На правах рукописи - Вектор

На правах рукописи
КОСОГОВА
Татьяна Алексеевна
ШТАММЫ БАЗИДИАЛЬНЫХ ГРИБОВ ЮГА ЗАПАДНОЙ СИБИРИ
– ПЕРСПЕКТИВНЫЕ ПРОДУЦЕНТЫ БИОЛОГИЧЕСКИ
АКТИВНЫХ ПРЕПАРАТОВ
03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии)
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Кольцово – 2013
Работа выполнена в Федеральном бюджетном учреждении науки
«Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии Вектор»
Научный руководитель:
доктор биологических наук, профессор
Теплякова Тамара Владимировна
Официальные оппоненты:
Аликин Юрий Серафимович, доктор биологических наук, Институт
медицинской биотехнологии ФБУН Государственного научного центра
вирусологии и биотехнологии «Вектор», старший научный сотрудник
лаборатории нуклеиновых кислот и рекомбинантных белков
Новикова Татьяна Ивановна, доктор биологических наук, Центральный
сибирский ботанический сад СО РАН, заведующая лабораторией
биотехнологии
Ведущая организация
Иркутский государственный университет, НИИ Биологии при ИГУ
Защита состоится «06» сентября 2013 г. в 11-00 часов на заседании
диссертационного совета Д 208.020.01 при ФБУН «Государственный научный
центр вирусологии и биотехнологии Вектор» по адресу: 630559, р.п. Кольцово,
Новосибирского района Новосибирской области, тел. (383)336-74-28.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор»
Автореферат разослан «____» ______________ 2013 г.
Ученый секретарь
диссертационного совета
доктор биологических наук
Г.П. Трошкова
2
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы исследования
Во всем мире возрастает интерес к разработке лекарственных препаратов
на основе природных соединений. В медицине становятся приоритетными
направления по изучению природных источников лекарственных препаратов
(Борщевская M.И., Васильева С.М., 1999; Толстикова Т.Г. и др., 2010).
Одними из перспективных источников получения лекарственных
препаратов являются высшие грибы. Класс Agaricomycetes из отдела
Basidiomycota (базидиальные грибы) включает свыше 15 тыс. видов, более
100 видов используются в традиционной медицине Китая, Кореи, Японии и
других странах, в том числе и в России (Белова Н.В., 2004). В Японии из
плодовых тел дикорастущих и культивируемых грибов выпускают препараты,
содержащие полисахариды и их комплексы с белками, которые широко
используются при лечении онкологических заболеваний. Наиболее известные
из них: лентинан (из шиитаке Lentinula edodes (Berk.) Pegler,
полисахаридпептид (PSP) и полисахарид Крестин (PSK) (из траметеса
разноцветного Trametes versicolor (L.) Lloyd), ганодеран (из трутовика
лакированного (рейши) Ganoderma lucidum (Curtis) P. Karst.), плевран (из
вешенки устричной (обыкновенной) Pleurotus ostreatus (Jacq.) P. Kumm.),
грифолан (из грифолы курчавой Grifola frondosa (Dicks.) Gray) (Wasser S.P.,
2002; Moradali M. et al., 2007). Известны и другие соединения грибов,
определяющие их фармакологический потенциал.
В России широко используется гриб чага Inonotus obliquus (Ach. ex Pers.)
Pilát, включенный в 1959 г в Фармакопею СССР и препараты на его основе
«Бефунгин», «Чаги настой», а также новые препараты на его основе «Чаговит»
и «Чагалюкс» (Шашкина М.Я. и др., 2008). Грибы помогают преодолеть
негативное последствие химиотерапии рака, снижают содержание сахара и
холестерина в крови, оказывают общий иммуномодулирующий эффект,
восстанавливают гормональный баланс, улучшают состояние нервной системы.
Известны противовирусные свойства грибов. Многие исследователи
отмечают связь противоопухолевой и противовирусной активностей экстрактов
и соединений из грибов. Так, полисахарид лентинан из Lentinula edodes,
который был открыт как противоопухолевый препарат, проявляет
антивирусную активность в отношении вирусов везикулярного стоматита,
энцефалита, вируса Абельсона, аденовируса 12 типа, вируса гриппа типа А,
вируса иммунодефицита человека (Tochikura S., 1988). У известных
противоопухолевых полисахаридов PSK и PSP, выделенных из Trametes
versicolor, in vitro обнаружены противовирусные свойства в отношении ВИЧ и
цитомегаловируса (Collins R. A., Ng T. B., 1997; M. Moradali et al., 2007).
Поиск и выделение новых видов и штаммов лекарственных грибов из
природных местообитаний в культуру открывает перспективы пополнения
коллекций активными продуцентами для развития медицинской биотехнологии
и разработки новых фармакологических препаратов против заболеваний, в том
числе и вызываемых патогенными вирусами.
3
Юг Западной Сибири (Новосибирская область, Томская область,
Алтайский край, Горный Алтай) представляет собой уникальный регион России
с высокой концентрацией биоразнообразия и природных ресурсов. Лесные
экосистемы на юге Западной Сибири богаты грибами, в том числе и
лекарственными видами (Горбунова И.А. и др., 2005). Это позволяет
заниматься поиском перспективных штаммов грибов для изучения и
разработки новых биологически активных препаратов.
Выделение базидиальных грибов в культуру и сохранение их в коллекции
имеют большое значение также в связи с Международной Конвенцией о
сохранении биологического разнообразия.
Цель и задачи исследования
Цель исследования – выделение в культуру штаммов базидиальных
грибов, произрастающих на юге Западной Сибири, перспективных для
разработки биологически активных препаратов.
Для достижения поставленной цели решались следующие задачи.
1. Отбор базидиальных грибов из природных местообитаний юга
Западной Сибири, выделение в чистую культуру и изучение их морфологокультуральных и микроморфологических особенностей.
2. Подбор условий культивирования для кандидатных штаммов
базидиальных грибов с целью получения биомассы мицелия.
3. Получение водных экстрактов, полисахаридных фракций и меланина
из плодовых тел и культивируемого мицелия грибов и оценка их
противовирусной активности в отношении ряда вирусов, патогенных для
человека.
4. Характеризация перспективных штаммов базидиальных грибов для
разработки противовирусных препаратов.
Научная новизна и практическая значимость работы
Впервые выделены в чистую культуру 82 штамма 44 видов базидиальных
грибов, произрастающих на юге Западной Сибири.
Изучены микроморфологические особенности базидиальных грибов в
культуре, разработаны методики контроля и очистки культур базидиомицетов
от микофильных грибов.
Впервые проведен скрининг водных экстрактов, суммарных
полисахаридов и меланина на противовирусную активность в отношении ряда
вирусов, патогенных для человека. Выявлены штаммы грибов, проявляющие
противовирусную активность в клеточных культурах в отношении вирусов:
простого герпеса 2 типа, лихорадки Западного Нила, гриппа, иммунодефицита
человека 1 типа, осповакцины, натуральной оспы, оспы обезьян.
Представлены характеристики 10 кандидатных штаммов базидиальных
грибов, депонированных в Коллекции бактерий, бактериофагов и грибов ФБУН
ГНЦ ВБ «Вектор», с указанием их места выделения, систематического
положения,
лекарственных
свойств,
культурально-морфологических
особенностей, противовирусной активности.
4
Положения, выносимые на защиту
Выделены в чистую культуру 82 штамма 44 видов базидиальных грибов,
произрастающих на юге Западной Сибири.
В колониях 24-х видов грибов, выделенных в культуру, обнаружены
микофильные грибы, контроль на наличие которых гарантирует выделение
целевых видов.
Определены 10 кандидатных штаммов базидиомицетов – продуцентов
биологически активных препаратов в отношении вирусов: гриппа (ВГ),
иммунодефицита человека 1 типа (ВИЧ-1), простого герпеса 2 типа (ВПГ-2),
лихорадки Западного Нила (ВЛЗН), осповакцины (ВОВ), натуральной оспы
(ВНО), оспы обезьян (ВОО).
Трутовик скошенный (чага) Inonotus obliquus Т-9 имеет широкий спектр
противовирусной активности. Меланин, полученный из природного сырья и из
культивированного мицелия чаги, обладает при низкой токсичности
вируснейтрализующей способностью в отношении ВИЧ-1, ВПГ-2, ВГ, ВОВ,
ВОО.
Апробация работы
Результаты работы были представлены на 6 международных и
6 российских научных конференциях: Пятый съезд Общества биотехнологов
России им. Ю.А. Овчинникова (Москва, 2008); Всероссийская научнопрактическая конференция «Макромицеты бореальной зоны» (Красноярск,
2009); Научно-практическая конференция молодых ученых и специалистов
Роспотребнадзора «Биологическая безопасность в современном мире»
(Оболенск, 2009); Четвертая Всероссийская научно-практическая конференция
с международным участием «Фундаментальные аспекты компенсаторноприспособительных процессов» (Новосибирск, 2009); VII Международная
научно-практическая конференция «Пища. Экология. Качество» (Краснообск,
2010); IX Международная научно-практическая конференция «Проблемы
ботаники Южной Сибири и Монголии» (Барнаул, 2010); XII Международная
научно-практическая конференция «Наука и современность – 2011»
(Новосибирск, 2011); 6-я Международная конференция по лекарственным
грибам. The 6th International Medicinal Mushroom Conference (Zagreb, Croatia,
2011); Международная конференция «Биология – наука XXI века» (Москва,
2012); Международная конференция «Фундаментальные и прикладные
исследования. Образование, экономика и право» (Италия (Рим, Флоренция),
2012); Третий Съезд микологов России (Москва, 2012); VIII Международная
конференция «Проблемы лесной фитопатологии и микологии» (Ульяновск,
2012).
По материалам диссертации опубликованы 8 статей в журналах списка,
рекомендованного ВАК, получено 4 патента на изобретения.
Объём и структура диссертации
Диссертация изложена на 146 страницах машинописного текста,
содержит 67 рисунков, 16 таблиц, 4 приложения (на 26 страницах). Состоит из
введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы», 3-х глав
собственных исследований, выводов, списка литературы и приложений. Список
5
цитированной литературы включает в себя 200 источников, из них
иностранных – 81.
Вклад автора в диссертационную работу
Автор принимал личное участие на всех этапах исследований: отборе
базидиальных грибов в природе, выделении их в культуру, идентификации,
очистке от микромицетов-контаминантов и микофильных грибов, поддержании
культур в коллекции. При участии автора проводилось планирование
экспериментов, получение на питательных средах биомассы и плодовых тел
грибов, приготовление образцов из биомассы грибов (экстрактов, суммарных
полисахаридов, меланина) для оценки их на противовирусную активность,
анализ результатов скрининга, математическая обработка результатов,
фотографирование объектов исследования.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Глава 1 Литературный обзор
Представлены литературные данные по лекарственным свойствам грибов,
их применению в народной и официальной медицине. Приведены сведения по
основным биологически активным веществам (полисахаридам, белкам,
меланину), определяющим противоопухолевый и противовирусный эффект
грибов. Отмечены результаты исследований российских и зарубежных ученых
по разработке лекарственных препаратов на основе базидиальных грибов.
Исследования
(рисунок 1).
Глава 2 Материалы и методы
проводили в соответствии со
ОТБОР ПЛОДОВЫХ
ТЕЛ БАЗИДИАЛЬНЫХ ГРИБОВ
ВЫДЕЛЕНИЕ ГРИБОВ
В ЧИСТЫЕ КУЛЬТУРЫ
ИЗУЧЕНИЕ
КУЛЬТУРАЛЬНОМОРФОЛОГИЧЕСКИХ
ХАРАКТЕРИСТИК,
ОЦЕНКА ТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ
ХАРАКТЕРИСТИК
ПОЛУЧЕНИЕ ВОДНЫХ
ЭКСТРАКТОВ,
ПОЛИСАХАРИДНЫХ ФРАКЦИЙ,
МЕЛАНИНА ИЗ ПЛОДОВЫХ ТЕЛ
ПОЛУЧЕНИЕ ВОДНЫХ
ЭКСТРАКТОВ,
ПОЛИСАХАРИДНЫХ ФРАКЦИЙ,
МЕЛАНИНА
ИЗ БИОМАССЫ МИЦЕЛИЯ
ПОЛУЧЕНИЕ БИОМАССЫ
КУЛЬТУР ГРИБОВ НА
ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕДАХ
следующей
схемой
ОПРЕДЕЛЕНИЕ
ПРОТИВОВИРУСНОЙ
АКТИВНОСТИ
В ОТНОШЕНИИ ВИРУСОВ:
- ПРОСТОГО ГЕРПЕСА 2 ТИПА
- ЛИХОРАДКИ ЗАПАДНОГО
НИЛА
- ИММУНОДЕФИЦИТА
ЧЕЛОВЕКА 1 ТИПА
- ГРИППА
- ОСПОВАКЦИНЫ
- НАТУРАЛЬНОЙ ОСПЫ
- ОСПЫ ОБЕЗЬЯН
ХАРАКТЕРИЗАЦИЯ
КАНДИДАТНЫХ
ШТАММОВ ДЛЯ
РАЗРАБОТКИ
ПРОТИВОВИРУСНЫХ
ПРЕПАРАТОВ
ВЫЯВЛЕНИЕ МИКОФИЛЬНЫХ
ГРИБОВ В КУЛЬТУРАХ
БАЗИДИОМИЦЕТОВ
И ОЧИСТКА ОТ НИХ
РАЗРАБОТКА СТАНДАРТНОЙ ОПЕРАЦИОННОЙ ПРОЦЕДУРЫ
ПО КОНТРОЛЮ КУЛЬТУР БАЗИДИАЛЬНЫХ ГРИБОВ
НА НАЛИЧИЕ МИКРОМИЦЕТОВ
Рисунок 1 – Схема исследований
6
ДЕПОНИРОВАНИЕ ШТАММОВ
В КОЛЛЕКЦИИ
ФБУН ГНЦ ВБ ВЕКТОР
Отбор плодовых тел базидиальных грибов проводили из природных
местообитаний Новосибирской области, Алтайского края в 2008-2010 гг. в
различных равнинных и горных экосистемах. Идентификация видов
проводилась по справочникам и определителям грибов (Шварцман С.Р., 1964;
Шварцман С.Р., Филимонова Н.М., 1970; Бондарцев А.С., 1953; Самгина Д.И.,
1981; Miller O.K., Miller H.H., 1988; Змитрович И.В. и др., 2004).
Выделение базидиальных грибов в чистую культуру проводилось из
тканей свежесобранных грибов. Для исключения контаминации и выявления
микофильных грибов в культурах базидиомицетов мицелий микроскопировали
при разных увеличениях (×400, ×1000) на временных препаратах,
изготовленных методом «раздавленной капли». Проводили очистку культур от
микофилов пересевом молодого мицелия гриба с края колонии.
Для подтверждения идентичности выделенных видов грибов получали
плодовые тела на питательных средах и субстратах, регулируя параметры
влажности, температуры и освещенности.
Хранение выделенных штаммов осуществляли на скошенной
агаризованной питательной среде в пробирках при температуре 4±2 °С. Пересев
культур проводили 1 раз в год на агаризованный овсяной отвар. Научная
коллекция штаммов хранится в лаборатории микологии, депонированные
штаммы – в Коллекции бактерий, бактериофагов и грибов ФБУН ГНЦ ВБ
«Вектор», р.п. Кольцово, Новосибирская область.
Определение параметров роста и ростового коэффициента штаммов
грибов проводили согласно методике, описанной Бухало А.С. (1988).
Статистическую обработку данных проводили с использованием пакета
программ Excel 1998 (MS Office 2000, США).
Биомассу грибов получали путем поверхностного и глубинного
культивирования на жидких питательных средах. В качестве основных
питательных сред для роста культур использовали: отвар на основе овса (ОО)
(Бухало А.С., 1988); отвар на основе овса агаризованный (ООА) и глюкозопептонную среду (ГПС) (Семенов С.М., 1990) в нашей модификации;
питательные среды на основе свекловичной мелассы и кукурузного экстракта
(МК) (Горшина Е.С. и др., 2003; Соломко Э.Ф. и др., 1988; Теплякова Т.В.,
1992).
Подготовку водных экстрактов из плодовых тел проводили следующим
образом. Плодовые тела измельчали с помощью мельницы IKA® WERKE MF10 (размер частиц до 1 мм), суспендировали в дистиллированной воде в
соотношении 1:20, выдерживали на кипящей водяной бане в течение 20 минут.
Наросты (склероции) чаги измельчали, суспендировали в дистиллированной
воде в соотношениях 1:20, прогревали на кипящей водяной бане (20 мин), или
проводили экстракцию при 50 °С в течение 12, 24, 48 и 72 часов.
При подготовке водных экстрактов из культивированного мицелия
биомассу отделяли от питательной среды с помощью капронового фильтра,
измельчали с помощью гомогенизатора в дистиллированной воде, в
соотношении 1:5 по сырой массе (Бабицкая В.Г. и др., 2003). Разрушали
клеточные стенки грибов с помощью ультразвука, от осадка избавлялись
7
центрифугированием. В полученных экстрактах определяли содержание сухих
веществ (ГОСТ 24027.2–80, 1999). Экстракты хранили в морозильной камере
при температуре минус 30±2 °С.
Для выделения суммарных полисахаридов измельченную с помощью
гомогенизатора биомассу гриба в воде (объемное соотношение – сырая
биомасса : дист. вода – 1:5) прогревали на кипящей водяной бане в течение
12 часов. Выделившиеся в раствор полисахариды осаждали с помощью 96 %
этилового спирта (соотношение водный экстракт : этиловый спирт – 1:1) в
течение 18 часов при температуре 6±2 °С, отделяли центрифугированием в
течение 20 мин, высушивали (Бабицкая В.Г. и др., 2003).
Выделение меланина из природной и культивируемой чаги проводили
методом щелочного гидролиза (Сушинская Н.В. и др., 2005). Водорастворимую
форму получали растворением полученного пигмента в 10 % растворе аммиака
с последующим выпариванием остаточного аммиака и воды. Полученные
пигменты идентифицировали при помощи качественной реакции с KMnO 4,
H2O2, FeCl3 (Кукулянская Т.А. и др., 2002). Поглощение УФ и видимого света
водными растворами пигмента регистрировали на спектрофотометре.
Тестирование образцов из базидиальных грибов на противовирусную
активность осуществляли в вирусологических подразделениях ФБУН ГНЦ ВБ
Вектор с соблюдением необходимых требований в соответствии с методиками,
изложенными в Руководстве по экспериментальному (доклиническому) изучению
новых фармакологических веществ и др. документах (Государственная
фармакопея СССР, 1999; Руководство… под ред. Хабриева Р.У., 2005).
Оценку образцов из грибов в отношении вируса простого герпеса 2 типа и
лихорадки Западного Нила проводили на культуре клеток Vero. В работе были
использованы: штамм MS вируса простого герпеса 2 типа (получен из
Американской коллекции типовых культур (АТСС)) и штамм Egypt 101 ВЛЗН
(получен из Государственной коллекции вирусных штаммов ГУ НИИ
вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН (Москва, Россия)).
Работу с вирусами гриппа проводили на культуре клеток MDCK,
используя штаммы вируса гриппа птиц A/chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1) и
гриппа человека A/Aichi/2/68 (H3N2) из коллекции ФБУН ГНЦ ВБ Вектор.
Исследование противовирусной активности образцов в отношении ВИЧ-1
проводили на клетках МТ-4. Для эксперимента использовали вирус
иммунодефицита человека 1 типа (штамм ГКВ 4046 из коллекции ФБУН ГНЦ
ВБ Вектор).
Исследования по противовирусной активности образцов из грибов в
отношении ортопоксвирусов проводили на культуре клеток Vero.
В экспериментах использованы вирус осповакцины (штамм Л-ИВП), вирус
натуральной оспы (штамм Индия-3а) и вирус оспы обезьян (штамм V79-1-005)
из коллекции ФБУН ГНЦ ВБ Вектор.
8
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Глава 3 Базидиальные грибы, выделенные в культуру из природных
местообитаний юга Западной Сибири
С 2008 по 2010 г.г. научная коллекция лаборатории микологии в
результате работы по выделению базидиальных грибов в культуру была
пополнена и составила 82 штамма 44 видов грибов, произрастающих на юге
Западной Сибири (таблица 1). Выделенные грибы относятся к классу
Agaricomycetes отдела Basidiomycota.
Таблица 1 – Список базидиальных грибов, выделенных в культуру
Виды грибов
Asterophora lycoperdoides (Bull.) Ditmar
Астерофора звездчато-споровая
Battarrea phalloides (Dicks.) Pers.
Баттареа веселковидная
Calvatia lilacina (Mont. & Berk.) Henn.
Головач сиреневатый
Cerrena unicolor (Bull.) Murrill
Церрена многоцветная
Chlorophyllum agaricoides (Czern.)
Vellinga Хлорофиллум агарикоидный
Clitocybe nebularis (Batsch) P. Kumm.
Говорушка серая, дымчатая
Coprinus comatus (O.F. Müll.) Pers.
Навозник белый, лохматый
Cyathus olla (Batsch) Pers.
Бокальчик Олла
Daedaleopsis confragоsa (Bolton) J.
Schröt. Дедалеопсис шершавый
Fomes fomentarius (L.) Fr. Трутовик
настоящий, обыкновенный
Fomitopsis officinalis (Vill.) Bondartsev
& Singer Трутовик лиственничный
Fomitopsis pinicola (Sw.) P. Karst.
Трутовик окаймленный
Ganoderma applanatum (Pers.) Pat.
Трутовик плоский
Hericium cirrhatum (Pers.) Nikol.
Ежовик кудрявый
Heterobasidion annosum (Fr.) Bref.
Корневая губка
Inonotus obliquus (Ach. ex Pers.) Pilát
Трутовик скошенный, чага
Ischnoderma benzoinum (Wahlenb.) P.
Karst. Ишнодерма смолистая
Lentinus cyathiformis (Schaeff.) Bres.
Пилолистник бокаловидный
Количество
штаммов
Виды грибов
Lycoperdon perlatum Pers.
Дождевик шиповатый, жемчужный
Lycoperdon utriforme Bull. Головач
мешковидный
Neolentinus lepideus (Fr.) Redhead &
Ginns Пилолистник чешуйчатый
Panellus stipticus (Bull.) P. Karst.
Панеллюс вяжущий
Phallus impudicus L.
Веселка обыкновенная
Phellinus igniarius (L.) Quél.
Трутовик ложный, дубовый
Phellinus tremulae (Bondartsev)
Bondartsev & P. N. Borisov
Трутовик осиновый
Piptoporus betulinus (Bull.) P. Karst.
Трутовик березовый
Pleurotus calyptratus (Lindblad ex
Fr.) Sacc. Вешенка покрытая
Pleurotus ostreatus (Jacq.) P. Kumm.
Вешенка устричная, обыкновенная
Pleurotus pulmonarius (Fr.) Quél.
Вешенка легочная
Polyporus tuberaster (Jacq. ex Pers.)
Fr. Полипорус клубненосный
Royoporus badius (Pers.) A. B. De
Трутовик каштановый
Stropharia aeruginosa (Curtis) Quél.
Строфария сине-зеленая
Trametes gibbosa (Pers.) Fr.
Трутовик горбатый
Trametes hirsuta (Wulfen) Lloyd
Траметес жестковолосистый
Trametes ochracea (Pers.) Gilb. &
Ryvarden Траметес охряный
Trametes suaveolens (L.) Fr.
Траметес пахучий
1
1
1
1
1
1
2
1
2
2
1
5
5
1
1
3
1
1
9
Количество
штаммов
1
1
1
2
1
1
1
3
2
10
2
2
1
1
3
1
1
1
Продолжение таблицы 1
Виды грибов
Количество
штаммов
Lentinus tigrinus (Bull.) Fr.
Пилолистник тигровый
Lenzites betulina (L.) Fr.
Ленцитес березовый
Lycoperdon umbrinum Pers.
Дождевик умбровый
Laetiporus sulphureus (Bull.) Murrill
Трутовик серно-желтый
Виды грибов
Trametes trogii Berk.
Траметес Трога
Trametes versicolor (L.) Lloyd
Траметес разноцветный
Trichaptum biforme (Fr.) Ryvarden
Трихаптум двоякий
1
1
2
Trametes pubescens (Schumach.)
Pilát Траметес опушенный
2
Количество
штаммов
1
7
1
1
Выделение в культуру базидиальных грибов, произрастающих в данном
регионе, проведено впервые. Большинство выделенных нами видов
используется в народной медицине, а некоторые из них употребляются
человеком как съедобные. В основном это грибы, имеющие мягкие плодовые
тела. К ним относятся Pleurotus ostreatus (вешенка обыкновенная или
устричная), Pleurotus pulmonarius (вешенка легочная), Coprinus comatus
(навозник белый или лохматый), Morchella elata (сморчок высокий), Laetiporus
sulphureus (трутовик серно-желтый), Flammulina velutipes (опенок зимний),
Lentinula edodes (шиитаке), Lycoperdon perlatum (дождевик шиповатый),
Lycoperdon utriforme (дождевик мешковидный), Grifola frondosa (грифола
курчавая), Lentinus tigrinus(пилолистник тигровый), Lycoperdon umbrinum
(дождевик умбровый), Phallus impudicus (веселка обыкновенная), Piptoporus
betulinus (трутовик березовый), Sparassis crispa (спарассис курчавый).
Лекарственные грибы с твердыми плодовыми телами: Fomitopsis officinalis
(лиственничная губка, трутовик лиственничный), Ganoderma applanatum
(трутовик плоский), Fomes fomentarius (трутовик обыкновенный), Trametes
versicolor (траметес разноцветный).
Одним из признаков для идентификации базидиальных грибов послужила
способность к формированию на гифах пряжек (рисунок 2). У видов, не
имеющих таких образований, изучали строение разных типов гиф. Так, для
чаги в культуре характерными образованиями были коричневые
щетинковидные гифы, формирующиеся из вегетативных гиф (рисунок 3).
Рисунок 2 – Пряжка на гифе Ganoderma
applanatum М-8, ×1000
Рисунок 3 – Щетинковидные гифы Inonotus
obliquus Т-9, ×400
10
Подтверждение идентичности выделенных в культуру видов
осуществляли изучением микроморфологических особенностей мицелия и
получением стадии телеоморфы (плодовых тел) в культуре (рисунки 4-6).
Рисунок 4 – Гифы
Pleurotus pulmonarius К-96
с пряжками (показаны
стрелками), ×1000
Рисунок 5 – Плодовые тела
P. pulmonarius К-96,
полученные на березовых
опилках
Рисунок 6 – Колония
Flammulina velutipes PSt
с плодовыми телами в чашке
Петри
Во время работы с культурами нашей коллекции зачатки плодовых тел
удалось получить у Cerrena unicolor, Daedaleopsis confragosa, Datronia mollis,
Dichomitus campestris, Fomes fomentarius, Hericium cirrhatum, Lenzites betulina,
Piptoporus betulinus, Pleurotus ostreatus, Р. calyptratus, Р. pulmonarius, Р. eryngii,
Trametes gibbosa, Т. pubescens, Т. versicolor, Volvariella volvacea.
При создании необходимого температурного режима зимний опенок
Flammulina velutipes формировал плодовые тела на агаризованных средах в
пробирках, в чашках Петри. Вешенки Pleurotus ostreatus и Р. pulmonarius
образовывали развитые плодовые тела на опилках и лузге подсолнечника.
При выделении базидиальных грибов в чистую культуру особое
внимание уделяли наличию в колониях грибов-микромицетов, которые могли
быть не только контаминантами, но и микофилами. Постоянный контроль
состояния колоний и мицелия позволили обнаружить у двадцати четырех видов
грибов микофильные грибы. Из микофильных грибов, имеющих
спороношение, отмечены грибы из родов Fusarium, Trichoderma, Penicillium. Но
чаще встречался гриб с тонкими гифами, на протяжении которых имелись
утолщения, которые, по-видимому, играют роль в осуществлении контакта с
гифами гриба-хозяина. Присутствие микофильных грибов в культурах
сопровождается появлением участков пустых гиф гриба-хозяина.
С целью предотвращения использования ложных продуцентов и грибовмикофилов, была разработана стандартная операционная процедура (СОП 2013-01-13) «Контроль культур базидиальных грибов на наличие микофилов на
разных этапах (хранение, посев, выращивание биомассы)».
11
Глава 4 Перспективные штаммы базидиальных грибов
с противовирусной активностью
Всего на противовирусную активность протестировано 447 образцов из
базидиальных грибов. На основе первичного скрининга образцов были
определены 10 кандидатных штаммов базидиомицетов, образцы из которых
показали противовирусный эффект в отношении 3-х и более вирусов и могут
являться основой для изучения и разработки противовирусных препаратов
(таблица 2). В отношении депонированных штаммов в диссертации приведены
полные данные по противовирусной активности.
Самый широкий спектр противовирусной активности проявил гриб чага
Inonotus obliquus, водные экстракты из склероция подавляли размножение всех
исследованных вирусов в культурах клеток. В отношении ВПГ-2
ингибирующая концентрация водного экстракта по сухому веществу из
склероция составила IC50=0,012±0,004 мг/мл; в отношении ВЛЗН –
IC50=0,37±0,12 мг/мл; в отношении ВИЧ-1 – IC50=0,00012±0,00005 мг/мл;
в отношении ортопоксвирусов (ВНО и ВОО) 0,26±0,08 и 0,03±0,01 мг/мл
соответственно (рисунок 7). В отношении ВОВ проявил активность меланин из
чаги (IC50=0,125±0,038 мг/мл). В отношении вируса гриппа (H5N1) водные
экстракты из склероция чаги в концентрации 0,05±0,016 мг/мл подавляли
4,7±1,2 lg вируса (титр вируса гриппа субтипа H5N1 в контроле составил
7,80±1,00 lg).
IC 50, мг/мл
0,1
0,26
0,37
1
0,03
0,012
0,01
0,001
0,00012
0,0001
ВПГ-2
ВЛЗН
ВИЧ-1
ВНО
ВОО
Вирусы
Рисунок 7 – Противовирусная активность водных экстрактов из склероция гриба чаги
Inonotus obliquus
Экстракт из культивированного гриба Inonotus obliquus Т-9 показал
меньшие результаты по отношению к ВГ. При концентрации 0,13±0,03 мг/мл
индекс нейтрализации вируса гриппа составил 2,43±0,92 lg для H5N1 и всего
0,75±0,49 lg для H3N2 (при титре вируса гриппа H5N1 в контроле –
7,80±1,00 lg; H3N2 – 7,50±0,50 lg). Мицелий и полисахариды из глубинной
культуры были активны в отношении ВПГ-2 с IC50=0,3±0,1 и 0,12±0,04 мг/мл
соответственно.
12
Таблица 2 – Депонированные штаммы базидиальных грибов, проявившие противовирусную активность
№
п/п
Вирусы гриппа
Наименование видов,
штаммов грибов
ВПГ-2
ВЛЗН
1.
Daedaleopsis confragosa К-116
●
●
2.
Fomes fomentarius Кр-112
●
3.
Fomitopsis officinalis СА-8
4.
Ganoderma applanatum М-8
●
5.
Inonotus obliquus Т-9
●
●
6.
Laetiporus sulphureus О-9
●
●
7.
Phallus impudicus К-917
●
8.
Pleurotus ostreatus БШ-08
●
●
●
●
9.
Pleurotus pulmonarius К-96
●
●
●
●
●
10.
Trametes versicolor К-817
●
●
●
●
●
ВИЧ-1
(H5N1)
(H3N2)
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
●
Примечания
● – отмечена эффективность;
пустая ячейка – исследования не проводились.
13
Ортопоксвирусы
ВНО
ВОВ
●
●
ВОО
●
●
●
●
Из других видов грибов заслуживают внимания: траметес разноцветный
T. versicolor К-817, образцы из которого проявили активность в отношении
5 вирусов (ВИЧ-1, ВПГ-2, ВЛЗН, ВГ (H5N1, H3N2); образцы из вешенки
легочной P. pulmonarius К-96 подавляли репликацию этих же вирусов; трутовик
плоский G. applanatum М-8 проявил активность в отношении 4 вирусов (ВИЧ-1,
ВПГ-2, ВНО, ВГ (H5N1); трутовик серно-желтый L. sulphureus О-9 был активен
в отношении 4 вирусов (ВПГ-2, ВЛЗН, ВГ (H5N1, H3N2); вешенка устричная
P. ostreatus БШ-08-01 – в отношении 4 вирусов (ВИЧ-1, ВПГ-2, ВЛЗН, ВГ
(H5N1); веселка обыкновенная P. impudicus К-917 – в отношении 3 вирусов
(ВПГ-2, ВЛЗН, ВГ (H5N1, H3N2).
В отношении некоторых вирусов исследования проведены впервые.
К приоритетным
можно
отнести
исследования,
выполненные
на
ортопоксвирусах, в частности, на вирусе натуральной оспы. Дальнейшие
исследования химических метаболитов из грибов (F. officinalis, I. obliquus),
подавляющих репликацию ВНО, могут обнаружить соединения с разными
механизмами действия, что является актуальным для разработки лечебных
препаратов против натуральной оспы.
Больше всего протестировано образцов в отношении вируса гриппа
(161 образец). Данные по оценке противогриппозной эффективности водных
экстрактов из плодовых тел и биомассы мицелия, полученной путем
культивирования грибов на питательной среде, свидетельствуют о возможности
разработки лекарственных препаратов на основе грибов с помощью
биотехнологии.
Образцы из плодового тела и культивированного мицелия трутовика
обыкновенного Fomes fomentarius Кр-112 в клеточной культуре MDCK в
отношении вируса гриппа субтипа H3N2 проявили сходную эффективность
(IN=2,90±0,55 lg и IN=2,75±0,35 lg, соответственно). Аналогичные результаты
были получены при испытании гриба веселки обыкновенной Phallus
impudicus К-917 на вирусе гриппа H5N1. Образцы из плодовых тел подавляли
репликацию вируса в клетках на 5,20±1,50 lg, из культивированного мицелия –
на 4,45±1,60 lg. Подтверждением этого являются высокие результаты по
противовирусной активности экстрактов из мицелия из 2-х видов вешенок в
отношении вируса гриппа птиц. Индекс нейтрализации образца из мицелия
вешенки устричной Pleurotus ostreatus БШ-08-01 составил 5,0±0,3 lg, а из
вешенки легочной Pleurotus pulmonarius К-96 – 4,50±1,41 lg. Образцы из
плодовых тел вешенки легочной подавляли вирус гриппа на 6,06±0,18 lg
(рисунок 8). Титр вируса в контроле составил для H5N1 – 7,80±1,00 lg, для
H3N2 – 7,5±0,5 lg.
Эксперименты на лабораторных животных подтверждают низкую
токсичность образцов из культивированного мицелия базидиомицетов при
введении опытным и контрольным животным экстрактов и дистиллированной
воды в объеме 200 мкл/мышь перорально в течение 5-ти дней. В конце
эксперимента животные имели массу, сравнимую с массой контрольных
мышей, не имели патологии внутренних органов.
Индекс нейтрализации вируса, lg
8
5,2
7
5
4
3
6,06 4,5
4,45
6
5,0
2,9
2,75
2
1
0
F. fomentarius
P. impudicus
плодовое тело
P. ostreatus
P. pulmonarius
мицелий
Рисунок 8 – Эффективность водных экстрактов из плодовых тел и биомассы мицелия грибов
в отношении вируса гриппа
Противовирусная активность на белых мышах в отношении вируса
гриппа птиц A/chicken/Kurgan/05/2005(H5N1) проявлялась при значительно
меньших концентрациях экстрактов по сухим веществам (таблица 3).
Таблица 3 – Противовирусная активность экстрактов из мицелия грибов in vivo
в отношении вируса гриппа птиц A/chicken/Kurgan/05/2005(H5N1)
(профилактическая схема)
Наименование штамма
G. applanatum М-8
Трутовик плоский
P. pulmonarius К-96
Вешенка легочная
F. fomentarius Кр-112
Трутовик обыкновенный
Тамифлю
Масса сухих Максимально Использованвеществ
переносимые
ные
(M±Sm), мг/мл концентрации, концентрации,
мг/мл
мг/мл
Количество
выживших
животных
(n=6)
8,9±0,04
4,5
0,1
2 (33,3 %)
10,1±0,4
5,0
0,1
2 (33,3 %)
10,4±0,1
5,0
0,1
4 (66,6 %)*
0,4
–
0,4
2 (33,3 %)*
Дистиллированная вода
–
–
–
1 (16,6 %)
П р и м е ч а ни я
M – среднее арифметическое; Sm – стандартное отклонение; n – число животных в группе;
* – отличие от контроля по критерию χ2 при р≤0,05
Из полученных данных (таблица 3) видно, что наибольшее количество
выживших животных было в случае использования экстракта гриба Fomes
fomentarius (66,6 %), которое превышало число выживших мышей в контроле
(дист. вода) на 50,0 % и при применении коммерческого препарата Тамифлю на
33,3 %. Экстракты двух других грибов Ganoderma applanatum и Pleurotus
pulmonarius проявили противовирусную активность, сравнимую с таковой для
15
Тамифлю. Полученные данные свидетельствуют о возможности получения
нетоксичных и эффективных противовирусных препаратов на основе биомассы
мицелия грибов.
Одними из важных биологически активных соединений в водных
экстрактах базидиальных грибов являются полисахариды и их комплексы с
белками, которые, согласно литературным данным, проявляют не только
противоопухолевый эффект (Wasser S.P., 2002), но и противовирусный эффект
(Collins R.A., Ng T.B, 1997; Moradali M. et al., 2007). Наши исследования
подтверждают, что полисахариды, содержащиеся в водных экстрактах грибов,
участвуют в подавлении размножения вирусов в клеточных культурах. В
таблице 4 приведены результаты по определению эффективности водных
экстрактов из мицелия и полисахаридных фракций некоторых штаммов грибов
в отношении вируса простого герпеса и вируса натуральной оспы.
Таблица 4 – Эффективность водных экстрактов из мицелия и суммарных
полисахаридных фракций в отношении ВПГ-2 и ВНО
Вид, штамм
гриба
ВПГ-2
IC50 (M±Sm), мг/мл по сухому
веществу
Водный
Суммарные
экстракт
полисахариды
ВНО
IC50 (M±Sm), мг/мл по
сухому веществу
Водный
Суммарные
экстракт
полисахариды
F. officinalis СА-8
Трутовик лиственничный
н.и.
н.и.
0,07±0,02 0,004±0,0012
G. applanatum М-8
Трутовик плоский
н.и.
н.и.
1,0±0,3
0,005±0,0015
F. fomentarius Кр-112
Трутовик настоящий
0,2±0,06
0,01±0,003
н.и.
н.и.
I. obliquus Т-9
Трутовик скошенный, чага
0,3±0,1
0,12±0,04
н.и.
н.и.
P. impudicus К-917
Веселка обыкновенная
0,03±0,009
0,003±0,001
н.и.
н.и.
P. ostreatus БШ-08-01
Вешенка устричная
0,15±0,045
0,05±0,014
н.и.
н.и.
P. pulmonarius К-96
Вешенка легочная
0,48±0,16
0,25±0,08
н.и.
н.и.
Примечания
н.и. – не исследовали; M – среднее арифметическое; Sm – стандартное отклонение.
Из результатов таблицы 4 видно, что суммарные полисахариды
проявляют противовирусный эффект в более низких концентрациях, чем
водные экстракты из этих же штаммов грибов.
Если разница по активности водного экстракта и полисахаридов из него
не очень значительна (P. ostreatus, P. pulmonarius), это связано с высоким
содержанием полисахаридов в исследуемом экстракте. Интерес для
дальнейших исследований полисахаридов представляют многие виды и
штаммы грибов, имеющиеся в коллекции, известные большим содержанием
полисахаридов (Щерба В. В., Бабицкая В. Г., 2008). К ним можно отнести виды
родов Ganoderma, Trametes, Fomes, Lentinula, Laetiporus, Phallus, Pleurotus и др.
16
Большой интерес для дальнейшей работы представляют съедобные грибы,
например, вешенка. Грибы рода Вешенка представляют пищевую ценность и
культивируются во многих странах мира. В Сибири наиболее широко
распространенными видами этого рода в природе являются P. ostreatus и
P. pulmonarius, среди которых целесообразно вести отбор наиболее
эффективных штаммов-продуцентов полисахаридов или их комплексов с
белками. Наши исследования, проведенные на нескольких видах грибов рода
Вешенка (таблица 5), подтвердили активность экстрактов из этих грибов
против ВИЧ-1 (Wang H. X., Ng T. B., 2000).
Таблица 5 – Антиретровирусная активность водных экстрактов из грибов рода
Pleurotus
Виды и штаммы
Содержание
Концентрация
сухого
полисахаридов
вещества в
в экстракте,
водном
% от сухого
экстракте,
вещества
(M±Sm), мг/мл
ТC50,
(M±Sm), мг/мл
IС50,
(M±Sm), мг/мл
P. eryngii PSt
2,5±0,06
н.и.
0,025±0,007
0,00004±0,00001
Вешенка королевская
P. ostreatus БШ-08-01
3,5±0,07
91,98
0,044±0,009
0,00011±0,00003
Вешенка устричная
P. djamor PSt
2,4±0,11
н.и.
0,060±0,011
0,00008±0,00001
Вешенка розовая
P. pulmonarius К-96
7,30±0,14
29,94
0,200±0,050
0,023±0,007
Вешенка легочная
Примечания
н.и. – не исследовали; M – среднее арифметическое; Sm – стандартное отклонение.
Следует отметить, что противовирусной активностью обладают все
4 вида вешенок, отобранные не только из Сибири, но и из других
климатических зон (P. eryngii, P. djamor – из коллекции P. Stamets, США).
Можно сделать вывод о целесообразности отбора эффективных штаммов среди
грибов рода вешенка (Pleurotus).
На примере водных экстрактов, содержащих в основном полисахариды и
белки, нами совместно с сотрудниками сектора биохимии на клетках
карциномы гортани Нер-2 было показано, что многие экстракты, обладающие
вируснейтрализующей активностью, проявляли и противоопухолевый эффект.
Концентрация сухого вещества экстракта, ингибирующая рост опухолевых
клеток на 50 %, составляла от 50 до 200 мг/мл. Данные свидетельствуют о
корреляции противовирусной и противоопухолевой активностей.
Десять штаммов базидиальных грибов депонированы в Коллекции ФБУН
ГНЦ ВБ Вектор. Получены 4 патента на противовирусные средства из грибов,
свидетельствующие о новизне проведенной работы.
В работе представлены характеристики перспективных штаммов,
включающие описание микроморфологических особенностей, сведения по
получению биомассы в культуре, химическому составу грибов, их известным
лекарственным свойствам и данным по противовирусной активности.
17
Таким образом, представленные кандидатные штаммы базидиальных
грибов могут являться продуцентами биологически активных соединений
(полисахаридов, меланина), обладающих противовирусными свойствами.
Преимуществом использования биомассы культивированного мицелия является
контролируемость сырья, возможность получения стандартной биомассы на
основе более эффективных штаммов-продуцентов биологически активных
соединений, составляющих основу препарата.
Глава 5 – Гриб чага Inonotus obliquus – перспективный объект
биотехнологии для получения противовирусных препаратов
Поскольку запасы природной чаги стремительно падают, практический
интерес для биотехнологии представляют штаммы, выделенные из склероциев
(наростов) чаги в культуру.
Имеющиеся в коллекции 4 штамма Inonotus obliquus различаются при
росте на питательных средах по морфолого-культуральным характеристикам,
продуктивности биомассы. При культивировании на агаризованной среде
(таблица 6), был определен ростовой коэффициент, что позволило штамм
I. obliquus Т-9 (рабочее название) использовать в качестве продуцента
биомассы мицелия для получения из нее водных экстрактов и меланина.
Таблица 6 – Продуктивность мицелия разных штаммов I. obliquus, 9 суток роста
на агаризованном овсяном отваре (n=3)
Штаммы
I. obliquus
Высота колонии,
мм
Плотность
колонии, балл
Ростовой
коэффициент
F-1656
Диаметр
колонии,
(M±Sm), мм
65,8±5,3
3
1
22,0
B-09-23
55,0±4,7
3
1
18,3
C-09-01
76,7±3,3
2
2
34,2
T-9
72,4±4,5
3
2
48,0
Примечания
M – среднее арифметическое; Sm – стандартное отклонение; n – число опытов.
Подбор питательных сред и условий культивирования позволил
оптимизировать выход биомассы. При стационарном культивировании на
жидких средах наибольший выход биомассы был получен на глюкозопептонной среде (ГПС) (Семенов С.М., 1990) в нашей модификации
(таблица 7). В дальнейшем эту среду использовали для глубинного
культивирования I. obliquus Т-9 на качалках и в ферментере.
Таблица 7 – Выход биомассы I. obliquus Т-9 при стационарном
культивировании на жидких средах в течение 20 суток, (M±Sm, n=3), г/л
Штамм гриба
ОО
МК
ГПС
I. obliquus Т-9
2,9±0,2
3,2±0,2
10,5±0,1
Примечания
M – среднее арифметическое; Sm – стандартное отклонение; n – число опытов.
18
В ГПС в глубинных условиях на круговой качалке (скорость вращения
180-200 об./мин, 24±2 °С) выход биомассы данного штамма по сухим
веществам составил 17,2±0,8 г/л, а при выращивании в биореакторе –
22,3±1,2 г/л. Начиная с 9-10 суток роста на качалке, питательная среда
приобретает темно-коричневый цвет за счет выделяющегося в нее меланина
(рисунок 9). В этот период в культуре наблюдаются многочисленные
фрагменты гиф коричневатого цвета, отделяющиеся от шаровидных колоний
(рисунок 10). Темно-коричневое окрашивание культуральной жидкости
появляется при росте в ферментере на 4-5-е сутки. Для получения меланина
ферментацию на качалке заканчивали на 12-е сутки, а в ферментере – на 9-е
сутки.
Рисунок 9 – I. obliquus Т-9, культивирование
в течение 5 суток на глюкозо-пептонной
среде в ферментере
Рисунок 10 – Отдельные гифы I. obliquus Т-9
в питательной среде при выращивании на
качалке
Повышение эффективности получения меланина из природной чаги
Извлечение меланина проводили из природного сырья чаги,
культивированного мицелия и культуральной жидкости Inonotus obliquus Т-9.
С целью повышения выхода меланина из чаги нами были апробированы
разные способы подготовки природного сырья. При первом способе
использовали готовое аптечное сырье, частицы которого проходили через сито
с отверстиями диаметром 7 мм (Государственная фармакопея СССР, 1990).
Второй способ – аптечное сырье чаги измельчали на мельнице IKA® WERKE
MF-10 для получения частиц размером до 2 мм. Третий способ –
механохимическая
обработка
сырья:
воздушно-сухая
масса
гриба
предварительно измельчалась до размера частиц до 3 мм; полученный
полупродукт смешивался до однородной массы с карбонатом натрия, в
соотношении 95:5 по массе. Смесь подвергалась механохимической обработке
в проточной шаровой эллипсовидной центробежной мельнице типа РМ-1
(разработка института химии твердого тела и механохимии СО РАН,
г. Новосибирск) при ускорении мелющих тел 200 м/с2 и времени пребывания в
зоне обработки 0,5 мин. Размер частиц чаги после такой обработки составлял
70-80 мкм (Теплякова Т.в. и др., 2012).
19
Сравнительный анализ различных способов подготовки и обработки
сырья для извлечения меланинов показал, что на эффективность экстракции
меланинов влияют все исследованные факторы: способ измельчения чаги,
размеры частиц чаги, продолжительность и температура обработки (таблица 8).
Таблица 8 – Выход меланина при различных способах подготовки сырья и
условиях проведения экстракции
№
варианта
Условия экстракции
Выход
меланина,
(M±Sm, n=4), %
Размеры частиц до 7 мм
(аптечное сырье)
1
2 суток при 50 °С
11,0 ± 1,0
2
30 минут при 112 °С
13,3 ± 1,6
Размеры частиц до 2 мм
(мельница IKA MF 10)
3
2 суток при 50 °С
21,3 ± 1,1
4
30 минут при 112 °С
24,4 ± 1,8
5
2 суток при 50 °С
28,2 ± 2,3
6
30 минут при 112 °С
30,1 ± 2,0
Размеры частиц чаги разных
способов подготовки
Размеры частиц 70-80 мкм,
механохимическая обработка,
(мельница РМ-1)
Примечания
M – среднее арифметическое; Sm – стандартное отклонение; n – число опытов.
Как видно из таблицы 8, на извлечение меланина особенно сильно влияет
размер частиц: в ряду вариантов №№ 1, 3 и 5 выход меланина увеличивается.
Увеличение температуры, очевидно, ускоряет процесс извлечения так, что за
30 мин при 112 °С (варианты №№ 2, 4 и 6) извлекается приблизительно столько
же меланина, сколько экстрагируется за двое суток при 50 °С (варианты №№ 2
и 4). Использование высокой температуры позволяет существенно сократить
затраты времени. Однако при этом могут разрушаться биологически активные
вещества. Поэтому выбор условий экстракции зависит также от
термостабильности извлекаемых веществ.
Наибольший выход пигмента, 30,1±2,0 % от массы гриба был достигнут
при разрушении биомассы посредством механохимической обработки,
извлечение меланина было увеличено на 19 %.
Получение меланина из культивируемой чаги Inonotus obliquus Т-9
При выделении меланина из культуральной жидкости Inonotus obliquus Т9 был достигнут максимальный выход меланиновых пигментов, который
составил 4,0±0,3 г/л (20 % от сухой биомассы). Результаты качественных
реакций и спектры поглощения 0,005 %-ных растворов (рисунок 11) показали,
что пигмент, полученный из культивированной чаги, можно отнести к
меланину. Известно, что меланины из природной чаги и выращенной в
культуре имеют разное химическое строение и поэтому могут различаться по
биологической активности (Бабицкая В.Г. и др. 2000).
В таблице 9 представлены обобщенные данные по противовирусной
активности меланина, полученного из природной чаги и из биомассы
20
3
Оптическая плотность .
2,5
2
1,5
1
0,5
700
680
660
640
620
600
580
560
540
520
500
480
460
440
420
400
380
360
340
320
300
280
260
240
0
Длина волны, нм
Меланин из склероция чаги
Меланин из культивированной чаги
Рисунок 11 – Спектры поглощения в УФ- и видимой областях 0,005 % водных растворов
меланинов из природного и культивированного гриба I. obliquus Т-9
Таблица 9 – Противовирусная активность меланина из чаги
Вирус, штамм
Культура
клеток
Концентрации меланина, ингибирующие
вирус (M±Sm, n=3), мг/мл
Природная чага
Культивированная
чага
ВИЧ-1, ГКВ 4046
МТ-4
0,002±0,00065
0,038±0,011
ВПГ-2, MS
VERO
0,003±0,0009
0,0025±0,0008
ВГ, А/Chicken/Kurgan05/2005
MDCK
0,02±0,006
н.и.
ВОВ, Л-ИВП
VERO
0,125±0,038
н.и.
ВОО, V79-1-005
VERO
0,071±0,021
н.и.
Примечания
для ВИЧ-1, ВПГ-2, ВОВ, ВОО – концентрация меланина, ингибирующая 50 % вируса (IC50),
мг/мл; для ВГ – концентрация меланина, подавляющая 2,2 lg вируса гриппа; н.и. – не
исследовали; M – среднее арифметическое; Sm – стандартное отклонение; n – число опытов.
культивируемого штамма чаги I. obliquus Т-9, которые показали, что меланин,
полученный из склероция, обладает противовирусной активностью в
отношении нескольких вирусов: ВИЧ-1, ВПГ-2, ВГ, ВОВ, ВОО. Меланин,
полученный из культивированной чаги, был проверен только в отношении
ВИЧ-1 и ВПГ-2. Полученные данные свидетельствуют о перспективности
дальнейших исследований по получению меланина из биомассы мицелия и
культуральной жидкости чаги.
Таким образом, результаты исследований свидетельствуют о
перспективности разработки профилактических и лечебных препаратов на
основе штаммов культивированной чаги. Одним из биологически активных
21
соединений гриба является пигмент меланин, проявляющий противовирусную
активность.
ВЫВОДЫ
1.
В чистую культуру впервые выделены 82 штамма 44 видов
базидиальных грибов, произрастающих на юге Западной Сибири, большинство
из которых относится к съедобным или лекарственным грибам.
2. В колониях 24-х видов грибов обнаружены микофильные грибы.
Разработана стандартная операционная процедура по контролю культур
базидиальных грибов на наличие грибов-микофилов с целью предотвращения
использования ложных продуцентов биомассы.
3.
Определены 10 кандидатных штаммов базидиомицетов, которые
при низкой токсичности показали противовирусный эффект в отношении 3-х и
более вирусов, и могут являться основой для разработки противовирусных
препаратов:
– в отношении ВИЧ-1 – чага Inonotus obliquus Т-9, вешенка устричная
Pleurotus ostreatus БШ-08-01, трутовик разноцветный Trametes versicolor К-817;
– в отношении ВПГ-2 – дедалеопсис шершавый Daedaleopsis confragosa
К-116, чага Inonotus obliquus Т-9, веселка обыкновенная Phallus impudicus К917, вешенка устричная Pleurotus ostreatus БШ-08-01, трутовик плоский
Ganoderma applanatum М-8;
– в отношении ВЛЗН – вешенка устричная Pleurotus ostreatus БШ-08-01,
вешенка легочная P. pulmonarius К-96, трутовик серно-желтый Laetiporus
sulphureus О-9;
– в отношении ортопоксвирусов – чага Inonotus obliquus Т-9,
лиственничная губка Fomitopsis officinalis СА-8;
– в отношении вирусов гриппа – трутовик плоский Ganoderma
applanatum М-8, трутовик серно-желтый Laetiporus sulphureus О-9, веселка
обыкновенная Phallus impudicus К-917, чага Inonotus obliquus Т-9, дедалеопсис
шершавый Daedaleopsis confragosa К-116, вешенка легочная Pleurotus
pulmonarius К-96, трутовик обыкновенный Fomes fomentarius Кр-112, вешенка
устричная Pleurotus ostreatus БШ-08-01;
4. Установлено, что гриб чага Inonotus obliquus обладает самым широким
спектром противовирусной активности. Для дедалеопсиса шершавого
Daedaleopsis confragosa и веселки обыкновенной Phallus impudicus
противовирусная активность показана впервые.
5. Впервые проведены исследования на ВНО. Показано, что штаммы
базидиальных грибов Inonotus obliquus Т-9, Fomitopsis officinalis СА-8,
Ganoderma applanatum М-8 проявляют противовирусный эффект в отношении
этого патогена.
6. Для эффективного штамма чаги Inonotus obliquus Т-9 подобраны
условия, позволяющие получать в погруженной культуре от 17,2 до 22,3 г/л
сухой биомассы гриба. Выделен пигмент меланин, выход которого из
культивируемой чаги составил 20 %. Из природного чаги был повышен выход
пигмента на 19 % за счет механохимической обработки сырья.
22
7. Установлено, что основными действующими веществами
базидиомицетов, проявляющими противовирусную активность в отношении
ВПГ-2 ВЛЗН и ВНО, являются суммарные полисахариды (от 0,003 до
0,3 мг/мл) и меланин (от 0,002 до 0,125 мг/мл) в отношении ВИЧ-1, ВПГ-2, ВГ,
ВОВ, ВОО.
Список работ, опубликованных по теме диссертации
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
Статьи в научных журналах, рекомендованных ВАК
Горбунова И.А.,
Власенко В.А.,
Теплякова Т.В.,
Косогова Т.А.,
Михайловская И.Н. Ресурсы лекарственных грибов на юге Западной
Сибири // Хвойные бореальной зоны. 2009. XXVI. № 1. С. 12-21.
Горбунова И.А.,
Власенко В.А.,
Теплякова Т.В.,
Косогова Т.А.,
Михайловская И.Н. Коллекция культур лекарственных грибов Западной
Сибири как основа для дальнейших биотехнологических исследований //
Иммунопатология, аллергология, инфектология. 2009. № 1. С. 39-40.
Гашникова Н.М.,
Теплякова Т.В.,
Проняева Т.Р.,
Пучкова Л.И.,
Косогова Т.А., Сергеев А.Н. Результаты исследований по выявлению
анти-ВИЧ активности экстрактов из высших базидиальных грибов //
Иммунопатология, аллергология, инфектология. 2009. № 2. С. 170-171.
Кабанов А.С.,
Шишкина Л.Н.,
Теплякова Т.В.,
Пучкова Л.И.,
Косогова Т.А., Мазуркова Н.А., Скарнович М.О., Сергеев А.Н. Изучение
противовирусной
эффективности
экстрактов,
выделенных
из
базидиальных грибов, в отношении вируса гриппа птиц //
Иммунопатология, аллергология, инфектология. 2009. № 2. С. 185-186.
Разумов И.А.,
Косогова Т.А.,
Казачинская Е.И.,
Пучкова Л.И.,
Щербакова Н.С., Горбунова И.А., Михайловская И.Н., Локтев В.Б.,
Теплякова Т.В. Противовирусная активность водных экстрактов и
полисахаридных фракций, полученных из мицелия и плодовых тел
высших грибов // Антибиотики и химиотерапия. 2010. 55. 9-10. С. 14-18.
Кабанов А.С.,
Косогова Т.А.,
Шишкина Л.Н.,
Теплякова Т.В.,
Скарнович М.О.,
Мазуркова Н.А.,
Пучкова Л.И.,
Малкова Е.М.,
Ставский Е.А., Дроздов И.Г. Изучение противовирусной активности
экстрактов, выделенных из базидиальных грибов, в экспериментах in vitro
и in vivo в отношении штаммов вируса гриппа разных субтипов // Журнал
микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 2011. № 1. С. 40-43.
Теплякова Т.В.,
Булычев Л.Е.,
Косогова Т.А.,
Ибрагимова Ж.Б.,
Юрганова И.А.,
Кабанов А.С.,
Пучкова Л.И.,
Бормотов Н.И.,
Бардашева А.В.
Противовирусная
активность
экстрактов
из
базидиальных грибов в отношении ортопоксвирусов // Проблемы особо
опасных инфекций. 2012. Вып. 3(113). С. 99-101.
Teplyakova T.V.,
Psurtseva N.V.,
Kosogova T.A.,
Mazurkova N.A.,
Khanin V.A., Vlasenko V.A. Antiviral Activity of Polyporoid Mushrooms
(Higher Basidiomycetes) from Altai Mountains (Russia) // International
Journals for Medicinal mushrooms. 2012. Vol. 14. Issue 1. P. 37-45.
23
1.
2.
3.
4.
1.
2.
3.
4.
Патенты
Теплякова Т.В.,
Гашникова Н.М.,
Пучкова Л.И.,
Проняева Т.Р.,
Косогова Т.А. Ингибитор репродукции вируса иммунодефицита
человека 1 типа: пат. 2375073 C1 Рос. Федерация. № 2008124179/15;
заявл. 11.06.2008; опубл. 10.12.2009, Бюл. № 34. 14 с.
Теплякова Т.В.,
Косогова Т.А.,
Мазуркова Н.А.,
Макаревич Е.В.,
Ставский Е.А. Ингибитор репродукции вируса гриппа А на основе
экстракта базидиального гриба Phallus impudicus: пат. 2475529 С2 Рос.
Федерация. № 2011109550/10; заявл. 14.03.2011; опубл. 20.09.2012, Бюл.
№ 26. 7 с.
Теплякова Т.В.,
Косогова Т.А.,
Мазуркова Н.А.,
Шишкина Л.Н.,
Кабанов А.С., Пучкова Л.И., Сергеев А.Н. Ингибитор репродукции
вируса гриппа А на основе экстракта базидиального гриба Laetiporus
sulphureus: пат. 2475530 С2 Рос. Федерация. № 2011110826/10; заявл.
22.03.2011; опубл. 20.02.2013, Бюл. № 5. 10 с.
Теплякова Т.В.,
Пучкова Л.И.,
Косогова Т.А.,
Булычев Л.Е.,
Шишкина Л.Н., Мазуркова Н.А., Гашникова Н.М., Балахнин С.М.,
Кабанов А.С.,
Казачинская Е.И.,
Афонина В.С.
Противовирусное
средство на основе меланина:
пат. 2480227 С2 Рос. Федерация.
№ 2011127305/15; заявл. 01.07.2011; опубл. 27.04.2013, Бюл. № 12. 11 с.
Работы, опубликованные в сборниках научных трудов
и материалах конференций
Косогова Т.А., Теплякова Т.В. Выделение в культуру лекарственных
видов базидиальных грибов // Материалы 5 съезда Общества
биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова. Москва, 2-4 декабря
2008 г. / Под ред. Р.Г. Василова. М.: ИАЦ, 2008. С. 273-275.
Кабанов А.С.,
Шишкина Л.Н.,
Теплякова Т.В.,
Пучкова Л.Н.,
Косогова Т.А., Мазуркова Н.А., Скарнович М.О., Сергеев А.Н. Изучение
противовирусной
эффективности
экстрактов,
выделенных
из
базидиальных грибов, в отношении вируса гриппа птиц // Достижения
современной биотехнологии. Сборник научных трудов под ред.
И.Г. Дроздова. 2008. С. 111-119.
Теплякова Т.В., Косогова Т.А., Михайловская И.Н. Выделение в
культуру лекарственных видов базидиальных грибов // Достижения
современной биотехнологии. Сборник научных трудов под ред.
И.Г. Дроздова. 2008. С. 335-340.
Горбунова И.А., Власенко В.А., Теплякова Т.В., Косогова Т.А.,
Михайловская И.Н. Ресурсы лекарственных грибов на юге Западной
Сибири / Макромицеты бореальной зоны. Материалы всероссийской
научно-практической конференции. 11-13 марта 2009 г. Красноярск / под
редакцией д.б.н. Павлова И.Н., Кутафьевой Н.П. – Красноярск: ГОУ ВПО
"Сибирский государственный технологический университет". 2009.
С. 145-148.
24
5. Кабанов А.С.,
Шишкина Л.Н.,
Теплякова Т.В.,
Косогова Т.А.,
Пучкова Л.И.,
Мазуркова Н.А.,
Скарнович М.О.,
Сергеев А.Н.
Кандидатные препараты против вируса гриппа из экстрактов
базидиальных грибов // Материалы научно - практической конференции
молодых ученых и специалистов Роспотребнадзора «Биологическая
безопасность в современном мире», Оболенск, Московская обл. 2122 апреля 2009, С. 234-235.
6. Теплякова Т.В., Косогова Т.А. Грибы – источник пищи и лекарств /
Пища. Экология. Качество. Труды VII международной научнопрактической конференции (Краснообск, 21-22 сентября 2010 г.).
Новосибирск, 2010. С. 233-235.
7. Теплякова Т.В.,
Псурцева Н.В.,
Косогова Т.А.,
Мазуркова Н.А.,
Власенко В.А. Противовирусная активность базидиальных грибов
Горного Алтая // Проблемы ботаники Южной Сибири и Монголии:
Сборник научных статей по материалам IX Международной научнопрактической конференции (25-27 октября 2010 г., Барнаул). Барнаул:
ARTИКА, 2010. С. 245-246.
8. Теплякова Т.В.,
Канаева О.И.,
Косогова Т.А.,
Костина Н.Е.,
Бардашева А.В., Трошкова Г.П. Отбор продуцентов противоопухолевых
соединений среди базидиальных грибов // Наука и современность – 2011:
сборник
материалов
XII Международной
научно-практической
конференции: в 3-х частях. Часть 1 / Под общ. ред. С.С. Чернова.
Новосибирск: Издательство НГТУ, 2011. С. 217-223.
9. Гашникова Н.М.,
Косогова Т.А.,
Пучкова Л.И.,
Балахнин С.М.,
Теплякова Т.В. Противовирусная активность экстрактов из базидиальных
грибов в отношении вируса иммунодефицита человека // Наука и
современность – 2011: сборник материалов XII Международной научнопрактической конференции: в 3-х частях. Часть 1 / Под общ. ред.
С.С. Чернова. Новосибирск: Издательство НГТУ, 2011. С. 12-19.
10. Teplyakova T.V.,
Psurtseva N.V.,
Kosogova T.A.,
Mazurkova N.A.,
Khanin V.A., Vlasenko V.A. Antiviral Activity of Polyporoid Mushrooms
(Higher Basidiomycetes) from Altai Mountains (Russia) // International
Journals for Medicinal mushrooms. 2012. Vol. 14. Issue 1. P. 37-45.
11. Теплякова Т.В., Косогова Т.А. Особенности отбора в культуру
эффективных для биотехнологии штаммов лекарственных грибов из
местообитаний юга Западной Сибири // Биология – наука XXI века:
Материалы Международной конференции. Москва, 24 мая 2012. / Ред.
Р.Г Василов. М.: МАКС Пресс, 2012. С. 929-931.
12. Теплякова Т.В.,
Ломовский О.И.,
Пучкова Л.И.,
Ананько Г.Г.,
Косогова Т.А. Механохимический способ подготовки сырья дл
получения меланина из чаги // Материалы VIII Международной
конференции «Проблемы лесной фитопатологии и микологии»: сборник
материалов VIII Международной конференции / Под редакцией
В.Г. Стороженко, Б.П. Чуракова. Ульяновск: УлГу, 2012. С. 289-292.
25
13. Косогова Т.А., Макаревич Е.В., Бардашева А.В., Мазуркова Н.А.,
Теплякова Т.В. Перспективные культивированные виды дикорастущих
грибов юга Западной Сибири, проявляющие противовирусную
активность в отношении вируса гриппа // Материалы VIII
Международной конференции «Проблемы лесной фитопатологии и
микологии»: сборник материалов VIII Международной конференции /
Под редакцией В.Г. Стороженко, Б.П. Чуракова. Ульяновск: УлГу, 2012.
С. 326-331.
14. Проценко М.А.,
Бардашева А.В.,
Скарнович М.А.,
Костина Н.Е.,
Косогова Т.А., Теплякова Т.В., Трошкова Г.П. Сравнение водных
экстрактов из культивируемого мицелия и плодового тела гриба Fomes
fomentarius // Материалы конференции «Фундаментальные и прикладные
исследования. Образование, экономика и право», Италия (Рим,
Флоренция), 6-13 сентября 2012 г. Международный журнал прикладных и
фундаментальных исследований. 2012. № 7. С. 135-136.
15. Псурцева Н.В.,
Теплякова Т.В.,
Косогова Т.А.
Противовирусные
свойства высших базидиальных грибов // Современная микология в
России. Том 3. Материалы 3-го Съезда микологов России. М.:
Национальная академия микологии, 2012. С. 416-417.
16. Теплякова Т.В.,
Гашникова Н.М.,
Балахнин С.М.,
Косогова Т.А.
Антиретровирусная активность экстрактов из чаги, меланина и
гуминовых соединений // Современная микология в России. Том 3.
Материалы 3-го Съезда микологов России. М.: Национальная академия
микологии, 2012. С. 419-420.
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ
ВГ
ВИЧ-1
ВЛЗН
ВНО
ВОВ
ВОО
ВПГ-2
ГПС
ОО
ООА
МК
– вирус гриппа
– вирус иммунодефицита человека 1 типа
– вирус лихорадки Западного Нила
– вирус натуральной оспы
– вирус осповакцины
– вирус оспы обезьян
– вирус простого герпеса 2 типа
– глюкозо-пептонная среда
– отвар на основе овса
– агаризованная среда на основе овсяного отвара
– питательная среда на основе мелассы и кукурузного экстракта
Автор благодарен коллегам, принимавшим участие в проведении данных
исследований. Особую благодарность автор выражает своему научному
руководителю д.б.н., профессору Тамаре Владимировне Тепляковой.
26