Автореферат (280 kb PDF) - Институт экологии и генетики
реклама
На правах рукописи КОЗЛОВ Сергей Васильевич БИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА БАКТЕРИАЛЬНЫХ ШТАММОВ-АКТИВНЫХ ПРОДУЦЕНТОВ НИТРИЛГИДРОЛИЗУЮЩИХ ФЕРМЕНТОВ 03.00.07 Микробиология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Пермь - 2007 2 Работа выполнена в лаборатории химического мутагенеза Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор Демаков Виталий Алексеевич Официальные оппоненты: доктор биологических наук Октябрьский Олег Николаевич доктор медицинских наук Несчисляев Валерий Александрович Ведущая организация: Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов, Москва Защита состоится "11" мая 2007 г. в 10 часов на заседании Диссертационного совета Д 004.019.01 в Институте экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН по адресу: 614081, г. Пермь, ул. Голева, 13. Факс: (342) 244 67 11. Автореферат диссертации размещен на сайте Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН (http://www.iegm.ru). С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН. Автореферат разослан "10" апреля 2007 г. Ученый секретарь диссертационного совета, чл.-корр. РАН Ившина Ирина Борисовна 3 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. В последние годы значительно возрос интерес к микроорганизмам, трансформирующим нитрилы карбоновых кислот, что обусловлено успешным опытом их использования в производстве акриламида, а также возможностью применения в качестве биокатализаторов для получения других полезных химических продуктов, в частности, акриловой кислоты. Акриловая кислота является сырьем для получения полимеров и сополимеров различного назначения, широко применяемых во всех сферах народного хозяйства. Объединение акриловых мономеров позволяет синтезировать заданные составы латексов и растворных сополимеров, пластических масс сополимера этилена и сшитых полимерных систем. Основной промышленный способ получения акриловой кислоты - окисление пропилена на многокомпонентных катализаторах. Данный процесс отличается высокой энергоемкостью, многостадийностью и образованием значительных количеств высокотоксичных побочных продуктов, требует существенных затрат на очистку промышленных стоков и газообразных выбросов. Применение биотехнологии для производства акриловой кислоты обладает явными преимуществами. В данном случае процесс осуществляется в одну стадию, при невысоких температурах, нормальном давлении, нейтральном значении pH, не требует использования дорогостоящих и агрессивных реагентов. Биоконверсия нитрилов может осуществляться посредством альтернативных ферментных систем: (1) нитрилазой, гидролизующей нитрил до соответствующей карбоновой кислоты и аммония; (2) последовательно нитрилгидратазой – до амида и амидазой – до кислоты и аммония. В настоящее время нитрилтрансформирующие ферменты обнаружены у бактериальных штаммов различной таксономической принадлежности. Известны первые опыты использования бактериальных клеток, обладающих высокой нитрилазной активностью, в биотехнологическом производстве акрилата аммония, осуществляемом на предприятии ЗАО «МоскваШтокгаузен-Пермь» (Полтавская и др., 2004). При этом следует отметить, что биокаталитический способ получения карбоновых кислот пока не может конкурировать по масштабам с химическим синтезом, как в случае с биотехнологическим производством акриламида. Известные бактериальные ферменты, трансформирующие нитрилы до карбоновых кислот, обладают низкой стабильностью или невысокой каталитической активностью. До сих пор недостаточно изучены механизмы устойчивости бактерий к нитрилам, не выявлено биологическое значение способности бактериальных клеток к 4 утилизации нитрилов. В связи с этим вопросы выделения, селекции и изучения бактериальных штаммов-биопродуцентов высокоактивных устойчивых нитрилконвертирующих ферментов остаются актуальными. Цель настоящего исследования – выделение и характеристика бактериальных штаммов-биопродуцентов нитрилтрансформирующих ферментов и оценка возможности их использования для получения акриловой кислоты. Основные задачи исследования 1. Выделить чистые культуры бактерий, активно гидролизующие нитрилы в соответствующие карбоновые кислоты, и идентифицировать их с использованием методов полифазной таксономии. 2. Определить пути метаболизма нитрилов у изучаемых штаммов и идентифицировать гены нитрилгидролизующих ферментов. 3. Исследовать влияние факторов среды на активность нитрилгидролизующих ферментов и подобрать оптимальные условия культивирования биопродуцентов. 4. Оценить возможность использования активных биопродуцентов нитрилгидролизующих ферментов для получения акриловой кислоты. Научная новизна. Выделены чистые культуры бактерий, обладающие высокой активностью нитрилгидролизующих ферментов, и идентифицированы на основании физиолого-биохимических, хемои генотаксономических характеристик как представители Pseudomonas fluorescens, Rhodococcus erythropolis. Установлено отсутствие факторов патогенности у штамма P. fluorescens С2, обладающего высокой нитрилазной активностью. С помощью разработанных праймеров к генам, кодирующим нитрилазные ферменты, у P. fluorescens С2 подтверждено наличие нитрилазной активности. Показано, что нитрилаза штамма P. fluorescens С2 характеризуется широким диапазоном термои рН-устойчивости. Данный фермент катализирует гидролиз алифатических и ароматических нитрилов. При этом для экспрессии нитрилазы не требуется добавление индуктора в ростовую среду. Обнаружено, что штамм R. erythropolis Р3 характеризуется высокой активностью нитрилгидратазноамидазного ферментного комплекса и трансформирует акрилонитрил в акриловую кислоту без накопления промежуточного амида. Теоретическое и практическое значение работы. Расширен спектр детально охарактеризованных культур бактерий, конвертирующих нитрилы до соответствующих карбоновых кислот. На основе разработанных праймеров предложен эффективный способ обнаружения генов, кодирующих нитрилазные ферменты. Показана возможность использования изученных бактериальных 5 штаммов для разработки эффективных биокатализаторов биотехнологического процесса получения акриловой кислоты. Основные положения, выносимые на защиту 1. Выделены и идентифицированы штаммы бактерий, обладающие высокой активностью нитрилгидролизующих ферментов и трансформирующие алифатические и ароматические нитрилы в соответствующие карбоновые кислоты. 2. Нитрилаза штамма P. fluorescens C2 характеризуется широким диапазоном температурной и рН-устойчивости и высокой стабильностью при хранении. 3. Штаммы R. erythropolis гидролизуют нитрилы по нитрилгидратазноамидазному пути метаболизма. Наиболее высокая амидазная активность выявлена у штамма R. erythropolis Р3, трансформирующего акрилонитрил в акриловую кислоту без накопления промежуточного амида. 4. Наиболее перспективным для получения эффективного биокатализатора синтеза акриловой кислоты является штамм P. fluorescens C2, обладающий нитрилазной активностью. Апробация работы и публикации. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на Региональной конференции «Проблемы химии и экологии», Пермь, 2000; Всероссийской конференции «Экология: проблемы и пути решения», Пермь, 2001, 2002; Международном семинаре "Научнотехнический потенциал Западного Урала в конверсии военно-промышленного комплекса" Пермь, 2001; Межрегиональной конференции молодых ученых «Современные проблемы экологии, микробиологии и иммунологии», Пермь, 2002; VI-VIII Пущинской школе-конференции «Биология - наука 21-го века», 2002-2004; II и III Международных конгрессах «Биотехнология: перспективы и пути развития», Москва, 2003, 2005. По теме диссертации опубликовано 14 научных работ и получен патент на изобретение Российской Федерации. Объем и структура диссертации. Работа изложена на 147 страницах машинописного текста, содержит 35 рисунков и 27 таблиц, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, трех глав результатов собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы. Список литературы включает 239 наименований работ, в том числе 24 отечественных и 215 зарубежных авторов. Связь работы с научными программами. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом НИР Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН и является частью исследований, проводимых по теме 6 «Биохимические и генетические системы трансформации органических соединений у бактерий, перспективных для биотехнологий» (номер госрегистрации 0120.0 406511), а также в рамках Программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Научные основы сохранения биоразнообразия России» и Программы ОБН РАН «Фундаментальные основы управления биологическими ресурсами». Исследования поддержаны грантом РФФИ № 02-0496411. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Выделение штаммов-биопродуцентов нитрилгидролизующих ферментов, условия их культивирования. Для выделения бактериальных культур, обладающих способностью конвертировать акрилонитрил в акриловую кислоту, использовали образцы почвы, загрязненной акрилонитрилом и отобранной на территории ФГУП «Пермский завод имени С.М. Кирова» и ОАО «Бератон» (Березники, Пермский край). Штаммы выделяли методами накопительной культуры и прямого высева на минеральную среду N следующего состава (г/л): KH2PO4 - 1,0; K2HPO4×3H2O - 1,6; NaCl - 0,5; MgSO4×7H2O - 0,5; CaCl2 - 0,005; CoCl2×6H2O - 0,01; FeSO4×7H2O - 0,005; рН 7,2 ± 0,2) с добавлением ацетонитрила, акрилонитрила или изобутиронитрила в качестве единственных источников углерода и азота. Для получения штаммов с нитрилазной активностью в качестве селективного агента дополнительно применяли хлорацетамид в концентрации 10 мМ. В дальнейшем при выращивании чистых культур в зависимости от целей экспериментов в качестве источника углерода использовали глюкозу в концентрации 0,1% или другие углеродсодержащие соединения; а в качестве источника азота - NH4Cl в концентрации 10 мМ или другие источники. Методы таксономического анализа. При идентификации выделенных штаммов использовали Определитель Берги (1997), а также диагностические таблицы и ключи, предложенные О.А. Нестеренко с соавт. (1985) и И.Б. Ившиной с соавт. (1995). Генетический анализ исследуемых штаммов проводили с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Определение патогенности выделенных культур псевдомонад. В работе использовали штамм P. fluorescens C2, обладающий наиболее высокой нитрилазной активностью. Эксперименты проводили на лабораторных животных с оценкой следующих факторов патогенности: наличие гемолитической активности, вирулентности, инвазивности в соответствии с требованиями Методических указаний МЗ РФ МУ 2.3.2.1830-04 на базе Регионального токсико- 7 гигиенического центра Управления Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека в Пермском крае. Определение активности ферментов метаболизма нитрилов карбоновых кислот. Трансформацию нитрилов проводили с использованием биомассы исследуемых штаммов, ультразвуковых гомогенатов и/или бесклеточных препаратов в 1 мл 10 мМ калий-натрий фосфатного буфера, pH 7,2 при начальной концентрации нитрила 2%; реакцию останавливали добавлением 5 мкл концентрированной HCl и центрифугировали 5 мин при 12 000 об./мин. Для количественной оценки субстратов и продуктов метаболизма алифатических нитрилов в супернатанте использовали газовый хроматограф «Chrom 5»; анализ ароматических нитрилов и продуктов их трансформации проводили с помощью жидкостного хроматографа высокого разрешения «Shimadzu-АА6300». Бесклеточный препарат получали путем обработки клеток бактерий ультразвуком на дезинтеграторе УЗДН-4 (22 кГц, 10 мкА, обязательное охлаждение). Супернатант использовали для оценки субстратной специфичности, влияния температуры, рН реакционной среды и ингибиторов на активность ферментов метаболизма нитрилов. За единицу активности фермента (нитрилазы, нитрилгидратазы, амидазы) принимали количество фермента, катализирующее образование 1 мкмоль продукта (кислоты или амида) в единицу (1 мин) времени. Удельная активность фермента выражалась числом единиц активности, приходящихся на 1 мг сухой массы клеток. Выделение ДНК. Препараты хромосомной ДНК бактерий получали фенольным методом (Гловер и др., 1988). Плазмидную ДНК выделяли щелочным методом Бирнбойма и Доли (Маниатис и др., 1984). Для элиминации плазмид бактериальные клетки культивировали в течение 48 ч на среде LB с добавлением митомицина C или бромистого этидия. Анализ ДНК проводили методом электрофореза в горизонтальном агарозном геле (Маниатис и др., 1984). Полимеразная цепная реакция. Реакционная смесь для амплификации ДНК содержала ПЦР-буфер, смесь дезоксинуклеотидфосфатов в концентрации 200 мкМ, праймеры в концентрации 5 мМ и 2,5 ЕД Taq-полимеразы. Праймерные олигонуклеотиды конструировали на основе анализа нуклеотидных последовательностей генов нитрилаз известных бактериальных штаммовпродуцентов, генов амидаз, железо- и кобальт-зависимых нитрилгидратаз, приведенных в базе данных GenBank. Электрофоретическое разделение продуктов реакции проводили в агарозном геле. Для оценки молекулярной массы фрагментов ДНК использовали молекулярные маркеры 1 kb и 100 b. 8 Визуализацию полос осуществляли окрашиванием геля бромистым этидием с помощью системы гель-документации BioDocAnalyze (Biometra, Германия). Статистическая обработка. Все эксперименты проводили в трехкратной повторности. При статистической обработке определяли среднее арифметическое, стандартное отклонение, доверительные интервалы. Достоверность различий определяли с использованием критерия Стьюдента и непараметрического критерия Уилкоксона-Манна-Уитни (U). Анализ результатов проводили с помощью программ MS Excel и Statistica 5.0. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Получение бактериальных изолятов. С целью поиска и изучения микроорганизмов, способных трансформировать нитрилы, было проанализировано 28 образцов почвы, загрязненных акрилонитрилом. В результате получено 48 изолятов, активно осуществляющих трансформацию ацетонитрила. Для детального изучения были отобраны 3 культуры микроорганизмов, обладающие наибольшей нитрилконвертирующей активностью (C2, Р1а и Р3). Культура, условно обозначенная лабораторным шифром С2, проявляла выраженную активность в отношении акрилонитрила и в результате проведенных реакций трансформации в среде обнаруживался акрилат аммония в качестве единственного продукта. Полученные данные позволили предположить наличие нитрилазного пути метаболизма нитрилов у данного изолята. Штаммы бактерий P1а и P3 в процессе конверсии нитрилов кроме кислоты образовывали амид, а также проявляли выраженную амидазную активность. Это позволило предположить наличие у данных двух штаммов нитрилгидратазно-амидазного пути метаболизма нитрилов. Идентификация бактерий, трансформирующих нитрилы карбоновых кислот. Штаммы, обладающие наибольшей нитрилгидролизующей активностью, по совокупности фенотипических и хемотаксономических признаков, а также результатам ПЦР отнесены нами к P. fluorescens (штамм C2) и R. erythropolis (штаммы P1a и P3). На рис. 1 и 2 представлены данные амплификации специфичных праймеров к генам 16S рРНК на матрице геномной ДНК исследуемых бактериальных культур. ← R. erythropolis 7T 1 kb маркер штамм С2 штамм Р1а штамм P10 штамм Р3 P. fluorescens C2 штамм Р3 штамм Р1а штамм С-329 штамм С-323 штамм С-3213 P. fluorescens 16 R. erythropolis 7T 1 kb маркер 9 - 1 т.п.н. ← Рис. 1. Продукты амплификации с Рис. 2. Продукты амплификации родоспецифичными праймерами к генам 16S рРНК Pseudomonas. с праймерами к генам 16S рРНК R. erythropolis. Определение биологической безопасности штамма P. fluorescens C2. Установлено отсутствие факторов патогенности (гемолитической активности, вирулентности, инвазивности), что свидетельствует об апатогенности штамма P. fluorescens C2 в отношении лабораторных животных. Амплификация генов нитрилконвертирующих ферментов. В образцах геномной ДНК P. fluorescens C2 с помощью ПЦР обнаружен фрагмент, соответствующий по размеру (1100 п.н.) гену нитрилазы Acidovorax facilis 72W (Chauhan et al., 2003) (рис. 3). Анализ нуклеотидной последовательности позволил установить высокую (93,3%) степень гомологии центральной части полученного фрагмента и гена нитрилазы A. facilis 72W. На матрице ДНК из R. erythropolis Р1a и R. erythropolis Р3 с праймерами, комплементарными консервативным участкам генов нитрилгидратаз, были амплифицированы фрагменты ДНК размером 180 п.н. (рис. 4), соответствующие внутренним последовательностям генов железосодержащих нитрилгидратаз, а также участки, по размеру соответствующие генам α- и β-субъединиц железозависимой нитрилгидратазы. Таким образом, показано, что геномная ДНК P. fluorescens С2 содержит ген нитрилазы, а геномы R. erythropolis Р1a и R. erythropolis Р3 - гены нитрилгидратаз. Маркер штамм Р10 штамм Р3 штамм С2 штамм Р1а Маркер штамм Р10 штамм Р3 штамм Р1а штамм С2 10 -1 т.п.н. -1 т.п.н - 250 п.н Рис. 3. Фрагменты ДНК, Рис. 4. Фрагменты ДНК, соответствующие гену нитрилазы штамма A. facilis 72W. соответствующие консервативному участку гена нитрилгидратазы. Зависимость нитрилазной активности клеток от фазы роста культуры. Как видно из рис. 5, оптическая плотность культуры P. fluorescens C2 достигает максимальных значений через 48 ч и сохраняется в течение 4 сут. На протяжении экспоненциальной фазы роста активность нитрилазы увеличивается пропорционально плотности культуры. Максимальное (8,0±0,4 Ед) значение достигается через 96 ч в стационарной фазе. Высокий уровень нитрилазной активности сохраняется до 6 сут с момента инокуляции среды. 100 1,6 1,2 60 0,8 40 0,4 2 1 20 ОП540 Относительная активность, % 80 0 0 0 50 100 Время, ч 150 Рис. 5. Рост и нитрилазная активность клеток P. fluorescens C2. 1 – оптическая плотность; 2 – относительная активность. 11 60 3 40 2 20 1 0 0 50 100 100 150 Время, ч Относительная активность, % 80 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 ОП540 Относительная активность, % 100 80 60 40 3 2 1 20 0 0 50 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 ОП540 Рост клеток R. erythropolis Р1a, обладающих нитрилгидратазно-амидазной системой метаболизма нитрилов, достигает максимальной оптической плотности через 48 ч (рис. 6). Активность нитрилгидратазы достигает максимума (21,0±1,05 Ед) к концу логарифмической фазы и резко снижается в начале стационарной фазы роста исследуемой культуры. При этом амидазная активность возрастает на протяжении всей экспоненциальной фазы и достигает максимума (4,2±0,2 Ед) в начале стационарной фазы роста R. erythropolis Р1a. Как видно из рис. 7, рост культуры R. erythropolis Р3 достигает максимальной плотности также через 48 ч культивирования, но в отличие от предыдущего штамма характеризуется наличием выраженной лаг-фазы. При этом максимум нитрилгидратазной активности клеток R. erythropolis Р3 регистрируется в начале экспоненциальной фазы и составляет 26,0±1,3 Ед. К концу логарифмической фазы роста данной культуры наблюдается постепенное уменьшение активности нитрилгидратазы. При этом амидазная активность увеличивается на протяжении логарифмической фазы и достигает максимума (10,1±0,51 Ед) к началу стационарной фазы роста R. erythropolis Р3. 100 150 Время, ч Рис. 6. Рост и Рис. 7. Рост и нитрилгидролизующая активность клеток R. erythropolis P1a. нитрилгидролизующая активность клеток R. erythropolis P3. 1 – оптическая плотность; 2 – относительная нитрилгидратазная активность; 3 – относительная амидазная активность. Оценка токсичности нитрилов. В табл. 1 представлены результаты исследований по оценке токсичности используемых в экспериментах нитрилов. По нашим данным, все исследуемые штаммы устойчивы к высоким концентрациям насыщенных алифатических нитрилов – ацетонитрила, пропионитрила и бутиронитрила. Наибольшее ингибирующее действие на рост 12 исследуемых культур оказывают акрилонитрил, бензонитрил, малонодинитрил, лактонитрил и цианопиридины. Установлена прямая зависимость между токсическими свойствами гидроксилированных нитрилов (на примере пропионитрила) от положения гидроксильной группы: 3-гидроксипропионитрил не вызывает существенного угнетающего действия на клетки, а 2-гидроксипропионитрил (лактонитрил) оказывает выраженный токсический эффект. Таким образом, незамещенные алифатические нитрилы проявляют меньший ингибирующий эффект на рост бактерий, чем динитрилы и ароматические нитрилы. Таблица 1. Минимальные ингибирующие концентрации нитрилов МИК (% действующего вещества) Нитрил P. fluorescens C2 R. erythropolis P1a R. erythropolis P3 Ацетонитрил 800 640 800 Акрилонитрил 80 80 80 Валеронитрил 320 160 320 Пропионитрил 320 320 320 Бутиронитрил 480 320 320 Изобутиронитрил 320 320 640 Лактонитрил 20 20 20 Малонодинитрил 20 20 20 Адипонитрил 160 80 80 Бензонитрил 40 80 20 3-Цианопиридин 80 20 40 2-Цианопиридин 80 80 40 3-Гидроксипропионитрил 480 20 80 Использование нитрилов в качестве ростовых субстратов. В табл. 2 представлены результаты изучения способности исследуемых бактериальных штаммов использовать различные нитрилы в качестве источников азота и углерода. 13 Таблица 2. Способность штамма использовать нитрилы в качестве единственного источника азота и энергии Нитрилы P. fluorescens C2 R. erythropolis P1a R. erythropolis P3 Ацетонитрил + + + Акрилонитрил + + + Пропионитрил + + + 3-Гидроксипропионитрил + + + Бутиронитрил + + + Изобутиронитрил + + + Лактонитрил - - - Малонодинитрил - - - Адипонитрил + - + Бензонитрил + + - 3-Цианопиридин + - + «+» - способность к росту (ОП540 > 0,5 через 48 часов), «–»- отсутствие способности к росту. Все исследуемые штаммы способны использовать большинство алифатических нитрилов, за исключением динитрилов (адипонитрила и малонодинитрила) и лактонитрила в качестве источников азота и углерода. Культура бактерий P. fluorescens C2 помимо алифатических, включая малонодинитрил и адипонитрил, утилизирует бензонитрил и 3-цианопиридин. Бактериальный штамм R. erythropolis Р1а помимо алифатических нитрилов использует лишь бензонитрил. Клетки R. erythropolis Р3 также способны расти на адипонитриле и 3-цианопиридине. Использование нитрилов в качестве индукторов. Как видно из рис. 8, добавление ацетонитрила, пропионитрила, бутиронитрила, 3-гидроксипропионитрила, малонодинитрила, ε-капролактама или валеронитрила в среду культивирования достоверно увеличивает (от 142 до 248% по отношению к контролю) активность нитрилазы P. fluorescens C2. Другие нитрилы (изобутиронитрил, пиридин-2-карбонитрил, акрилонитрил, адипонитрил, бензонитрил, лактонитрил) не оказывают достоверного влияния на активность нитрилазы данного штамма. 14 Относительная активность, % Показано, что активность нитрилгидратазы и амидазы R. erythropolis Р1а показало, что активность нитрилгидратазы и амидазы может коиндуцироваться, что полностью согласуется с литературными данными (Яненко и др., 1995). При этом уровень нитрилгидролизующей активности R. erythropolis Р3, не подвержен индуцированию. 250 200 150 100 50 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Рис. 8. Зависимость относительной активности нитрилазы штамма P. fluorescens C2 при добавлении различных потенциальных индукторов. 1 – акрилонитрил, 2 – ацетонитрил, 3 – бутиронитрил, 4 – изобутиронитрил, 5 – пропионитрил, 6 – 3-гидроксипропионитрил, 7 – бензонитрил, 8 – пиридин-2карбонитирил, 9 – адипонитрил, 10 – лактонитрил, 11 – малонодинитрил, 12 – валеронитрил, 13 – ε-капролактам, 14 – контроль – среда без нитрила. Утилизация ацетонитрила. Показано, что в течение 120 ч роста клеток P. fluorescens C2 и R. erythropolis Р3 происходит уменьшение концентрации ацетонитрила и накопление в культуральной среде ацетата. Максимальная концентрация последнего регистрируется через 120 ч с момента посева культуры. Ацетонитрил в ростовой среде к этому моменту полностью утилизируется. В то же время для полной утилизации aцетонитрила с использованием R. erythropolis P1a требуется более 160 ч. Влияние условий культивирования на рост и нитрилгидролизующую активность. С целью оптимизации условий культивирования изучено влияние различных источников углерода на рост бактерий и активность нитрилгидролизующих ферментов. В соответствии с поставленными задачами изучаемые бактериальные культуры рассматривались как потенциальные биокатализаторы, и оценка активности ферментов проводилась по количеству образуемой акриловой кислоты, т.е. по нитрилазной (P. fluorescens C2) или суммарной нитрилгидратазно-амидазной активности (у R. erythropolis). 15 Установлено, что глюкоза, сахароза и маннит являются наилучшими источниками углерода для P. fluorescens C2 (табл. 3). При росте на среде с цитратом, лактатом, пируватом или сорбитом скорость роста клеток данного штамма значительно ниже. Глицерин хуже остальных субстратов поддерживает рост P. fluorescens C2. Исследуемый штамм не использует в качестве субстрата лактозу. Максимальная экспрессия нитрилазы обнаружена при росте на среде с глюкозой. По нашим данным, использование в качестве единственного источника углерода маннита, сорбита или цитрата приводит к заметному снижению активности фермента, а при росте на среде с ацетатом, пируватом или глицерином она составляет менее 10 % от активности в варианте с глюкозой. Таблица 3. Рост P. fluorescens C2 и относительная активность нитрилазы на различных источниках углерода Источник углерода Глюкоза Сахароза Ацетат Лактат Пируват Цитрат Сорбит Маннит Глицерин Рост, максимальная ОП540 Относительная активность, % 4,78±0,239 3,43±0,172 0,95±0,480 1,80±0,090 1,34±0,120 2,40±0,289 1,26±0,063 2,87±0,144 0,26±0,013 100* 60,2 6,8 11,7 5,9 31,8 41,7 48,7 5,8 Изучение влияния концентрации глюкозы в диапазоне от 0 до 30 мМ на рост и активность ферментов гидролиза нитрилов при культивировании на минеральной среде N c добавлением 10 мМ ацетонитрила и смеси микроэлементов позволило выявить линейное увеличение оптической плотности бактериальной культуры P. fluorescens C2, пропорциональное повышению содержания глюкозы в среде. Активность нитрилазы P. fluorescens C2 достигала максимальной величины при концентрации глюкозы 10 мМ. Дальнейшее повышение содержания глюкозы приводило к постепенному снижению уровня нитрилазной активности. Так, при 20 мМ глюкозы удельная активность фермента составляла 86% от максимального значения, а при 30 мМ – 62%. Оценка влияния концентрации ацетонитрила (0-400 мМ), на рост и нитрилазную активность P. fluorescens C2 выявила, что увеличение содержания ацетонитрила в среде с 25 16 до 100 мМ приводит к заметному повышению скорости роста и выхода биомассы и возрастанию удельной активности фермента. Плотность культуры (ОП 540) при этом составляла 3,74. Последующее повышение концентрации ацетонитрила до 200 мМ вызывало резкое ингибирование активности нитрилазы. Показано, что при повышении концентрации ацетонитрила до 400 мМ активность нитрилазы уменьшалась более чем в 3 раза, а оптическая плотность снижалась до 2,28. С целью обоснования оптимального состава среды для культивирования бактериальных штаммов исследовано влияние альтернативных источников азота на ростовые характеристики и активность нитрилгидролизующих ферментов. Наибольшая оптическая плотность культуры P. fluorescens C2 отмечена при добавлении β-аланина к среде. Применение ацетамида, глицина, нитрата и мочевины заметно снижало выход биомассы бактерий. Установлено, что пропионамид, метиламин и диметиламин хуже остальных поддерживают рост данного штамма. Максимальная активность нитрилазы обнаружена при росте на β-аланине. Добавление глицина, ацетамида, нитрата и мочевины приводило к снижению активности фермента. При росте на пропионамиде и нитрите зарегистрирована минимальная активность нитрилазы. Метиламин и диметиламин полностью ингибировали активность. Исследовали влияние различных концентраций аммония на рост и активность фермента. Показано, что с увеличением концентрации аммония происходит увеличение оптической плотности культуры до максимума при концентрации 30 мМ. Дальнейшее повышение содержания аммония в среде до 50 мМ не вызывало статистически достоверных изменений данного показателя. Установлено, что активность нитрилазы штамма P. fluorescens C2 линейно возрастает с увеличением концентрации аммония до 30 мМ. Дальнейшее повышение концентрации аммония до 50 мМ приводило к снижению активности фермента. Исследование влияния источника азота и углерода на активность нитрилазы показало, что при росте на различных нитрилах наблюдаются различные уровни активности фермента. При росте бактерий на бутиронитриле отмечена наибольшая активность нитрилазы. Данные, полученные в ходе экспериментов, свидетельствуют о том, что оптимальным субстратом для получения наибольшего выхода биомассы клеток штамма P. fluorescens C2 и проявления высокой активности нитрилазы являлся бутиронитрил (рис. 9). 17 Относительная активность, % 100 80 60 40 20 0 1 2 3 4 5 6 7 Рис. 9. Относительная активность нитрилазы штамма P. fluorescens C2 при росте на различных нитрилах 1 – акрилонитрил, 2 – ацетонитрил, 3 – бутиронитрил, 4 – изобутиронитрил, 5 – пропионитрил, 6 – бензонитрил, 7 – аммоний+глюкоза Проведена оценка возможности использования культуры бактерий P. fluorescens C2 в качестве биокатализатора для получения различных карбоновых кислот из соответствующих нитрилов. В качестве субстратов нитрилтрансформирующих ферментов исследуемых штаммов были оценены предельные алифатические нитрилы, акрилонитрил, бензонитрил и цианопиридин. За 100 % принимали удельную активность фермента по отношению к акрилонитрилу (табл. 4): Таблица 4. Нитрилазная активность штамма P. fluorescens C2 Субстрат Относительная активность, % Акрилонитрил 100 Ацетонитрил 11,0 Пропионитрил 4,5 Бутиронитрил 3,6 Изобутиронитрил 3,9 Бензонитрил 15,8 3-Цианопиридин 19,1 Установлено, что наилучшим субстратом для нитрилазы штамма P. fluorescens C2 является акрилонитрил. Уровень активности фермента по отношению к ацетонитрилу был на порядок ниже, а бензонитрилу и 3-цианопиридину более, чем в 5 раз ниже по сравнению с таковой в отношении акрилонитрила. Активность нитрилазы в отношении пропионитрила, бутиронитрила, изобутиронитрила оказалась самой низкой из всех значений для исследованного ряда соединений. Показано, что для культивирования штамма 18 R. erythropolis Р1а оптимальным источником углерода для получения высокой плотности и активности ферментов является глюкоза, для культуры R. erythropolis Р3 – маннит, сахароза и глюкоза. Суммарная нитрилгидролизующая активность R. erythropolis Р1а достигала максимального уровня при содержании глюкозы в ростовой среде 5 мМ, для культуры R. erythropolis Р3 - 20 мМ. Оптимальным источником азота и углерода для штамма R. erythropolis Р1а оказался ацетонитрил, для штамма R. erythropolis Р3 - изобутиронитрил. Изучение зависимости роста штаммов R. erythropolis Р1а и R. erythropolis Р3 на среде с различным содержанием ацетонитрила позволило выявить, что изучаемые культуры бактерий достигали максимальной оптической плотности и проявляли максимальную суммарную активность в среде с ацетонитрилом в концентрации 25 мМ. Изучение влияния альтернативных источников азота на рост и активность ферментов, показало, что наибольшую суммарную нитрилгидролизующую активность клетки штаммов R. erythropolis Р1а и R. erythropolis Р3 проявляют при росте в среде с мочевиной. Проведена оценка возможности использования культур бактерий R. erythropolis Р1а и Р3 в качестве биокатализатора для получения различных карбоновых кислот из соответствующих нитрилов. Показано, что наилучшими субстратами для ферментов штамма R. erythropolis Р1а являются бутиронитрил и акрилонитрил; ферменты штамма R. erythropolis Р3 проявляют наибольшую активность по отношению к ацетонитрилу. Активность по отношению к акрилонитрилу и пропионитрилу была почти в 2 раза ниже, чем по ацетонитрилу. Влияние температуры реакции на активность ферментов. Установлено, что максимальная нитрилазная активность проявляется при 55-60оС (рис. 10). Относительная активность, % 100 80 60 40 20 0 10 20 30 40 50 о Температура, С 60 70 80 Рис. 10. Зависимость относительной активности нитрилазы штамма P. fluorescens C2 от температуры реакционной среды. 19 Дальнейшее повышение температуры реакции приводит к снижению активности фермента. Активность нитрилазы при 80оС составляет 29,7% от максимальной. Нитрилгидратаза штамма R. erythropolis Р1а проявляла максимальную активность при 25оС. Повышение температуры реакции до 55оС приводило к инактивации фермента. Показано, что амидаза данного штамма имеет выраженный максимум активности при 37оС. При дальнейшем повышении температуры реакции амидазная активность резко падала. Нитрилгидролизующие ферменты штамма R. erythropolis Р3 проявляют наибольшую активность при 3745оС. Повышение температуры реакции до 50оС резко снижало активность обоих ферментов. Влияние pH реакционной среды на активность ферментов. Минимальная активность нитрилазы штамма P. fluorescens C2 отмечена при рН=4,0 (рис. 11). Повышение рН реакционной среды до 8,0 вызывало резкое увеличение ферментативной активности, при котором отмечена максимальная нитрилазная активность (11Ед.). При повышении рН реакции до 11,0 активность фермента плавно уменьшалась и резко падала с достижением рН=12,0, составляя 23,4% от максимальной. Нитрилгидратаза и амидаза штамма R. erythropolis Р1а проявили выраженный максимум ферментативной активности при рН=8,0. Сдвиг реакции среды в кислую или щелочную сторону приводил к резкому снижению активности ферментов. Нитрилгидратаза штамма R. erythropolis Р3 имеет более широкий рН-диапазон действия. Наибольшая активность нитрилгидратазы данного штамма отмечена в диапазоне рН 8-10,0. При сдвиге реакции среды к нейтральной, активность нитрилазы штамма снижалась до 52%. При повышении щелочности среды до рН=11,0 активность падала до 16% от максимальной. Амидаза штамма R. erythropolis Р3 имеет выраженный пик активности при рН=8,0 и также быстро падает при отклонении от оптимального значения. Относительная активность, % 100 80 60 40 20 0 3 5 7 рН 9 11 13 Рис. 11. Зависимость относительной активности нитрилазы штамма P. fluorescens C2 от кислотности реакционной среды. 20 Влияние ингибиторов на активность нитрилгидролизующих ферментов. Активность нитрилазы штамма P. fluorescens C2 полностью ингибируется при добавлении нитрата серебра и хлорида железа до концентрации 1,0 мM в реакционной среде (рис. 12). Снижение активности нитрилазы более чем на 50% было обнаружено при содержании в реакционной среде солей меди и алюминия, сульфата железа, иодацетата, гидроксиламина, азида натрия и перекиси водорода. Существенное ингибирование нитрилазной активности до 50% оказывали соли цинка, кобальта, никеля, семикарбазид, ЭДТА и мочевина. Добавление солей натрия и лития в концентрации 10 мМ, 2-меркаптоэтанола и фенилгидразина в концентрации 1 мМ не приводило к достоверному снижению активности фермента. Полученные результаты оценки влияния ингибиторов на активность нитрилазы согласуются с приведенными в литературе свойствами тиоловых ферментов, описанными для штаммов R. rhodochrous J1, P. chlororaphis B23, C. nitrilophilus ATCC21419, B. smithii SC-J05-1. 100 Относитьельная активность, % 80 60 40 20 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Рис. 12. Зависимость относительной активности нитрилгидратазы штамма P. fluorescens C2 от присутствия потенциальных ингибиторов в реакционной среде. 1 – алюминий, 2 – никель, 3 – серебро, 4 – йодацетат, 5 – азид, 6 – мочевина, 7 – семикарбазид, 8 – гидроксиламин, 9 – фенилгидразин, 10 – железа хлорид, 11 – железа сульфат, 12 – медь, 13 – цинк, 14 – кобальт, 15 – перекись водорода, 16 – натрия хлорид, 17 – литий, 18 – 2-меркаптоэтанол, 19 – ЭДТА, 20 – контроль. Наибольшее ингибирующее влияние на нитрилгидратазную активность штамма R. erythropolis Р1а оказывают хлорид железа, фенилгидразин и перекись водорода. Выраженный ингибирующий эффект наблюдается в присутствии гидроксиламина, семикарбазида и азида. Статистически достоверный ингибирующий эффект на нитрилгидратазную активность штамма 21 R. erythropolis Р1a других потенциальных ингибиторов не обнаружен. Нитрат серебра вызывал полное ингибирование фермента R. erythropolis Р3. Выраженный ингибирующий эффект оказывали перекись водорода и хлорид железа. Статистически достоверный ингибирующий эффект на нитрилгидратазную активность штамма R. erythropolis Р3 отмечен в присутствии сульфата алюминия, семикарбазида, гидроксиламина и фенилгидразина. Конверсия акрилонитрила. Опытным путем установлено, что при оптимальных условиях (t=60oC, pH=8,0) 1,2 мг биомассы клеток штамма P. fluorescens C2 за 30 мин способны конвертировать до 2% акрилонитрила. На рис. 13 представлена динамика конверсии акрилонитрила в акриловую кислоту, осуществляемой 1,2 мг биомассы клеток P. fluorescens C2 в течение 30 мин при оптимальных условиях реакции. Концентрация, мМ Концентрация, мМ 1 2 3 300 300 200 1 100 2 0 200 100 0 0 5 10 15 20 Время, мин Рис. 13. Трансформация 25 30 0 5 10 15 20 Время, ч 25 30 Рис. 14. Трансформация акрилонитрила штаммом акрилонитрила штаммом P. fluorescens C2. R. erythropolis Р3. 1 – акрилонитрил; 2 – акрилат; 3 – акриламид. Трансформацию акрилонитрила в акриловую кислоту проводили при температуре 55оС в течение 5 ч с дробным добавлением к клеточной суспензии (18 мг сухого веса с исходной активностью 4,32 Ед.) субстрата до конечной концентрации 2% (300 мM) каждые 30 мин. Концентрация акрилонитрила за 30 мин снижалась до следовых количеств после каждого добавления. Биомасса бактерий штамма P. fluorescens C2 за 5 ч при оптимальных условиях реакции конвертировала 3,0 M (20 %) раствор акрилонитрила в акриловую кислоту без образования промежуточного амида. Штамм бактерий R. erythropolis Р3 за 30 мин конвертирует 2% (300 мМ) раствор акрилонитрила в соответствующий амид и акриловую кислоту (рис. 14). Использование биомассы штамма R. erythropolis Р1a для конверсии акрилонитрила приводит к накоплению акриламида и низкому выходу акриловой кислоты. 22 ВЫВОДЫ 1. Выделены бактериальные культуры P. fluorescens C2, R. erythropolis P1a и P3, активно конвертирующие алифатические и ароматические нитрилы в соответствующие карбоновые кислоты. 2. Показано, что геномная ДНК P. fluorescens C2 содержит фрагменты, соответствующие гену нитрилазы штамма A. facilis 72W размером 1100 п.н. В ДНК штаммов R. erythropolis Р1a и Р3 обнаружены гены железосодержащих нитрилгидратаз. 3. Установлено, что нитрилазная активность клеток P. fluorescens C2 обусловлена конститутивным синтезом фермента. Присутствие индуктора не является необходимым условием для ее проявления. 4. Обнаружено, что нитрилгидролизующая способность штамма R. erythropolis Р3 обусловлена высоким уровнем экспрессии амидазы на фоне низкой экспрессии нитрилгидратазы, что позволяет получать акриловую кислоту без накопления промежуточного амида. 5. Показано, что нитрилаза штамма P. fluorescens C2 характеризуется широким диапазоном оптимальных значений температуры (37-60оС) и рН (7,010,0) реакционной среды, а также более широким спектром субстратной специфичности по сравнению со штаммами R. erythropolis Р1а и Р3. 23 Список основных работ, опубликованных по теме диссертации 1. Демаков В.А., Максимов А.Ю., Овечкина Г.В., Кузнецова М.В., Козлов С.В. Микробная конверсия нитрилов карбоновых кислот//Матер. Междунар. семинара МНТЦ «Научно-технический потенциал Западного Урала в конверсии военно-промышленного комплекса». - Пермь, 2001. - С. 63-66. 2. Козлов С.В., Максимов А.Ю., Кузнецова М.В., Овечкина Г.В., Демаков В.А. Выделение штаммов, обладающих термостабильной нитрилазной и нитрилгидратазной активностью//Матер. VI Пущинской конф. молодых ученых «Биология – наука XXI века». - Пущино, 2002. - Т. 3. - С. 29. 3. Козлов С.В., Максимов А.Ю., Кузнецова М.В., Овечкина Г.В., Ремезовская Н.Б., Максимова Ю.Г., Гусев В.А. Новый штамм нокардиоподобных бактерий, обладающий термостабильной нитрилазной активностью//Матер. Межрегион. конф. молодых ученых «Современные проблемы экологии, микробиологии и иммунологии». - Пермь, 2002. - С. 43-44. 4. Демаков В.А., Максимов А.Ю., Кузнецова М.В., Козлов С.В., Овечкина Г.В. рН-зависимость нитрилазной и нитрилгидратазной активности штаммов Rhodococcus//Матер. III-го съезда биохимического общества. - СанктПетербург, 2002. - С. 50-52. 5. Демаков В.А., Максимов А.Ю., Кузнецова М.В., Овечкина Г.В., Козлов С.В., Ремезовская Н.Б., Максимова Ю.Г. Штамм бактерий Rhodococcus erythropolis – продуцент нитрилгидратазы. Патент на изобретение РФ № 2196822. Приоритет изобретения 25.07.2001. Зарегистр. в Госреестре изобретений 20.01.2003. 6. Максимов А.Ю., Кузнецова М.В., Овечкина Г.В., Козлов С.В., Максимова Ю.Г., Демаков В.А. Влияние нитрилов и амидов на рост и нитрилгидратазную активность штамма R. erythropolis gt1//Прикладная биохимия и микробиология. - 2003. - Т. 39, N. 1. - С. 63-68. 7. Козлов С.В., Максимов А.Ю., Овечкина Г.В., Гусев В.А., Демаков В.А. Особенности роста и активности нитрилгидролизующего штамма на средах с различным содержанием глюкозы и ацетонитрила//Матер. Регион. конф. молодых ученых и студентов «Проблемы химии и экологии». - Пермь, 2003. - С. 30. 8. Козлов С.В., Максимов А.Ю., Овечкина Г.В. Исследование ресурсов почвенной микрофлоры, утилизирующей нитрилы карбоновых кислот, и оценка ее перспективности для биотехнологического получения акриловой кислоты//Матер. Междунар. научно-практ. конф. «Проблемы и перспективы реабилитации техногенных экосистем». - Астрахань, 2005. - С. 69. 24 9. Максимов А.Ю., Кузнецова М.В., Максимова Ю.Г., Козлов С.В., Демаков В.А. Использование ПЦР-метода для поиска бактерий, трансформирующих нитрилы карбоновых кислот//Матер. Междунар. научнопракт. конф. «Перспективы и проблемы развития биотехнологии в рамках единого экономического пространства стран содружества». - Минск, Белорусь, 2005. С. 132. 10. Демаков В.А., Максимов А.Ю., Козлов С.В., Кузнецова М.В., Ремезовская Н.Б. Получение биокатализатора для синтеза акриловой кислоты//Матер. III Междунар. конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития». - Москва, 2005. - С. 189. 11. Козлов С.В., Максимов А.Ю., Ремезовская Н.Ю., Демаков В.А. Скрининг микробных штаммов-продуцентов нитрилаз методом полимеразной цепной реакции//Микробное разнообразие: состояние, стратегия сохранения, биотехнологический потенциал: тез. докл. - Пермь-Казань, 2005. - С. 39.
