раствора, содержащего 55 г FeCl3, 20 г трихлоруксусной кислоты и
21 мл HCl в 1 л воды. Контролем служила смесь без L-глутамина. Образующийся
осадок удаляли центрифугированием и измеряли поглощение при 540 нм. 0,63
единицы поглощения соответствовали 1 мкмоль/мл ɤ-глутамилгидроксамата –
продукта реакции.
Глутаматсинтазу (Meers et al., 1970) определяли по окислению НАД(Ф)Н
при 340 нм. Реакционная смесь в 2 мл содержала (мкмоль): 1,75 мл Трис-HCl буфера рН 7,6 – 50; НАДН – 0,5 или НАДФН 0,5; α-кетоглутарат – 10. Реакцию
начинали добавлением 25 мкмоль глутамина.
β-кетотиолазу определяли по обратной реакции тиолиза (Senior and Dawes,
1973). Реакционная смесь в 1 мл содержала: 100 мМ трис-HCl (pH 8,3), 25 мМ
MgCl2, 100 мкМ ацетоацетил-КоА и 100 мкМ КоА. После 2 мин преинкубации
при 30°С реакцию начинали 0,05 мл экстракта. Уменьшение концентрации ацетоацетил-КоА измеряли при 303 нм, используя миллимолярный коэффициент экстинкции 12,9.
87
Ацетоацетил-КоА-редуктазу определяли спектрофотометрически (Senior
and Dawes, 1973). Реакционная смесь содержала: 1,5 мл 100 мМ калийфосфатного буфера, pH 5,5; 0,12 мл 0,25 мМ MgCl2·6H2O; 0,1 мл 12,5 мМ дитиотрейтола; 0,1 мл 6,0 мМ НАД(Ф)Н; 10 мкл 18 мМ ацетоацетил-КоА; 0,1–0,5 мл
экстракта, воду до общего объёма 2,5 мл. Контролировали изменение смеси при
340 нм в течение 3 мин и затем начинали реакцию добавлением ацетоацетил-КоА.
ПГБ-синтазу определяли спектрофотометрически при 412 нм (Jossek et al.,
1998) в 25 мМ Трис-HCl буфере, содержащем 1 мМ 5,5-дитиобис-2нитробензойную кислоту (ДТНБ), 30 мМ В-3-гидроксибутирил-КоА и экстракт.
Удельную активность ферментов выражали, как число нмоль превращённого субстрата или образованного продукта в мин/мг белка. Для определения удельной активности подбирали такое количество белка, при котором скорость линейно зависела от количества фермента. При расчётах использовали следующие коэффициенты молярной экстинкции (мМ-1×см-1): НАД(Ф) (при 340 нм) – 6,22;
ДХФИФ (при 600 нм) – 21,9; ДТНБ (при 412 нм) – 13,6.
В таблицах представлены средние результаты трёх независимых экспериментов, вариация данных ±10%.
4.2.6.2. Биохимические тесты
Наличие активностей β-галактозидазы, аргининдигидролазы, лизиндекарбоксилазы, орнитиндекарбоксилазы, а также способность гидролизовать мочевину (уреаза), сбраживать/окислять глюкозу, маннит, инозит, сорбит, рамнозу, сахарозу, мелибиозу, амигдалин и арабинозу проверяли при помощи API тестов “20Е”,
(“BioMe´rieux”, Франция), согласно инструкции фирмы-производителя.
Способоность к продукции H2S, восстановление нитратов до нитритов,
наличие активностей β-галактозидазы, β-глюкозидазы, способность к ассимиляции малата, цитрата, маннозы, арабинозы, глюкозы, мальтозы проверяли с использованием API тестов “20NE” (“BioMe´rieux”, Франция), согласно инструкции
фирмы-производителя.
4.2.7. Радиометрические измерения проводили на жидкостном сцинтилляционном регистрирующем спектрометре LS6500 Multi-Purpose Scintillating
88
Counter (“Beckman Coulter”, США) в смеси, содержащей 4 г 2,5-дифенилоксазола
(ППО) и 0,05 г 1,3-ди 2/5-фенилоксазолил бензола (ПОПОП) в 1 л толуола. Для
просчёта водосодержащих образцов использовали сцинтилляционный коктейль
Aquasol-2 (“NEN”, Германия).
4.2.8. Молекулярно-генетические методы
4.2.8.1. Выделение и анализ ДНК проводили по методу Мармура (Marmur,
1961). Нуклеотидный состав ДНК определяли* методом тепловой денатурации на
спектрофотометре “Beckman DU-8B” (США) при скорости нагрева 0,5°С/мин. В
качестве стандарта использовали ДНК E. coli K-12 (Owen and Lapage, 1976). Уровень ДНК-ДНК сходства изолятов и референтных культур определяли** методом
ДНК-ДНК реассоциации (Доронина и соавт., 1988, De Ley et al., 1970) в трёх
повторостях; стандартное отклонение данных реассоциации ДНК составляло ±
3%.
Фрагменты генов 16S рРНК амплифицировали, используя универсальные
для бактерий праймеры 27f: 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 и 1492r: 5'AAGGAAGGTGATCCAGCTCGT-3' (Lane, 1991). ПЦР – амплификацию проводили на ДНК – термоциклере MJ Mini (“BioRad”, США) в режиме: 1 цикл – 96°С, 3
мин; 27 циклов – 95°С, 40с; 58°С, 40с; 72°С, 50с; последний цикл – 72°С, 4 мин.
Реакционная смесь (30 мкл) содержала: 0,5 мкмоль соответствующих праймеров; 1
мкл (10–100 нг) ДНК, 200 мкмоль каждого дНТФ и 1 Е Таq-ДНК-полимеразы. Ген
mxaF амплифицировали, используя праймеры f1003 и r1561 согласно протоколу
(McDonald and Murrell, 1997). Ампликоны mxaF очищали с помощью ZR Fungal/Bacterial DNA MiniPrep (“Zymo Research”, США) в соответствии с рекомендациями фирмы-производителя, и секвенировали на автоматическом секвенаторе
CEQ2000 XL (“Beckman Coulter”, США). Обработку и перевод нуклеотидных последовательностей в аминокислотные проводили с использованием Gene Runner,
версия 3.05 [Hastings Software, Inc.].
__________________
*, **
Нуклеотидный состав ДНК и ДНК-ДНК гибридизация проведены к.б.н. Детковой Е.Н.,
ИНМИ РАН, Москва.
89
4.2.8.2. RAPD-анализ (метод случайной амплификации полиморфной
бактериальной ДНК) проводили, используя праймер OPQ6: GAGCGCCTTG
(Balachandar et al., 2008) в режиме: 1 цикл – 95°С, 3 мин; 30 циклов – 95°С, 1 мин;
36°С, 1 мин; 72°С, 90 с; последний цикл – 72°С, 5 мин. Реакционная смесь (15
мкл) содержала: 10 мкл воды MQ, 2,2 мкл ПЦР 10×буфера, 1 мкл (10–100 нг) геномной ДНК, смесь 0,2 мМ дНТФ, 4 мкмоль праймера и 1 Е Таq-ДНКполимеразы.
Продукты реакции разделяли методом электрофореза в 1%-ном агарозном
геле. ПЦР-продукты генов 16S рРНК и mxaF выделяли и очищали на легкоплавкой
агарозе с использованием набора ZR Fungal/Bacterial DNA MiniPrep (“Zymo
Research”, США) в соответствии с рекомендациями фирмы-производителя.
4.2.8.3. Филогенетический анализ
При анализе генов 16S рРНК были использованы следующие количества
п.н.: 1447 – штамм 2395АT, 1428 – штамм S3T,1444 – штамм SK12T, 1444 – штамм
C2T, 1381– штамм SK15T, 1367– штамм PK2T, 1424 – штамм LS, 1496 – штамм
2395B, 1449 – штамм S3270, 1415 – штамм PK1. При анализе аминокислотных последовательностей белка mxaF использовали 546 аминокислотных остатка для
изолята SK12T и 528 – для штамма C2T.
Предварительный скрининг сходства нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК исследуемых штаммов по базе данных GenBank [NCBI] проводили с
помощью пакета программ BLAST [http://ncbi.nlm.nih.gov], а также на сервере
EzBioCloud [http://www.ezbiocloud.net/]. Для более точного определения филогенетического положения изолятов нуклеотидные последовательности генов 16S рРНК
и аминокислотные последовательности белка mxaF выравнивали c последовательностями референтных штаммов ближайших прокариот с помощью программы
CLUSTAL W (Thompson et al., 1997) с последующим редактированием вручную с
помощью редактора Chromas, версия 2.0. [www.technelysium.com.au]. Филогенетический анализ был выполнен при помощи программы MEGA 5 (Tamura et al.,
2011). Бескорневые филогенетические деревья (филограммы) нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК строили методом присоединения соседей
90
(“neighbor-joining” = NJ) (Saitou and Nei, 1987). Порядок ветвления был подтверждён построением филограмм методами минимальной эволюции (ME), максимального правдоподобия (ML), невесового попарно-группового метода с использованием средних значений (UPGMA) и максимальной экономии (MP). Статистическую достоверность ветвления оценивали с помощью “bootstrap-анализа” 1000
альтернативных филограммм, используя соответствующую функцию программы
MEGA, версия 5 [http://www.megasoftware.net/].
91
5. Результаты
5.1. Характеристика метилобактерий из биотопов Урала
5.1.1. Морфология изолятов
Исследованные в работе изоляты представлены грамотрицательными (штаммы LS, S3T, C2T, SK12T, SK15T, S3270, 2395АT) и грамположительными (штамм
2395В) клетками, размножающимися бинарным делением. Спор и простек не образуют. Изоляты C2T и SK12T представлены кеглеобразными палочками, собранными в розетки (рис. 10, а, б). Штамм C2T накапливает внутриклеточно гранулы
ПГБ (рис. 10, в), штамм SK12T имеет полисахаридную капсулу (рис. 10, б).
а)
б)
в)
Рис. 10. Морфология и ультраструктура клеток штамма C2T (а, в). Морфология штамма SK12T (б). Негативный контраст (а, б); ультратонкие срезы (в).
Длина масштабной метки 1 мкм
92
Клетки штаммов LS, длинные палочки (рис. 11, а, в), и 2395АT (короткие палочки) (рис. 12, а) подвижны благодаря одному полярному жгутику. Клетки других
изолятов неподвижны. Штамм S3T представлен очень короткими, практически кокковидными клетками в полисахаридной капсуле (рис. 11, б, г), в то время как
штамм S3270 имеет изогнутую, почти бобовидную форму (рис 12, б).
а)
б)
в)
г)
Рис. 11. Морфология и ультраструктура штаммов LS (а, в) и S3T (б, г). Негативное контрастирование (а, б); ультратонкие срезы (в, г). Длина масштабной
метки 1 мкм
Изоляты 2395В и SK15T представлены короткими палочками (рис. 12, в, г).
На 3 сут роста на агаризованной среде “К” с 0,5% метанола при 29°С образуют
круглые колонии, с ровным краем, гладкой поверхностью, выпуклым профилем,
однородные, бесцветные, белые или серые, прозрачные (штаммы LS, SK15T,
S3270) или непрозрачные (штаммы S3T, С2T, SK12T, 2395АT, 2395В). На агаризованной среде с пептоном колонии штамма 2395АT имеют слегка желтоватую
окраску.
93
а)
б)
в)
г)
Рис. 12. Морфология штаммов 2395АT (а), S3270 (б), 2395В (в) и SK15T (г). Негативный контраст (а-в), ультратонкие срезы (г). Длина масштабной метки 1 мкм
5.1.2. Культуральные, физиолого-биохимические и хемотаксономические свойства
Все штаммы растут на жидкой среде с метанолом без агрегации клеток,
пигмент не образуют. Дополнительные факторы роста требуются для штаммов LS
(В12), C2T и SK12T (В12, биотин). Все штаммы оксидазо- и каталазоположительные. В качестве источника углерода используют метанол; штаммы LS, S3T, C2T,
SK12T, 2395АT, 2395В используют также метиламин. Рост штаммов S3270 и
SK15T на метиламине не обнаружен. Диметиламин потребляют штаммы С2T,
2395АT, 2395В и S3T (табл. 5). Наряду с аммонийным азотом все штаммы, за исключением штаммов C2T и SK12T, используют KNO3. Способностью к нитратредукции обладают штаммы 2395B, SK15T и S3270.
Исследуемые штаммы не образуют аммиак или сероводород на тестовых
средах; у штаммов S3T, SK15T и S3270 обнаружена слабоположительная реакция
94
API тестов на сбраживание/окисление сорбита и арабинозы, штамм S3T сбраживал
также инозит, рамнозу и сахарозу. Штамм 2395B cбраживает/окисляет практически все тестированные субстраты: инозит, сорбит, рамнозу, сахарозу, мелибиозу,
в то время как штаммы C2T и SK12T не сбраживают и не асимилируют ни один из
них. Штаммы S3T и 2395В растут на глюкозе, мальтозе и рамнозе; штаммы S3T,
SK15T, 2395B и S3270 – на сорбите, штаммы S3T, SK15T, и S3270 – на манните;
штаммы SK15T, 2395АT и 2395В – на малате. Штаммы SK15T и S3270 способны к
автотрофному росту в атмосфере H2/O2/CO2. Растворимый крахмал в присутствии
метанола гидролизуют все исследуемые изоляты, слабо – штаммы C2T и SK12T,
тогда как желатину гидролизуют только штаммы 2395B и S3 (табл. 5).
Суммируя полученные данные, можно сделать вывод, что штаммы S3T,
2395АT, 2395В, SK15T и S3270, растущие на ряде полиуглеродных субстратов, являются факультативными метилобактериями, штамм LS, из полиуглеродных соединений использующий лишь фруктозу – ограниченно-факультативный метилотроф, штаммы C2T и SK12T, использующие только одноуглеродные субстраты –
облигатные метилотрофы (табл. 5).
Активность аргининдигидролазы не обнаружена у штаммов C2T, SK12T,
SK15T, S3270, 2395AT, 2395В, но выявлена у штамма S3T. Активности βглюкозидазы и β-галактозидазы отсутствуют у штаммов C2T, SK12T, SK15T,
2395AT, 2395В, S3T , но обнаружены у штамма S3270.
Штаммы C2T, SK12T, LS, S3T, 2395AT и 2395В синтезируют индолы (0,5–4
мкг/мл). Оптимум роста всех изолятов наблюдается при концентрации метанола
0,5% в среде.
Несмотря на одинаковый оптимум роста (~1% NaCl) штаммов 2395AT,
2395B, S3T, SK15T и S3270, их толерантность к солёности весьма различается. Так,
штамм 2395В выдерживает до 3% NaCl, а штаммы S3270, 2395AT – до 6% NaCl. В
то же время штаммы S3T и SK15T способны расти при 10% NaCl, следовательно,
являются галотолерантными. Для штаммов LS, C2T и SK12T, выдерживающих до
17% NaCl, оптимум роста составляет 3–5% NaCl, что позволяет считать их умеренными галофилами (табл. 6).
95
Таблица 5. Характеристика аэробных метилобактерий, выделенных из Уральских биотопов.
Характеристика
LS
Ограниченнофакультативный
2395В
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
-
+
+
-
+
+
+
РМФ, КДФГ
РМФ, ФБФА
С16:0
С18:1w7c,
С19:0 cyc
С18:1w7c,
С16:0
С18:1w7c,
С19:0 cyc
С18:1w7c,
С16:0
1–17 (3)
0,5–3 (1)
0–6 (1)
1–10 (1)
0,5–10 (1)
0,5–5 (1)
Содержание Г+Ц в
ДНК, мол.%
44
н.о.
66,2
65
64,5
67
Класс
Gammaproteobacteria
Actinobacteria
Тип метилотрофии
Ростовые субстраты:
метанол
метиламин
диметиламин
глюкоза
груктоза
Восстановление NO3 в
NO2
Гидролиз желатины
Гидролиз крахмала
Уреаза
Автотрофный рост
Путь С1-ассимиляции
Доминирующие жирные кислоты
Диапазон NaCl, %
(оптимум)
S3270
2395АT
Ограниченнофакультативный
SK12T
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
-
+
-
-
-
-
+
+
+
+
-
+
+
-
+
-
+
-
SK15T
S3T
Факультативный
РБФ
C2T
Облигатный
Сериновый, ицлС18:1w7c,
С19:0 cyc
0,5–17 (3–5)
60,5
60,9
Alphaproteobacteria
Примечание: н.о. – не определяли, РМФ – рибулозомонофосфатный путь, РБФ – рибулозобисфосфатный путь, ицл- – изоцитратлиазо-негативный вариант серинового пути, КДФГ – 2-кето-3-дезокси-6-фосфоглюконатный вариант РМФ-пути, ФБФА –
фруктозо-бисфосфат-альдолазный вариант РМФ-пути.
96
Таблица 6. Состав жирных кислот клеток исследуемых метилобактерий (% от
общего содержания).
Жирная кислота
C12:1
C15:0
Ci15
Ca15
C16:0
C16:1 ω7c
C16:1 ω9
C17:0
C17:1
C18:0
C18:2
C18:1ω7c
C18:1ω9
C19:0 cyc
C19:1
C20:0
C20:1ω9
C11-Me 18:1
Гидроксикислота
3-OH C10:0
2-OH C19:1
2-OH C21:1
3-OH C24:0
3-OH C25:0
3-OH C26:0
3-OH C14:0
3-OH C18:0
3-OH C18:1
3-OH C20:1
S3T
0,6
0,3
14,0
0,5
2,6
0,3
3,3
74,0
1,7
0,7
0,5
0,2
0,5
C2T
0,5
0,1
17,5
56,5
0,5
11,6
0,4
3,0
2,8
0,2
0,8
SK12T
0,6
17,4
36,7
28,7
1,7
5,2
4,8
1,7
1,4
1,6
0,2
-
Штамм
SK15T S3270
7,4
6,2
0,3
1,0
0,6
2,0
4,0
0,4
77,0
78,0
1,0
12,3
5,4
1,0
3,3
-
0,1
-
2395AT
2,4
0,4
1,0
2,0
5,1
68,0
0,6
10,0
0,4
0,7
2,0
2395B
0,3
1,4
2,0
0,5
0,6
1,3
5,6
64,5
0,5
12,4
0,3
0,8
2,0
2,0
3,8
1,0
0,6
-
2,0
4,7
0,7
0,4
-
В составе жирных кислот клеток изучаемых штаммов (табл. 5, 6) преобладает
цис-11-октадеценовая кислота C18:1ω7c (36,7–78,0%). Помимо указанной доминирующей кислоты, для штаммов LS и S3T (14,0%) характерно наличие гексадекановой
кислоты C16:0, штаммов C2T и SK12T – циклопропан-нонадекановой C19:0 cyc (11,6 и
28,7%) и октадекановой C18:0 (17,5 и 17,4%) кислот, соответственно. Штаммы
S3270 и SK15T содержат циклопропан-нонадекановую C19:0 cyc (5,4 и 12,3%) и гек-
97
садекановую C16:0 (6,2 и 7,4%, соответственно) кислоты. У штаммов 2395АT и
2395В обнаружены циклопропан-нонадекановая C19:0 cyc (10,0 и 12,4%) и октадекадиеновая C18:2 кислоты (5,1 и 5,6%).
Наибольшее содержание гидроксикислот (2-гидрокси-нонадеценовой и 2гидрокси-ункозановой) характерно для штаммов 2395АT и 2395В. Как видно из табл.
6, у штамма S3T обнаружена 3-гидроксидекановая кислота (0,7%).
Методами ТСХ и ВЭЖХ у галотолерантных и умеренно-галофильных изолятов выявлено накопление эктоина. При возрастании внешней концентрации NaCl в
клетках штаммов S3T, LS, C2T и SK12T увеличивалось содержание эктоина – основного осмопротектора, и составило 13–18% от веса сухих клеток при содержании 8–10% NaCl (табл. 7).
Таблица 7. Внутриклеточный пул эктоина у метилобактерий, выращенных при
разной солёности.
Концентрация NaCl, %
Содержание эктоина [мкг/мг сухого веса клеток]
Штамм
T
T
C2
SK12
S3T
LS
PK2T
1,5
0
5
140
8–10
180
Примечание: н.о. – не определяли.
0
110
135
0
55
н.о.
0
11
95
0
62
н.о.
Кроме того, в клетках штамма C2T в качестве минорных осмопротекторов
при 5% NaCl в среде обнаружены незначительные количества глутамата, глутамина и сахарозы (2,5, 6,5 и 5% от веса сухих клеток, соответственно).
В фосфолипидном составе клеток изолятов преобладают фосфатидилэтаноламин и фосфатидилхолин, присутствуют также фосфатидилглицерин, дифосфатидилглицерин (кардиолипин). У штаммов C2T и SK12T обнаружены фосфатидилхолин, фосфатидилглицерин, фосфатидилдиметилэтаноламин, фосфатидилэтаноламин, а также неидентифицированные фосфолипиды. У штамма 2395В доминирующими фосфолипидами являются фосфатидилглицерин, фосфатидилхолин и
фосфатидилэтаноламин.
98
5.1.3. Энзимологический анализ
В экстрактах клеток исследуемых штаммов выявлены активности дегидрогеназ метанола (исключение – штамм 2395В), формальдегида и формиата (табл.
8). У штаммов LS и 2395В обнаружена активность ключевого фермента рибулозомонофосфатного (РМФ) пути – гексулозофосфатсинтазы (ГФС). Кроме того, у
штамма LS обнаружена активность 2-кето-3-дезокси-6-фосфоглюконатальдолазы
(КДФГ), а у штамма 2395В – фруктозо-1,6-бисфосфат альдолазы (ФБФА). Следовательно, штамм LS реализует КДФГ-, а штамм 2395В – ФБФА-вариант РМФпути.
Примечательно, что у штамма 2395В обнаружены также активности ключевых ферментов серинового пути – оксипируватредуктазы (ОПР) и серинглиоксилат аминотрансферазы (СГАТ). Этот факт может свидетельствовать о том,
что изолят 2395B реализует одновременно рибулозомонофосфатный и сериновый
пути С1-метаболизма. У штаммов C2T, SK12T, 2395АT выявлены активности ключевых ферментов серинового пути – ОПР и СГАТ, но не найдена активность изоцитратлиазы. Следовательно, эти штаммы реализуют ицл-отрицательный вариант
серинового пути. В клетках штаммов S3T, SK15T и S3270 выявлена активность
рибулозобисфосфат карбоксилазы (РубисКо), ключевого фермента рибулозобисфосфатного (РБФ) пути, но не обнаружены активности гексулозофосфатсинтазы. В клетках штаммов SK15T и S3270 также не обнаружены активности
ОПР и СГАТ, тогда как у штамма S3T выявлена активность этих ферментов.
Наличие у штаммов C2T и SK12T активностей глутаматдегидрогеназы, глутамат- и глутаминсинтетазы свидетельствует, что штаммы ассимилируют аммиак
через
глутаматный
кетоглутарата.
цикл
и
через
восстановительное
аминирование
α-
99
Таблица 8. Активности ферментов (нмоль мин-1 мг-1 белка) в экстрактах клеток штаммов, выращенных на метаноле
Штамм
Фермент
Кофактор
S3T
С2T
SK12T 2395АT 2395В LS SK15T S3270
Метанолдегидрогеназа
ФМС
170
273
317
25
0
90
64
235
Формальдегиддегидрогеназа
ФМС
28
30
28
36
38
8
25
23
НАД+
44
15
10
2
15
0
25
34
НАД+, GSH
180
4
6
2
10
0
126
97
ФМС
26
50
23
150
171
5
27
143
НАД+
5
34
20
108
5
35
24
149
НАДФН
700
37
165
443
2132
0
98
2
НАДН
147
196
100
172
910
0
13
0
НАДФН
600
390
251
23
70
0
0
0
НАДН
236
100
100
58
123
0
0
0
Гексулозофосфатсинтаза
НАДФ+
0
0
0
0
395
79
0
0
Рибулозобисфосфат карбоксилаза
-
105
0
0
0
0
0
155
107
Изоцитратлиаза
-
0
0
0
0
0
0
0
0
НАДН
0
0
0
0
0
58
0
0
НАДН
15
0
16
23
52
0
12
7
Формиатдегидрогеназа
Гидроксипируватредуктаза
Серин-глиоксилат аминотрансфераза
2-кето-3-дезокси-6-фосфоглюконат
альдолаза
фруктозо-1,6-бисфосфат альдолаза
Примечание: ФМС – феназинметосульфат.
100
5.1.4. Филогенетический анализ
Филогенетическое положение штаммов, основанное на сравнении нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК, представлено на рис. 13.
Обнаружено, что штамм LS имеет высокое сходство нуклеотидных последовательностей
гена
16S
рРНК
(95,2–99,9%)
с
представителями
рода
Methylophaga. Наибольшее сходство штамма LS (99,9%) выявлено с M. thalassica
ВКМ B-2057T, а уровень их сходства по ДНК-ДНК гибридизации составил 100%.
Следовательно, штамм LS относится к этому виду метилофаг. Содержание Г+Ц в
ДНК штамма LS составило 44 мол.%, что также соответствует содержанию Г+Ц в
ДНК для M. thalassica ВКМ B-2057T. По результатам секвенирования гена 16S
рРНК, грамположительный штамм 2395B отнесён к Arthrobacter protophormiae
ВКМ Ac-2104T, о чём свидетельствует их 100%-ное сходство по 16S рРНК.
Штаммы SK15T и S3270 имеют наибольшее сходство (97,8–99,0%) нуклеотидных
последовательностей генов 16S рРНК с представителями рода Ancylobacter (табл.
9).
По данным секвенирования генов 16S рРНК, сходство штаммов SK15T и S3270
составляет 98,4%, а содержание Г+Ц в ДНК – 65,9 и 66,2 мол.%, соответственно.
Штамм S3270 имеет 99,8% сходства с A. rudongensis DSM 17131T и 99,4% – с A.
aquaticus ВКМ B-1287T. Высокий процент ДНК-ДНК сходства с A. rudongensis
DSM 17131T (78%) свидетельствует о принадлежности штамма S3270 к этому
виду.
На основании проведенных исследований три штамма идентифицированы как
известные виды – Arthrobacter protophormiae 2395В, Methylophaga thalassica LS,
Ancylobacter rudongensis S3270 (рис. 13).
У штамма SK15T выявлено 98,3%-ное сходство с A. oerskovii DSM 18746T и
A. rudongensis DSM 17131T; 98,0% – с A. vacuolatus ВКМ B-1381T и A. aquaticus
ВКМ B-1287T (табл. 9).
101
62
77
99
100
99
68
66
98
100
67
100
55
81
100
56
100
50
100
99
100
100
100
Ancylobacter polymorphus AS 1.2800T (AY211516)
Ancylobacter aquaticus ØrskovT (M62790)
Ancylobacter vacuolatus AS 1.2807T (AY211515)
Ancylobacter rudongensis S3270
Ancylobacter rudongensis AS 1.1761T (029047)
Ancylobacter defluvii SK15T (KC243678)
Ancylobacter oerskovii NS05T (AM778407)
Afifella pfennigii AR 2102T (EU445271)
Methylopila jiangsuensis JZL-4T (FJ502233)
Methylopila musalis MUSA T (JQ173144)
Methylopila helvetica DM9T (AF227126)
Methylopila oligotropha 2395AT (KC243676)
Methylopila capsulata IM1T (AF004844)
Hyphomicrobium denitrificans TK 0415T (CP002083)
Hyphomicrobium methylovorum KM 146 T (Y14307)
Rhodobium orientis MB312T (NR_029128)
Tepidamorphus gemmatus CB-27AT (GU187912)
Dichotomicrobium thermohalophilum DSM 5002T (FR733679)
Methyloligella halotolerans C2T (JQ 773443)
Methyloligella solikamskensis SK12T (JQ 773444)
Uncultured alpha proteobacterium clone B23 (EU360292)
Paracoccus communis S3T (KC243677)
Paracoccus denitrificans Stanier 381T (Y16927)
Methylophaga thalassica LS
Methylophaga thalassica ATCC 33146T (036802)
Arthrobacter protophormiae 2395B
Arthrobacter protophormiae VKM Ac-2104T (026195)
Рис. 13. Филограмма, показывающая положение штаммов на основании сравнения последовательностей генов 16S рРНК. Использован метод
присоединения соседей (“neighbor-joining”). Цифрами показана статистическая достоверность (значения выше 50%) порядка ветвления, определенная с помощью “bootstrap”- анализа 100 альтернативных деревьев
102
Таблица 9. Матрица сходства между последовательностями генов 16S рРНК новых изолятов и представителей рода Ancylobacter.
1
2
3
4
5
6
7
Штамм
1
100
Ancylobacter rudongensis S3270
Ancylobacter rudongensis AS 1.1761 T
Ancylobacter aquaticus Ørskov T
Ancylobacter vacuolatus AS 1.2807 T
Ancylobacter polymorphus AS 1.2800 T
Ancylobacter defluvii SK15T
Ancylobacter oerskovii NS05 T
2
99,8
100
3
99,4
98,7
100
4
99,3
99,1
99,8
100
5
99,1
98,9
99,3
99,4
100
6
98,4
98,3
98
98
97,8
100
7
98,3
98,1
97,9
97,8
97,9
98,3
100
Уровень ДНК-ДНК сходства штамма SK15T с A. rudongensis и A. oerskovii
составляет 29–32%. Следовательно, штамм SK15T является представителем нового вида, для которого предложено название Ancylobacter defluvii (Порошина и др.,
2013).
Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей генов 16S
рРНК выявил, что штамм S3T имеет 97,8% сходства с Paracoccus denitrificans
ВКМ B-1320T и 96,5% сходства – с Paracoccus aminovorans ВКМ B-2140T. Согласно результатам ДНК-ДНК гибридизации, уровень сходства между штаммом
S3T и типовым штаммом P. denitrificans составляет 42%. Содержание Г+Ц в ДНК
штамма S3T составляет 64,5 мол.%. Таким образом, штамм S3T является представителем нового вида, для которого мы предлагаем название Paracoccus communis
(Порошина и др., 2013).
Штамм 2395АT на основании данных секвенирования гена 16S рРНК имеет
высокое сходство с представителями рода Methylopila: 98,5% – с Methylopila
capsulata IM1T (ВКМ B-1606T) и 98,2% – с Methylopila jiangsuensis JZL-4T (табл.
10).
ДНК-ДНК гибридизация нового изолята с типовым штаммом M. capsulata
IM1T выявила лишь 56% их сходства. Следовательно, штамм 2395АT является новым видом, для которого мы предлагаем название Methylopila oligotropha (Порошина и др., 2013).
103
Таблица 10. Матрица сходства между последовательностями генов 16S рРНК новых изолятов и представителей рода Methylopila.
1
2
3
4
5
Штамм
Methylopila oligotropha 2395AT
Methylopila capsulata IM1T
Methylopila helvetica DM9T
Methylopila jiangsuensis JZL-4T
Methylopila musalis MUSAT
1
100
2
98,5
100
3
95,2
95,8
100
4
93,9
97,1
94,3
100
5
98
97,4
94,8
99,5
100
RAPD-анализ. Результаты RAPD-анализа показали, что штаммы C2T и
SK12T имеют различные паттерны продуктов амплификации, что свидетельствует
о том, что штаммы C2T и SK12T представляют собой два отдельных вида (рис. 14).
Согласно филогенетическому анализу, штаммы C2T и SK12T принадлежат к классу Alphaproteobacteria, порядку Rhizobiales. Изоляты могут быть отнесены к одному роду (99,1% сходства последовательностей), но уровень сходства последовательностей генов 16S рРНК с ближайшими валидными родственниками ниже
94%,
за
исключением
нуклеотидной
последовательности
клона
B23-01
(EU360292), полученного из вод Тихого океана (99,3–99,1%, соответственно).
1
2 3 4
Рис. 14. RAPD-профили штаммов C2T и SK12T,
5 M
3000 п.н.
полученные с использованием праймера OPQ6:
1 – С2T; 2 – SK12T; 3-Hyphomicrobium zavarzinii ZV-
1031 п.н.
622T;
500 п.н.
4 – Methylobacterium extorquens ВКМ B-2064T,
M – маркер GeneRuler DNA Ladder Mix
(“Thermo Scientific”, США)
Проверка полученных результатов с помощью расчётов на сервере EzTaxon
показала, что ближайшими родственниками для штаммов C2T и SK12T являются
типовые штаммы Rhodobium pfennigii (=Afifella pfennigii) AR 2102T (93,19 и
93,33%, соответственно) и Dichotomicrobium thermohalophilum DSM5002T (93,22 и
93,08%, соответственно). Кроме того, штаммы C2T и SK12T имеют 93,14 и
104
92,86%-ное сходство последовательностей гена с типовым видом рода Rhodobium,
– Rhodobium orientis MB312T.
По результатам анализа последовательностей гена 16S рРНК, выявлено, что
штаммы C2T и SK12T связаны с членами родов Rhodobium, Dichotomicrobium,
Hyphomicrobium, но уровень сходства между этими организмами (90,1–92,6%)
указывает на их принадлежность к разным родам (табл. 11).
Содержание Г+Ц в ДНК штаммов C2T и SK12T составляет 60,9 и 60,5
мол.%, соответственно. Уровень ДНК-ДНК сходства между штаммами C2T и
SK12T не превышает 53%, что свидетельствует об их видовом отличии в пределах
одного рода. Это согласуется с результатами RAPD-анализа, выявившего полиморфизм продуктов амплификации, и фенотипическими признаками.
Таблица 11. Матрица сходства между последовательностями генов 16S рРНК новых изолятов и представителей порядка Rhizobiales.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Штамм
1
Hyphomicrobium denitrificans TK 0415T
100
Hyphomicrobium methylovorum KM 146T
Rhodobium pfennigii AR 2102T
Methyloligella solikamskensis SK12T
Uncultured alpha proteobacterium clone B23
Methyloligella halotolerans C2T
Dichotomicrobium thermohalophilum DSM 5002T
Rhodobium orientis MB312T
Tepidamorphus gemmatus CB-27AT
2
3
4
97,7 86,8 89,4
100 87,1 89,6
100 88,1
100
5
89,7
89,5
88,1
99,5
100
6
89,7
89,7
88,5
99,1
99,3
100
7
90,2
89,6
88,8
92,8
93
93
100
8
88,6
89,2
88,2
92,5
92,4
92,8
92,4
100
9
88,9
89,7
88,2
92,2
92,2
92,5
92,4
94,4
100
Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей белка MxaF
демонстрирует высокий уровень сходства штаммов C2T и SK12T между собой
(90%) и с представителями рода Hyphomicrobium: H. denitrificans XT и
H. methylovorum GM2T (75–79%), а также – рода Methylobacterium: М. nodulans
ORS 2060T, М. extorquens NRIC 0601T и M. organophilum АТСС 27886T (75,0–
76,5%) (рис. 15).
105
Hyphomicrobium zavarzinii ATCC 27496T (CAA69318)
100
Hyphomicrobium aestuarii ATCC 27483T (CAA69307)
Hyphomicrobium vulgare ATCC 33404T (CAA69308)
78
51
Hyphomicrobium denitrificans XT (CAA69322)
Hyphomicrobium methylovorum KM 146T (BAA23272)
93
Angulomicrobium tetraedrale Z-2821T (DQ652142)
Methylobacterium nodulans ORS 2060T (AF220764)
Methylobacterium extorquens NRIC 0601 T (BAH24009)
99
85
100
Methylobacterium organophilum ATCC 27886 T (AAA50289)
Methyloligella halotolerans C2T (JQ796869)
Methyloligella solikamskensis SK 12T (JQ796868)
0,02
Рис. 15. Филограмма, показывающая положение штаммов С2T и SK12T на основании сравнения аминокислотных последовательностей генов mxaF. Использован
метод присоединения соседей (“neighbor-joining”). Масштаб соответствует 2 аминокислотным заменам на каждые 100 аминокислотных остатков (эволюционное
расстояние). Цифрами показана статистическая достоверность порядка ветвления
(показаны значения выше 50%), определенная с помощью “bootstrap”- анализа 100
альтернативных деревьев
Исследуемые нами умеренно галофильные изоляты имеют чёткие отличия
(табл. 12) от всех известных членов Alphaproteobacteria, в том числе метилобактерий с сериновым путём из родов Methylobacterium (Bousfield and Green, 1985),
Aminobacter (Urakami et al., 1992), Albibacter (Doronina et al., 2001), Hyphomicrobium (Gliesche et al., 2005), Methylorhabdus (Doronina et al., 1995) и Methylopila (Doronina et al., 1998), в некоторых морфологических особенностях, галотолерантности, физиологических и биохимических свойствах.
Штаммы С2T и SK12T отличаются от умеренно галофильных факультативно
метилотрофных сериновых метилобактерий рода Methylarcula (Doronina et al.,
2000) по их морфологии, неспособности расти на полиуглеродных соединениях и
профилю жирных кислот. Новые умеренно галофильные метилобактерии представляют биотехнологический интерес, так как оба штамма синтезируют осмопротектор эктоин и ПГБ.
106
Таблица 12. Дифференцирующая характеристика нового рода Methyloligella и наиболее близких родов бактерий *.
Признак
Морфология (жгутикование)
Размножение:
почкование
деление
гифообразование
Цвет колоний:
неокрашенные
розовые
красновато-коричневые
Восстановление NO3 до NO2
Рост при 10% NaCl
Источник углерода:
метанол
глюкоза
Фототрофный рост
Пигмент
Хинон:
Содержание Г+Ц в ДНК, мол.%
Methyloligella а Hyphomicrobium б Dichotomicrobium в
+
-
Rhodobium г
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+**
+***
Н.о.
+
+
-
+
-
+*
-
-
-
Кантаксантин
Q10
60–61
Q9
59–65
Q10
62–64
+
+
Спириллоксантин
Q10, MK10
62–66
-
Примечание.* условные знаки: +, положительный; -, отрицательный; Н.о., не определяли.
а
Данные нашего исследования. б Данные из (Gliesche, 2005), в данные из (Hirsch, 1989), г данные из (Hiraishi et al., 1995; Urdiain et al., 2008).
*Для типового штамма IFAM 954T рода Dichotomicrobium, данные из (Hirsch, 1989), **аэробная хемотрофная культура, ***фотосинтезирующая
культура.
107
Согласно полученным данным, оба изолята отнесены к разным видам нового рода Methyloligella: Methyloligella halotolerans (штамм C2T; ВКМ B2706T=CCUG 61687T=DSM 25045T) и Methyloligella solikamskensis (штамм SK12T;
ВКМ B-2707T=CCUG 61697T=DSM 25212T) (Doronina et al., 2013).
5.2.Характеристика метилобактерий из парка Памуккале
Из проб, отобранных на территории национального парка Турции – Памуккале – выделены в чистую культуру на среде с метанолом два новых штамма метилотрофных бактерий: штамм PК1 – из ризосферы осоки, штамм PК2T – из образца воды (табл. 13).
5.2.1. Морфология
Штаммы представлены короткими палочками, имеющими грамотрицательный тип клеточной стенки (рис. 16).
Рис. 16. Морфология и ультраструктура штаммов PK2T (а-в) и PK1 (г). Негативное контрастирование (а); фазовый контраст (б); ультратонкие срезы (в, г). Длина масштабной метки: а, в, г – 1 мкм; б – 10 мкм
108
Клетки штамма PK2T (0,7–1×1,5–2 мкм) подвижны, формируют розетки и
накапливают гранулы ПГБ (рис. 16, в). Клетки штамма PK1 – неподвижные палочки размером 0,3–0,35×0,4–0,45 мкм (рис. 16, б, г). На 3 сут роста штамм PK1
на минеральной агаризованной среде с метанолом образует точечные бежевые, а
на богатой среде – округлые, желтовато-кремовые, прозрачные, с плоским профилем и ровным краем, с гладкой блестящей поверхностью, однородной структуры
колонии. На 4 сут роста штамм PK2T на минеральной агаризованной среде с метанолом образует округлые, светло-коричневые, непрозрачные с выпуклым профилем и цельным краем, с глянцевой поверхностью, 3 мм в диаметре колонии.
5.2.2. Культуральные, физиолого-биохимические и хемотаксономические свойства
Оба штамма – строгие аэробы. Факторами роста являются: для штамма PK1
– фолиевая кислота, для штамма PK2T – биотин.
Штамм PK2T растёт на метаноле и манните, слабый рост отмечен на метиламине и формиате. Не растёт на триптон-соевом агаре, среде LB, формальдегиде,
ди- и триметиламине, а также на сахарах, аминокислотах, органических кислотах
или спиртах (табл. 13).
Штамм PK1 растёт на метаноле, формиате, ацетате, глюкозе, арабинозе,
рамнозе, ксилозе, рибозе, малате, фумарате, сукцинате, лактате, α-кетоглутарате,
цитрате, серине, аланине, глутамате, глицине, глюкуроновой кислоте, а также
МПА и триптон-соевом агаре. Слабый рост отмечен на метиламине, мочевине,
изоцитрате, рафинозе. Не растёт на диметиламине и триметиламине, дихлорметане, диметилсульфоксиде, манните, сорбите, мелицитозе.
Оба штамма гидролизуют растворимый крахмал, но не желатину. Штаммы
не обладают способностью к нитратредукции. Оксидазо- и каталазоположительны. Согласно результатам API тестов, в клетках штамма PK2T обнаружена активность уреазы и β-глюкозидазы (табл. 13), но не активностей β-галактозидазы, аргининдигидролазы, лизин декарбоксилазы, орнитин декарбоксилазы. Результаты
109
тестов на сбраживание/окисление глюкозы, маннита, инозита, сорбита, рамнозы,
сахарозы, мелибиозы, амигдалина и арабинозы также отрицательные.
Таблица 13. Характеристика аэробных метилобактерий, выделенных из
Памуккале.
Признак
Тип метилотрофии
Штамм PK1
Факультативный
Ростовые субстраты:
метанол, метиламин
+
диметиламин, мочевина
маннит
глюкоза, сукцинат, ацетат, фумарат,
+
малат, глутамат, мальтоза, рафиноза,
ксилоза, серин, аланин
Восстановление NO3 в NO2
Гидролиз желатины
Гидролиз крахмала
+
Каталаза, оксидаза
+
Уреаза, β-глюкозидаза
Путь С1-ассимиляции
РБФ
Доминирующие жирные кислоты:
C18:1ω7
31,3
C16:1ω7с
29,2
Диапазон NaCl (оптимум), %
0–1 (0,5)
Основные фосфолипиды
ФЭА и ДФГ
Содержание Г+Ц, мол.%
55,6
Синтез индолов, мкг/мл
3,8
Основной хинон
Q8
Класс
Betaproteobacteria
Примечание: ФЭА – фосфатидилэтаноламин, ДФГ
Штамм PK2T
Ограниченнофакультативный
+
+
-
+
+
+
Сериновый, ицл+
47,0
13,0
0–6 (1)
ФЭА и ФМЭА
67,9
Q10
Alphaproteobacteria
– дифосфатидилглице-
рин, ФМЭА – фосфатидилмонометилэтаноламин.
Штамм PK1 сбраживает глюкозу, рамнозу, мелибиозу. Активности βгалактозидазы, уреазы и орнитиндекарбоксилазы не обнаружены. Тест на продукцию H2S у обоих штаммов отрицательный.
Источниками азота служат соли аммония, нитраты и аминокислоты: для
штамма PK1 – глицин, аланин, глутамат; для штамма PK2T – серин, валин, аланин
и аспарагин. На среде с нитратом как источником азота, метанолом и триптофа-
110
ном штамм PK1 образует индолы (~3,8 мкг/мл культуральной жидкости при ОП600
культуры =1,0), штамм PK2T индолов не образует (табл. 13).
Оптимальная концентрация NaCl в среде для штамма PK1 – 0,5%. Рост ингибируется 2% NaCl. Штамм PK2T (оптимум 1% NaCl) хорошо растёт при 4%
NaCl и выдерживает до 6–8% NaCl. Оба штамма растут оптимально при 29°С и
слабощелочном pH: 7,5–8,0 (штамм PK2T), 8,0–8,5 (штамм PK1). Оптимум роста
наблюдается при концентрации 0,5% метанола в среде (табл. 13).
В составе фосфолипидов клеток штамма PK1 преобладают фосфатидилэтаноламин и дифосфатидилглицерин, у штамма PK2T – фосфатидилэтаноламин,
фосфатидилмонометилэтаноламин, фосфатидилглицерин и минорное количество
неидентифицированного фосфолипида. Доминирующими жирными кислотами
для штаммов PK2T и PK1 являются 11-октадеценовая С18:1ω7 (47,0 и 31,3%) и цис9-гексадеценовая С16:1ω7с (13,0 и 29,2%), а также гексадекановая С16:00 (8,0 и
17,3%), соответственно (табл. 13, 14).
Поскольку секвенирование гена 16S рРНК выявило до 99% сходства штамма PK1 с видами рода Advenella, а 70%-ный уровень ДНК-ДНК сходства штамма
PK1 с типовой культурой A. kashmirensis WT001T позволил отнести его к этому
виду (см. разд. 5.2.4), для сравнения штаммов был проведён также жирнокислотный анализ A. kashmirensis WT001T (табл. 14), выявивший заметные отличия между штаммами в профилях жирных кислот. Так, штамм PK1 содержит 6,40% циклопропан-нонадекановой
кислоты,
отсутствующей
в
клетках
штамма
A. kashmirensis WT001T; штамм A. kashmirensis WT001T содержит 3,12% додекановой кислоты, которая не обнаружена в профиле штамма PK1. Основной хинон
штамма PK1 – убихинон Q8, штамма PK2T – Q10.
5.2.3. Энзимологический анализ экстрактов клеток штаммов PK1 и PK2T,
выращенных на метаноле, выявил активность дегидрогеназы метанола (ФМС)
(табл. 15). Несмотря на это, амплифицировать фрагмент гена mxaF большой субъединицы метанолдегидрогеназы у данных штаммов не удалось. Обнаружены активности формальдегиддегидрогеназ и формиатдегидрогеназ, использующих в
111
качестве акцепторов электронов как НАД+, так и ФМС. Обнаружены активности
дегидрогеназ формальдегида (ФМС, НАД+) и формиата (ФМС, НАД+). НАД+зависимая форма формальдегид дегидрогеназ обоих изолятов стимулируется восстановленным глутатионом.
Таблица 14. Жирнокислотный состав клеток изучаемых штаммов (% от
общего содержания), выращенных на среде с пептоном.
Жирная кислота
Штамм PK2T
12:0
14:0
15:0
16:1ω7с и/или 15:0 iso 2-OH
16:1ω7t
16:00
14:0 3-OH и/или 16:1 iso I
17cyc
17:0
17:1ω8
18:1ω7
18:00
11-Methyl 18:1
16:0 3-OH
18:0 3-OH
19cyc
19:0 cyc ω8c
19:0 10 methyl
19:1
20:1 ω7c
Неизвестно
0,50
1,00
13,00
8,00
1,00
2,40
7,00
5,60
47,0
4,40
1,00
1,00
0,40
7,00
0,70
-
Штамм
PK1
0,50
A. kashmirensis
WT001T
3,12
0,18
29,20
0,60
17,30
5,20
6,90
-
28,02
21,69
10,13
3,53
0,27
31,30
1,60
28,31
1,86
1,00
0,80
6,40
-
1,32
0,18
-
0,34
0,24
Штамм PK2T ассимилирует формальдегид в ицл-положительном варианте
серинового пути С1-метаболизма, что подтверждается наличием активностей
ключевых
ферментов
–
гидроксипируватредуктазы
(ОПР)
и
серин-
глиоксилатаминотрансферазы (СГАТ), а также изоцитратлиазы.
У штамма PK1 обнаружена активность ключевого фермента РБФ-пути – рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилазы. Следовательно, штамм PK1 окисляет мета-
112
нол до CO2 и автотрофно ассимилирует его в реакции карбоксилирования РБФпути С1-ассимиляции.
У обоих штаммов отсутствует активность гексулозофосфатсинтазы (ГФС) –
ключевого фермента РМФ-пути. Штамм PK1 также не имеет активностей глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (НАД+) и 6-фосфоглюконатдегидрогеназы (НАД+).
Для обоих штаммов характерно наличие активностей глутамат дегидрогеназы:
НАДФН-зависимая форма – у штамма PK1 и обе формы (НАДФН, НАДН) у
штамма PK2T. Активности ферментов глутаматного цикла (глутаматсинтазы и
глутаминсинтетазы) отсутствуют или незначительны, следовательно, штаммы ассимилируют азот восстановительным аминированием α-кетоглутарата.
Таблица 15. Энзимологический анализ новых штаммов.
Фермент
Кофактор
Метанолдегидрогеназа
ФМС
Формальдегиддегидрогеназа ФМС
НАД+
НАД+, GSH
Формиатдегидрогеназа
ФМС
НАД+
Гидроксипируватредуктаза НАДН
НАДФН
Серин-глиоксилат аминоНАДН
трансфераза
НАДФН
Изоцитратлиаза
Гексулозофосфатсинтаза
НАДФ
Рибулозобисфосфаткарбоксилаза
Глутаматдегидрогеназа
НАДН
НАДФН
Глутаматсинтаза
НАДН
НАДФН
Глутаминсинтетаза
АТФ, Mn2+
Штамм PK1
Штамм PK2T
Активность, (нмоль/мин/мг белка)
83
42
4
33
6
10
0
0
127
46
14
48
148
100
709
127
0
593
0
0
0
65
14
0
56
0
0
20
0
2
2
50
90
215
170
1
113
5.2.4. Филогенетический анализ
Секвенирование гена 16S рРНК изолята PK2T выявило его принадлежность
к порядку Rhizobiales. Штамм имеет 96% сходства с некультивируемой пирендеградирующей бактерией из речных отложений – штаммом 23-01 (Hilyard et al.,
2008). Однако среди валидно описанных штамм PK2T отдалённо связан с Mesorhizobium gobiense CCBAU 83330T (Han et al., 2008) с 94% сходства последовательностей 16S рРНК. Филогенетический анализ показал низкий процент сходства (82–
94%) с представителями порядка Rhizobiales (рис. 17). Содержание Г+Ц в ДНК
штамма PK2T составляет 67,9 мол.%.
Таким образом, на основании морфологических, физиологических, хемотаксономических, биохимических и генетических характеристик штамм PK2T
(ВКМ В-2849T=JCM 30229T) предложен как типовой штамм нового рода и вида
Methylobrevis pamukkalensis (Poroshina et al., 2015).
Секвенирование гена 16S рРНК выявило принадлежность штамма PK1 к
Betaproteobacteria и 96,6–99,2% сходства с известными видами рода Advenella
(рис. 18). Уровень ДНК-ДНК сходства штамма PK1 с типовой культурой
A. kashmirensis WT001T составляет 70%, что свидетельствует о принадлежности
штаммов к одному виду. Содержание Г+Ц пар в ДНК штамма PK1 составляет
55,4 мол.%. Несмотря на обнаруженную активность метанолдегидрогеназы, амплифицировать фрагмент широко используемого в последнее десятилетие для детекции метилотрофии маркерного гена mxaF большой субъединицы классической
PQQ-зависимой метанолдегидрогеназы у штамма PK1 не удалось. Это находит
объяснение в ряде работ, показавших, что способность использовать метанол распространяется за пределы популяций, обладающих маркерным геном mxaF (Троценко и др., 2010).
RAPD и МАЛДИ-анализы. Согласно результатам RAPD-анализа, профили
представителей рода Advenella достаточно неоднородны: очевидно сходство профилей A. kashmirensis WT001T и A. incenata 4GA2008, однако профиль штамма
PK1 отличается от других штаммов Advenella бо́льшим количеством полос и их
молекулярным весом.
114
67
88
78
61
72
63
100
95
91
63
98
78
100
65
100
93
99
Mesorhizobium loti LMG 6125T (X67229)
Mesorhizobium sangaii SCAU7T (EU514525)
Mesorhizobium ciceri UPM-Ca7T (U07934)
Mesorhizobium qingshengii CCBAU 33460T (JQ339788)
Mesorhizobium australicum WSM2073T (AY601516)
Mesorhizobium shangrilense CCBAU 65327T (EU074203)
Aminobacter aminovorans DSM 7048T (AJ011759)
Mesorhizobium chacoense CECT 5336T (AJ278249)
Mesorhizobium caraganae CCBAU 11299T (EF149003)
Mesorhizobium gobiense CCBAU 83330T (EF035064)
Mesorhizobium camelthorni CCNWXJ40-4T (EU169581)
Methylobrevis pamukkalensis PK2T (KF683074)
Sediment bacterium 23-01 (EU167992)
Xanthobacter aminoxidans 14aT (AF399969)
Ancylobacter aquaticus ØrskovT (M62790)
Methylorhabdus multivorans DM13T (AF004845)
Starkeya novella IAM 12100T (D32247)
Angulomicrobium tetraedrale Z-2821T (AJ535708)
Methylopila capsulata IM1T (AF004844)
Albibacter methylovorans DM10T (FR733694)
Hansschlegelia plantiphila S1T (DQ404188)
Methylobacterium organophilum ATCC 27886T (AB175638)
Afipia felis ATCC 53690T (M65248)
Рис. 17. Филограмма, основанная на сравнении нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК и показывающая
положение штамма PK2T среди представителей порядка Rhizobiales. Использован метод присоединения соседей (“neighborjoining”). Цифрами показана статистическая достоверность порядка ветвления (показаны значения выше 50%),
определенная с помощью “bootstrap”- анализа 1000 альтернативных деревьев
115
Advenella kashmirensis subsp. nov. methyliсa PK1 (KF683075)
100
Advenella incenata CCUG 45225T (AM944734)
84
Advenella kashmirensis WT001T (AJ864470)
70
Advenella mimigardefordensis DPN7T (AY880023)
67
Advenella faeciporci M-07T (AB567741)
40
Brackiella oedipodis R8846T (AJ277742)
Alcaligenes faecalis CIP 55.84T (D88008)
100
Alcaligenes aquatilis 22996T (AJ937889)
98
Taylorella equigenitalis NCTC 11184T (X68645)
68
Pelistega europaea N57T (Y11890)
Pusillimonas noertemannii BN9T (AY695828)
Alcaligenes defragrans 54PinT (AJ005447)
Pigmentiphaga kullae K24T (AF282916)
Kerstersia gyiorum API 184-2-84T (AY131213)
95
94
Achromobacter xylosoxidans Hugh 2838T (Y14908)
Bordetella pertussis CIP 63.1T (U04950)
Derxia gummosa IAM 13946T (AB089482)
100
Burkholderia cepacia 717T (U96927)
99
Azohydromonas lata IAM 12599T (AB188125)
Рис. 18. Филограмма, основанная на сравнении нуклеотидных последовательностей 16S рРНК и показывающая
80
положение Advenella kashmirensis subsp. nov. methyliсa PK1 среди представителей порядка Burkholderiales. Использован метод присоединения соседей (“neighbor-joining”). Цифрами показана статистическая достоверность порядка ветвления (показаны значения выше 50%), определенная с помощью “bootstrap”- анализа 100 альтернативных деревьев
116
Рис. 19. Дендрограмма распределения белков изучаемых штаммов
На дендрограмме, построенной по результатам МАЛДИ-анализа, видно, что
по распределению белков с массами 2000–20000 Да разницы между штаммом
PK1, A. incenata CCUG 45225T и A. kashmirensis 4GA2008 не наблюдается; культура A. kashmirensis WT001T чётко отличается от указанных штаммов и кластеризуется отдельно (рис. 19).
5.2.5. Дифференцирующие признаки подвида A. kashmirensis subsp. nov.
methyliсa.
Помимо обнаружения ключевой особенности – способности к метилотрофии – были выявлены заметные отличия между штаммами PK1 и A. kashmirensis
WT001T. Так, штамм PK1 содержит 6,40% циклопропан-нонадекановой С19:0cyc, отсутствующей в клетках штамма A. kashmirensis WT001T, но не имеет додекановой
С12:0, характерной для A. kashmirensis WT001T (3,12%). В отличие от типового
штамма A. kashmirensis WT001T, растущего при 6% NaCl, метилотрофный изолят
PK1 растёт в диапазоне ≤2% NaCl, потребляет метанол, α-кетоглутарат и лактат,
гидролизует крахмал; не растёт хемолитоавтотрофно на кристаллической сере,
тиосульфате или тетратионате, не имеет активности уреазы, не восстанавливает
нитраты до нитритов (табл. 16).
117
Итак, по совокупности полученных гено- и фенотипических признаков,
предложено разделить вид A. kashmirensis на два подвида и выделить штамм PK1
как представитель нового метилотрофного подвида – A. kashmirensis subsp.
methyliсa. Ключевой дифференцирующей характеристикой подвидов является
способность к метилотрофии. Описание подвида Advenella kashmirensis subsp.
kashmirensis приведено в оригинальных работах (Ghosh et al., 2005; Gibello et al.,
2009). Описание нового подвида приведено ниже (см. раздел «Диагнозы новых
таксонов»).
Таблица
16.
Дифференцирующая
характеристика
A. kashmirensis subsp. nov. methylica.
Признак
Нитратредукция
Денитрификация
Уреаза API 20E
Ростовые субстраты:
метанол
формиат
α -кетоглутарат
лактат
тиосульфат
тетратионат
рафиноза
сукцинат
глюкоза
фруктоза
арабиноза
ксилоза
рибоза
рамноза
глюкуроновая кислота, серин
глицерин, сахароза,
мелицитоза, сорбит,
дульцит
Гидролиз крахмала
Рост при 6% NaCl
Жирные ислоты:
C19cyc
C12:0
A. kashmirensis subsp.
methylica
±
-
A. kashmirensis subsp.
kasmirensis
+
+
+
+
+
+
±
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
-
+
-
+
+
-
+
подвида
118
5.3. Биосинтез полигидроксиалканоатов из метанола
метилобактериями
В лаборатории радиоактивных изотопов ИБФМ РАН ранее был исследован
продуцент полигидроксиалканоатов (ПГБ и ПГБВ) – Methylobacterium extorquens
G10. Поскольку новая культура M. halotolerans С2T также синтезировала этот полимер (рис. 20), представляло интерес провести культивирование данных метилобактерий с целью наработки образцов и сравнительного изучения свойств полученных полимеров.
5.3.1. Культивирование штаммов
Розовоокрашенный ограниченно-факультативный метилотроф M. extorquens
G10 не зависит от витаминов и других факторов роста. Напротив, M. halotolerans
С2T является бесцветным облигатно метилотрофным B12-зависимым продуцентом
ПГБ, хорошо растёт на минеральной среде с метанолом и дрожжевым автолизатом (0,1%) как более дешёвым заменителем витамина B12.
Рис. 20. Электронно-микроскопические снимки срезов клеток M. extorquens
G10 (а) и M. halotolerans С2T (б) на стадии синтеза ПГБ. Длина масштабной метки
1 мкм
119
На электронно-микроскопических снимках ультратонких срезов клеток
(рис. 20) чётко видны цитоплазматические гранулы ПГБ, синтезируемые культурами в начале лимита по азоту (вторая стадия культивирования). Характер образования гранул у исследуемых метилотрофов практически одинаков.
Как видно на рис. 21, интенсивный рост штаммов в ферментёре происходил
на первой стадии культивирования, когда достаточное количество азота обеспечивалось NH4OH, который использовали для поддержания pH.
Рис. 21. Динамика накопления биомассы (1) и ПГБ (2) M. extorquens G10 (а) и M.
halotolerans С2T (б) при различных концентрациях NH4+ (3)
120
На второй стадии культивирования, когда pH среды поддерживали раствором NaOH, происходило постепенное потребление остаточных ионов NH4+. При
этом создавался лимит по азоту при избытке углерода. Культуры начинали усиленно синтезировать ПГБ. Обе культуры к началу стационарной фазы роста
накапливали максимальное количество ПГБ (20–40%).
Отличительной особенностью культур являлась зависимость биосинтеза
ПГБ от концентрации NH4+ в среде (табл. 17).
M. extorquens G10 синтезировал ПГБ только в условиях лимитирования по
азоту. Присутствие в среде достаточного количества азота резко снижало синтез
биополимера, вплоть до полного прекращения. Кроме того, при концентрации
NH4+, равной 0,1 г/л и более, резко снижалась Мм ПГБ, синтезируемого
M. extorquens G10. Продуцент M. halotolerans С2T отличался ме́ньшей чувствительностью к лимитированию по азоту. Присутствие малых количеств остаточного NH4+ в ростовой среде M. halotolerans С2T также снижало выход ПГБ, однако
его Мм оставалась высокой.
Таблица 17. Биосинтез ПГБ метилобактериями при различных остаточных концентрациях источника азота.
Культура
M. extorquens
G10
M. halotolerans
С2T
Время
культивирования, ч
76
72
71
72
72
84
80
Остаточная
концентрация
NH4+, г/л
0
0
0,1
0,17
0
0,05
0,22
Сухая
биомасса,
г/л
54,8
50,0
60,4
62,0
42,0
48,2
51,6
Содержание
ПГБ в биомассе, %
39,2
39,5
29,0
2,0
17,4
12,6
5,2
Мм
ПГБ, Дa
252000
230000
153000
85000
3400000
2616000
2930000
5.3.2. Характеристика ПГБ
В табл. 17–18 представлены основные физико-химические свойства ПГБ,
синтезируемых M. halotolerans С2T и M. extorquens G10.
Примечательно, что ПГБ, синтезируемый культурой M. halotolerans С2T,
обладал более высокими значениями Мм (>3 млн Да), температуры плавления и
121
степени кристалличности, нежели ПГБ, синтезируемый M. extorquens G10 (15 тыс.
Да) (табл. 18). Предполагается, что обнаруженные свойства полимера штамма С2T
позволят после специальной обработки получить цепи с высокой степенью ориентации. Эти волокона применимы в медицине в качестве биодеградируемых (шовных) нитей, а также – как компоненты композитных материалов.
Таблица 18. Физико-химические свойства ПГБ метилотрофных продуцентов.
Мм полимера, Да
Температура плавления, °C
Пик I
Пик II
Температура кристаллизации, °C
Энтальпия плавления
Энтальпия кристаллизации
Степень кристалличности, %
M. halotolerans С2T
3,3×106
M. extorquens G10
15×104
183,0
74,7
234,6
167,9
71,0
176,3
165,9
80,2
78,69
36,19
67,0
ысокие значения Мм ПГБ обусловлены, по-видимому, большей процессивностью
ПГБ-синтазы/полимеразы M. halotolerans С2T по сравнению с таковой M.
extorquens G10. Для проверки этого предположения необходимо очистить и охарактеризовать соответствующие ферменты исследуемых культур.
5.3.3. Энзимологический анализ
В табл. 19 приведены результаты сравнительного анализа активностей ферментов C1-метаболизма и биосинтеза ПГБ в экстрактах клеток, отобранных в экспоненциальной фазе роста на метаноле. Исследуемые штаммы обладали полным
набором дегидрогеназ, окисляющих метанол, формальдегид и формиат до CO2.
Метанолдегидрогеназа проявляла максимальную активность при pH 9,0 в
присутствии ионов аммония. Обе культуры имели высокие активности оксипируватредуктазы и серин-глиоксилат трансаминазы. Однако, если у M. extorquens
G10 оксипируватредуктаза более активна с НАДН, то у M. halotolerans С2T – с
НАДФН. В то же время у исследуемых метилобактерий не обнаружены изоцитратлиаза, гексулозофосфатсинтаза и рибулозобисфосфаткарбоксилаза. Следовательно, оба метилотрофа реализуют изоцитратлиазо-негативный вариант серино-
В
122
вого пути С1-метаболизма. Биосинтез ПГБ катализируют β-кетотиолаза, ацетоацетил-KoA-редуктаза и ПГБ-синтаза, активности которых были практически одинаковы у исследуемых метилотрофов (табл. 19).
Таблица 19. Активность ферментов в экстрактах клеток метилобактерий, выращенных на метаноле.
Фермент
Кофактор Methylobacterium Methyloligella
extorquens G10
halotolerans С2T
Активность, (нмоль/мин/мг белка)
Метанолдегидрогеназа
ФМС
140
270
Формальдегиддегидрогеназа
ФМС
14
8
НАД
25
6
Формиатдегидрогеназа
ФМС
10
8
НАД
94
1
Оксипируватредуктаза
НАДН
1020
37
НАДФН 410
196
Серин-глиоксилат трансаминаза НАДН
320
390
НАДФН 96
100
β-кетотиолаза
22
21
Ацетоацетил-КоА-редуктаза
НАДН
37
30
ПГБ-синтаза
4
4
5.3.4. Биосинтез ПГБ/В продуцентами M. halotolerans С2T и
M. extorquens G10
Вторая серия ферментаций M. halotolerans С2T и M. extorquens G10 была
направлена на биосинтез культурами сополимера полигидроксибутировалерата
(ПГБ/В). Культивирование проводили в две стадии, проводя поддержание pH среды и создавая лимит по азоту, как описано выше для процесса синтеза ПГБ. В качестве источника углерода на первой стадии использовали метанол, поскольку
добавление пентанола при низкой оптической плотности культуры ингибировало
её рост; на второй стадии культивирования использовали смесь метанол:пентанол
8:2 (об/об). Полученную культуральную среду центрифугировали для выделения
биомассы.
Показано, что у Methylobacterium extorquens G10 Мм полимера, синтезированного на смеси метанола и пентанола, значительно возрастает (до 700 кДа) по
123
сравнению с ПГБ, синтезируемым на чистом метаноле (150–200 кДа), причём сополимер – ПГБВ – обладал бо́льшей эластичностью, чем ПГБ.
Напротив, использование в качестве источника углерода смеси метанола с
пентанолом для метилотрофа Methyloligella halotolerans С2T снижало Мм биополимера с 3300 кДа до 1600 кДа.
В заключение следует отметить, что оба исследованных метилотрофных
продуцента ПГБ росли на метаноле-сырце, не снижая скорости роста и продуктивности по сравнению с чистым метанолом, что значительно повышает конкурентоспособность производства биопластика.
При оптимизации культивирования штамма С2T в аппаратах АНКУМ-2М
Мм ПГБ достигала 10 млн Да.
5.3.5. Биосинтез ПГБ продуцентом Methylobrevis pamukkalensis PK2T
Поскольку при выращивании культуры Methylobrevis pamukkalensis PK2T на
колбах было обнаружено накопление гранул ПГБ (рис. 16, в) , представляло интерес наработать образцы пластика для определения его физико-химических
свойств.
Для культивирования новой культуры Methylobrevis pamukkalensis PK2T в
аппарате АНКУМ-2М была подобрана оптимальная среда. Показано, что максимальный рост культуры обнаружен при использовании среды MAMS с добавлением раствора микроэлементов и витаминов. Режим ферментации был аналогичен
указанному ранее для культуры Methyloligella halotolerans С2T (см. разд. 4.2.2.4,
п. 4).
При первой ферментации наблюдался слабый рост культуры, максимальная
оптическая плотность составила ~6,5. Переход на подтитровку NaOH производили при оптической плотности 4,8.
Вторая ферментация, с использованием дрожжевого автолизата в качестве
дополнительного источника азота и витаминов, прошла более успешно. Оптическая плотность культуры достигла 30. При достижении высокой оптической
плотности (29) переход на подтитровку щёлочью позволил понизить содержание
124
ионов аммония, что стимулировало культуру к синтезу высокомолекулярного (1
млн Да) ПГБ. Выход ПГБ составил 4,4% от веса сухой биомассы.
Таким образом, исследуемые метилобактерии синтезировали разные по
свойствам биопластики.
Cинтезируемый продуцентом Methylobacterium extorquens G10, ПГБ довольно хрупкий и имеет Мм ~200 кДа; при синтезе сополимера ПГБВ на смеси
метанола с пентанолом, Мм биополимера значительно возрастала (до 700 кДа),
этот полимер более эластичен, следовательно, может легко подвергаться формованию, что указывает на высокий потенциал применения в медицине. Напротив,
использование в качестве источника углерода смеси метанола с пентанолом для
метилотрофа Methyloligella halotolerans C2T снижало Мм биополимера с 3 млн Да
до 1600 кДа, нивелируя его уникальные физические свойства, связанные с высокой Мм и кристалличностью. Продуцент Methylobrevis pamukkalensis PK2T синтезировал высокомолекулярный (1 млн Да) ПГБ, что также нехарактерно для изученных ранее метилотрофов.
С учётом свойств ПГБ, наработанные образцы биопластиков прошли
успешные испытания в НИИ комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний СО РАМН (Кемерово) при изготовлении противоспаечных мембран и биодеградабельных туннелей, имплантации проводящих нервных пучков (ПГБВ
штамма Methylobacterium extorquens G10) и стентов (ПГБ штаммов Methyloligella
halotolerans C2T и Methylobrevis pamukkalensis PK2T).
Аэробные метилобактерии привлекают всё большее внимание как потенциальные продуценты биосовместимых и биодеградируемых пластиков (KhosraviDarani et al., 2013). Пути биосинтеза ПГБ у прокариот исследуются давно (Волова
и Шишацкая, 2011). Однако механизмы биосинтеза ПГБ у метилобактерий имеют
принципиальные отличия в метаболизме углерода. В частности, два ключевых
фермента биосинтеза ПГБ (β-кетотиолаза и ацетоацетил-KoA-редуктаза) являются
частью этилмалонатного пути регенерации глиоксилата и глицина, акцептора
формальдегида в сериновом цикле, причем в геномах некоторых метилобактерий
обнаружены несколько генов, кодирующих ПГБ-синтазы (Skovran et al., 2010;
125
Троценко и др., 2010). Хотя исследуемые штаммы реализуют сериновый путь С1метаболизма, выявлены существенные отличия в свойствах ПГБ, синтезируемых
M. halotolerans С2T и M. extorquens G10, что свидетельствует о структурнофункциональных особенностях этих продуцентов.
Диагнозы новых таксонов
Род Methyloligella Doronina et al., 2013.
Methyloligella (me.thyl.o.li.gel'la. Fr. methyle, метильная группа; N.L. pref.
methylo-, метильный радикал; Gr. adj. oligos, немногий, малочисленный, скудный;
L. dim. ending -ella, маленький; N.L. fem. dim. n. Methyloligella, бактерии с ограниченным спектром субстратов).
Клетки – неспорообразующие грамотрицательные неподвижные, собранные
в розетки, размножаются бинарным делением. Строго аэробные, умеренно галофильные, облигатно метилотрофные бактерии. Ассимилируют C1-соединения через сериновый путь. Не растут на метане. Каталазо- и оксидазоположительные. Не
растут на богатых средах: глюкозо-пептонном агаре, среде LB. Накапливают
внутриклеточно ПГБ и при концентрации NaCl выше 3% – осмопротектор эктоин.
Преобладающий хинон в дыхательной цепи – Q10. Основные жирные кислоты –
C18:1ω7c и C19:0cyc. Основные фосфолипиды – фосфатидилэтаноламин, фосфатидилдиметилэтаноламин, фосфатидилглицерин и фосфатидилхолин. Содержание Г+Ц
в ДНК составляет 60–61 мол.%. Род принадлежит к классу Alphaproteobacteria.
Типовой вид рода – Methyloligella halotoleransT.
Methyloligella halotolerans Doronina et al., 2013.
Methyloligella halotolerans (ha.lo.to'le.rans. Gr. n. hals halos, соль; L. part. adj.
tolerans, устойчивость; N.L. part. adj. halotolerans, солеустойчивый).
В дополнение к родовому описанию обладает следующими свойствами.
Клетки – неподвижные кеглеобразные палочки, собранные в розетки (0,5–
0,6×1,6–1,7 мкм), представленные одиночно или в парах. Облигатный метилотроф, потребляет метанол, метиламин, слабый рост обнаружен на диметиламине.
Реализует сериновый путь (ицл-) С1-метаболизма. Растёт при pH 6,0–10,0 (опти-
126
мум pH 7,0–8,0). Умеренный галофил, растёт при концентрации NaCl 0–16%, с
оптимумом при 3–5%. Источниками азота служат аммоний, метиламин и диметиламин. Содержание Г+Ц в ДНК типового штамма составляет 60,9 мол.% (Тпл).
Чувствителен к гентамицину и стрептомицину, устойчив к канамицину, неомицину, пенициллину, тетрациклину, оксалицину, новобиоцину, эритромицину, хлорамфениколу, налидиксовой кислоте, линкомицину.
Типовой штамм, C2T (=ВКМ B–2706T=CCUG 61687T=DSM 25045T), выделен
из образца солёной почвы (Троицкий заказник, Челябинская область, Россия). Последовательности генов 16S рРНК и mxaF штамма C2T депонированы в GenBank
под номерами JQ773443 и JQ773444, соответственно.
Methyloligella solikamskensis Doronina et al., 2013.
Methyloligella solikamskensis (so.li.kamsk.en'sis. N.L. fem. adj. solikamskensis,
относящийся к Соликамску, источнику выделения типового штамма).
Следующие свойства приведены в дополнение к характеристикам, описанным для рода. Клетки – кеглеобразные палочки (0,4–0,6×1,8–2,0 мкм), расположенные по отдельности или в парах, формируют розетки. Облигатный метилотроф, использует метанол и метиламин, но не диметиламин. Реализует ицл-- вариант серинового пути. Растёт при pH 6,5–10,0 (оптимум при pH 7,5). Умеренный
галофил. Диапазон роста 0–16% NaCl (оптимум 3–5%). В качестве источников
азота использует аммоний и метиламин. Г+Ц состав ДНК типового штамма составляет 60,5 мол.% (Тпл). Штамм SK12T чувствителен к гентамицину и стрептомицину, устойчив к канамицину, неомицину, пенициллину, тетрациклину, оксалицину, новобиоцину, эритромицину, хлорамфениколу, налидиксовой кислоте,
линкомицину.
Типовой штамм, SK12T (=ВКМ B–2707T=CCUG 61697T=DSM 25212T), выделен из ила антропогенного биотопа г. Соликамска (Пермский край, Россия). Последовательности генов 16S рРНК и mxaF штамма SK12T депонированы в GenBank под номерами JQ796869 и JQ796868, соответственно.
Methylopila oligotropha Порошина и др., 2013.
127
Methylopila oligotropha (o.li.go.tro'pha; Gr. adj. oligos немного, несколько, Gr.
n. trophos питающий, ML fem. n. oligotropha использует ограниченный спектр полиуглеродных субстратов).
Клетки – грамотрицательные, подвижные, короткие аспорогенные палочки
(1,0×1,4–2,0 мкм), монотрихи, размножаются бинарным делением. На минеральной агаризованной среде с метанолом формирует белые, а на среде с пептоном –
слегка желтоватые непрозрачные колонии с выпуклым профилем и ровным краем.
Галотолерант. Растёт при температуре 16–40°C, pH 5,0–10,0 и 0,5–5% NaCl. Оптимум температуры для роста 29°C, pH 8,0–8,5. Не требует витаминов и других
факторов роста. Гидролизует крахмал, но не желатину. Оксидазо-, каталазо- и
уреазоположителен. Строгий аэроб. Не восстанавливает нитраты до нитритов.
Ограниченно-факультативный метилотроф. Реализует ицл-негативный вариант
серинового пути С1-метаболизма. Использует метанол, метилированные амины и
глюконат калия, но не глюкозу, фруктозу, сахарозу, арабинозу, мелибиозу, маннозу, мальтозу, сорбит, инозит, маннит, малат, глицерин, цитрат натрия, амигдалин.
Источниками азота служат соли аммония, нитраты, метиламин. Обладает активностью β-галактозидазы, орнитиндекарбоксилазы и аргининдегидролазы. В жирнокислотном составе клеток доминируют цис-11-октадеценовая (С18:1ω7c) – 68% и
циклопропан-нонадекановая (С19:0cyc) – 10%. Основные фосфолипиды: фосфатидилэтаноламин, дифосфатидилглицерин. Доминирующий убихинон – Q10. Содержание Г+Ц в ДНК составляет 67 мол.% (Тпл).
Чувствителен к тетрациклину, неомицину, стрептомицину, канамицину, пенициллину, гентамицину, устойчив к оксалицину, новобиоцину, линкомицину,
налидиксовой кислоте, эритромицину, хлорамфениколу.
Типовой штамм, 2395АT (=ВКМ B-2788T=CCUG 63805T), выделен из почвы
на территории солеразработок г. Соликамска. Последовательность гена 16S рРНК
штамма 2395АT депонирована в GenBank под номером KC243676.
Paracoccus communis Порошина и др., 2013.
Paracoccus communis (com'mu.nis; L. masc. adj. communis обычный, общий, –
не имеющий существенных отличий от представителей рода).
128
Грамотрицательные
сферические
неподвижные
аспорогенные
клетки
0,7×0,75 мкм, одиночные и в парах. Образуют полисахаридные капсулы. Размножаются бинарным делением. Колонии непрозрачные, на среде с метанолом кремово-белого цвета, на среде с пептоном – слегка желтоватые. Растёт при температуре
16–40ºC и pH 6–9,5. Оптимум температуры для роста 29ºC, pH 7,5. Галотолерант,
выдерживает до 10,0% NaCl.
Оксидазо- и каталазоположителен. Осуществляет денитрификацию. Растёт
на широком спектре субстратов: метаноле, метиламине, глюкозе, маннозе, мальтозе, рамнозе, цитрате, аспартате, сорбите, манните, пирувате, амигдалине, аргинине, но не использует арабинозу, фруктозу, мелибиозу, ксилозу, малат, серин,
аланин. В качестве источников азота использует аммоний и нитраты. Реализует
рибулозобисфосфатный путь С1-метаболизма. Обладает активностью орнитиндекарбоксилазы, но не лизиндекарбоксилазы, β-галактозидазы и β-глюкозидазы.
Гидролизует крахмал и желатину.
Доминирующий убихинон – Q10. В составе жирных кислот клеток доминируют цис-11-октадеценовая (С18:1w7c) – 74% и гексадекановая (С16:0) – 14%. Содержание Г+Ц в ДНК составляет 64,5 мол.% (Тпл).
Чувствителен к новобиоцину, стрептомицину, канамицину, хлорамфениколу, неомицину, устойчив к оксалицину, гентамицину, тетрациклину, эритромицину, линкомицину, пенициллину, налидиксовой кислоте.
Типовой штамм, S3T (=ВКМ B-2787T=CCUG 63804T), выделен из ила поверхностного стока со шламохранилища г. Соликамска. Последовательность гена
16S рРНК штамма S3T депонирована в GenBank под номером KC243677.
Ancylobacter defluvii Порошина и др., 2013.
Ancylobacter defluvii (de.flu'vi.i. L. gen. n. defluvii – сточная вода, загрязнения
- выделен из загрязнённой воды вблизи шламохранилища).
Короткие, почти кокковидные грамотрицательные неподвижные палочки
0,6–0,7×0,8–1,0 мкм, одиночные и в парах. Размножаются бинарным делением. На
минеральной среде с метанолом, а также на среде с пептоном образуют полупрозрачные серовато-белые колонии. Строгий аэроб. Галотолерант – растёт до 10%
129
NaCl с оптимумом при 1%. Оптимальная температура 29°С, оптимальный pH 7,0.
Оксидазо – и каталазоположителен. Восстанавливает нитраты до нитритов. Желатину не разжижает, но гидролизует крахмал. Индол из триптофана не образует.
Не имеет активностей β-галактозидазы, аргининдегидролазы, лизиндекарбоксилазы, орнитиндекарбоксилазы. Источниками азота служат аммонийные соли. Способен к автотрофному росту в атмосфере H2/O2/CO2. Факультативный метилотроф.
Растёт
на
метаноле,
реализует
рибулозобисфосфатный
путь
С1 -
метаболизма. Использует глюкозу, фруктозу, маннит, сорбит, малат, глюконат. Не
растёт на метиламине, диметиламине, сахарозе, маннозе, мальтозе, рамнозе, мелибиозе, цитрате, инозите, амигдалине. Доминирующие жирные кислоты: цис-11октадеценовая (С18:1w7c) – 77,0% и циклопропан-нонадекановая (С19:0cyc) – 12,3%.
Основные фосфолипиды: фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин, дифосфатидилглицерин. Доминирующий убихинон – Q10. Содержание Г+Ц в ДНК составляет 65,1 мол.% (Тпл).
Чувствителен к канамицину, неомицину и стрептомицину, устойчив к пенициллину, тетрациклину, гентамицину, оксалицину, новобиоцину, эритромицину,
хлорамфениколу, налидиксовой кислоте, линкомицину.
Типовой штамм, SK15T (=ВКМ B-2789T=CCUG 63806T), выделен из загрязнённой воды вблизи солеотвала г. Соликамска. Последовательность гена 16S
рРНК штамма SK15T депонирована в GenBank под номером KC243678.
Род Methylobrevis Poroshina et al., 2015.
Methylobrevis (me.thy.lo.bre'vis. Fr.n. methyle метильный радикал; L. adj. brevis короткий, соответствует коротким клеткам; N.L. masc. n. Methylobrevis метилпотребляющие короткие клетки].
Клетки – грам-отрицательные, строго аэробные, размножаются бинарным
делением, спор и простек не формируют. Накапливают внутриклеточно гранулы
ПГБ.
Галотолерантные ограниченно-факультативные метилотрофы, реализуют
изоцитратлиазо-положительный вариант серинового пути С1-метаболизма. Не
растут автотрофно. Основные фосфолипиды – фосфатидилэтаноламин и фосфа-
130
тидилмонометилэтаноламин, а также фосфатидилглицерин. Основные жирные
кислоты – 11-октадеценовая (C18:1ω7) и цис-9-гексадеценовая (C16:1ω7с). Основной
убихинон – Q10. Содержание Г+Ц в ДНК составляет 67,9 мол.% (Тпл). Типовой вид
– Methylobrevis pamukkalensisT.
Methylobrevis pamukkalensis Poroshina et al., 2015.
Methylobrevis pamukkalensis (pa.muk.kal.en'sis. N.L. masc. adj. pamukkalensis
относящийся к Памуккале, Иераполис, Турция).
Штамм представлен подвижными клетками, 0,7–1×1,5–2 мкм, образующими
розетки. Способен выдерживать до 6% NaCl (оптимум – 4% NaCl). 4-дневные колонии на агаризованной среде с метанолом круглые, бледно-коричневые, с выпуклым профилем, непрозрачные, с глянцевой поверхностью и цельным краем, 3
мм в диаметре.
Растёт оптимально при pH 7,5–8,0, 30°C, в присутствии 0,5% метанола. Ассимилирует метанол, маннит, слабый рост обнаружен на метиламине и формиате.
Не растёт на триптон-соевом агаре, LB, формальдегиде, диметиламине, триметиламине, а также на сахарах, аминокислотах, органических кислотах и спиртах. Не
восстанавливает нитраты до нитритов. Уреазо-, каталазо-, оксидазо- и βглюкозидазоположительный, но аргинин дигидролазо-, лизин- и орнитин декарбоксилазоотрицательный. Не образует H2S; не синтезирует из L-триптофана индолов. Гидролизует крахмал, но не желатину. Биотин стимулирует рост. Накапливает органический осмопротектор эктоин в ответ на повышение солёности внешней среды.
Штамм PK2T чувствителен к гентамицину, новобиоцину, канамицину, неомицину, хлорамфениколу, стрептомицину; устойчив к оксалицину, эритромицину, налидиксовой кислоте, пенициллину, тетрациклину.
Типовой штамм, PK2T (=ВКМ B-2849T=JCM 30229T), выделен из солёного
горячего источника на территории Памуккале (Иераполис, Турция). Последовательность гена 16S рРНК штамма PK2T депонирована в GenBank под номером
KF683074.
131
Advenella kashmirensis subsp. nov. methyliсa Порошина и др., 2015.
A. kashmirensis methyliсa (me.thy'.li.сa. Fr. methyle, метильная группа; соответствует С1-группе, потребляемой микроорганизмом).
Клетки – грамотрицательные неподвижные короткие палочки (0,3–
0,35×0,4–0,45 мкм). На минеральной агаризованной среде с метанолом образует
точечные бежевые, а на богатой среде – желтовато-кремовые, прозрачные, округлые, с плоским профилем и ровным краем, с гладкой блестящей поверхностью,
однородной структуры колонии. Не обладает способностью к нитратредукции.
Активность уреазы не обнаружена. Факультативный метилотроф. При росте на
метаноле реализует рибулозобисфосфатный путь С1-метаболизма. В качестве источников энергии использует метанол, формиат, но не кристаллическую серу,
тиосульфат или тетратионат. Утилизирует α-кетоглутарат и лактат. Гидролизует
крахмал. Растёт при ≤2% NaCl. Источниками азота служат соли аммония, нитраты
и аминокислоты (глицин, аланин, глутамат). На среде с нитратом как источником
азота, 0,5% метанола и 0,01% триптофана образует индолы. Рост стимулирует фолиевая кислота. Основные фосфолипиды – фосфатидилэтаноламин, фосфатидилмонометилэтаноламин, фосфатидилглицерин и дифосфатидилглицерин. В профиле жирных кислот обнаружена С19cyc (~6%). Основной убихинон – Q8. Содержание
Г+Ц в ДНК – 55,4 мол.% (Тпл). Штамм PK1 чувствителен к гентамицину, устойчив
к оксалицину, канамицину, новобиоцину, эритромицину, неомицину, налидиксовой кислоте, пенициллину, хлорамфениколу, тетрациклину, стрептомицину.
Штамм PK1 (=ВКМ-B 2850=DSM 27514) выделен из ризосферы осоки на территории национального парка Памуккале, Иераполис, Турция. Последовательность
гена 16S рРНК штамма PK1 депонирована в GenBank под номером KF683075.
132
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Из проб активного ила, почвы, воды, растений, отобранных как в техногенных, так и природных солёных биотопах России и Турции нами были получены
накопительные и выделены чистые культуры аэробных метилобактерий. Это подтверждает тезис о широком распространении метилобактерий в природе, являющихся важным звеном в трофической цепи углерода нашей планеты. Метанол –
ключевой субстрат для многих метилотрофов. Огромные количества метанола
(>200 млн т/год) образуются биогенно и антропогенно, но его эмиссия значительно снижается в наземных биотопах аэробными метилобактериями. Из 10 выделенных нами чистых культур три классифицированы и описаны как представители разных видов новых родов Methyloligella и Methylobrevis, а четыре штамма отнесены к новым видам известных родов метилобактерий. Полученные данные
указывают на слабую изученность биоразнообразия метилобактерий солёных
биотопов и необходимость проведения дальнейшего исследования этих экониш.
Изоляты реализуют разные пути С1-метаболизма – сериновый, РМФ, РБФ, что,
возможно, обусловлено особенностями их местообитаний. У ранее изученных метилобактерий ицл+-вариант серинового пути был обнаружен лишь у представителей родов Aminobacter и Hyphomicrobium; в работе описан новый род ицл+сериновых бактерий – Methylobrevis.
Впервые показано, что род Advenella включает метилотрофных представителей, в частности, подвид Advenella kashmirensis subsp. nov. methylica. Можно
полагать, что различия в способности к метилотрофии являются результатом горизонтального переноса генов.
В свою очередь, благодаря метилотрофии, Advenella kashmirensis subsp. nov.
methylica способен к фитосимбиозу, поскольку метанол – естественный метаболит
растений, а синтезируемые метилобактериями индолы (ауксины) являются фитогормонами. Корни осоки, из которых выделен штамм, были погружены в солёную
воду с концентрацией 4% NaCl, однако, обитая внутри растительных тканей,
штамм PK1, вероятно, утратил галотолерантность.
133
Суммируя полученные данные, следует отметить, что при высоком проценте сходства по 16S рРНК и ДНК-ДНК гибридизации, культуры Advenella kashmirensis spp. имеют явные различия в профилях белков, что свидетельствует о
необходимости применения различных методов для идентификации нового
штамма.
Выделенные галотолерантные и умеренно-галофильные культуры синтезируют в качестве основного осмопротектора эктоин, который был обнаружен у
других метилотрофов из солёных биотопов (Доронина и др., 2015). Существенное
накопление эктоина клетками ряда изолятов (до 20% от веса сухой биомассы) даёт основание считать их перспективными продуцентами этого универсального
биопротектора.
Нами впервые обнаружены представители метилобактерий (роды Methyloligella и Methylobrevis), синтезирующие ПГБ с высокой Мм (1–10 млн Да). Этот
биополимер очень прочен, но достаточно эластичен и эффективен для использования в медицине. Наработанные образцы биопластиков, переданные на испытания, признаны перспективными для использования в хирургии для изготовления
противоспаечных мембран, шовных нитей и стентов. Кроме того, недавно было
показано, что мономер ПГБ – 3ГБ – является химическим шапероном, повышающим устойчивость клеток к стрессовым факторам (Soto et al., 2012). Очевидно,
образование ПГБ метилобактериями родов Methyloligella и Methylobrevis, наряду с
биосинтезом эктоина, играет важную роль в адаптации к постоянно изменяющимся условиям солёных местообитаний.
Названия новых таксонов опубликованы в списках валидации International
Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology № 156 и 157 (Oren and Garrity,
2014a; 2014b), штаммы представлены в международных коллекциях, а нуклеотидные последовательности их генов 16S рРНК депонированы в международной базе
данных.
134
ВЫВОДЫ
1.
Из техногенных (г. Соликамск, Пермский край, Россия) и природных
солёных биотопов (Троицкий заказник, Челябинская область, Россия; Памуккале,
Турция) выделены в чистой культуре 10 штаммов аэробных метилобактерий.
Методами полифазной таксономии 7 штаммов классифицированы как
представители двух новых родов, шести новых видов и одного подвида:
Methyloligella
halotolerans,
Methyloligella
solikamskensis,
Methylobrevis
pamukkalensis, Paracoccus communis, Methylopila oligotropha, Ancylobacter defluvii,
Advenella kashmirensis subsp. methylica. Штаммы LS, 2395B и S3270 отнесены к
известным видам: Methylophaga thalassica, Arthrobacter protophormiae и
Ancylobacter rudongensis, соответственно.
2. Описанные штаммы реализуют различные пути С1-метаболизма:
M. halotolerans С2T, M. solikamskensis SK12T, M. pamukkalensis PK2T,
M. oligotropha 2395АT – сериновый путь, A. defluvii SK15T, A. rudongensis S3270,
P. communis S3T и A. kashmirensis subsp. methyliсa PK1 – рибулозобисфосфатный,
M. thalassica LS – рибулозомонофосфатный.
3. Установлено,
что
умеренно-галофильные
и
галотолерантные
T
метилобактерии Methyloligella halotolerans С2 , Methyloligella solikamskensis
SK12T, Methylobrevis pamukkalensis PK2T, Ancylobacter defluvii SK15T, Paracoccus
communis S3T, Methylophaga thalassica LS синтезируют в качестве основного
биопротектора циклическую иминокислоту – эктоин, содержание которого
возрастает при увеличении солёности среды и достигает 18–20% от веса сухих
клеток, что свидетельствует о перспективности выделенных штаммов в качестве
продуцентов этого ценного метаболита.
4. Показано, что представители новых родов Methyloligella и Methylobrevis
синтезируют высокомолекулярный ПГБ (1–10 млн Да), перспективный для
использования в биомедицине (прочные шовные нити и стенты).
135
Список сокращений и условных обозначений
АТФ – аденозин-5’-трифосфат
БСТФА – (триметилсилил)трифторацетамид
ВЭЖХ – высокоэффективная жидкостная хроматография
ГАФ – глицеральдегид-3-фосфат
3ГБ – 3-гидроксибутират
3ГВ –3-гидроксивалерат
ГФС – гексулозофосфатсинтаза
ДАБ – диаминобутират
ДГ – дегидрогеназа
ДТНБ – ди-тионитробензойная кислота
ДХМ – дихлорметан
ДХФИФ –дихлорфенолиндофенол
КоА – коэнзим А
МАДГ – метиламиндегидрогеназа
МАО – метиламиноксидаза
МГДГ – метилглутамат метилглутаматдегидрогеназа
НАД(Ф)+ – никотинамидадениндинуклеотид(фосфат), оксиленный
НАД(Ф)Н – никотинамидадениндинуклеотид(фосфат), восстановленный
п.н. – пары нуклеотидов
ПГБ – полигидроксибутират
ПГБ/В – полигидроксибутировалерат
ПЦР – полимеразная цепная реакция
СБФ – седогептулозобисфосфат
ТБО – твердые бытовые отходы
ТГМП-тетрагидрометаноптерин
ТГФ – тетрагидрофолат
ТПФ – тиамипирофосфат
Трис-НСl – трис(гидроксиметил)аминометанхлорид
ТСХ – тонкослойная хроматография
ТХУ – трихлоруксусная кислота
ФГИ – фосфогексулоизомераза
ФМС – феназинметосульфат
ЦТК – цикл трикарбоновых кислот
ANI – от англ. “average nucleotide identity” – средняя нуклеотидная идентичность
GSH – восстановленный глутатион
ME– от англ. “minimum evolution” – метод минимальной эволюции
ML – от англ. “maximum-likelihood” – метод максимального правдоподобия
MLSA – от англ.”multilocus sequence analysis” – анализ мультилокусной последовательности
MP – от англ. “maximum-parsimony” – метод максимальной экономии
MQ – бидистиллированная вода
MySH – восстановленный микотиол
NJ – от англ. “neighbor-joining” – метод присоединения соседей
UPGMA – от англ. “unweighted pair group method with averages” – метод невесового попарногруппового метода с использованием средних значений
136
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Акентьева Т.Н., Борисов В.В., Кудрявцева Ю.А., Доронина Н.В., Ежов В.А.
Влияние покрытия на основе полигидроксиалканоатов на свойства шовного материала // Ангиология и сосудистая хирургия. 2014. Т. 20. №4. С. 42–47.
2. Бонарцева Г.А., Мышкина В.Л., Николаева Д.А., Ребров А.В., Герасин В.А.,
Махина Т.К. Биодеградация поли-β-гидроксибутирата в модельных условиях
почвенного сообщества: влияние условий среды на скорость процесса и физико-химические характеристики полимера // Микробиол. 2002. Т. 71. №2. С.
258–263.
3. Бут С.Ю., Хмеленина В.Н., Мустахимов И.И., Троценко Ю.А. Получение и характеристика нокаут-мутантов Methylomicrobium alcaliphilum 20Z, дефектных
по генам синтеза сахарозы и эктоина // Микробиол. 2013. Т. 82. №2. С. 251–253.
4. Волова Т.Г., Калачева Г.С., Кожевников И.В., Штайнбюхель А. Биосинтез многокомпонентных полигидроксиалканоатов бактериями Wautersia eutropha //
Микробиол. 2007. Т. 76. №6. С. 797–804.
5. Волова Т.Г., Шишацкая Е.И. Разрушаемые биополимеры: получение, свойства,
применение. Красноярск: “Красноярский писатель”, 2011. 392 с.
6. Говорухина Н.И., Троценко Ю.А. Фосфолипидный состав метилотрофных бактерий // Микробиол. 1989. Т. 58. №3. С. 405–411.
7. Дегтева Г.К., Беляева Е.В., Ермолина Г.Б. Значение хемотаксономических исследований нижегородского НИИ эпидемиологии и микробиологии им. акад.
И.Н. Блохиной в современной микробиологии // Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского. Серия Биология. Изд-во ННГУ, Нижний Новгород. 2001. №1. С. 8–11.
8. Доронина Н.В. Биоразнообразие и таксономия аэробных метилобактерий // Автореф. дисс. докт. биол. наук. Пущино. 1999. С. 32.
137
9. Доронина Н.В., Говорухина И.И., Лысенко A.M., Троценко Ю.А. Анализ ДНКДНК гомологии у облигатно-метилотрофных бактерий // Микробиол. 1988. Т.
57. №4. С. 629–633.
10. Доронина Н.В., Дармаева Л.Ц., Троценко Ю.А. Новые аэробные метилотрофные изоляты из содовых озёр Южного Забайкалья // Микробиол. 2001. Т. 70.
№3. С. 398–404.
11. Доронина Н.В., Ежов В.А., Бесчастный А.П., Троценко Ю.А. Биосинтез биопротектора эктоина аэробными метилотрофными бактериями // Прикл. биохимия и микробиология. 2010. Т. 46. №2. C. 187–190.
12. Доронина Н.В., Ежов В.А., Троценко Ю.А. Культивирование на метане и биосинтез поли-β-гидроксибутирата Methylosinus trichosporium ОВ3b // Прикл.
биохимия и микробиология. 2008. Т. 44. №2. С. 202–206.
13. Доронина Н.В., Краузова В.И., Троценко Ю.А. Methylophaga limanica – новый
вид умеренно-галофильных аэробных метилобактерий // Микробиол. 1997. Т.
66. №4. С. 520–526.
14. Доронина Н.В., Ли Ц.Д., Иванова Е.Г., Троценко Ю.А. Methylophaga murata sp.
nov. – галоалкалофильный аэробный метилотроф из разрушающегося мрамора
// Микробиол. 2005. Т. 74. №4. С. 511–519.
15. Доронина Н.В., Сахаровский В.Г., Драчук С.В., Троценко Ю.А. Органические
осмопротекторы аэробных умеренно галофильных метилобактерий // Микробиол. 1998. Т. 67. №4. С. 457–462.
16. Доронина Н.В., Торгонская М.Л., Федоров Д.Н., Троценко Ю.А. Аэробные метилобактерии – перспективные объекты современной биотехнологии (обзор) //
Прикл. биохимия и микробиология. 2015. Т. 51. №2. C. 111–121.
17. Доронина Н.В., Троценко Ю.А. Метаболизм метанола и глюкозы у Angulomicrobium tetraedrale // Микробиол. 2006. Т. № 3. С. 424–426.
18. Доронина Н.В., Федоров Д.Н., Троценко Ю.А., Смолянина С.О., Беркович Ю.А.
Стимуляция облигатными метилотрофными бактериями морфогенеза и антигрибной устойчивости китайской капусты Brassica chinensis L. // Биотехнология.
2009. № 6. С. 56–61.
138
19. Ежов В.А., Доронина Н.В., Троценко Ю.А. Биосинтез полигидроксибутировалерата с разной молекулярной массой при росте Methylobacterium extorquens G10 на смеси метанола и пентанола // Прикл. биохимия и микробиология. 2013.
Т. 49. №2. С. 171–174.
20. Еремченко О.З., Чудинова Л.А. Микроэлементный состав почв и растительности заповедной лесостепи в условиях техногенеза // Современные проблемы
науки и образования. 2012. №5. С. 279–286.
21. Ешинимаев Б.Ц., Цыренжапова И.С., Хмеленина В.Н., Троценко Ю.А.
Определение содержания осмопротектора эктоина у метилотрофных бактерий
методом нормально-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии //
Прикл. биохимия и микробиология. 2007. Т. 43. №2. С. 215–218.
22. Иванова Е.Г., Доронина Н.В., Шепеляковская А.О., Ламан А.Г., Бровко Ф.А.,
Троценко Ю.А. Факультативные и облигатные аэробные метилобактерии синтезируют цитокинины // Микробиол. 2000. Т. 69. №6. С. 764–769.
23. Карандашова И.В., Еланская И.В. Генетический контроль и механизмы устойчивости цианобактерий к солевому и гиперосмотическому стрессу // Генетика.
2005. Т. 41. №12. С. 1589–1600.
24. Кендиван О. Природное чудо глазами химика // Наука и жизнь, 2011. №5. С.
84–85.
25. Константинов И. Соль соликамская // Наука и жизнь, 2010. №11. С. 16–19.
26. Короткова Н.А., Доронина Н.В., Троценко Ю.А. Биосинтез сополимера 3гиброксибутирата/3-гидроксивалерата Methylobacterium extorquens: метаболизм
пропанола, пропионата, пентанола и валерата // Микробиол. 1999. Т. 68. № 3. С.
347–355.
27. Короткова Н.А., Доронина Н.В., Троценко Ю.А. Биосинтез сополимера 3оксибутирата/3-оксивалерата метилобактериями с сериновым путем метаболизма // Прикл. биохимия и микробиология. 1997. Т. 33. №4. С. 397–402.
28. Логинова Н.В., Троценко Ю.А. Пируват и фософоенолпируват карбоксилаза в
метилотрофах // Микробиол. 1979. Т. 48. №2. С. 202–207.
139
29. Методы общей бактериологии: Пер. с англ./Под ред. Ф. Герхардта и др. — М.:
Мир, 1984. — 264 с.
30. Мустахимов И.И., Решетников А.С., Федоров Д.Н., Хмеленина В. Н., Троценко
Ю.А. Роль белка EctR как транскрипционного регулятора генов биосинтеза эктоина у Methylophaga thalassica // Биохимия. 2012. Т. 77. №8. С. 1044–1051.
31. Насонова М.В., Антонова Л.В., Матвеева В.Г., Доронина Н.В., Ежов В.А., Бураго А.Ю., Глушкова Т.В., Кудрявцева Ю.А. Скорость резорбции трансплантата
на основе полигидроксиалканоатов и мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток // Комплексные проблемы сердечно-сосудистых заболеваний.
2015. №1. С. 39–45.
32. Насонова М.В., Глушкова Т.В., Борисов В.В., Матвеева В.Г., Доронина Н.В.,
Ежов В.А., Кудрявцева Ю.А. Разработка биодеградируемых мембран на основе
полиоксиалканоатов
для
профилактики
спайкообразования
в
сердечно-
сосудистой хирургии // Сибирский медицинский журнал. 2012. Т. 115. №8. С.
58–60.
33. Порошина М.Н., Доронина Н.В., Капаруллина Е.Н., Ковалевская Н.П., Троценко Ю.А. Галофильные и галотолерантные аэробные метилобактерии из техногенных соликамских биотопов // Микробиол. 2013. Т. 82. №4. С. 473–482.
34. Порошина М.Н., Доронина Н.В., Капаруллина Е.Н., Троценко Ю.А. Advenella
kashmirensis subsp. methylica PK1 – факультативный метилотроф из ризосферы
осоки // Микробиол. 2015. Т. 84. №1. C. 90–97.
35. Решетников А.С., Хмеленина В.Н., Троценко Ю.А. Идентификация генов синтеза эктоина у умеренно галофильной альфапротеобактерии Methylarcula marina // Микробиол. 2010. Т. 79. №6. С. 859–860.
36. Рязанцев С.В. Барьерная терапия – новое направление в лечении аллергического ринита // Российская оториноларингология. 2014. №2 (69). С.148–153.
37. Скрипник Р.Л. К вопросу лечения аллергических конъюнктивитов // Офтальмология Восточная Европа. Минск. 2015. №1 (24). С. 110.
38. Соколов А.П., Троценко Ю.А. Циклический путь окисления формальдегида у
Pseudomonas oleovorans // Микробиол. 1977. Т. 46. №6. С. 1119–1121.
140
39. Троценко Ю.А., Доронина Н.В., Ли Ц.Д., Решетников А.С. Умеренно галоалкалофильные аэробные метилобактерии // Микробиол. 2007. Т. 76. №3. C. 293–
305.
40. Троценко Ю.А., Доронина Н.В., Торгонская М.Л. Аэробные метилобактерии /
Под. ред. В.Ф. Гальченко. Пущино: ОНТИ ПНЦ РАН, 2010. С. 222–224.
41. Федоров Д.Н., Замахаева С.А., Ежов В.А., Доронина Н.В., Троценко Ю.А. Генетическая
модификация
штамма-продуцента
полигидроксибутирата
Methylobacterium extorquens G10 // Прикл. биохимия и микробиология. 2014. Т.
50. №3. С. 289–294.
42. Широких И.Г., Огородникова С.Ю., Широких А.А. Влияние ассоциативных метилотрофных бактерий на проростки пшеницы при осмотическом стрессе // Агрохимия. 2013. №7. С. 56–61.
43. Agladze N.N., Doronina N.V., Agladze K.I. Cardiac tissue engineering with the aid
of polyhydroxybutyrate membranes and nanofibers // J. Chem. Chem. Eng. 2013. V.
7. P. 1168–1174.
44. Aguzzi A., Polymenidou M. Mammalian prion biology: one century of evolving concepts // Cell. 2004. V. 116. P. 313–327.
45. Anthony C. Bacterial oxidation of methane and methanol // Adv. Microb. Physiol.
1986. V. 27. P. 113–210.
46. Anthony C. The biochemistry of methylotrophs. Academic Press, London. 1982.
47. Anthony C., Zatman L.J. The microbial oxidation of methanol. The methanoloxidizing enzyme of Pseudomonas sp. M27 // Biochem. J. 1964. V. 92. P. 614–621.
48. Antony C.P., Doronina N.V., Boden R., Trotsenko Y.A., Shouche Y.S., Murrell J.C.
Methylophaga lonarensis sp. nov., a moderately haloalkaliphilic methylotroph
isolated from the soda lake sediments of a meteorite impact crater // Int. J. Syst. Evol.
Microbiol. 2012. V. 62. P. 1613–1618.
49. Arora N.K., Singhal V., Maheshwari D.K. Salinity-induced accumulation of poly-bhydroxybutyrate in rhizobia indicating its role in cell protection // World J. Microbiol. Biotechnol. 2006. V. 22. P. 603–606.
141
50. b S. Aerobic methanol-oxidizing Bacteria in soil. Minireview // FEMS Microbiol.
Lett. 2009. V. 300. P. 1–10.
51. Balachandar D., Raja P., Sundaram S.P. Genetic and metabolic diversity of pinkpigmented facultative methylotrophs in phyllosphere of tropical plants // Braz. J. Microbiol. 2008. V. 39. P. 68–73.
52. Beck D.A.C., McTaggart T.L., Setboonsarng U., Vorobev A., Kalyuzhnaya M.G.,
Ivanova N., Goodwin L., Woyke T., Lidstrom M.E., Chistoserdova L. Ed. by M.R.
Mormile. The expanded diversity of Methylophilaceae from Lake Washington
through cultivation and genomic sequencing of novel ecotypes // PLoS One. 2014. V.
9. doi: 10.1371/journal.pone.0102458.
53. Bhatia S.K., Shim Y.H., Jeon J.M., Brigham C.J., Kim Y.H., Kim H.J., Seo H.M.,
Lee J.H., Kim J.H., Yi D.H., Lee Y.K., Yang Y.H. Starch based polyhydroxybutyrate
production in engineered Escherichia coli // Bioprocess Biosyst. Eng. 2015. V. 38. P.
1479–1484.
54. Blackmore M.A., Quayle J.R. Microbial growth on oxalate by a route not involving
glyoxylate carboligase // Biochem. J. 1970. V. 118. P. 53–59.
55. Boden R. Emended description of the genus Methylophaga Janvier et al. 1985 // Int.
J. Syst. Evol. Microbiol. 2012. V. 62. P. 1644–1646.
56. Boden R., Kelly D.P., Murrell J.C., Schäfer H. Methylophaga thiooxydans sp. nov. In
List of New Names and new combinations previously effectively, but not validly,
published, Validation List no. 137 // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2011. V. 61. P. 1–3.
57. Boden R., Kelly D.P., Murrell J.C., Schäfer H. Oxidation of dimethylsulfide to
tetrathionate by Methylophaga thiooxidans sp. nov.: a new link in the sulfur cycle //
Environ. Microbiol. 2010. V. 12. P. 2688–2699.
58. Borodina E., Kelly D.P., Rainey F.A., Ward-Rainey N.L., Wood A.P. Dimethylsulfone as a growth substrate for novel methylotrophic species of Hyphomicrobium
and Arthrobacter // Arch. Microbiol. 2000. V. 173. P. 425–437.
59. Botta C., Di Giorgio C., Sabatier A.S., De Meo M. Genotoxicity of visible light
(400–800 nm) and photoprotection assessment of ectoin, L-ergothioneine and mannitol and four sunscreens // J. Photochem. Photobiol. 2008. V. 91. P. 24–34.
142
60. Bourque D., Ouellette B., Andre G., Groleau D. Production of poly-βhydroxybutyrate from methanol – characterization of a new isolate of
Methylobacterium extorquens // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1992. V. 37. P. 7–12.
61. Bourque D., Pomerleau Y., Groleau D. High-cell-density production of poly-βhydroxybutyrate (PHB) from methanol by Methylobacterium extorquens: production
of high-molecular-mass PHB // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1995. V. 44. P. 367–
376.
62. Bousfield I.J., Green P.N. Reclassification of bacteria of the genus Protomonas Urakami and Komagata 1984 in the genus Methylobacterium (Patt, Cole, and Hanson)
emend. Green and Bousfield, 1983 // Int. J. Syst. Bacteriol. 1985. V. 35. P. 209.
63. Bradford M.M. Rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Anal. Biochem. 1976.
V. 72. P. 248–254.
64. Brand H., Gross R.A., Lenz R.W., Fuller R.C. Plastics from Bacteria and for Bacteria: poly(β-hydroxyalkanoates) as natural, biocompatible, and biodegradable Polyesters // Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 1990. V. 41. P. 78–93.
65. Brenner D.J., Hollis D.G., Moss C.W., English C.K., Hall G.S., Vincent J., Radosevic
J., Birkness K.A., Bibb W.F., Quinn F.D. Proposal of Afipia gen. nov., with Afipia felis sp. nov. (formerly the cat scratch disease bacillus), Afipia clevelandensis sp. nov.
(formerly the cleveland flinic foundation strain), Afipia broomeae sp. nov., and three
unnamed genospecies // J. Clin. Microbiol. 1991. V. 29. P. 2450–2460.
66. Brown A.D. Microbial water stress // Bacteriol. Rev. 1976. V. 40. P. 803–846.
67. Buenger J., Driller H. Ectoin: An effective natural substance to prevent UVA-induced
premature photoaging // Skin Pharmacol. Physiol. 2004. V. 17. P. 232–237.
68. Bunger J. Ectoine added protection and care for the skin // Eur. Cosmet. 1999. V. 7.
P. 22–24.
69. Burg M.B., Ferraris J.D. Intracellular organic osmolytes: function and regulation // J.
Biol. Chem. 2008. V. 283. P. 7309–7313.
143
70. Bursy J., Pierik A.J., Pica N., Bremer E. Osmotically induced synthesis of the compatible solute hydroxyectoine is mediated by an evolutionarily conserved ectoine hydroxylase // J. Biol. Chem. 2007. V. 282. P. 31147–31155.
71. But S.Y., Khmelenina V.N., Reshetnikov A.S., Trotsenko Y.A. Bifunctional sucrose
phosphate synthase/phosphatase is involved in the sucrose biosynthesis by Methylobacillus flagellatus KT // FEMS Microbiol. Lett. 2013. V. 347. P. 43–51.
72. Cagliero C., Jin D.J. Dissociation and re-association of RNA polymerase with DNA
during osmotic stress response in Escherichia coli // Nucleic Acids Res. 2013. V. 41.
P. 315–326.
73. Cánovas D., Vargas C., Calderón M.-J., Ventosa A., Nieto J.J. Characterization of the
genes for the biosynthesis of the compatible solute ectoine in the moderately halophilic bacterium Halomonas elongata DSM 3043 // System. Appl. Microbiol. 1998.
V. 21. P. 487–497.
74. Carls R.A., Hanson R.S. Isolation and characterization of tricarboxylic acid cycle
mutants of Bacillus subtilis // J. Bacteriol. 1971. V. 106. P. 848–855.
75. Chanprateep S. Current trends in biodegradable polyhydroxyalkanoates (review) // J.
Biosci. Bioeng. 2010. V. 110. P. 621–632.
76. Chee J.-Y., Tan Y., Samian M.-R., Sudesh K. Isolation and characterization of a
Burkholderia sp. USM (JCM15050) capable of producing polyhydroxyalkanoate
(PHA) from triglycerides, fatty acids and glycerols // J. Polym. Environ. 2010. V. 18.
P. 584–592.
77. Chistoserdova L. Modularity of methylotrophy, revisited; minireview // Environ. Microbiol. 2011. V. 13. P. 2603–2622.
78. Chistoserdova L., Chen S.W., Lapidus A., Lidstrom M.E. Methylotrophy in Methylobacterium extorquens AM1 from a genomic point of view // J. Bacteriol. 2003. V.
185. P. 2980–2987.
79. Chistoserdova L., Crowther G.J., Vorholt J.A., Skovran E., Portais J.C., Lidstrom
M.E. Identification of a fourth formate dehydrogenase in Methylobacterium extorquens AM1 and confirmation of the essential role of formate oxidation in
methylotrophy // J. Bacteriol. 2007. V. 189. P. 9076–9081.
144
80. Christensen H., Bisgaard M., Frederiksen W., Mutters R., Kuhnert P., Olsen J.E. Is
characterization of a single isolate sufficient for valid publication of a new genus or
species? Proposal to modify Recommendation 30b of the Bacteriological Code (1990
Revision) // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2001. V. 51. P. 2221–2225.
81. Colby J., Zatman L.J. Regulation of citrate synthase activity in methylotrophs by reduced nicotinamide-adenine dinucleotide, adenine nucleotides and 2-oxoglutarate //
Biochem. J. 1975. V. 150. P. 141–144.
82. Collins M.D. Analysis of isoprenoid quinines // Method. Microbiol. Ed. Gottschalk
G. N.Y.: Acad. Press., 1985. V. 18. P. 329–366.
83. Csonka L.N. Physiological and genetic responses of bacteria to osmotic stress // Microbiol. Rev. 1989. V. 53. P. 121–147.
84. Da Costa M.S., Albuquerque L., Nobre M.F., Wait R. The Identification of fatty acids in bacteria // Method microbiol. 2011. V. 38. P. 183–196. doi 10.1016/B978-0-12387730-7.00008-5.
85. Da Costa M.S., Santos H., Galinski E.A. An overview of the role and diversity of
compatible solutes in Bacteria and Archaea // Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 1998.
V. 61. P. 117–153.
86. DasSarma S., DasSarma P. Halophiles and their enzymes: negativity put to good use
// Curr. Opin. Microbiol. 2015. V. 25. P. 120–126.
87. De Ley J., Cattoir H., Reynaerts A. The quantitative measurement of DNA hybridization from renaturation rates // Eur. J. Biochem. 1970. V. 12. P. 133–142.
88. De Roo G., Kellerhals M.B., Ren Q., Witholt B., Kessler B. Production of chiral R-3hydroxyalkanoic acids and R-3-hydroxyalkanoic acid methylesters via hydrolytic
degradation of polyhydroxyalkanoate synthesized by Pseudomonads // Biotechnol.
Bioeng. 2002. V. 77. P. 717–722.
89. De Smet W., De Loof K., De Vos P., Dawyndt P., De Baets B. Filtering and ranking
techniques for automated selection of high-quality 16S rRNA gene sequences // Syst.
Appl. Microbiol. 2013. V. 36. P. 549–559. doi: 10.1016/j.syapm.2013.09.001.
90. De Zwart J.M.M., Nelisse P.N., Kuenen J.G. Isolation and characterization of
Methylophaga sulfidovorans sp. nov.: an obligately methylotrophic, aerobic, dime-
145
thylsulfide oxidizing bacterium from a microbial mat // FEMS Microbiol. Ecol. 1996.
V. 20. P. 261–270.
91. De Zwart J.M.M., Nelisse, P.N., Kuenen, J.G. Methylophaga sulfidovorans sp. nov.
In List of New Names and new combinations previously effectively, but not validly,
published, Validation List no. 67 // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 1998. V. 48. P.
1083–1084.
92. Dedysh S.N., Smirnova K.V., Khmelenina V.N., Suzina N.E., Liesack W., Trotsenko
Y.A. Methylotrophic autotrophy in Beijerinckia mobilis // J. Bacteriol. 2005. V. 187.
P. 3884–3888.
93. Delaney N.F., Kaczmarek M.E., Ward L.M., Swanson P.K., Lee M.-C., Marx C.J.
Development of an optimized medium, strain and high-throughput culturing methods
for
Methylobacterium
extorquens
//
PloS
One.
2013.
V.
8.
e62957.
doi:10.1371/journal.pone.0062957.
94. Deyhle R.R., Barton L.L. Nicotinamide adeninedinucleotide – independent phlei //
Can. J. Microbiol. 1977. V. 23. P. 125–130.
95. Dixon G.H., Kornberg H.L. Assay methods for key enzymes of the glyoxylate cycle
// Proceedings of the biochemical society. 1959. P. 3.
96. Doi Y., Kunioka M., Nakamura Y., Soga K. Conformational analysis of poly (βhydroxybutyrate) in Alcaligenes eutrophus by solid-state
13
C NMR spectroscopy //
Macromol. Chem. Rapid Commun. 1986. V. 7. P. 661–664.
97. Domínguez-Ferreras A., Muñoz S., Olivares J., Soto M.J., Sanjuán J. Role of potassium uptake systems in Sinorhizobium meliloti osmoadaptation and symbiotic performance // J. Bacteriol. 2009. V. 191. P. 2133–2143.
98. Donaldson K., Tran L., Jimenez L.A., Duffin R., Newby D.E., Mills N., MacNee W.,
Stone V. Combustion-derived nanoparticles: a review of their toxicology following
inhalation exposure // Part. Fibre Toxicol. 2005. V. 2. doi: 10.1186/1743-8977-2-10.
99. Doronina N.V., Braus-Strohmeyer S.A., Leisinger T., Trotsenko Y.A. Isolation and
characterization of a new facultatively methylotrophic bacterium: description of
Methylorhabdus multivorans gen. nov., sp. nov. // Syst. Appl. Microbiol. 1995. V. 18.
P. 92–98.
146
100. Doronina N.V., Darmaeva T.D., Trotsenko Y.A. Methylophaga alcalica sp. nov., a
novel alkaliphilic and moderately halophilic, obligately methylotrophic bacterium
from an East Mongolian soda lake // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2003a. V. 53. P.
223–229.
101. Doronina N.V., Darmaeva T.D., Trotsenko Y.A. Methylophaga natronica sp. nov., a
new alcaliphilic and moderately halophilic, restricted-facultatively methylotrophic
bacterium from soda lake of the Southern Transbaikal Region // Syst. Appl. Microbiol. 2003b. V. 26. P. 382–389.
102. Doronina N.V., Gogleva A.A., Trotsenko Y.A. Methylophilus glucosoxydans
sp. nov., a restricted facultative methylotroph from rice rhizosphere // Int. J. Syst.
Evol. Microbiol. 2012. V. 62. P. 196–201.
103. Doronina N.V., Li T.D., Ivanova E.G., Trotsenko Y.A. Methylophaga muralis sp.
nov. in List of New Names and new combinations previously effectively, but not validly, published, validation list no. 138 // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2011. V. 61. P.
475–476.
104. Doronina N.V., Poroshina M.N., Kaparullina E.N., Ezhov V.A., Trotsenko Yu.A.
Methyloligella halotolerans gen. nov., sp. nov. and Methyloligella solikamskensis
sp. nov., two non-pigmented halotolerant obligately methylotrophic bacteria isolated
from the Ural saline environments // Syst. Appl. Microbiol. 2013. V. 36. P. 148–154.
105. Doronina N.V., Trotsenko Y.A., Krausova V.I., Boulygina E.S., Tourova T.P.
Methylopila capsulata gen. nov., sp. nov., a novel non-pigmented aerobic facultatively methylotrophic bacterium // Int. J. Syst. Bacteriol. 1998. V. 48. P. 1313–1321.
106. Doronina N.V., Trotsenko Y.A., Tourova T.P. Methylarcula marina gen. nov., sp.
nov. and Methylarcula terricola sp. nov.: novel aerobic, moderately halophilic, facultatively methylotrophic bacteria from coastal saline environments // Int. J. Syst. Evol.
Microbiol. 2000. V. 50. P. 1849–1859.
107. Doronina N.V., Trotsenko Y.A., Tourova T.P., Kuznetsov B.B., Leisinger T. Albibacter methylovorans gen. nov., sp. nov., a novel aerobic, facultatively autotrophic
and methylotrophic bacterium that utilizes dichloromethane // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2001. V. 51. P. 1051–1058.
147
108. Doronina N.V., Trotsenko Y.A. Reclassification of 'Blastobacter viscosus' 7d and
'Blastobacer aminooxidans' 14a as Xanthobacter viscosus sp. nov. and Xanthobacter
aminoxidans sp. nov. // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2003. V. 53. P. 179–182.
109. Dunstan P.M., Anthony C., Drabble W.T. Microbial metabolism of C1 and C2 compounds. The role of glyoxylate, glycolate and acetate in the growth of Pseudomonas
AM1 on ethanol and on C1 compounds // Biochem. J. 1972. V. 128. P. 107–115.
110. Egorov A.M., Avilova T.V., Dikov M.M., Popov V.O., Rodionov Y.V., Berezin I.V.
NAD+-dependent formate dehydrogenase from methylotrophic bacterium strain 1.
Purification and characterization // Eur. J. Biochem. 1979. V. 99. P. 569–576.
111. Elliot W.H., Kaplan N.O. In: Methods in Enzymol / Eds. Colowick S.P., Kaplan N.O.
N.Y.: Acad. Press., 1955. V. 11. P. 337.
112. Empadinhas N., Da Costa M.S. Osmoadaptation mechanisms in prokaryotes: distribution of compatible solutes // Int. Microbiol. 2008. V. 11. P. 151–161.
113. Erb T.J., Berg I.A., Brecht V., Muller M., Fuchs G., Alber B.E. Synthesis of C5dicarboxylic acids from C2-units involving crotonyl-CoA carboxylase/reductase: The
ethylmalonyl-CoA pathway // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2007. V. 104. P. 10631–
10636.
114. Ferenci T., Strom T., Quayle J.R. Purification and properties of 3-hexulose phosphate
synthase and phospho-3-hexuloisomerase from Methylococcus capsulatus // Biochem. J. 1974. V. 144. P. 477–486.
115. Firsova J., Doronina N., Lang E., Spröer C., Vuilleumier S., Trotsenko Y. Ancylobacter dichloromethanicus sp. nov. – a new aerobic facultatively methylotrophic bacterium utilizing dichloromethane // Syst. Appl. Microbiol. 2009. V. 32. P. 227–232.
116. Föllner C.G., Babel W., Valentin H.E. Steinbüchel A. Expression of polyhydroxyalkanoic-acid-biosynthesis genes in methylotrophic bacteria relying on the ribulose
monophosphate pathway // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1993. V. 40. P. 284–291.
117. Föllner C.G., Mueller S., Steinbüchel A., Babel W. Biosynthesis of poly-3hydroxybutyric acid by the facultatively methanol-assimilating bacterium Mycoplana
rubra B346 and recombinant strains // J. Basic Microbiol. 2007. V. 35. P. 179–188.
148
118. Fukui T., Doi Y. Efficient production of polyhydroxyalkanoates from plant oils by
Alcaligenes eutrophus and its recombinant strain // Appl. Microbiol. Biotechnol.
1998. V. 49. P. 333–336.
119. Galia M.B. Isolation and analysis of storage compounds. In Handbook of Hydrocarbon and Lipid Microbiology; Timmis, K.N., Ed.; Springer: Berlin/Heidelberg, Germany. 2010. P. 3725–3741.
120. Galinski E.A. Osmoadaptation in Bacteria // Adv. Microb. Physiol. 1995. V. 37. P.
273–328.
121. Galinski
E.A.,
Pfeiffer
H.P.,
Trüper
H.G.
1,4,5,6-Tetrahydro-2-methyl-4-
pyrimidinecarboxylic acid. A novel cyclic amino acid from halophilic phototrophic
bacteria of the genus Ectothiorhodospira // Eur. J. Biochem. 1985. V. 149. P. 135–
139.
122. Garcia-Estepa R., Argandona M., Reina-Bueno M., Capote N., Iglesias-Guerra F.,
Nieto J.J., Vargas C. The ectD gene, which is involved in the synthesis of the compatible solute hydroxyectoine, is essential for thermoprotection of the halophilic bacterium Chromohalobacter salexigens // J. Bacteriol. 2006. V. 188. P. 3774–3784.
123. Ghosh W., Bagchi A., Mandal S., Dam B., Roy P. Tetrathiobacter kashmirensis
gen. nov., sp. nov., a novel mesophilic, neutrophilic, tetrathionate-oxidizing, facultatively chemolithotrophic betaproteobacterium isolated from soil from a temperate orchard in Jammu and Kashmir, India // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2005. V. 55. P.
1779–1787.
124. Gibello A., Vela A.I., Martín M., Barra-Caracciolo A., Grenni P., FernándezGarayzábal J.F. Reclassification of the members of the genus Tetrathiobacter Ghosh
et al. 2005 to the genus Advenella Coenye et al. 2005 // Int. J. Syst. Evol. Microbiol.
2009. V. 59. P. 1914–1918.
125. Glaeser S.P., Kämpfer P. Multilocus sequence analysis (MLSA) in prokaryotic taxonomy // System. Appl. Microbiol. V. 38. 2015. P. 237–245.
126. Gliesche C., Fesefeldt A., Hirsch P. Genus Hyphomicrobium Stutzer and Hartleb
1898, 76AL, in: Brenner, D.J., Krieg, N.R., Staley, J.T. (Eds.), Bergey’s manual of
systematic bacteriology, V. 2, 2nd ed, Springer, New York, 2005. P. 476–494.
149
127. Göller K., Galinski E.A. Protection of a model enzyme (lactate dehydrogenase)
against heat, urea and freeze-thaw treatment by compatible solute additives // J. Mol.
Catal. B: Enzymatic. 1999. V. 7. P. 37–45.
128. Gomez J.G.C., Mèndez B.S., Nikel P.I., Pettinari M.J., Prieto M.A., Silva L.F. Ed M.
Petre. Making green polymers even greener: towards sustainable production of polyhydroxyalkanoates from agroindustrial by-products // Adv. Appl. Biotechnol.,
inTech, Croatia. 2012. P. 41–62.
129. Gordon S.A., Weber R.P. Colorimetric estimation of indoleacetic acid // Plant Physiol. 1951. V. 26. P. 192–195.
130. Govorukhina N.I., Trotsenko Y.A. Methylovorus, a new genus of restricted facultatively methylotrophic bacteria // Int. J. Syst. Bacteriol. 1991. V. 41. P. 158–162.
131. Graf R., Anzali S., Buenger J., Pfluecker F., Driller H. The multifunctional role of ectoine as a natural cell protectant // Clin. Dermatol. 2008. V. 26. P. 326–333.
132. Grage K., Jahns A.C., Parlane N., Palanisamy R., Rasiah I. A., Atwood J.A., Rehm
B.H.A. Bacterial polyhydroxyalkanoate granules: biogenesis, structure, and potential
use as nano-/micro-beads in biotechnological and biomedical applications // Biomacromolecules. 2009. V.10. P. 660–669.
133. Greenberg D.E., Porcella S.F., Stock F., Wong A., Conville P.S., Murray P.R., Holland S.M., Zelazny A.M. Granulibacter bethesdensis gen. nov., sp. nov., a distinctive
pathogenic acetic acid bacterium in the family Acetobacteraceae // Int. J. Syst. Evol.
Microbiol. 2006. V. 56. P. 2609–2616.
134. Grothe E., Moo-Young M., Chisti Y. Fermentation optimization for the production of
poly(beta-hydroxybutyric acid) microbial thermoplastic // Enzyme Microb. Technol.
1999. V. 25. P. 132–141.
135. Guthrie P.A.I., Magill C.W., Frederiksen R.A., Odvody G.N. Random amplified polymorphic DNA markers: a system for identifying and differentiating isolates of
Colletotrichum graminicola // Phytopathology. 1992. V. 82. 832–835.
136. Haas R., Jin B., Zepf F.T. Production of poly(3-hydroxybutyrate) from waste potato
starch // Biosci. Biotechnol. Biochem. 2008. V. 72. P. 253–256.
150
137. Han T.X., Han L.L., Wu L.J., Chen W.F., Sui X.H., Gu J.G., Wang E.T., Chen W.X.
Mesorhizobium gobiense sp. nov. and Mesorhizobium tarimense sp. nov., isolated
from wild legumes growing in desert soils of Xinjiang, China // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2008. V. 58. P. 2610–2618.
138. Handel E. Direct microdetermination of sucrose // Anal. Biochem. 1968. V. 22. P.
280.
139. Handrick R., Reinhardt S., Schultheiss D., Reichart T., Schüler D., Jendrossek V.,
Jendrossek D. Unraveling the function of the Rhodospirillum rubrum activator of
polyhydroxybutyrate (PHB) degradation: the activator is a PHB-granule-bound protein (phasin) // J. Bacteriol. 2004. V. 186. P. 2466–2475.
140. Hanson A.D., Roje S. One-carbon metabolism in higher plants // Annu. Rev. Plant
Physiol. Plant Mol. Biol. 2001. V. 52. P. 119–137.
141. Heermann R., Jung K. Structural features and mechanisms for sensing high osmolarity in microorganisms // Curr. Opin. Microbiol. 2004. V. 7. P. 168–174.
142. Heinrich U., Garbe B., Tronnier H. In vivo assessment of ectoin: a randomized, vehiclecontrolled clinical trial // Skin Pharmacol. Physiol. 2007. V. 20. P. 211 –218.
143. Hilyard E.J., Jones-Meehan J.M., Spargo B.J., Hill R.T. Enrichment, isolation, and
phylogenetic identification of polycyclic aromatic hydrocarbon-degrading bacteria
from Elizabeth river sediments // Appl. Env. Microbiol. 2008. V. 74. P. 1176–1182.
144. Hiraishi A., Urata K., Satoh T. A new genus of marine budding phototrophic bacteria,
Rhodobium gen. nov., which includes Rhodobium orientis sp. nov. and Rhodobium
marinum comb. nov. // Int. J. Syst. Bacteriol. 1995. V. 45. P. 226–234.
145. Hirsch P. Genus Hyphomicrobium Stutzer and Hartleb 1898, 76AL In: J.T. Staley,
M.P. Bryant, N. Pfennig, J.G. Holt (eds), Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, first edition, vol. 3, The Williams & Wilkins Co., Baltimore, 1989. P. 1895–1904.
146. Höeppner A., Widderich N., Lenders M., Bremer E., Smits S. H. Crystal structure of
the ectoine hydroxylase: a snapshot of the active site // J. Biol. Chem. 2014. V. 289.
P. 29570–29583. doi: 10.1074/jbc.M114.576769.
151
147. Höfer P., Choi Y.J., Osborne M.J., Miguez C.B., Vermette P., Groleau D. Production
of functionalized polyhydroxyalkanoates by genetically modified Methylobacterium
extorquens strains // Microb. Cell Fact. 2010. V. 9. doi: 10.1186/1475-2859-9-70.
148. Höfer P., Vermette P., Groleau D. Production and characterization of polyhydroxyalkanoates by recombinant Methylobacterium extorquens: Combining desirable thermal
properties with functionality // Biochem. Eng. J. 2011. V. 54. P. 26–33.
149. Holmes A.S., Kelly D.P., Baker S.C., Thomson A.S., De Marco P., Kenna E.M.,
Murrell J.C. Methylosulfonomonas methylovora gen. nov., sp. nov., and Marinosulfonomonas methylotropha gen. nov., sp. nov.: novel methylotrophs able to grow on
methanesulfonic acid // Arch. Microbiol. 1997. V. 167. P. 46–53.
150. Hölscher T., Breuer U., Adrian L., Harms H., Maskow T. Production of the chiral
compound (R)-3-hydroxybutyrate by a genetically engineered methylotrophic bacterium // Appl. Environ. Microbiol. 2010. V. 76. P. 5585–5591.
151. Höpner T., Trautwein A. Pseudomonas oxalaticus: requirement of a cosubstrate for
growth on formate // Arch. Mikrobiol. V. 77. P. 26–35.
152. Horneffer V., Haverkamp J., Janssen H.G., Steeg P.F., Notz R. MALDI-TOF-MS
analysis of bacterial spores: wet heat-treatment as a new releasing technique for biomarkers and the influence of different experimental parameters and microbiological
handling // J. Am. Soc. Mass. Spectrom. 2004. V. 15. P. 1444–1454.
153. Ibrahim M.H., Steinbüchel A. Zobellella denitrificans strain MW1, a newly isolated
bacterium suitable for poly(3-hydroxybutyrate) production from glycerol // J. Appl.
Microbiol. 2010. V. 108. P. 214–225.
154. Ibrahim M.H.A., Steinbüchel A. High-cell-density cyclic fed-batch fermentation of a
poly(3-hydroxybutyrate)-accumulating thermophile, Chelatococcus sp. strain MW10
// Appl. Environ. Microbiol. 2009. P. 6222–6231.
155. Ignatova Z., Gierasch L.M. Inhibition of protein aggregation in vitro and in vivo by a
natural osmoprotectant // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006. V. 103. P. 13357–13361.
156. Imhoff J.F., Süling J. The phylogenetic relationship among Ectothiorhodospiraceae:
a reevaluation of their taxonomy on the basis of 16S rDNA analyses // Arch. Microbiol. 1996. V. 165. P. 106–113.
152
157. Ivanova E., Doronina N., Trotsenko Y. Hansschlegelia plantiphila gen. nov. sp. nov.,
a new aerobic restricted facultative methylotrophic bacterium associated with plants
// Syst. Appl. Microbiol. 2007. V. 30. P. 444–452.
158. Janvier M., Frehel C., Grimont F., Gasser F. Methylophaga marina gen. nov.,
sp. nov. and Methylophaga thalassica sp. nov., marine methylotrophs // Int. J. Syst.
Bacteriol. 1985. V. 35. P. 131–139.
159. Janvier M., Regnault B., Grimont P. Development and use of fluorescent 16S RNAtargeted probes for the specific detection of Methylophaga species by in situ hybridization in marine sediments // Res. Microbiol. 2003. V. 154. P. 483–490.
160. Johnson P.A., Quayle J.R. Microbial growth on C1-compounds. Oxidation of methanol, formaldehyde and formate by methanol-grown Pseudomonas AM1 // Biochem.
J. 1964. V. 93. P. 281–290.
161. Jossek R., Reihelt R., Steinbüchel A. In vitro biosynthesis of poly(3-hydroxybutyric
acid) by using purified poly(hydroxyalkanoic acid) synthase of Chromatium vinosum
// Appl. Microbiol. Biotechnol. 1998. V. 49. P. 258–266.
162. Jung Y.M., Lee Y.H. Utilization of oxidative pressure for enhanced production of
poly-β-hydroxybutyrate and poly(3-hydroxybutyrate-3-hydroxyvalerate) in Ralstonia
eutropha // J. Biosci. Bioeng. 2000. V. 90. P. 266–270.
163. Kadouri D., Jurkevitch E., Okon Y., Castro-Sowinski S. Ecological and agricultural
significance of bacterial polyhydroxyalkanoates // Crit. Rev. Microbiol. 2005. V. 31.
P. 55–67.
164. Kalyuzhnaya M.G., Beck D.A.C., Vorobev A., Smalley N., Kunkel D.D., Lidstrom
M.E., Chistoserdova L. Novel methylotrophic isolates from lake sediment, description of Methylotenera versatilis sp. nov. and emended description of the genus
Methylotenera // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2012. V. 62. P. 106–111.
165. Kalyuzhnaya M.G., Bowerman S., Lara J.C., Lidstrom M.E., Chistoserdova L.
Methylotenera mobilis gen. nov., sp. nov., an obligately methylamine-utilizing bacterium within the family Methylophilaceae // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2006. V. 56.
P. 2819–2823.
153
166. Kalyuzhnaya M.G., De Marco P., Bowerman S., Pacheco C.C., Lara J.C., Lidstrom
M.E., Chistoserdova L. Methyloversatilis universalis gen. nov., sp. nov., a novel taxon within the Betaproteobacteria represented by three methylotrophic isolates // Int.
J. Syst. Evol. Microbiol. 2006. V. 56. P. 2517–2522.
167. Kalyuzhnaya M.G., Lidstrom M.E., Chistoserdova L. Utility of environmental primers targeting ancient enzymes: methylotroph detection in Lake Washington // Microb. Ecol. 2004. V. 48. P. 463–472.
168. Kalyuzhnaya M.G., Nercessian O., Lidstrom M.E., Chistoserdova L. Development
and application of polymerase chain reaction primers based on fhcD for environmental detection of methanopterin-linked C1-metabolism in bacteria // Environ. Microbiol. 2005. V. 7. P. 1269–1274.
169. Kanapathipillai M., Ku S.H., Girigoswami K., Park C.B. Small stress molecules inhibit aggregation and neurotoxicity of prion peptide 106–126 // Biochem. Biophys.
Res. Commun. 2008. V. 365. P. 808–813.
170. Kanapathipillai M., Lentzen G., Sierks M., Park C.B. Ectoine and hydroxyectoine inhibit aggregation and neurotoxicity of Alzheimer's beta-amyloid // FEBS Lett. 2005.
V. 579. P. 4775–4780.
171. Kashiwaya Y., Takeshima T., Mori N., Nakashima K., Clarke K., Veech R.L. d-βhydroxybutyrate protects neurons in models of Alzheimer's and Parkinson's disease //
Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000 V. 97. P. 5440–5444.
172. Kawata Y., Aiba S. Poly(3-hydroxybutyrate) Production by isolated Halomonas sp.
K M-1 using waste glycerol // Biosci. Biotechnol. Biochem. 2010. V. 74. P. 175–177.
173. Kempf B., Bremer E. Uptake and synthesis of compatible solutes as microbial stress
responses to high osmolality environments // Arch. Microbiol. 1998. V. 170. P. 319–
330.
174. Khanna S., Srivastava A.K. Recent advances in microbial polyhydroxyalkanoates //
Process Biochem. 2005. V. 40. P. 607–619.
175. Khosravi-Darani K., Mokhtari Z.B., Amai T., Tanaka K. Microbial production of
poly(hydroxybutyrate) from C1 carbon sources // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2013.
V. 97. P. 1407–1424.
154
176. Kiefer P., Portais J.C., Vorholt J.A. Quantitative metabolome analysis using liquid
chro-matography high-resolution mass spectrometry // Anal. Biochem. 2008. V. 382.
P. 94–100.
177. Kim B.S., Lee S.C., Lee S.Y., Chang H.N., Chang Y.K., Woo S.I. Production of poly
(3-hydroxybutyric acid, by fed-batch culture of Alcaligenes eutrophus with glucose
concentration control // Biotechnol. Bioeng. 1994. V. 43. P. 892–898.
178. Kim H.G., Doronina N.V., Trotsenko Y.A., Kim S.W. Methylophaga aminisulfidivorans sp. nov., a restricted facultatively methylotrophic marine bacterium // Int. J.
Syst. Evol. Microbiol. 2007. V. 57. P. 2096–2101.
179. Kim M., Oh H.-S., Park S.-C., Chun J. Towards a taxonomic coherence between average nucleotide identity and 16S rRNA gene sequence similarity for species demarcation of prokaryotes // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2014. V. 64. P. 346–351.
180. Kim S.W., Kim P., Lee H.S., Kim J.H. High production of poly-β-hydroxybutyrate
(PHB) from Methylobacterium organophilum under potassium limitation // Biotechnol Lett. 1996. V. 18. P. 25–30.
181. Klähn S., Hagemann M. Compatible solute biosynthesis in cyanobacteria // Env. Microbiol. 2011. V. 13. P. 551–562.
182. Kocharin K., Nielsen J. Specific growth rate and substrate dependent polyhydroxybutyrate production in Saccharomyces cerevisiae // AMB Express. 2013. V. 3. doi:
10.1186/2191-0855-3-18.
183. Kornberg A., Horecker B.L. Glucose-6-phosphate dehydrogenase. In: Methods in
Enzymol. 1955. V. 1. P. 323.
184. Korotkova N., Lidstrom M.E. Connection between poly-β-hydroxybutyrate biosynthesis and Growth on C1 and C2 compounds in the methylotroph Methylobacterium
extorquens AM1 // J. Bacteriol. 2001. V. 183. P. 1038–1046.
185. Korotkova N., Chistoserdova L., Kuksa V., Lidstrom M.E. Glyoxylate regeneration
pathway in the methylotroph Methylobacterium extorquens AM1 // J. Bacteriol. 2002. V. 184. P. 1750–1758.
155
186. Korotkova N., Lidstrom M.E., Chistoserdova L. Identification of genes involved in
the glyoxylate regeneration cycle in Methylobacterium extorquens AM1, including
two new genes, meaC and meaD // J. Bacteriol. 2005. V. 187. P. 1523–1526.
187. Kuhlmann A.U., Bremer E. Osmotically regulated synthesis of the compatible solute
ectoine in Bacillus pasteurii and related Bacillus spp. // Appl. Environ. Microbiol.
2002. V. 68. P. 772–783.
188. Kuhlmann A.U., Bursy J., Gimpel S., Hoffmann T., Bremer E. Synthesis of the compatible solute ectoine in Virgibacillus pantothenticus is triggered by high salinity and
low growth temperature // Appl. Environ. Microbiol. 2008. V. 74. P. 4560–4563.
189. Kuhlmann A.U., Hoffmann T., Bursy J., Jebbar M., Bremer E. Ectoine and hydroxyectoine as protectants against osmotic and cold stress: uptake through the SigBcontrolled betaine-choline-carnitine transporter-type carrier EctT from Virgibacillus
pantothenticus // J. Bacteriol. 2011. V. 193. P. 4699–4708.
190. Kuhlmann S.I., Terwisscha van Scheltinga A.C., Bienert R, Kunte H.J., Ziegler C.
1.55 Å structure of the ectoine binding protein TeaA of the osmoregulated TRAPtransporter TeaABC from Halomonas elongata // Biochemistry. 2008. V. 47. P.
9475–9485.
191. Kurz M. Compatible solute influence on nucleic acids: many questions but few answers. Review // Saline Systems. 2008.V. 4. doi:10.1186/1746-1448-4-6.
192. Lane D.J. 16S/23S rRNA sequencing. In Nucleic acid techniques in bacterial systematics. Eds.: Stackebrandt E., Goodfellow M. Chichester: John Wiley and Sons.
1991. P. 115–175.
193. Lapage S.P., Sneath P.H.A., Lessel E.F., Skerman V.B.D., Seeliger H.P.R., Clark
W.A. (eds). International Code of Nomenclature of Bacteria (1990 Revision). Bacteriological Code. Washington, DC: American Society for Microbiology, 1992.
194. Lara L.M., Huisman G.W. Metabolic engineering of poly (3-hydroxyalkanoates):
from DNA to plastic // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1999. V. 63. P. 21–53.
195. Lechevalier M.P., Prauser H., Labeda D.P., Ruan J.S. Two new genera of nocardioform actinomycetes: Amycolata gen. nov. and Amycolatopsis gen. nov. // Int. J. Syst.
Bacteriol. 1986. V. 36. P. 29–37.
156
196. Lee I.Y., Nam S.W., Choi E.S., Chang H.N., Park Y.H. Production of poly-βhydroxybutyrate and measurement related emzyme activities in Alcaligenes eutrophus // J. Ferment. Bioeng. 1993. V. 76. P. 416–418.
197. Lee J.H., Kim Y.S., Choi T.-J., Lee W.J., Kim Y.T. Paracoccus haeundaensis sp. nov.,
a gram-negative, halophilic, astaxanthin-producing bacterium // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2004. V. 54. P. 1699–1702.
198. Lee S.Y., Chang H.N. Effect of complex nitrogen source on the synthesis and accumulation of poly (3-hydroxybutyric acid) by recombinant Escherichia coli in flask
and fed-batch cultures // J. Environ. Polymer Degrad. 1994. V. 2. P. 169–176.
199. Lehmann K.B., Neumann R. Atlas und grundriss der bakteriologie und lehrbuch der
speciellen bakteriologischen diagnostik, 1st ed., J.F. Lehmann, München, 1896.
200. Lemoigne M. Products of dehydration and of polymerization of β-hydroxybutyric acid // Bull. Soc. Chem. Biol. 1926. V. 8. P. 770–782.
201. Lentzen G., Schwarz T. Extremolytes: natural compounds from extremophiles for
versatile applications // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2006. V. 72. P. 623–634.
202. Lidstrom M.E., Stirling D. Methylotrophs: genetics and commercial applications //
Ann. Rev. Microbiol. 1990. V. 44. P. 27–58.
203. Lòpes M.S.G., Rocha R.C.S., Zanotto S.P., Cabrera Gomez J.G., Ferreira da Silva L.
Screening of bacteria to produce polyhydrohyalcanoate from xylose // World J. Microbiol. Biotechnol. 2009. V. 25. P. 1751–1756.
204. Louis P., Galinski E.A. Characterization of genes for the biosynthesis of the compatible solute ectoine from Marinococcus halophilus and osmoregulated expression in
Escherichia coli // Microbiology. 1997. V. 143. P. 1141–1149.
205. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with the
Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 1951. V. 193. P. 265–275.
206. Lu J., Takahashi A., Ueda S. 3-Hydroxybutyrate oligomer hydrolase and 3hydroxybutyrate dehydrogenase participate in intracellular polyhydroxybutyrate and
polyhydroxyvalerate degradation in Paracoccus denitrificans // Appl. Environ. Microbiol. 2014. V. 80. P. 986–993.
157
207. Lu J., Tappel R.C., Nomura C.T. Mini-review: Biosynthesis of poly (hydroxyalkanoates) // Polym. Rev. 2009. V. 49. P. 226–248.
208. Lu J., Takahashi A., Ueda S. 3-Hydroxybutyrate oligomer hydrolase and 3hydroxybutyrate dehydrogenase participate in intracellular polyhydroxybutyrate and
polyhydroxyvalerate degradation in Paracoccus denitrificans // Appl. Environ. Microbiol. 2014. V. 80. P. 986–993.
209. Luizier W.D. Materials derived from biomass/biodegradable materials // Proc. Natl.
Acad. Sci. USA. 1992. V. 8. P. 379–383.
210. Maden B.E.H. Tetrahydrofolate and tetrahydromethanopterin compared: functionally
distinct carriers in C1 metabolism // Biochem. J. 2000. V. 350. P. 609–629.
211. Madhaiyan M., Poonguzhali S., Kwon S.-W., Sa T.-M. Methylophilus rhizosphaerae
sp. nov., a restricted facultative methylotroph isolated from rice rhizosphere soil //
Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2009. V. 59. P. 2904–2908.
212. Madhaiyan M., Poonguzhali S., Ryu J., Sa T. Regulation of ethylene level in canola
(Brassica campestris) by 1-aminocyclopropane-l-carboxylate deaminase containing
Methylobacterium fujisawaense // Planta. 2006. V. 224. P. 268–278.
213. Marison I.W., Attwood M.M. A possible alternative mechanism of the oxidation of
formaldehyde to formate // J. Gen. Microbiol. 1982. V. 128. P. 1441–1446.
214. Marmur J.A. A procedure for the isolation of deoxyribonucleic acid from microorganisms // J. Mol. Biol. 1961. V. 3. P. 208–218.
215. McDonald I.R., Murrell J.C. The methanol dehydrogenase structural gene mxaF and
its use as a functional gene probe for methanotrophs and methylotrophs // Appl. Environ. Microbiol. 1997. V. 63. P. 3218–3224.
216. Meers J.L., Tempest D.W., Brown C.M. Glutamine (amide): α-oxoglutarate aminotransferase oxidoreductase (NADP) an enzyme involved in biosynthesis of glutamate by some bacteria // J. Gen. Microbiol. 1970. V. 64. P. 187–194.
217. Meier-Kolthoff J.P., Klenk H.-P., Göker M. Taxonomic use of DNA G+C content
and DNA-DNA hybridization in the genomic age // Int. J. Syst. Evol. Microbiol.
2014. V. 64. P. 352–356.
158
218. Mesbah N.M., Whitman W.B., Mesbah M. Determination of the G+C content of prokaryotes. In Taxonomy of Prokaryotes, pp. 299–324. Edited by F. Rainey, A. Oren.
Waltham, MA: Academic Press, 2011.
219. Mokhtari-Hosseini Z.B., Vasheghani-Farahani E., Shojaosadati S.A., Karimzade R.,
Khosravi-Darani K. Media selection for poly(hydroxybutyrate) production from
methanol by Methylobacterium extorquens DSMZ 1340 // Iran. J. Chem. Chem. Eng.
2009. V. 28. P. 45–52.
220. Moosvi S.A., McDonald I.R., Pearce D.A., Kelly D.P., Wood A.P. Molecular detection and isolation from Antarctica of methylotrophic bacteria able to grow with
methylated sulfur compounds // Syst. Appl. Microbiol. 2005. V. 28. P. 541–554.
221. Murrell J.C., McDonald I.R. Methylotrophy. In: Lederberg J. (ed) Encyclopedia of
microbiology. 2nd edn. Academic Press: London; 2000. V. 3. P. 245–255.
222. Nanatani K., Shijuku T., Takano Y., Zulkifli L., Yamazaki T., Tominaga A., Souma
S., Onai K., Morishita M., Ishiura M., Hagemann M., Suzuki I., Maruyama H., Arai
F., Uozumia N. Comparative analysis of kdp and ktr mutants reveals distinct roles of
the potassium transporters in the model Cyanobacterium synechocystis sp. strain PCC
6803 // J. Bacteriol. 2015. V. 197. P. 676–687.
223. Nemecek-Marshall M., MacDonald R.C., Franzen J.J., Wojciechowski C.L., Fall R.
Methanol emission from leaves (enzymatic detection of gas-phase methanol and relation of methanol fluxes to stomatal conductance and leaf development) // Plant Physiol. 1995. V. 108. P. 1359–1368.
224. Nercessian O., Kalyuzhnaya M.G., Joye S.B., Lidstrom M.E., Chistoserdova L.
Analysis of fae and fhcD genes in Mono Lake, California // Appl. Environ. Microbiol. 2005. V. 71. P. 8949–8953.
225. Nierman W.C., DeShazer D., Kim H.S., Tettelin H., Nelson K.E., Feldblyum T., Ulrich R.L., Ronning C.M., Brinkac L.M., Daugherty S.C., Davidsen T.D., Deboy R.T.,
Dimitrov G., Dodson R.J., Durkin A.S., Gwinn M.L., Haft D.H., Khouri H., Kolonay
J.F., Madupu R., Mohammoud Y., Nelson W.C., Radune D., Romero C.M., Sarria S.,
Selengut J., Shamblin C., Sullivan S.A., White O., Yu Y., Zafar N., Zhou L., Fraser
159
C.M. Structural flexibility in the Burkholderia mallei genome // Proc. Natl. Acad.
Sci. USA. 2004. V. 28. P. 14246–14251.
226. Oren A. Bioenergetic aspects of halophilism // Microbiol. Mol.Biol. Rev. 1999. V.
63. P. 334–348.
227. Oren A., Garrity G.M. List of new names and new combinations previously effectively, but not validly, published: Validation List no. 156 // Int. J. Syst. Evol. Microbiol.
2014a. V. 64. P. 693–696.
228. Oren A., Garrity G.M. List of new names and new combinations previously effectively, but not validly, published: Validation List no. 157 // Int. J. Syst. Evol. Microbiol.
2014b. V. 64. P. 1455–1458.
229. Oren A., Heldal M., Norland S., Galinski E. Intracellular ion and organic solute concentration of the extremely halophilic bacterium Salinibacter ruber // Extremophiles.
2002. V. 6. P. 491–498.
230. Ostafin M., Haber J., Doronina N.V., Sokolov A.P., Trotsenko Y.A. Methylobacterium extorquens strain P14, a new methylotrophic bacteria producing poly-betahydroxybutyrate (PHB) // Acta Microbiol. Pol. 1999. 48. P. 39–51.
231. Owen R.J., Lapage S.P. The thermal denaturation of partly purified bacterial deoxyribonucleic acid and its taxonomic applications // J. Appl. Bacteriol. 1976. V. 41. P.
335–340.
232. Page W.J. Production of poly-β-hydroxybutyrate by Azotobacter vinelandii strain
UWD during growth on molasses and other complex carbon sources // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1989. V. 31. P. 329–333.
233. Page W.J., Knosp O. Hyperproduction of poly-β-hydroxybutyrate during exponential
growth of Azotobacter vinelandii UWD // Appl. Environ. Microbiol. 1989. V. 55. P.
1334–1339.
234. Pastor J.M., Salvador M., Argandoña M., Bernal V., Reina-Bueno M., Csonka L.N.,
Iborra J.L., Vargas C., Nieto J.J., Cánovas M. Ectoines in cell stress protection: uses
and biotechnological production // Biotechnol. Adv. 2010. V. 28. P. 782–801.
235. Patt T.E., Cole G.C., Hanson R.S. Methylobacterium, a new genus of facultatively
methylotrophic bacteria // Int. J. Syst. Bacteriol. 1976. V. 26. P. 226–229.
160
236. Pech T., Ohsawa I., Praktiknjo M., Overhaus M, Wehner S., von Websky M., AbuElmagd K., van Echten-Deckert G., Kalff J.C., Schaefer N. A natural tetrahydropyrimidine, ectoine, ameliorates ischemia reperfusion injury after intestinal transplantation in rats // Pathobiology. 2013. V. 80. P. 102–110.
237. Peel B.D., Quayle J.R. Microbial growth on C1 compounds. Isolation and characterization of Pseudomonas AM1 // Biochem. J. 1961. V. 81. P. 465–469.
238. Peña C., Castillo T., García A., Millán M., Segura D. Biotechnological strategies to
improve production of microbial poly-(3-hydroxybutyrate): a review of recent research work // Microbiol. Biotechnol. 2014. V. 7. P. 278–293.
239. Peplinski K., Ehrenreich A., Döring C., Bömeke M., Reinecke F., Hutmacher C.,
Steinbüchel A. Genome-wide transcriptome analyses of the “Knallgas” bacterium
Ralstonia eutropha H16 with regard to polyhydroxyalkanoate metabolism // Microbiol. 2010. V. 156. P. 2136–2152.
240. Peyraud R., Kiefer P., Christen P., Massou S., Portais J.-C., Vorholt J.A. Demonstration of the ethylmalonyl-CoA pathway using 13C metabolomics // Proc. Natl. Acad.
Sci. USA. 2009. V. 106. P. 4846–4851.
241. Pflüger K., Müller V. Transport of compatible solutes in extremophiles // J. Bioenerg.
Biomembr. 2004. V. 36. P. 17–24.
242. Poirier Y. Production of polyesters in transgenic plants // Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 2001. V. 71. P. 209–240.
243. Poolman B., Glaasker E. Regulation of compatible solutes accumulation in bacteria //
Mol. Microbiol. 1998. V. 29. P. 397–407.
244. Poroshina M.N., Trotsenko Yu.A., Doronina N.V. Methylobrevis pamukkalensis
gen. nov., sp. nov., a halotolerant restricted facultative methylotroph isolated from saline water // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2015. V. 65. P. 1321–1327.
245. Pötter M., Müller H., Reinecke F., Wieczorek R., Fricke F., Bowien B., Friedrich B.,
Steinbüchel A. The complex structure of polyhydroxybutyrate (PHB) granules: four
orthologous and paralogous phasins occur in Ralstonia eutropha // Microbiology.
2004. V. 150. P. 2301–2311.
161
246. Rabe J.H., Mamelak A.J., McElgunn P.J.S., Morison W.L., Sauder D.N. Photoaging:
mechanisms and repair // J. Am. Acad. Dermatol. 2006. V. 55. P. 1–19.
247. Rai R., Keshavarz T., Roether J.A., Boccaccini A.R., Roy I. Medium chain length
polyhydroxyalkanoates, promising new biomedical materials for the future // Mater.
Sci. Eng. R. Rep. 2011. V. 72. P. 29–47.
248. Rainey F.A., Oren A. In: Taxonomy of Prokaryotes, 1st Edn. Eds.: Harwood C.,
Wipat A. // Methods in Microbiol. 2011. V. 39. P. 486.
249. Ramasamy D., Mishra A.K., Lagier J.-C., Padhmanabhan R., Rossi M., Sentausa E.,
Raoult D., Fournier P.-E. A polyphasic strategy incorporating genomic data for the
taxonomic description of novel bacterial species // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2014.
V. 64. P. 384–391.
250. Ratledge C., Kristiansen B. Basic Biotechnology, 2nd ed.; Cambridge University
Press: Cambridge, UK, 2001.
251. Rehm B.H.A. Polyester synthases: natural catalysts for plastics: review article // Biochem. J. 2003. V. 376. P.15–33.
252. Remenant B., Coupat-Goutaland B., Guidot A., Cellier G., Wicker E., Allen C., Fegan M., Pruvost O., Elbaz M., Calteau A., Salvignol G., Mornico D., Mangenot S.,
Barbe V., Médigue C., Prior P. Genomes of three tomato pathogens within the Ralstonia solanacearum species complex reveal significant evolutionary divergence //
BMC Genomics. 2010. V. 11. P. 379. doi: 10.1186/1471-2164-11-379.
253. Reshetnikov A.S., Khmelenina V.N., Trotsenko Y.A. Characterization of the ectoine
biosynthesis genes of haloalkalotolerant obligate methanotroph “Methylomicrobium
alcaliphilum 20Z” // Arch. Microbiol. 2006. V. 184. P. 286–297.
254. Reynolds E.S. The use of lead citrate at high pH as an electron opaque strain in electron microscopy // J. Cell. Biol. 1963. V. 17. P. 208–219.
255. Rhee Y.H., Jang J.H., Roger P.L. Biopolymer production by an Alcaligenes sp. for
biodegradable plastics // Austral. Biotechnol. 1992. V. 2. P. 230–232.
256. Richter M., Rosselló-Móra R. Shifting the genomic gold standard for the prokaryotic
species definition // Proc. Natl. Acad. Sci USA. 2009. V. 106. P. 19126–19131.
162
257. Riis V., Maskow T., Babel W. Highly sensitive determination of ectoine and other
compatible solutes by anion-exchange chromatography and pulsed amperometric detection // Anal. Bioanal. Chem. 2003. V. 377. P. 203–207.
258. Rinehart J.A., Petersen M.W., John M.E. Tissue-specific and developmental regulation of cotton gene FbL2A (demonstration of promoter activity in transgenic plants) //
Plant Physiol. 1996.V. 112. P. 1331–1341. doi:10.1104/pp.112.3.1331.
259. Roberts M.F. Organic compatible solutes of halotolerant and halophilic microorganisms: review // Saline Systems. 2005. V. 1. P. 5. doi:10.1186/1746-1448-1-5.
260. Robertson D.E., Roberts M.F., Belay N., Stetter K.O., Boone D.R. Occurrence of beta-glutamate, a novel osmolyte, in marine methanogenic bacteria // Appl. Environ.
Microbiol. 1990. V. 56. P. 1504-1508.
261. Roeßler M., Müller V. Osmoadaptation in bacteria and archaea: common principles
and differences // Env. Microbiol. 2001. V. 3. P. 743–754.
262. Rosselló-Móra R., Amann R. Past and future species definitions for Bacteria and Archaea. Review // Syst. Appl. Microbiol. 2015. V. 38. P. 209–216.
263. Rosselló-Móra R., Amann R. The species concept for prokaryotes // FEMS Microbiol. Rev. 2001. V. 25. P. 39–67.
264. Saitou N., Nei M. The neighbour-joining method: a new method for reconstructing
phylogenetic trees // Mol. Biol. Evol. 1987. V. 4. P. 405–425.
265. Sangkharak K., Prasertsan P. Nutrient optimization of production polyhydroxybutyrate from halotolerant photosynthetic bacteria cultivated under aerobic-dark condition
// Microbiol. Biotechnol. 2008. V. 11. P. 1–8.
266. Santos H., Da Costa M.S. Organic solutes from termofiles and hypertermophiles //
Meth. Enzymol. 2002. V. 334. 302–315.
267. Schaefer J.K., Goodwin K.D., McDonald I.R., Murrell J.C., Oremland R.S.
Leisingera methylohalidivorans gen. nov., sp. nov., a marine methylotroph that grows
on methyl bromide // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2002. V. 52. P. 851–859.
268. Schäfer H. Isolation of Methylophaga spp. from marine dimethylsulfide-degrading enrichment cultures and identification of polypeptides induced during growth on dimethylsulfide // Appl. Environ. Microbiol. 2007. V. 73. P. 2580–2591.
163
269. Schwibbert K., Marin-Sanguino A., Bagyan I., Heidrich G., Lentzen G., Seitz H.,
Rampp M., Schuster S.C., Klenk H.-P., Pfeiffer F., Oesterhelt D., Kunte1 H.J. A
blueprint of ectoine metabolism from the genome of the industrial producer Halomonas elongata DSM 2581T // Environ. Microbiol. 2011. V. 13. P. 1973–1994.
270. Senior P.J., Dawes E.A. The regulation of poly-β-hydroxybutyrate metabolism in
Azotobacter beijerinckii // Biochem. J. 1973. V. 134. P. 225–238.
271. Shimizu R., Chou K., Orita I., Suzuki Y., Nakamura S., Fukui T. Detection of phasedependent transcriptomic changes and Rubisco-mediated CO2 fixation into poly (3hydroxybutyrate) under heterotrophic condition in Ralstonia eutropha H16 based on
RNA-seq and gene deletion analyses // BMC Microbiol. 2013. V. 13. P. 169. doi:
10.1186/1471-2180-13-169.
272. Skerman V.B.D., McGowan V., Sneath P.H.A. (eds): Approved Lists of Bacterial
Names // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 1980. V. 30. P. 225–420.
273. Skovran E., Crowther G.J., Guo X., Yang S., Lidstrom M.E. A systems biology approach uncovers cellular strategies used by Methylobacterium extorquens AM1 during the switch from multi- to single-carbon growth // PLoS One. 2010. V. 5. e14091.
doi:10.1371/journal.pone.0014091.
274. Sleator R.D., Hill C. Bacterial osmoadaptation: the role of osmolytes in bacterial
stress and virulence // FEMS Microbiol. Rev. 2002. V. 26. P. 49–71. Doi:
10.1111/j.1574-6976.2002.tb00598.x.
275. Sorokin D.Y., Trotsenko Y.A., Doronina N.V., Tourova T.P., Galinski E.A., Kolganova T.V., Muyzer G. Methylohalomonas lacus gen. nov., sp. nov. and
Methylonatrum kenyense gen. nov., sp. nov., methylotrophic gammaproteobacteria
from hypersaline lakes // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2007. V. 57. P. 2762–2769.
276. Soto G., Setten L., Lisi C., Maurelis C., Mozzicafreddo M., Cuccioloni M., Angeletti
M., Ayub N.D. Hydroxybutyrate prevents protein aggregation in the halotolerant bacterium Pseudomonas sp. CT13 under abiotic stress // Extremophiles. 2012. V. 16. P.
455–462.
277. Stackebrandt E., Ebers J. Taxonomic parameters revisited: tarnished gold standards //
Microbiol. Today. 2006. V. 33. P. 152–155.
164
278. Stackebrandt E., Frederiksen W., Garrity G.M., Grimont P.A., Kämpfer P., Maiden
M.C., Nesme X., Rosselló-Móra R., Swings J., Trüper H.G., Vauterin L., Ward A.C.,
Whitman W.B. Report of the ad hoc committee for the reevaluation of the species
definition in bacteriology // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2002. V. 52. P. 1043–1047.
279. Steinbüchel A., Hein S. Biochemical and molecular basis of microbial synthesis of
polyhydroxyalkanoates in microorganisms In Biopolyesters; Babel W., Steinbüchel
A., eds.; Springer: Berlin/Heidelberg, Germany. 2001. V. 71. P. 81–123.
280. Street T.O., Bolen D.W., Rose G.D. A molecular mechanism for osmolyte-induced
protein stability // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006. V. 103. P. 13997–4002.
281. Strom T., Ferenci T., Quayle J.R. The carbon assimilation pathways of Methylococcus capsulatus, Pseudomonas methanica and Methylosinus trichosporium // Biochem. J. 1974. V. 144. P. 465–476.
282. Suzuki T., Yamane T., Shimizu S. Mass production of poly-β-hydroxybutyric acid in
fully automatic fed-batch culture of methylotroph // Appl. Microbiol. Biotechnol.
1986. V. 23. P. 322–329.
283. Sydlik U., Gallitz I., Albrecht C., Abel J., Krutmann J., Unfried K. The compatible
solute ectoine protects against nanoparticle-induced neutrophilic // Am. J. Respir.
Crit. Care Med. 2009. V. 180. P. 29–35.
284. Tamura K., Peterson D., Peterson N., Stecher G., Nei M., Kumar S. MEGA5:
molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary
distance, and maximum parsimony methods // Mol. Biol. Evol. 2011. V. 28. P. 2731–
2739.
285. Tan G.-Y. A., Chen C.-L., Li L., Ge L., Wang L., Razaad I.M.N., Li Y., Zhao L., Mo
Y., Wang J.-Y. Start a research on biopolymer polyhydroxyalkanoate (PHA): A Review // Polymers. 2014. V. 6. P. 706–754.
286. Tanadchangsaeng N., Yu J. Microbial synthesis of polyhydroxybutyrate from glycerol: gluconeogenesis, molecular weight and material properties of biopolyesters // Biotechnol. Bioeng. 2012. V. 109. P. 2808–2818.
287. Theodorou E.C., Theodorou M.C., Kyriakidis D.A. Regulation of poly-(R)-(3hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) biosynthesis by the AtoSCDAEB regulon in
165
phaCAB+ Escherichia coli // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2013. V. 97. P. 5259–
5274.
288. Thompson C.C., Chimetto L., Edwards R.A., Swings J., Stackebrandt E., Thompson
F.L. Microbial genomic taxonomy // BMC Genomics. 2013. V. 14. P. 913.
doi:10.1186/1471-2164-14-913.
289. Thompson J.D., Gibson T.J., Plewniak F., Jeanmougin, F., Higgins D.G. The ClustalX
windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by
quality analysis tools // Nucleic Acids Res. 1997. V. 25. P. 4876–4882.
290. Tieu K., Perier C., Caspersen C., Teismann P., Wu D.-C., Yan S.-D., Naini A., Vila
M., Jackson-Lewis V., Ramasamy R., Przedborski S. D-β-hydroxybutyrate rescues
mitochondrial respiration and mitigates features of Parkinson disease // J. Clin. Invest. 2003. V. 112. P. 892–901.
291. Tindall B.J., Kämpfer P., Euzéby J.P. and Oren A. Valid publication of names of
prokaryotes according to the rules of nomenclature: past history and current practice
// Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2006. V. 56. P. 2715–2720.
292. Tindall B.J., Rosselló-Móra R., Busse, H.-J., Ludwig W., Kämpfer P. Notes on the
characterization of prokaryote strains for taxonomic purposes // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2010. V. 60. P. 249–266.
293. Trotsenko Y.A., Doronina N.V., Govorukhina N.I. Metabolism of non-motile obligately methylotrophic bacteria // FEMS Microbiol. Lett. 1986. V. 33. P. 293–297.
294. Uchino Y., Hirata A., Yokota A., Sugiyama J. Reclassification of marine Agrobacterium species: proposals of Stappia stellulata gen. nov., comb. nov., Stappia aggregata sp. nov., nom. rev., Ruegeria atlantica gen. nov., comb. nov., Ruegeria gelatinovora comb. nov., Ruegeria algicola comb. nov., and Ahrensia kieliense gen. nov.,
sp. nov., nom. rev. // J. Gen. Appl. Microbiol. 1998. V. 44. P. 201–210.
295. Ueda S., Matsumoto S., Takagi A., Yamane T. Synthesis of poly(3-hydroxybutyrateco-3-hydroxyvalerate) from methanol and n-amyl alcohol by the methylotrophic bacteria Paracoccus denitrtificans and Methylobacterium extorquens // Appl. Environ.
Microbiol. 1992. V. 58. P. 3574–3579.
166
296. Ueda S., Yabutani T., Maehara A., Yamane T. Molecular analysis of the poly(3hydroxyalkanoate) synthase gene from a methylotrophic bacterium, Paracoccus denitrificans // J. Bacteriol. 1996. V. 178. P. 774–779.
297. Urakami T., Araki H., Oyanagi H., Suzuki K.I., Komagata K. Transfer of Pseudomonas aminovorans (den Dooren de Jong 1926) to Aminobacter gen. nov. as Aminobacter aminovorans comb. nov. and description of Aminobacter aganoensis sp. nov. and
Aminobacter niigataensis sp. nov. // Int. J. Syst. Bacteriol. 1992. V. 42. P. 84–92.
298. Urakami T., Komagata K. Emendation of Methylobacillus Yordy and Weaver 1977, a
genus of methanol-utilizing bacteria // Int. J. Syst. Bacteriol. 1986. V. 36. P. 502–
511.
299. Urakami T., Tamaoka J., Suzuki K., Komagata K. Paracoccus alcaliphilus sp. nov.,
an alkaliphilic and facultatively methylotrophic bacterium // Int. J. Syst. Bacteriol.
1989. V. 39. P. 116–121.
300. Urdiain M., López-López A., Gonzalo C., Busse H.J., Langer S., Kämpfer P., Rosselló-Móra R. Reclassification of Rhodobium marinum and Rhodobium pfennigii as
Afifella marina gen. nov. comb. nov. and Afifella pfennigii comb. nov., a new genus
of photoheterotrophic Alphaproteobacteria and emended descriptions of Rhodobium,
Rhodobium orientis and Rhodobium gokarnense. Syst. Appl. Microbiol. 2008. V. 31.
P. 339–351.
301. Van de Peer Y., De Wachter R. Evolutionary relationships among the eucaryotic
crown taxa taking into account site-to-site rate variation in 18S rRNA // J. Mol. Evol.
V. 45. P. 619–630.
302. Van de Peer Y., De Wachter R. TREECON for Windows: a software package for the
construction and drawing of evolutionary trees for the Microsoft Windows environment // Comput. Appl. Biosci. 1994. V. 10. P. 569–570.
303. Van Dijken J.P., Quayle J.R. Fructose metabolism in four Pseudomonas species //
Arch. Microbiol. 1977. V. 114. P. 281–286.
304. Van-Thuoc D., Hashim S.O., Hatti-Kaul R., Mamo G. Ectoine-mediated protection of
enzyme from the effect of pH and temperature stress: a study using Bacillus
167
halodurans xylanase as a model // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2013. V. 97. P.
6271–6278.
305. Vasilyeva L.V., Semenov A.M. Labrys monahos, a new budding prosthecate bacterium with radial symmetry // Mikrobiologiya, 1984, 53, 85–92 // Validation List no.
18 // Int. J. Syst. Bacteriol. 1985. V. 35. P. 375–376.
306. Ventosa A., Nieto J.J., Oren A. Biology of moderately halophilic aerobic bacteria //
Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1998. V. 62. P. 504–544.
307. Ventosa A., Nieto J.N.J., Oren A. Biology of moderately halophilic aerobic bacteria.
Review // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2008. V. 62. P. 504–544.
308. Villeneuve C., Martineau C., Mauffrey F., Villemur R. Methylophaga nitratireducenticrescens sp. nov. and Methylophaga frappieri sp. nov., isolated from the
biofilm of the methanol-fed denitrification system treating the seawater at the Montreal Biodome // Int. J. Syst. Bacteriol. 2013. V. 63. P. 2216–2222.
309. Vorholt J.A.
Cofactor-dependent
pathways
of
formaldehyde
oxidation
in
methylotrophic bacteria // Arch. Microbiol. 2002. V. 178. P. 239–49.
310. Vorholt J.A., Chistoserdova L., Stolyar S.M., Thauer R.K., Lidstrom M.E. Distribution of tetrahydromethanopterin-dependent enzymes in methylotrophic bacteria and
phylogeny of methenyl tetrahydromethanopterin cyclohydrolases // J. Bacteriol. 1999. V. 181. P. 5750–5757.
311. Vorob’ev A.V., De Boer W., Folman L.B., Bodelier P.L.E., Doronina N.V., Suzina
N.E., Trotsenko Y.A., Dedysh S.N. Methylovirgula ligni gen. nov., sp. nov., an obligately acidophilic, facultatively methylotrophic bacterium with a highly divergent
mxaF gene // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2009. V. 59. P. 2538–2545.
312. Wallen L.L., Rohwedder W. Poly-β-hydrohyalkanoate from activated sluge // Environ. Sci. Technol. 1974. V. 8. P. 576–579.
313. Wang F.L., Lee S.Y. Poly(3-hydroxybutyrate) by fed-batch culture of filamentationsuppressed recombinant Escherichia coli // Appl. Environ. Microbiol. 1997. V. 63. P.
3703–3706.
314. Wayne L.G., Brenner D.J., Colwell R.R., Grimont P.A.D., Kandler O., Krichevsky
M.I., Moore L.H., Moore W.E.C., Murray R.G.E., Stackebrandt E., Starr M.P.,
168
Trüper H.G. Report of the ad hoc committee on reconciliation of approaches to bacterial systematics // Int. J. Syst. Bacteriol. 1987. V. 37. P. 463–464.
315. Wei G., Kloepper J.W., Tuzun S. Induction of systemic resistance of cucumber to
Colletotrichum orbiculare by select strains of plant growth-promoting rhizobacteria //
Phytopathology. 1991. V. 81. P. 1508–1512.
316. Widderich N., Höppner A., Pittelkow M., Heider J., Smits S.H.J., Bremer E. Biochemical properties of ectoine hydroxylases from extremophiles and their wider taxonomic distribution among microorganisms // PLoS ONE. 2014a. V. 9. №4. doi:
10.1371/journal.pone.0093809.
317. Widderich N., Pittelkow M., Höppner A., Mulnaes D., Buckel W., Gohlke H., Smits
S.H.J., Bremer E. Molecular dynamics simulations and structure-guided mutagenesis
provide insight into the architecture of the catalytic core of the ectoine hydroxylase //
J. Mol. Biol. 2014b. V. 426. P. 586–600.
318. Wood J.M., Bremer E., Csonka L.N. Osmosensing and osmoregulatory compatible
solute accumulation by bacteria // Com. P. Biochem. Physiol. A. Mol. Integr. Physiol.
2001. V. 130. P. 437–460.
319. Wood W.A. Assay of enzymes representative of metabolic pathways // Method. Microbiol. 1971. V. 6A. P. 421.
320. Yamane T., Fukunaga M., Lee Y.W. Increased PHB Productivity by high-celldensity fed-batch culture of Alcaligenes latus, a growth-associated PHB producer //
Biotechnol. Bioeng. 1996. V. 50. P. 197–202.
321. Yamashita S., Uchimura T., Komagata K. Emendation of the genus Acidomonas
Urakami, Tamaoka, Suzuki and Komagata 1989 // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2004.
V. 54. P. 865–870.
322. Yi H., Lim Y.W., Chun J. Taxonomic evaluation of the genera Ruegeria and Silicibacter: a proposal to transfer the genus Silicibacter Petursdottir and Kristjansson
1999 to the genus Ruegeria Uchino et al. 1999 // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2007.
V. 57. P. 815–819.
323. Zhao S., Fan C., Hu X., Chen J., Feng H. The microbial production of polyhydroxybutyrate from methanol // Appl. Biochem. Biotechnol. 1993. V. 39/40. P. 191–199.
169
324. Zheng Y.-J., Xia Z.-X., Chen Z.-W., Mathews F.S., Bruice T.C. Catalytic mechanism
of quinoprotein methanol dehydrogenase: A theoretical and x-ray crystallographic investigation // PNAS. 2001. V. 98. P. 2432–434.