3. Питание и рост прокариот. РОСТ: источник энергии +

3. Питание и рост прокариот.

РОСТ: источник энергии + элементы питания.

Прокариот
можно
разделить
узкоспециализированные
по
отношению
(могут
к
использовать
источникам
лишь
питания
небольшое
на
число
субстратов) и малоспециализированные (могут использовать разнообразные
субстраты) бактерии.

Прототрофы могут расти на простых средах, содержащих одно вещество в
качестве источника энергии и углерода.

Ауксотрофы зависят от присутствия готовых компонентов клетки (аминокислот и
др.), или витаминов.

Облигатные
паразиты
зависят
от
хозяина,
имеют
редуцированные
метаболические пути.
3.1. Питание прокариот.
Для построения прокариотической клетки требуются:

Макроэлементы в следующей пропорции: С:2, H:7, O:1,5, N

+ P, S, Fe

+ щелочные металлы и их соли (Na, K, Cl, Mg, Ca)

+ микроэлементы (Zn, Mn, Co, Mo, Cu, Ni, W, Se, V, B).
Источник углерода
Автотрофы
Гетеротрофы
СО2 – основной источник углерода для биосинтеза
Органика произведенная другими организмами
Источник энергии
Фототрофы
Свет
Хемотрофы
Окисление органики или неорганики
Источник электронов
Литотрофы
Органотрофы
Восстановленные неорганические молекулы
Органика
1
2
Механизмы транспорта.
Пассивная диффузия

Под действием разности концентраций (для неэлектролитов) или разности
электрических потенциалов (для ионов) по обе стороны мембраны;

Транспортируется вода, кислород и некоторые ионы, скорость такого
переноса веществ весьма незначительна.
Облегченная диффузия

По градиенту концентрации вещества по обе стороны мембраны;

Молекула вещества соединяется с молекулой-переносчиком и
диффундирует через мембрану к ее внутренней стороне, не требует расхода энергии,
скорость процесса зависит от концентрации вещества в наружном растворе.
Активный транспорт

Специфические транспортные белки, которые также находятся в
цитоплазматической мембране. Растворенные вещества переносятся в клетки
микроорганизмов «вверх» по химическому градиенту (или против градиента
концентрации);

Большинство веществ проникает в клетку микроорганизма в результате
активного транспорта. Источниками энергии для транспортных процессов служат АТФ,
протонный потенциал и фосфоенолпируват.

Различные механизмы активного транспорта: Симпорт, Антипорт, Унипорт.
3.2. Рост и методы измерения численности прокариот.
Рост бактерий происходит путем увеличения массы клетки с последующим
делением на две идентичных клетки. Следует различать понятия:
 Микробный рост – увеличение числа клеток, представляет собой процесс роста
бактериальной колонии, исходная материнская клетка часто обозначается КОЕ
(колониеобразующая единица).
 Рост бактериальной клетки – увеличение размеров и последующее бинарное
деление, представляет собой клеточный цикл прокариот.
В клеточном цикле прокариот выделяют 3 фазы:
 B, (соответствует G1 периоду эукариот, может отсутствовать в быстро растущих
культурах);
 С (соответствует синтетическому периоду эукариот);
3
 D (расхождение дочерних нуклеоидов и деление клетки).
Когда клетка готова к репликации точка Ori мигрирует к центру клетки и
формируется реплисома. По мере завершения репликации, дочерние хромосомы движутся
к полюсам клетки.
Запуск процесса клеточного деления осуществляется после начала процесса
репликации ДНК, при достижении определенного предела реплицированной ДНК. При
этом в быстро растущей культуре в бактериальной клетке протекает одновременно 2-3
перекрывающихся цикла репликации ДНК.
Если
время
удвоения
числа
клеток
постоянно
–
культура
находится
в
экспоненциальной фазе роста. Максимальная скорость роста возможно в оптимальных
условиях при наличии избытка нутриентов и факторов роста, на практике скорость роста
ограничивается недостатком питательных веществ, накоплением продуктов обмена,
старением культуры и другими причинами.
4
Скорость роста бактериальной колонии можно оценить при помощи показателя
время генерации (td) - период удвоения числа клеток в экспоненциальной фазе роста.
Также используется показатель коэффициент пропорциональности, (µ) – удельная
скорость роста (1/ед времени). Как правило, время генерации составляет от 15 мин до 1
сут.
Время генерации для некоторых микроорганизмов
Микроорганизм
Температура
Период генерации
инкубации (ºС)
(часов)
Beneckea natriegens
37
0,16
Escherichia coli
40
0,35
Bacillus subtilis
40
0,43
Staphylococcus aureus
37
0,47
Pseudomonas aeruginosa
37
0,58
Clostridium botulinum
37
0,58
Rhodospirillum rubrum
25
4,6-5,3
Anabaena cylindrica
25
10,6
Mycobacterium tuberculosis
37
12
Treponema palladium
37
33
Tetrahymena geleii
24
2,2-4,2
Scenedesmus quadricauda
25
5,9
Chlorella pyrenoidosa
25
7,75
Asterionella formosa
20
9,6
Leishmania donovani
26
10-12
Paramecium caudatum
26
10,4
Euglena gracilis
25
10,9
Acanthamoeba castellanii
30
11-12
Giardia lamblia
37
18
Ceratium tripos
20
82,8
30
2
Бактерии
Простейшие
Грибы
Saccharomyces cerevisiae
5
Monilinia fructicola
25
30
Пример:
Возрастание биомассы E.coli:
 1 клетка = объем 1 мкм3 , масса 10-12г, время генерации 1 ч.
 Спустя 48 часов :
248 клеток = 3*1014 клеток, масса 300г.
 Спустя 72 часа
5*1021 клеток, масса 50т.
Деление клеточной стенки происходит одним из нескольких способов
На основании числа или массы бактерий, можно вычислить константу скорости
деления и время генерации (время, необходимое для удвоения числа клеток). Число
бактериальных клеток в оптимальных условиях увеличивается в геометрической
прогрессии. В культуре за счет снижение количества питательных веществ и накопления
продуктов обмена, происходит снижение скорости роста.
6
Кривая роста отражает увеличение бактериальной популяции со временем.
Типичная кривая имеет следующие участки:

Начальная фаза (лаг-фаза), между стартом культуры и достижением максимальной
скорости деления. Скорость роста в начальной фазе низка – происходит адаптация
клеток.
Продолжительность лаг-фазы
увеличивается, если
клетки, которые
выращивались на более богатой среде, перенесены на обедненную среду;

Экспоненциальная фаза, характеризуется постоянной максимальной скоростью
роста;

Стационарная фаза, число клеток не увеличивается, выход клеток максимален –
«урожай».
Экспоненциального
прироста
не
наблюдается
из-за
исчерпания
питательных веществ и накопления продуктов обмена;

Фаза отмирания, наступает истощение среды – гибель клеток, образование спор и
цист, адаптация и скрытый рост на остатках лизированных клеток.
Помимо обычной кривой роста, можно выделить несколько особенностей роста
бактериальных колоний.
 Диауксический рост наблюдается в присутствии двух питательных субстратов.
Сначала бактерии используют наиболее эффективный источник питательных веществ,
далее наблюдается спад скорости роста с последующим вторым экспоненциальным
периодом роста на 2 субстрате. Остановка роста связана с индукцией ферментов.
7
 Линейный рост наблюдается в условиях лимитирующего фактора, (например
кислорода), поступление которого ограничивает рост колонии.
 Трофофаза/идиофаза (экспоненциальная, стационарная фазы). Фаза стабильного
развития колонии, число делящихся клеток равно числу отмирающих. Часто используется
в биотехнологической промышленности для выработки продукта.
Рост бактерий в культуре
Хемостатные (непрерывные культуры) используются в биотехнологии для синтеза.
Характеризуются постоянной плотностью популяции. Часть культуры отбирается для
выделения полезного продукта, взамен поступает свежая среда, содержащая питательные
вещества. Стационарная концентрация клеток остается постоянной при изменении
скорости протока среды. Скорость прироста устанавливается равной скорости их
вымывания. При изменении скорости разбавления, меняется скорость роста до
достижения нового равновесного состояния.
Общая схема хемостата представлена на рисунке:
Применение хемостатных культур:
 Изучение регуляторных процессов у прокариот;
 Исследование константы роста и реакции культуры на лимитирование факторов;
 Исследование экологии микроорганизмов.
8
 Конкуренцию субстратов и предпочтения проркариот;
 Исследование токсинов прокариот;
 Отбор мутантов;
 Исследование двухкомпонентных культур.
Рост МО на среде
Методы определения числа бактерий и бактериальной массы.
Основной метод определения числа живых бактериальных клеток, способных к
образованию новых колоний (колониеобразующие единицы – КОЕ), является метод
посадки на питательную среду клеточных суспензий в серии кратных разведений. С
каждым разведение плотность бактерий снижается, на определенном уровне удается
подсчитать количество КОЕ. Преимущества метода в том, что
учитываются
только
жизнеспособные
клетки,
способные
делиться, образуя новые бактериальные колонии.
Для подсчета общего числа клеток, пользуются подсчетом
в «счетной камере».
С помощью счетной камеры подсчитывается количество
клеток в суспензии бактерий.
Прямой подсчет под микроскопом.
9
Метод кратных разведений – основной метод подсчета жизнеспособных бактерий
(КОЕ).
Другие способы определения массы бактерий:
- Центрифугирование с последующим взвешиванием;
- Определение общего содержания азота или углерода;
- Колориметрия клеточных суспензий;
- Показатели интенсивности клеточного метаболизма;
- Измерение биомассы (светорассеяние или мутность).
- По метаболическим параметрам.
- По массе высушенных клеток.
- Нефелометрия, Турбидиметрия (спектрофотомерия).
- Наиболее вероятное число бактерий (метод предельных разведений).
- Подсчет на фильтре с иммерсионным маслом.
10
Турбидиметрия – измерение доли падающего света, которая теряется в результате
поглощения и рассеяния при прохождении через образец.
11
Примеры бактериального роста на искусственных питательных средах.
12
13
14
15
16