Диссертация Жумагулова Жангуль Боранкуловна
реклама
Казахский национальный аграрный университет УДК 634.8:575.1:634.10.13 На правах рукописи ЖУМАГУЛОВА ЖАНГУЛЬ БОРАНКУЛОВНА Совершенствование биотехнологических методов сохранения генофонда груши 6D080900 – Плодоовощеводство Диссертация на соискание ученой степени доктора философии (PhD) Научные консультанты к.с-х.н., профессор Кампитова Г.А. к.с-х.н. Ковальчук И.Ю. PhD, доктор Reed Barbara M. Республика Казахстан Алматы, 2014 СОДЕРЖАНИЕ НОРМАТИВНЫЕ ССЫЛКИ.............................................................. ОПРЕДЕЛЕНИЯ..................................................................................... ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ................................................. ВВЕДЕНИЕ.............................................................................................. 1 ВЫБОР НАПРАВЛЕНИЯ ИССЛЕДОВАНИЙ............................. 1.1 Биологические особенности и распространение груши................ 1.2 Сохранение генофонда растений...................................................... 1.3 Микроклональное размножение....................................................... 1.4 Хладохранение плодовых культур................................................... 1.5 Криосохранение растений................................................................ 2 ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ................................ 2.1 Объекты исследований...................................................................... 2.2 Методы исследований....................................................................... 2. 2.1 Методы введения растений в асептическую культуру........................... 2.2.2 Метод микроклонального размножения....................................... 2.2.3 Методы хладохранения груши....................................................... 2.2.4 Методы криосохранения спящих почек........................................ 2.2.5 Методы криосохранения апикальных меристем.......................... 3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.............................................. 3.1 Введение в асептическую культуру in vitro различных генотипов груши, инициированных из зимних почек и верхушечных побегов.......................... 3.1.2 Тестирование микропобегов груши 3.1. 3 Влияние минерального состава питательной среды для пролиферации побегов груши........................................................... 3.1.4 Оптимизация состава питательных сред при введении микропобегов в культуру in vitro 3.1.5 Клональное микроразмножение груши........................................ 3.1.6 Хладохранение груши 3.1.7 Криосохранение спящих зимующих почек.................................. 3.1.8 Определение продолжительности закаливания меристем груши в жидком азоте (-1960 С) 3.1.9 Зависимость криосохранения меристем от концентрации сахарозы питательной среды................................................................ 3.2 Влияние предобработки криопротекторами меристем груши в жидком азоте (-1960 С) 3.2.1 Зависимость влажности инкапсулированных меристем в альгинатном геле............................ 3.2.2 Сравнение методов предобработки при криоконсервации изолированных меристем в жидком азоте (-1960 С) 3.2.3 Определение состава питательных сред,оптимальных для 2 4 5 6 7 11 14 16 17 21 22 30 30 30 30 31 35 37 41 42 42 44 45 46 48 51 53 60 61 62 64 66 68 регенерации эксплантов груши............................................................... 3.2.4 Выход тканей сортов груши из состояния глубокого охлаждения и регенерации растений...................................................... 3.2.5 Регламент оптимизации криосохранения меристем груши 3.2.6 Экономическая эффективность ЗАКЛЮЧЕНИЕ...................................................................................... СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ......................... ПРИЛОЖЕНИЕ...................................................................................... 3 69 70 72 73 75 85 НОРМАТИВНЫЕ ССЫЛКИ В настоящей диссертации использованы ссылки на следующие стандарты: ГОСТ 2.105 – 95 ЕСКД. Общие требования к текстовым документам. ГОСТ 6709 – 72 Вода дистиллированная. Технические условия. ГОСТ 12.0.004 90 Система стандартов безопасности труда. Организация обучения безопасности труда. Общие положения. ГОСТ 12.1.005 88 Система безопасности труда. Общие санитарногигиенические требования к воздуху рабочей зоны. ГОСТ 12.1.008 76 Система стандартов безопасности труда. Биологическая безопасность. Общие требования. ГОСТ 12.2.003 91 Система стандартов безопасности труда. Опасные и вредные производственные факторы. Классификация. ГОСТ 12.3.002 75 Система стандартов безопасности труда. Процессы производственные. Общие требования безопасности. ГОСТ 12.4.011 89 Система стандартов безопасности труда. Средства защиты работающих. Общие требования и классификация. ГОСТ 17.0.0.01 76 Система стандартов в области охраны природы и улучшения использования природных ресурсов. Основные положения. ГОСТ 25336 82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры. 4 ОПРЕДЕЛЕНИЯ В настоящей диссертации применяют следующие термины с соответствующими определениями: Генетические ресурсы – растительный материал, являющийся потенциальным источником ценных генов для использования в селекционных программах. Банк гермоплазмы – коллекция сортов, видов и форм растений. Генофонд – это совокупность всех генов или генотипов в популяции или группе популяции какого-либо вида организмов. Биотехнология – пограничная между биологией и техникой научная дисциплина и сфера практики, изучающая пути и методы изменения окружающей человека природной среды в соответствии с его потребностями. Криоконсервация – это метод глубокого замораживания и хранения растительного материала при сверхнизкой температуре (–196 C), что позволяет сохранять генетические характеристики объектов практически в течение любого срока. Криопротекторы – это химические соединения, которые защищают клетки растений от механических и осмотических стрессов при криоконсервации. Питательные среды – субстраты, состоящие из компонентов, обеспечивающих необходимые условия для культивирования растений in vitro. Эксплант – часть растения, вводимая в культуру in vitro. Микроклональное размножение – получение in vitro, неполовым путем, генетически идентичных исходному экземпляру растений. Закаливание – это обратимое физиологическое приспособление к неблагоприятным воздействиям, происходящее под влиянием определенных внешних условий. Рост – процесс новообразования элементов структуры организма. Покой – такое состояние целого растения или отдельных органов, когда отсутствует видимый рост. Фитогормоны – это вещества, действующие в уменьшенных количествах, образующиеся в одних органах и оказывающие регуляторное влияние на какиелибо физиологические процессы в других органах растения. Осмос – односторонняя диффузия молекул воды или другого растворителя через полупроницаемую мембрану. 5 ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ МС – питательная среда Мурасиге и Скуга БАП – 6-бензиламинопурин АБК – абсцизовая кислота ИУК – индолилуксусная кислота ИМК – индолилмасляная кислота ГК – гибберелловая кислота АС – аскорбиновая кислота PRS – (Pear Rootstock solution) питательная среда для груши Кр – коэффициент размножения ЖА – жидкий азот ЭГ – этиленгликоль ПЭГ – полиэтиленгликоль ДМСО – диметилсульфоксид 6 ВВЕДЕНИЕ Актуальность исследования В настоящее время сельское хозяйство и его отрасль плодоводство, а также пищевая и перерабатывающая промышленность ощущают острую необходимость в повышении эффективности производства и урожайности плодовых культур. В условиях интенсификации садоводства и ухудшения экологической ситуации все большое значение приобретает создание новых, высокоурожайных сортов растений, а также разработка эффективных технологий сохранения генетических ресурсов, что решается при помощи биотехнологических приемов. Внедрение этих приемов в садоводство позволяет не только повысить морфогенетический потенциал насаждений, но и значительно ускорить создание новых сортов с хозяйственно - ценными признаками, толерантных к неблагоприятным факторам среды, а также повысить эффективность отрасли в целом. По данным А.Д. Джангалиева во флоре Казахстана широко представлены экономически важные виды плодовых растений, среди которых большой научный и практический интерес представляют плодовые растения. Агробиоразнообразие плодовых растений Казахстана включает также сорта и гибриды, которые содержатся ввиде живых коллекций в помологических садах (около четырёх тысяч образцов), ботанических садах и госсортоучастках. Печальная ситуация сложилась из-за безвозвратной утери огромного числа гибридного материала, получаемого в процессе селекционных работ. Это обусловлено тем, что выращивание гибридов у плодовых растений требует длительного времени до начала плодоношения (например, у груши – около 15 лет), позволяющего проводить их селекционную оценку. Поэтому значительная часть гибридов, не использованных в процессе получения какоголибо конкретного сорта, вынуждено уничтожается из-за дефицита посадочных площадей и большой затратности их многолетнего содержания. Между тем, совершенно очевидно, что фактически любой гибрид представляет собой случайное, неповторимое сочетание родительских генов, детерминирующих хозяйственно-биологические признаки. Следовательно, каждый конкретный гибрид является носителем уникального набора генов и представляет собой потенциально ценный селекционный материал и требует бережного сохранения и использования для генетического улучшения плодовых культур. Таким образом, генетические ресурсы плодовых растений Казахстана представляют собой огромную научную и практическую ценность глобального значения и включают биоразнообразие дикорастущих видов и их уникальных форм, а также районированные сорта отечественной и зарубежной селекции, стародавние сорта народной селекции и уникальный гибридный материал. Разработка биотехнологии криоконсервации является актуальной проблемой, так как содержание генофонда плодовых культур в помологических и ботанических садах, а также в природных резерватах и заповедниках связано с серьёзными трудностями и, к тому же, не гарантирует высокую степень 7 надёжного сохранения. Это обусловлено следующими причинами: 1) живые коллекции содержат только лишь незначительную, причем случайно представленную часть генома того или иного вида; 2) возрастает риск переопыления дикорастущих видов и культивируемых сортов, что может привести к генной эрозии или даже к утере специфичности генотипов; 3) для содержания полевых коллекций необходима большая земельная площадь и регулярный уход, что требует значительных ежегодных материальных затрат; 4) коллекции могут заражаться опасными болезнями и повреждаться вредителями, погибнуть при действии неблагоприятных факторов. Сохранение генофонда in vitro имеет значительные преимущества перед традиционными методами, состоящие, в частности, в незначительных затратах площадей для стерильного выращивания растений, а также в возможности длительного хранения пробирочных растений при пониженных температурах. Недостатки традиционных приемов сохранения генетических ресурсов обусловило необходимостью разработки технологии сохранения генофонда с использованием биотехнологических методов. Наиболее эффективным биотехнологическим методом сохранения растительных тканей является криоконсервация в жидком азоте (–196 C) [1]. Криоконсервация – наиболее перспективный способ длительного хранения генофонда, гарантирующий стабильное сохранение биосинтетических, генетических и всех других характеристик клеток в течение практически неограниченного времени. Хорошо организованная работа криобанка менее трудоемка, поскольку исключаются затраты на поддержание и депонирование постоянно растущих коллекций. Банк гермоплазмы in vitro расширяет возможность надежного сохранения генетических ресурсов, полностью исключает заражение коллекций грибными, бактериальными, вирусными инфекциями и повреждение вредителями, облегчает интродукцию растений из карантинных регионов, а также обеспечивает надёжный международный обмен. Конвенция по Биологическому разнообразию, которую подписал Казахстан, признает суверенные права государств на естественные ресурсы и в соответствии с действующим законодательством предусматривает возможность обмена гермоплазмой с другими странамии. Генетические ресурсы растений для производства продовольствия и ведения сельского хозяйства оказывают все большое влияние на продовольственную безопасность и экономическое развитие в мире. В качестве неотъемлемого компонента биоразнообразия в сельском хозяйстве генетические ресурсы исключительно важны как ценный исходный материал в селекции для создания новых устойчивых и высокопродуктивных сортов для устойчивой интенсификации сельскохозяйственного производства. Для успешного создания новых высокопродуктивных, устойчивых интенсификации и улучшения существующих сортов и подвоев необходимо сохранить генетические ресурсы сортов груши. 8 В странах ближнего и дальнего зарубежья уже давно проводятся интенсивные исследования в области криоконсервации и хладохранения гермоплазмы и создаются криобанки экономически важных растений. В дальнем зарубежье самой крупной является Национальная система гермоплазмы растений США, которая представляет собой сеть региональных структур, занимающихся изучением и сохранением мировых генетических ресурсов. Центральное генохранилище, расположенное в штате Колорадо, представляет собой крупнейший криобанк, в котором заложены на долгосрочное хранение тканевые культуры более 100 видов полезных растений (650 000 образцов) [2]. Криобанк гермоплазмы функционирует также во ВНИИ растениеводства им. Н.И. Вавилова. Криобанк содержит богатейшую коллекцию семян и тканевых культур ценных сортов, форм и гибридов сельскохозяйственных растений [3]. В Казахстане исследования в области сохранения генофонда биотехнологическими методами впервые были начаты в 2001 году в Институте биологии и биотехнологии растений. Подробные исследования по сохранению генофонда груши не проводились. Цель и задачи исследований Целью исследований является разработка биотехнологии сохранения генофонда изолированных меристематических тканей и создание криогенной коллекции гермоплазмы ценных, отечественных сортов груши. Для достижения цели необходимо было решить следующие задачи: - Оптимизировать методы микроклонального размножения груши; - Подобрать минеральную основу питательных сред; - Изучить способы хладохранения груши; - Оптимизировать условия криоконсервации изолированных тканей груши в жидком азоте (-196°С); - Создать криогенную коллекцию гермоплазмы ценных отечественных сортов груши; Научная новизна Криоконсервация гермоплазмы груши и экономически важных растений для сохранения, пополнения и рационального использования генетических ресурсов – это новое направление в Казахстане. Впервые в условиях региона проведено детальное изучение клонального микроразмножения сортов груши различного генетического происхождения. Выявлены оптимальные способы стерилизации эксплантов груши. Изучены способы хладохранения различных сортов груши. Впервые разработана биотехнология криоконсервации (–196°С) изолированных тканей отечественных сортов груши. Установлена зависимость жизнеспособности меристем после криоконсервации от предобработок криопротекторами, закаливания постоянной и переменной температурами, влажности инкапсулированных меристем в альгинатном геле и продолжительности дегидратации. 9 Создана криогенная коллекция ценных генотипов растений груш для целей селекции, интродукции, международного обмена и коммерциализации. Практическая ценность работы Применение разработанной биотехнологии по криосохранению меристематических тканей груши позволит надёжно, экономически выгодно сохранять генофонд растений, защитит генофонд от экстремальных воздействий, предотвратит поражение вредителями и болезнями, создаст возможность для массового размножения растений. Криобанк гермоплазмы и обмен образцами в замороженном виде способствует расширению агробиоразнообразия путем интродукции зарубежных коммерчески важных сортов и доноров полезных генов для повышения эффективности селекционного процесса. При этом международный обмен гермоплазмой значительно упрощается вследствие гарантированной стерильности биоматериала, исключающей длительные карантинные наблюдения. Созданная криогенная коллекция гермоплазмы ценных генотипов груши, хранящаяся в криобанке гермоплазмы Института биологии и биотехнологии растений обладают высокой конкурентоспособностью на мировом рынке и может использоваться в коммерческих целях. Апробация работы. Результаты научных и экспериментальных исследований доложены на международных научных конференциях: ІV Республиканской научно-практической конференции молодых ученых и студентов «Миссия молодежи в науке Республики Казахстан» (2014); II ежегодная международная научная конференция молодых учёных инициированная Фондом 1 президента "Лидер нации" и Южно-Казахстанской государственной фармацевтической академией (2014); «Международный симпозиум древесных растений в умеренной зоне климата» (Бельгия, 2012); Международной научно-практической конференции «Современное общество, образование и наука» (Россия, 2014); Публикация результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано 11 научных работ, в том числе 3 из них в изданиях, рекомендованных Комитетом МОН РК ВАК Казахстана, 6 - в материалах международных конференций, 2- в международных научных изданиях Scopus и Thomson Reuters. Структура и объем диссертации. Диссертационная работа выполнена по общепринятому образцу. Она состоит из введения, материалов и методов исследования, результатов исследований, обсуждений полученных результатов, заключения, списка использованных источников из 145 наименований. Диссертация изложена на 85 страницах компьютерного текста, оформленного с соблюдением необходимых стандартов, иллюстрирована 8 таблицами и 25 рисунками. 10 1 Выбор направления исследований В настоящее время доля импорта плодово-ягодной продукции Казахстана составляет около 30%, превышение которой может привести к зависимости страны от импортных поставок. Для недопущения такой ситуации принимаются меры по наращиванию собственного производства плодовоягодной продукции. Принят Закон РК от 08.06.2005 г. «О государственном регулировании развития агропромышленного комплекса и сельских территорий», направленный на обеспечение продовольственной безопасности, в том числе увеличение производства плодовой продукции. В соответствии с Постановлением Правительства РК от 02.02.2009 г. № 98 выделяются значительные бюджетные субсидии на частичное возмещение затрат фермеров на закладку новых и содержание имеющихся многолетних насаждений плодово-ягодных культур (425 000 тенге на 1 га). Более того, полностью возмещаются затраты на закладку маточников плодово-ягодных культур (1 126 000 тенге на 1 га). При этом обязательным условием является то, что закладка как маточников, так и промышленных садов интенсивного типа должна быть осуществлена сортами, включенными в Государственный реестр селекционных достижений или в Перечень перспективных сортов отечественной и зарубежной селекции. Этот мировой опыт внедряется и в Казахстане. Принято Постановление Правительства РК № 1429 от 29 декабря 2004 г. «О строительстве Национального генохранилища». Для обеспечения его функционирования необходимо разработать технологию криоконсервации гермоплазмы плодовых культур и создать первый в Казахстане криобанк гермоплазмы ценных сортов и гибридов отечественной и зарубежной селекции, а также уникальных дикорастущих форм плодовых растений. Создание криобанка гермоплазмы имеет большое социально-экономическое значение для сохранения и использования генетических ресурсов плодовых культур в целях расширения генетического базиса селекции и обогащения агробиоразнообразия. Эффективным подходом к решению проблемы сохранения генофонда вегетативно размножаемых растений, к числу которых относятся плодовые культуры, является биотехнология криоконсервации гермоплазмы. Криосохранение в жидком азоте при температуре -196°С изолированных тканей, позволяет длительное время (неограниченное число лет) сохранять жизнеспособность, регенерационный потенциал и генетическую стабильность. Криобанк гермоплазмы и коллекции живых растений рассматриваются не как альтернативы, а как взаимно дополняющие и усиливающие друг друга способы. При необходимости в любое нужное время биологический материал может быть извлечён из криобанка, размножен in vitro и использован для закладки плантаций или в селекционном процессе. В Казахстане до сих пор не существовало криобанка гермоплазмы, хотя для дальнейшего развития агропромышленного сектора экономики остро стоит 11 проблема изучения, сохранения и рационального использования как собственных, так и зарубежных генетических ресурсов полезных растений. Криоконсервация гермоплазмы экономически более эффективна по сравнению с традиционной технологией содержания полевых коллекций плодовых растений. Так, у нас в стране содержание 1 га коллекции обходится в 425 000 тенге в год (обработка почвы, полив, борьба с вредителями и болезнями, внесение удобрений, обрезка, сельхозтехника, садовый инвентарь, охрана, ГСМ и т.д.). По технологии криоконсервации, например, в США при стоимости жидкого азота 400 долларов за тонну, затраты на хранение 1000 микропробирок с биоматериалом на площади 0,5 кв.м (эквивалент 1 га полевой коллекции) составляют 40 долларов в год. Следовательно, криогенную коллекцию сортообразцов плодовых культур отечественной и зарубежной селекции можно содержать на небольшой лабораторной площади в 10-15 кв.м. Кроме того, сохранение гермоплазмы в криобанке позволит полностью исключить загрязнение окружающей среды пестицидами и минеральными удобрениями, что приведёт к значительному улучшению экологической обстановки. Разработка биотехнологии криоконсервации и создание криобанка гермоплазмы плодовых растений в Казахстане будет способствовать расширению агробиоразнообразия, повышению эффективности селекционных работ, ускоренному клональному размножению элитного посадочного материала, развитию питомниководства, промышленного садоводства, и международного обмена генетическими ресурсами. Наиболее широкое распространение в качестве метода, замедляющего развитие растений в условиях in vitro нашло использование низких положительных температур. Другой наиболее перспективный подход к решению сохранения гермоплазмы вегетативно размножаемых культур in vitro – криоконсервация. Использование этого метода гарантирует длительное сохранение материала и одновременно снижает вероятность возникновения генетических изменений, возможных в культуре при положительных температурах. Результаты исследований по криосохранению различных культур показывают, что выживаемость апикальных меристем после цикла подготовки – замораживание – хранение – отогревание зависит от очень большого числа факторов, включая особенности применяемых методик, а также видовые и сортовые различия. Криосохранение покоящихся почек древесных растений – это возможность обеспечения эффективной длительной консервации гермоплазмы вегетативно размножаемых культур. Покоящиеся почки могут быстро восстанавливать рост при прививке их на карликовые подвои, быстро образуют цветоносы, при этом сводится к минимуму возможность индукции сомаклональных вариантов. Это важно, когда необходимо сохранить целостность клона с уникальной комбинацией генов. Сохранение гермоплазмы методом криоконсервации зимующих почек проводят в США, Европе, Японии и других странах. 12 Возможности метода криоконсервации с развитием современных технологий производства контейнера для хранения биологических материалов при сверхнизких температурах и средств получения жидкого азота постоянного возрастают. Некоторые типы контейнеров могут вмещать до 50 тыс. ампул по 1,2 мл и до 130 дней сохранять температуру –196 оС, без перезарядки. При стоимости жидкого азота в 1990 г. 40 руб. за тонну затраты на хранение 1000 ампул с образцами могут составить от 2,5 до 6 рублей в год, в зависимости от типа хранения. Таким образом, теоретически сохранение даже очень большой коллекции потребует минимум средств и небольшой площади. Сохранение коллекций вегетативно размножаемых культур на современном этапе необходимо проводить с учетом применения всех наиболее прогрессивных технологий. Параллельно с хранением in vitro появится возможность решать все остальные задачи, связанные с изучением, размножением, международным обменом образцов и селекционным процессом. На основе выше изложенного следует, что сохранение генетического материала плодовых культур в соответствии с современным уровнем науки и экономическими условиями Казахстана возможно осуществить тремя способами: 1.Сохранение в вегетирующей форме в помологических садах или в естественной среде обитания. 2.Хладохранение в условиях вынужденного меристематического покоя при положительной низкой температуре (+3-4ºС). 3.Криоконсервация меристематических тканей в жидком азоте (-196ºС). Исследования по криосохранению сортов груши проводятся в Казахстане впервые. Также впервые изучено влияние способов и режимов закаливания и криосохранения на устойчивость к действию сверхнизкой температуры различных генотипов груши в условиях in vitro. Создан криобанк отечественной и зарубежной селекции груши имеющих большое значение для использования генетических ресурсов в целях расширения и улучшения агробиоразнообразия. Собранный в криобанке уникальный генетический материал может использоваться для расширения генетического базиса селекции и для интродукции, а также для обмена генотипами между регионами. Результаты исследований будут внедрены при организации Национального генохранилища. 13 1.1 Биологические особенности и распространение груши Груша – вторая после яблони по распространению семечковая культура. Культура груши уже за 300 лет до н.э. была хорошо развита в Греции. 23-79 гг. до н.э. описано 35 сортов выращиваемых в Риме. В XVI и XVII вв. главным продуцентом груш являлась Франция, а в 1800-х годах здесь выращивалось 900 сортов груш [4]. В настоящее время культура груши получила широкое распространение. Ее выращивают более чем в 80 странах мира. Мировое производство плодов груши в 2003 году составило 10-11 млн. т. Половина этого количества приходится на страны Азии, 1/3 часть - на страны Европы и 1/7 - на страны Америки [5]. В Казахстане культивируются следующие сорта груши: Ароматная - сорт селекции Казахского НИИ плодоводства и виноградарства (КазНИИПиВ) рекомендуется для пригородов южного региона. Бере Арданпон - Бельгийский сорт рекомендуется для юга и юго-востока Казахстана. Бере Боск Французский осенний сорт рекомендуется для Южно-Казахстанской области. Талгарская красавица - сорт селекции КазНИИПиВ, рекомендуется для всех зон садоводства Алматинской, Жамбылской (кроме равнинной), ЮжноКазахстанской (кроме южной) и Кызылординской областей (Рисунок 1). Рисунок 1 –Талгарская Красавица Любимица Клаппа рекомендуется для Алматинской и ЮжноКазахстанской областей. Масляная - сорт народной селекции рекомендуется для северных и восточных областей Казахстана. Юрьевка–сорт местной народной селекции рекомендуется для всех зон юга и юго-востока Казахстана, отмечается высокой урожайностью. Лесная красавица - Бельгийский летнеосенний сорт основной сорт груши, широко распространенный на юге и юговостоке Казахстана. 14 За последние годы помологическим садом Казахского НИИ плодоводства и виноградарства выведены хорошие сорта груши различного срока созревания, с высокими товарными и вкусовыми качествами: Бостандык, Адеми, Карындас, Нагима, Сувенир, Умит. Достоинством этих отечественных сортов является устойчивость к бактериальным заболеваниям, в частности бактериозу – опасному заболеванию груши в наших условиях. Культура груши представлена видами – груша домашняя (P. domestica Medik), груша уссурийская (P. ussuriensis Maxim). Селекционером Алексеенко С.П. выведены и переданы в ГСИ сорта – Айдана, Нагима, Нурай, Шыгыс и другие [6]. Груша – культура умеренного климата. Она характеризуется требовательностью к теплу, от степени зимостойкости зависит урожайность, регулярность плодоношения, рентабельность промышленных насаждений [7,8]. В период вегетационного роста сорта груши повреждаются заморозками в 3°С, тогда как в период естественного покоя они могут переносить без вреда мороз до 30°С. В период покоя деревья груши наиболее чувствительны к морозам в ноябре и феврале. Критической температурой для молодых завязей груши являются поздневесенние заморозки до 1,5°С, а для распустившихся цветков – до 1,9°С [9]. По мнению Г.К.Карпенчук [10] цветки груши гибнут в фазе бутона при температуре минус 4°С, в период полного цветения при минус 2°С, завязь – при минус 1°С. У груши при температуре минус 23-250С повреждаются плодовые почки и плодушки. Хорошо растет на различных почвах; не пригодны для нее лишь заболоченные, лишенные дренажа, плохо аэрируемые, засоленные, а также каменистые и тяжелые глинистые почвы [11]. Дерево груши на протяжении всей своей жизни, по определению профессора П.Г.Шитта, имеет разные периоды роста. До начала плодоношения (первые 6-10 лет после прививки) проходит активный рост корней и надземной части дерева. Начало и полное плодоношение (возраст с 10 до 20 лет) – рост деревьев продолжается. С 20 до 40 лет период наибольшего плодоношения и незначительный рост за счет обрастающих веточек. После 40–45 лет жизни наступает период снижения плодоношения и активного старения. В этот период деревья становятся малопродуктивными и экономически невыгодными для производства [12]. Цветки у груши отличаются по величине, длине, толщине и степени опущенности цветоножки. Большая часть сортов груши имеет средний размер цветка (2-3 см. в диаметре). Корневая система груши состоит из многолетних толстых скелетных корней нескольких порядков, обрастающих тонких коротких корешков, всасывающих или активных корешков. Вертикальные корни идут глубоко в почву, а горизонтальные находятся у её поверхности, сильно ветвятся и обрастают корешками [13]. Время вступления в плодоношение в значительной степени зависит от подвоя. Подвоями для груши служат дикие ее виды, а также айва, черноплодная (арония) и обыкновенная рябина, боярышник, ирга Лучшими семенными подвоями являются сеянцы культурных сортов и местных форм груши [14]. 15 Сорта груши на айве ЕМА (А, МА, Анжерская – Cydonia oblonga) вступают в плодоношение на 4 год после посадки. В качестве слаборослого подвоя для груши применяют вегетативно размножаемые формы айвы типа А, В, С [15,16,17,18]. Согласно методических указаний, деревья груши на айве начинают плодоносить на 3-5 год. Айва Анжерская наиболее часто используется как подвой для груши. Она хорошо размножается вертикальными отводками, образуя среднее количество корней; в засушливых условиях корней, нередко, образуется мало, но даже в этом случае пересаженные отводки приживаются удовлетворительно [19]. В Казахстане Айва Анжерская – это единственный районированный подвой груши из числа клоновых. К почве Айва Анжерская не требовательна, мирится с близким залеганием грунтовых вод и некоторым засолением почвы [20]. 1.2 Сохранение генофонда растений Сохранение генофонда – одна из важнейших задач в деле сохранения природы, которой уделяют большое внимание во всем мире. Связано это с ограниченностью необходимых для существования человека биологических ресурсов и угрозой их истощения, вызванной мощным техногенным воздействием цивилизации на окружающую среду, от которого иногда страдают растения. Многие виды еще недостаточно хорошо изучены, однако все они являются генетическими ресурсами, которые человек может использовать. Поэтому потеря любого из них – невосполнимая утрата. В настоящее время очень актуальна проблема сохранения генофонда, как культурных видов, так и дикорастущих растений, представляющих собой ценный селекционный материал. Существующие традиционные подходы сохранения генофонда базируются, во-первых, на создании разнообразных коллекций, а так же банков семян (хранение ex situ); во-вторых, на организации заповедников и заказников(in situ). В настоящее время сохраняемые в генетических банках коллекции генетических ресурсов растений принято подразделять на три типа: базовые, активные и дублетные. Базовые коллекции сохраняют в условиях, обеспечивающих их длительное хранение (long-term conservation), доступ к ним предельно ограничен. Активные коллекции служат для восстановления, размножения, рассылки и изучения образцов и сохраняются в условиях, обеспечивающих среднесрочное хранение (medium-term conservation). Дублетные коллекции хранят отдельно от базовой коллекции с целью увеличения надежности хранения [21]. Применительно к коллекциям вегетативно размножаемых культурных растений в базовые коллекции включаются все образцы, сохраняемые в полевых условиях [22] и образцы, заложенные на хранение при температуре – 196°С (при развитии методов надежного криосохранения). Коллекции in vitro создаются как часть активной и дублетной коллекций. Состав и размер in vitro 16 коллекций определяется структурой core–collections генофонда каждой культуры, требованиями международного обмена, необходимостью оздоровления, размножения и дублирования наиболее ценных экземпляров полевой коллекции. Коллекции in vitro обеспечивают сохранение оздоровленных от патогенов образцов вегетативно размножаемых растений в контролируемых условиях среды. В крупных мировых генбанках присутствуют все три системы хранения генетического материала культурных растений, размножаемых вегетативно (полевые, in vitro и криоколлекции), поскольку каждая из перечисленных выше систем хранения имеет свои преимущества и недостатки. Генофонд плодовых культур умеренного климата представлен преимущественно полевыми коллекциями и сосредоточен в генбанках и научно-исследовательских институтах. Наиболее трудоемкие и дорогие криоколлекции и коллекции in vitro, как правило, немногочисленны по сравнению с полевыми коллекциями и поддерживаются не во всех подразделениях, сохраняющих генофонд культур. Одним из условий генетического улучшения плодовых культур является наличие и сохранение генофонда культурных растений, обладающих хозяйственно ценными признаками [23]. 1.3 Микроклональное размножение Современные методы биотехнологии позволили значительно повысить эффективность клонирования растений. Исследования в области культивирования соматических тканей привели к разработке принципиально новых методов размножения – клональное микроразмножение. В сущности, эти методы аналогичны вегетативному способу размножения и различаются лишь тем, что весь процесс протекает в условиях in vitro. Главное условие клонального микроразмножения – получение in vitro растений, полностью сохраняющих генетическую однородность. Поэтому для этих целей предпочтительнее использовать культуру апексов (меристематических верхушек), т.к. в условиях in vitro они являются генетически стабильными, и пролиферирующие ткани всегда остаются диплоидными. Клональное микроразмножение является эффективным способом вегетативного размножения, позволяющим быстро тиражировать отдельные генотипы, получать оздоровленный материал и, главное, сокращать сроки селекционного процесса [24,25]. В настоящее время все большую актуальность приобретают различные способы микроклонального размножения сельскохозяйственных культур (прежде всего вегетативно размножаемых) в системе in vitro: размножение пазушными и адвентивными почками, непрямой морфогенез, соматический эмбриогенез. Использование этих методов дает возможность: получать за короткий срок оздоровленного, безвирусного материала, генетически идентичного материнскому растению; работать в лабораторных условиях и 17 поддерживать активно растущие растения круглый год; размножать растения практически без контакта с внешней средой, что исключает воздействие неблагоприятных абиотических и биотических факторов; получать максимальное число растений с единицы площади; в короткий срок получать большое число растений трудноразмножаемых или вегетативно не размножаемых; длительно (1-3 лет) сохранять растительный материал в условиях in vitro. Для любого типа регенерации in vitro можно выделить четыре группы факторов, определяющих ее успех: генотип и состояния исходного материала, условия и методы культивирования, состав питательных сред, особенности введения экспланта в стерильную культуру [25]. Разработка и совершенствование метода культуры тканей растений имеет сравнительно короткую историю. В первые микроклональное размножение провел французский ученый Жорж Морель на орхидеях в 50-х годах ХХ века. В своих работах он использовал технику культивирования апикальной меристемы растений. Растения, полученные таким образом, были свободны от вирусной инфекции. В СССР работы по микроклональному размножению были начаты в 1944 году в Институте физиологии растений им. К.А. Тимирязева под руководством Н.А. Максимова и А.А. Прокофьева, далее продолжены Р.Г. Бутенко. В Казахстане (Алматы) работы по культуре тканей начались с 1975 года в Главном ботаническом саду, затем были продолжены в Институте молекулярной биологии и биохимии, университете им. Аль-Фараби, Институте ботаники. В настоящее время фундаментальные исследования в этой области проводятся в Институте биологии и биотехнологии растений. Основателями биотехнологической школы в Казахстане являются И.Р Рахимбаев и М. Айтхожин [26]. Основой методов клонального микроразмножения растений является тотипотентность - способность растительной клетки при определенных условиях вторично дифференцироваться и под влиянием внешних условий выбирать тот или иной путь морфогенеза [27,28]. Наиболее успешный период в развитии этого метода начался с работ R. Gautheret (1932) и F. White (1931), которые показали способность каллусов и тканей растительных опухолей к неограниченному росту при переносе на свежие питательные среды [29]. Существуют различные классификации приемов клонального микроразмножения. Согласно одной из них, предложенной T. Murashige (1977), процесс можно осуществлять следующими путями: 1) активацией пазушных меристем; 2) инициацией образования адвентивных побегов тканями экспланта; 3) инициацией возникновения адвентивных побегов в каллусе; 4) индукцией соматического эмбриогенеза в клетках экспланта; 5) инициацией соматического эмбриогенеза в каллусной ткани; 6) инициацией формирования придаточных эмбриоидов в ткани первичных соматических зародышей [30]. Н.В. Катаева и Р.Г. Бутенко (1983) выделили два принципиально различных типа клонального микроразмножения: 1) активация уже существующих в растении меристем (апекс стебля, пазушные и спящие почки 18 стебля); 2) индукция возникновения почек или эмбриоидов de novo, которая включает: а) образование адвентивных побегов непосредственно тканями экспланта; б) индукция прямого или непрямого соматического эмбриогенеза; в) дифференциация адвентивных почек в первичной и пересадочной каллусной ткани [31]. Один из традиционных методов вегетативного размножения растений – активация роста пазушных почек и использование пазушных побегов. Он основан на снятии апикального доминирования. Этого можно достичь двумя методами: а) удалением верхушечной меристемы стебля и последующим микрочеренкованием побега in vitro на безгормональной среде и б) добавлением в питательную среду веществ цитокининового типа действия, таких как 6-бензиламинопурин (БАП) или 6-фурфуриламинопурин (кинетин) и зеатин [32,33]. Часто в качестве экспланта используют верхушечные или пазушные почки, которые изолируют из побега и помещают на питательную среду с цитокининами. Образующиеся пучки делят на отдельные побеги, которые при необходимости черенкуют и переносят на свежую питательную среду. После необходимого числа пассажей побеги укореняют in vitro, добавляя в питательную среду ауксины, а затем переносят в почву, где создают условия, способствующие адаптации растений [34]. При клональном микроразмножении плодовых косточковых культур в качестве источника эксплантов обычно используют верхушечные и боковые почки, а также меристематические верхушки [35,36]. Отрабатывались оптимальные условия введения растений в стерильную культуру, культивирование и размножение на искусственных питательных средах, перевод растений из асептических условий в нестерильные для 8 пород плодово-ягодных культур: яблоня, груша, вишня, слива, абрикос, черешня, персик, черная смородина и виноград. В результате проведенных зарубежных исследований установлено, что на этапе введения эксплантатов в культуру in vitro плодовых культур можно подразделить на группы по оптимальному воздействию одинакового состава минеральных элементов и стимуляторов: Минеральная основа – среда Гамборга, содержащая БАП – -2 мг/л, ИМК – -0,5 мг/л, ГК – -0,25 мг/л, аскорбиновую кислоту – – Скуга, содер – 1-2 мг/л, ИМК – -0,4 мг/л, аскорбиновую кислоту – – Для длительного сохранения растений экспланты помещали в камеру с низкой положительной температурой +3оС, освещенностью от 0.5 до 1 тыс. люкс и 10-ти часовым фотопериодом, создавая условия для вынужденного покоя. Также проверялось действие различного содержания сахаров и интенсивности освещённости на сохранение плодовых культур в условиях вынужденного покоя. В результате проведённых опытов было установлено, что для лучшего сохранения растений in vitro благоприятна крайне низкая освещённость. Для длительного содержания сортов в условиях вынужденного покоя необходимо индивидуально подбирать 19 состав питательных сред, так как у различных генотипов отмечаются различия в потребности углеводов [37]. Изучались размножение яблони и груши в условиях in vitro. Сравнительное изучение сред Мурасиге-Скуга и Кворина-Лепуавра на фоне БАП 0,5 мг/л при введении в культуру in vitro яблони и груши свидетельствует о наиболее эффективной регенерации меристематических верхушек через 3 месяца культивирования на среде Кворина-Лепуавра. Из изучаемых цитокининов (БАП, кинетин, зеатин, TDZ) наиболее эффективным оказался БАП в концентрации 2,0 мг/л, обеспечивающий коэффициент размножения до 7,2. Субкультивирование эксплантов на среду без гормонов позволило увеличить количество микропобегов, пригодных для укоренения, более чем в 2 раза. Введение аденин-сульфата в состав среды в концентрации 50,0 мг/л на фоне БАП 2 мг/л позволило не только увеличить в 1,2-2,0 раза, в зависимости от генотипа, коэффициент размножения, но и улучшить качество микропобегов подвоев яблони и груши за счет увеличения их длины и количества листьев на побег. Коэффициент размножения яблони варьировал от 1,1 до 13,4, а груши от 5,3 до 9,0. Положительное влияние на процесс пролиферации побегов яблони и груши in vitro также оказывает снижение в 4 раза аммонийной формы азота в среде Мурасиге-Скуга, обеспечивающее увеличение коэффициента размножения в 1,3-1,5 раза, по сравнению с контролем. [38]. Таким образом, микроклональное размножение открывает также возможности для микроразмножения новых и оздоровленных сортов, а также позволяет организовать длительное хранение растений в пробирках и различными методами криоконсервации (–196°С) для использования в селекции. Следовательно, разработка и усовершенствование этапов микроклонального размножения является актуальной проблемой. К настоящему времени достигнуты определенные результаты по клональному микроразмножению плодовых культур (яблони). Однако микроразмножение сортов груши изучены недостаточно. 20 1.4 Хладохранение Методы хладохранения в течение многих лет достаточно успешно применяются в различных регионах земного шара. Наиболее широкое распространение в качестве метода, замедляющего развитие растений в условиях in vitro, нашло использование низких положительных температур. Впервые, используя положительную температуру, Гэзли удалось сократить частоту субкультивирования растений винограда до одного раза в год [39] Использование оригинальной жидкой питательной среды позволило сохранить жизнеспособность растений земляники в течение 6 лет при температуре + 6 оC в условиях темноты [40]. Длительное сохранение растений in vitro способствует депонированию ценных генотипов, а также является основой для изучения процессов морфогенеза и регенерации в культуре ткани и исследований процессов адаптации микроклонов к условиям ex vitro [41]. Однако при хранении растений in vitro в оптимальных условиях возникает необходимость частого пассирования на свежую питательную среду, что повышает стоимость хранения и затраты ручного труда, увеличивает риск инфицирования, а также может способствовать возникновению сомаклональных вариантов. Наиболее распространенным методом поддержания коллекции растительных тканей in vitro, позволяющим увеличить сроки хранения растительного материала, является использование низких положительных температур. Инкапсулированные бутоны шелковицы хранились в течение 60-90 дней при температуре 4°С без потери регенеративной способности [42]. Синтетические семена, содержащие пазушные почки ананаса, хранились при температуре 4°С и оставались жизнеспособными без прорастания в течение 45 дней [43]. Побеги артишока были высажены на среду для размножения и хранились при 6°С в полной темноте. После трех месяцев хранения наблюдалась 100% выживаемость. Через год хранения выживаемость снизилась до 50% [44]. Установлено, что длительное хранение микропобегов при 4°С и пониженной освещенности не наносит вреда растениям, регенерирующим из таких эксплантов. В Казахстане ведутся работы по сохранению генетического материала плодовых и косточковых культур в условиях вынужденного покоя. При +4°С успешно сохраняются в пластиковых воздухопроницаемых пакетах асептические растения плодовых растений. 21 1.5 Криоcохранение растений Криосохранение – это метод замораживания и хранения растительного материала при сверхнизкой температуре (–196 C), являющийся основой единственной возможности неограниченно долгого хранения генофонда растений [45,46]. Метод позволяет сохранить без изменений клетки и протопласты разных видов растений, меристемы и кончики побегов, зиготические и соматические зародыши, пыльцу, семена, в том числе не выносящие обезвоживания. По имеющимся данным, была успешно осуществлена криоконсервация клеток, протопластов и меристем 40 видов растений [47]. Основные научные проблемы криобанка разработка методов замораживания и восстановления жизнеспособных особей после криосохранения, создание критериев для материалов, предназначенных к криосохранению, и реинтродукция сохраненных видов в природу [48,49]. Самым простым способом является длительное хранение генетической коллекции растений в виде семян, так как содержание влаги в семенах относительно невелико и при закладке их на низкотемпературное и криогенное хранение не требуется дорогостоящего оборудования и специальной подготовки (обезвоживание, обработка криопротекторами и др.) [50]. Из 1700 ботанических садов мира долговременное хранение семян существует в 200 [51]. В частности, в ГБС РАН с 1986 г. изучается эффективность различных режимов хранения семян 180 видов растений [52]. При этом наиболее дешевым и надежным является хранение семян в шахтах в вечной мерзлоте. В толще многолетнемерзлых грунтов температуры могут быть -10°С и ниже. Вечная мерзлота обеспечивает преимущество в сроках хранения по сравнению с температурой +4°С, ограничивая деятельность микроорганизмов и старение семян. В течение трех лет получены положительные результаты в подземной лаборатории (температура около -3°С) Института мерзлотоведения [53]. Успех криогенного хранения семян определяется, в первую очередь, влажностью семян, скоростью их охлаждения и отогревания и особенностями морфоанатомического строения [54,55,56]. Для криосохранения чаще всего используют апикальные меристемы, изолированные из растений, культивируемых в условиях in vitro [57,58,59]. Применение апикальных меристем обеспечивает регенерацию целых растительных организмов, являющихся в генетическом отношении точными копиями исходных растений [60]. роме того, культуру изолированных апикальных меристем применяют для оздоровления от вирусов.Растения, полученные из меристем, повторно тестируют на присутствие различных патогенов, прежде чем переходить к их микроразмножению. Если освободиться от вирусов не удалось, используют методы хемотерапии, основанные на введении в питательные среды веществ, ингибирующих развитие вирусной инфекции в растениях in vitro. Наиболее часто употребляют химический рибаверин (виразол, 1-β-D-ribofuranosyl-1,2,4-triazole-3-carboxamide) [61]. 22 Также имеются данные об ингибирующем влиянии на ряд вирусов груши, рябины, ежевики и малинно-ежевичных гибридов фенолкарбоновых кислот – салициловой, сиреневой, кофейной, галловой, феруловой и кумаровой [62]. Проведена оценка генетической стабильности растений Prunus Ferlenain, регенерированных из криосохраненных апексов, на фенотипическом, цитологическом и молекулярном уровне. Никаких генетических изменений у растений, регенерированных из замороженных апексов, не было обнаружено. Этот результат указывает на то, что метод, используемый для криосохранения Prunus, может быть использован для длительного сохранения [63]. Выживаемость апикальных меристем после криоконсервации зависит от применяемых методик, а также видовых и сортовых различий. В настоящее время не существует единой методики криоконсервации. Для каждого вида и даже типа клеток необходимы свои режимы замораживания-оттаивания, а также криозащитные среды. Общие приемы технологии криосохранения - это применение криопротекторов и предобработка клеток перед замораживанием, соблюдение определенного режима замораживания в интервале от 0 до - 40°С, специальные предосторожности при оттаивании и рекультивировании объектов. Целью этих приемов является предотвращение повреждения мембран кристаллами льда, а также ослабление осмотического шока, возникающего при обезвоживании клеток [64]. В настоящее время успешно используются следующие методы криоконсервации меристем растений: Метод медленного программируемого замораживания, при котором растительные ткани, обработанные криопротекторами, охлаждаются со скоростью от 0,1 до 1°С/мин до -40°С с помощью программируемого прибора – замораживателя, затем помещаются в жидкий азот [65]. Этим методом замораживают как меристематические ткани, так и клеточные культуры [66,67]. Была изучена способность апикальных меристем груши выживать после жидкого азота. Растеньица выращивали in vitro в 2 режимах: при 25С или на холоде при –1С в течение 1 недели. Затем ступенчато снижали температуру с различными скоростями: 0.1; 0.3; 0.5 и 0.8 С/мин до – 40С и погружали пробирки с меристемами в жидкий азот. Пробирки оттаивали 1 мин при 40С. Использовали смесь криопротекторов: ПЭГ, глюкоза и ДМСО. Процент восстановления меристем варьировал от 0 до 51% для растений без акклиматизации и от 5 до 95 % для акклиматизированных растений [68]. Были изучены также влияние различных вариантов предобработки и условий замораживания и оттаивания на выживание апексов побегов Prunus Ferlenain. Апексы побегов обрабатывали 1 мл модифицированного раствора криопротектора PVS2 в течение 45 мин при 4°С, замораживали со скоростью 5°С/мин до -40°С и погружали в ЖА. После быстрого оттаивания при +40°С, апексы побегов промывали раствором 1,2М сахарозы, помещали на стандартную твердую среду, выдерживали в течение 2-3 дней в темноте и затем переносили в обычные условия. Высокий уровень выживания (50-60%) был достигнут при выделении апексов побегов из растеньиц, прошедших 23 холодовую акклиматизацию in vitro (24 ч при 4°С) и прекультивировании в течение 24 ч при 4°С на твердой среде с добавлением 5% ДМСО и 20% пролина [69]. В последнее время применяется криоконсервирование на основе метода витрификации [70]. При этом способе растительный материал обрабатывают высококонцентрированными растворами криопротекторов [71] и сразу погружают в жидкий азот. В результате витрификации вода в клетках затвердевает в аморфном состоянии, тем самым предотвращается образование внутриклеточных кристаллов льда и повреждение клеточных мембран. Методом витрификации были криоконсервированы апексы побегов яблони (Malus domestica Borkh. cv. Fuji). Верхушки побегов прекультивировали на среде МС с 0,7М сахарозой в течение 1 дня при 5°С, затем переносили в криопробирки и добавляли высококонцентрированный криопротектор PVS2 при 25°С. После дегидратации при 25°С в течение 80 мин побеги сразу погружали в ЖА. После быстрого оттаивания верхушки побегов промывали в 2 мл среды МС с 1,2М сахарозой и помещали на агаризованную среду МС. Прямую регенерацию побегов (около 80%) наблюдали приблизительно через 3 недели. Этот метод витрификации был успешно применен к 5 видам или сортам яблони и 8 сортам груши [72]. Методом одноэтапной витрификации были криосохранены меристемы белого тополя. После предварительного культивирования при 5°С в течение 2 дней на безгормональной среде МС, содержащей различные концентрации сахарозы, а также после выдерживания в растворе 2 М глицерина и 0,4 М сахарозы в течение 20 мин, меристемы обрабатывали раствором для витрификации PVS2 и погружали в ЖА. Лучший процент выживания (90%) был получен, когда верхушки побегов предварительно культивировали на безгормональной среде МС с 0,09 М сахарозой, витрифицировали в растворе PVS2 при 0°С в течение 60 мин, погружали в ЖА, оттаивали при 40°С и промывали в растворе 1,2 М сахарозы в течение 20 минут [73]. Изучались криосохранение меристем Arabidopsis thaliana методом витрификации с использованием криопротекторов PVS2 или PVS3. При использовании криопротектора PVS2 побеги отрастают лучше после холодовой акклиматизации в течение 8 или 18 дней. После обработки PVS3 в течение 60 мин при 22°C все меристемы регенерировали [74]. Были разработаны протоколы криоконсервации Dioscorea bulbifera и D. alata методом витрификации. Изолированные верхушки побегов были обработаны всю ночь 0,3М раствором сахарозы в среде MS, погружены в 2М глицерин с 0,4М сахарозой на 20 мин при 25°С, обработаны раствором PVS2 в течение 90 мин при 0°С, погружены в жидкий азот на 1 ч, разморожены при температуре 40°С в течение 2 мин, отмыты в среде с 1,2 М сахарозы в течение 20 мин и культивированы на восстановительной питательной среде. Выживание криосохраненных побегов Dioscorea bulbifera составило до 89% и D. alata до 82% [75]. Эмбриогенные ткани дикой вишни (Prunus avium L.) были успешно криоконсервированы с помощью процедуры одноступенчатого замораживания. 24 Предобработка состояла из культивирования на твердой среде с увеличением концентрации сахарозы (0,25 м на 1 день, 0,5 м за 1 день, 0,75 м в течение 2 дней, и 1,0 м в течение 3 дней) и высушивания на воздухе до 20% содержания влаги. Через 6 недель культивирования рост был сопоставим с ростом необезвоженной и не замороженной ткани. В отличие от этого, не наблюдалось роста эмбриогенных тканей при предварительной обработке на твердой среде, содержащей 5% ДМСО и 2% пролина с последующим погружением в модифицированный раствор PVS2 [76]. Удалось криоконсервировать выращенные in vitro молодые боковые почки Solenostemon rotundifolius методом витрификации. Узловые сегменты выращенных in vitro побегов (2-4 мм в длину) культивировали на среде MS, содержащей 0,1 М сахарозы в чашках Петри в течение 3 недель при 16-часовом фотопериоде при 25°C. Узловые сегменты (0,5 - 1,0 мм в длину) с двумя боковыми почками прекультивированы с 0,3 М сахарозы в течение 2 дней при 25°С, затем обработаны раствором, содержащим 2 М глицерина и 0,4 М сахарозы в течение 20 мин при 25°С и обезвожены в растворе PVS2 в течение 18 мин при 25°С до быстрого погружения в жидкий азот. Восстановление роста после криоконсервации составило в среднем 85% [77]. При методе инкапсуляции-дегидратации меристемы заключают в альгинатный гель, затем проводят их частичное обезвоживание в высокомолярном растворе сахарозы и высушивание в потоке стерильного воздуха до определенного содержания влаги (примерно 20%) [78]. Инкапсулированные меристемы помещают в криопробирки и быстро погружают в жидкий азот. Изучали криоконсервацию яблони M. domestica и M. robusta методом инкапсуляции-дегидратации. Верхушки побегов изолировали из растеньиц, прошедших акклиматизацию холодом при 5°С в течение 3 недель, через 70 дней после их последней пересадки, прекультивировали при 5°С на среде с постепенно повышающейся концентрацией сахарозы (0,1М, 0,3М и 0,7М), инкапсулировали и предварительно выращивали на среде с 1М сахарозой в течение 1 дня, затем подсушивали в течение 4 ч в потоке воздуха в ламинаре до содержания влаги 30% (на основе сырого веса) и погружали в жидкий азот. Процент регенерации был от 70 до 90%, в зависимости от образца [79]. Апексы пазушных побегов яблони сорта Golden Delicious успешно криосохраняли при использовании метода инкапсуляции-дегидратации. После инкапсуляции в альгинатный гель верхушки побегов дегидратировали в стерильном потоке воздуха, затем погружали в ЖА, после чего медленно размораживали. Прекультивирование на модифицированной среде МС, содержащей 0,75 М сахарозу, с последующей дегидратацией в течение 6 ч (21% остаточной воды) приводило к 83,7% восстановления роста верхушек побегов [80]. Меристемы Arabidopsis thaliana криоконсервированы методом инкапсуляции-дегидратации. От одной до семи меристем были инкапсулированы в 4 мм шарики альгината кальция. Шарики были 25 сформированы в присутствии 2М глицерина + 0,4М сахарозы. Регенерация меристем составила между 60 и 68%. Альгинатные шарики, содержащие пять меристем Arabidopsis, были сформированы в присутствии 2 М глицерина + 0,4 М сахарозы или 0,5 М сахарозы. Шарики, сформированные в присутствии глицерина, высушены на воздухе до содержания влаги 0,21-0,26. Альгинатные шарики, сформированные в 0,5М сахарозы, обработаны в растворах 0,5, 0,75 и 1М сахарозы в течение одного дня и высушены на воздухе до содержания влаги 0,19-0,21. Регенерация меристем после криоконсервации была 42- 65% [81]. Был оптимизирован протокол инкапсуляции-дегидратации для криоконсервации побегов Dioscorea floribunda in vitro. Максимальный показатель выживания (87%) был получен при предварительной обработке с 0,3 М сахарозой в течение ночи после инкапсуляции, прекультивировании в 0,75 М сахарозой в течение 4 дней, обезвоживании в ламинарном потоке воздуха в течение 5ч, замораживании в жидком азоте и оттаивании при 40°С [82]. Протокол инкапсуляции-дегидратации оптимизирован для культивируемого in vitro гибрида Actinidia arguta х А. deliciosa. Меристемы были изолированы из 14-дневных побегов, помещены на жидкую среду с ежедневным увеличением концентрации сахарозы (0,3, 0,5, 0,75 М), а затем хранились в 0,75 М сахарозе в течение 2 или 4 дней. Обезвоживание на силикагеле осуществлялось до 20-1,5% остаточного содержания воды. Восстановление колебалось от 85% до 95% [83]. Апексы побегов 5 сортов яблони были успешно криосохранены с использованием метода капельного замораживания. После 3 недель ХА при температуре 5˚С верхушки побегов предварительно культивировали на жидкой среде с 1% ДМСО в течение 24 ч при 5˚С, обрабатывали в течение 75 мин при комн темп. 0,3 М сахарозой и 15% ДМСО, помещали в 5µл капли криопротектора, содержащего 0,3 М сахарозу и 15% ДМСО, в алюминиевой фольге и охлаждали до -40˚С со скоростью 0,2˚С/мин с последующим погружением в ЖА. Процент восстановления роста после криосохранения варьировал от 70 до 92% в зависимости от сорта. Восстановление роста было прямым без образования каллуса [84]. Важным этапом криосохранения является предварительная обработка растительных тканей. Для повышения эффективности криосохранения и подготовки клеток растений к воздействию сверхнизкой температуры в качестве первой стадии предобработки используют холодовую акклиматизацию пробирочных растений. Для предварительной акклиматизации побегов in vitro используют постоянную низкую положительную температуру (4-5°С) [85,86], или температуру, изменяющуюся в течение суток [87,88]. Для холодовой акклиматизации плодовых культур in vitro как правило применяют постоянную температуру: 5°С с 8-ми часовым освещением [89] или 4°С при культивировании в темноте [90]. Использование переменных в течение суток температур (22°/-1°С) значительно увеличивало процент выживаемости меристем [91]. 26 Изучалось влияние различных вариантов предобработки и условий замораживания и оттаивания на выживание апексов побегов Prunus Ferlenain. Высокий уровень выживания (50-60%) был достигнут при выделении апексов побегов из растеньиц, прошедших холодовую акклиматизацию in vitro (24 ч при 4°С) и прекультивировании в течение 24 ч при 4°С на твердой среде с добавлением 5% ДМСО и 20% пролина [92]. Согласно литературным данным, холодовая акклиматизация (22С, 8ч свет, -1С, 16 ч темнота) улучшает регенерацию меристем малины. При увеличении продолжительности акклиматизации от 1 до 3 недель процент выживших меристем сорта Rubus parvifolius L. возрос от 63 до 90%; а процент формирования побегов – от 25 до 75%. Для сорта R.caesius L. было необходимо 6-10 недель акклиматизации, чтобы улучшить выживаемость меристем от 8 до 70-80%, и формирование побегов от 0 до 60-80% [93]. Также изучали влияние холодовой акклиматизации побегов груши на криосохранение меристем с помощью контролируемого замораживания: 1) переменные температуры (22С, свет, -1С темнота); 2) постоянная температура (4С с 8-час фотопериодом или темнотой). Оба вида холодовой акклиматизации улучшали регенерацию растений после криосохранения меристем. LT50 побегов, акклиматизированных в течение 10 недель при переменных температурах составляла –25С, при акклиматизации постоянной температурой –14.7С, в случае неакклиматизированных растений –10С. [94]. Следующим этапом подготовки меристем к замораживанию является прекультивирование на питательных средах с осмотиками, как правило, сахарозой. Возможно, на этом этапе происходит накопление сахаров, которые увеличивают стабилизацию мембран в условиях сильной дегидратации [95]. Доказано, что прекультивирование клеток на среде с высоким осмотическим потенциалом улучшает их выживание [96]. Также оказалась эффективной предобработка растительных тканей 2М глицерином в 0,4 – 0,6M сахарозе в течение 20 мин при комнатной температуре [97]. Для химической предобработки растительных тканей чаще всего используют диметилсульфоксид (ДМСО). Он применяется как для предварительного выращивания, так и во время криосохранения. Наиболее общепринятой предобработкой клеток растений является культивирование меристем на среде с 5% ДМСО в течение 48 часов [98]. Для защиты клеток от повреждения при замораживании используют специальные вещества – криопротекторы, которые должны уменьшить повреждения клеток от осмотического и механического стресса. Их отбирают по принципу наименьшей токсичности и оптимального эффекта. Это либо проникающие в клетки вещества - диметилсульфоксид (ДМСО) и глицерин, либо непроникающие высокомолекулярные - поливинилпирролидон, декстран, полиэтиленгликоль. Группой Sakai разработаны криопротекторы PVS (plant vitrification solution): раствор PVS1 - для замораживания клеточной суспензии и меристемальных тканей Asparagus [99], раствор PVS2 изначально был предложен для криоконсервирования культуры клеток цитрусовых [100], 27 однако сейчас успешно применяется для криоконсервирования апексов более 200 видов растений [101],; раствор PVS3 - для криоконсервирования меристем Wasabi, Asparagus, Allium [102], а PVS4 - меристем Wasabi [103]. Методы витрификации и инкапсуляции-дегидратации получили для целого ряда культур большое развитие как наиболее доступные [104,105]. Также применяется метод, включающий этапы витрификации и инкапсуляциидегидратации. Меристемы, выделенные из узловых сегментов мяты, акклиматизировали при 4°C в течение 3 недель, инкапсулировали, обрабатывали смесью 2М глицерина и 0,4М сахарозы, дегидратировали в высококонцентрированном растворе PVS2 в течение 3 ч при 0°C и помещали в жидкий азот. Образование побегов было почти у 90% меристем [106]. Другим способом сохранения генофонда является криосохранение покоящихся почек древесных растений. При этом сводится к минимуму возможность возникновения сомаклональных вариантов, что важно, когда необходимо сохранить целостность клона с уникальной комбинацией генов, как в случае плодовых культур. Показано, что покоящиеся почки акклиматизированных к холоду яблонь могут восстанавливать рост после криоконсервации с высоким процентом выживания (80-100%), при использовании метода контролируемого высушивания и медленного замораживания с последующим погружением в жидкий азот [107]. Проводились исследования для разработки метода длительного сохранения почек морозостойких плодовых деревьев в жидком азоте. У морозостойких побегов яблони (Malus domestica Borkh.), предварительно замороженных при температуре от -30 до -50°С, почти не было никаких повреждений в листовых почках и коре после погружения в жидкий азот и последующего медленного оттаивания при 0°С. Такой метод предварительного замораживания был успешно применен и для других морозостойких плодовых культур, таких как крыжовник, смородина, малина и груша [108]. Изучали выживание покоящихся вегетативных почек 5 сортов яблони, предварительно замороженных до -30°С или -40°С на 5 мин или 24 ч и затем погруженных в жидкий азот. Для большинства сортов выживание было оптимальным при предварительном замораживании при -30°С на 24 ч. [109]. Для оценки эффективности метода криосохранения вегетативных почек покоящиеся почки 64 образцов яблони (M. domestica Borkh. и др. виды Malus) были собраны и помещены в жидкий азот. Затем для определения жизнеспособности почки оттаивали, регидратировали и окулировали на подвои. Средний процент выживаемости составлял 76% для 40 холодоустойчивых образцов, 66% для 20 среднеустойчивых образцов, и 24% для 4 чувствительных к холоду образцов (вариации от 16 до 100%). Только 4 образца имели ≤25% жизнеспособности, тогда как 54 образца ≤50%, и 35 образцов ≤75%. После 4 лет хранения в жидком азоте не было выявлено значительного снижения жизнеспособности этих образцов при окулировке почек [110]. Криоконсервированы спящие почки трех видов Fraxinus. После высушивания до 30% содержания влаги и охлаждения со скоростью -1°C/ч или -5°C/день до 28 30 или -35°C они были погружены в пары жидкого азота. После отогрева и регидратации почки были привиты на подвои для оценки выживаемости. Процент восстановления колебался от 34 до 100% [111]. Криосохранение генофонда растительного материала в жидком азоте – более совершенный метод, по сравнению с хранением in vitro. Метод позволяет сохранить без изменений мутантные, гибридные, трансформированные, способные к морфогенезу клетки разных видов растений, меристемы и кончики побегов, зиготические и соматические зародыши, пыльцу, семена, в том числе не выносящие обезвоживания [112]. Использование этого метода гарантирует длительное сохранение материала и одновременно снижает вероятность возникновения генетических изменений, возможных в культуре in vitro при положительных температурах [113,114]. 29 2 ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 2.1 Объекты исследований Объектами исследования служили отечественные и зарубежные сорта груши из коллекции Помологического сада КазНИИ плодоводства и виноградарства. Верхушки побегов и черенки груш были собраны на участках Помологического сада. 2.2 Методы исследований В процессе исследований использованы методические указания и рекомендации по клональному микроразмножению и криоконсервации [115, 116, 117]. 2.2.1 Методы введения растений в асептическую культуру Введение в культуру in vitro проводили в два периода: первый – инициация роста побегов из спящих почек черенков груши. После прохождения периода покоя с января по март месяцы. Использовались зеленые побеги, пророщенные в лабораторных условиях из собранных черенков (Рисунок 1). Рисунок 2 – Зеленые побеги груш пророщенные из собранных черенков Второй период – в период активного роста этих культур в май-июнь месяцы, то есть зеленые побеги, срезанные с деревьев в полевых условиях (Приложение А). Собрали черенки зимних почек груши из Помологического сада НИИ плодоводства и виноградарства. Собранные черенки с почками промыли в мыльным растворе в проточной воде в течение часа. Промыв 3 раза в стерильной воде, погрузили в стерилизующие агенты. Инициацию роста у почек проводили путём проращивания в 50% растворе макро- и микроэлементов по Мурасиге и Скугу с добавлением 1 мг/л гибберелловой кислоты, рН 5,6. Отросшие побеги и верхушки активно растущих побегов с меристематической зоной отмывали в мыльном растворе, ополаскивали дистиллированной водой и погружали в стерилизующий агент с различной 30 концентрацией и экспозицией, затем промывали 3 раза в стерильной воде. Спящие почки сортов груши Нагима, Талгарская Красавица, Лесная Красавица, Жаздык и Шыгыс поставили в жидкую среду МС на проращивание. В культуру in vitro вводили меристематические верхушки размером 0,2-0,4 см, которые изолировали из развивающихся почек, освобождая их от покровных тканей, что обеспечивало достаточно эффективную стерилизацию. В качестве стерилизующих агентов использовали 0,2 % раствор ртути HgCl2 с экспозициями 3 и 4 минуты, 5% гипохлорид натрия «Доместос» в соотношении 1:2 с экспозицией 3 минут, «Доместос» в соотношении 1:5 с экспозицией 15 мин., раствор гипохлорид натрия «Белизна», содержащий гипохлорид натрия, «Белизна» 1:2 с экспозицией 3 мин., «Белизна» 1:5 с экспозицией 5 мин., «Деохлор» 1% 5 мин., чистящие средства «Vanish» без разведения 15 мин., «Мистер Мускул» без разведения. В работах Harvey A.E., Grasham J.L. [118] применение 5,25% гипохлорита натрия и 3% перекиси водорода оказалось эффективным для поверхностной стерилизации годичных стеблей. В ходе работы подбирали стерилизующие агенты и оптимальные способы обработки для введения растений в асептическую культуру. Поскольку стандартная процедура дезинфекции растительного материала при введении их в культуру in vitro включает использование растворов ртутьсодержащих веществ, таких как диацид, необходимо было подобрать менее опасные стерилизующие агенты. В связи с этим была изучена эффективность использования различных стерилизующих веществ, для ингибирования роста сапрофитной микрофлоры при введении растений в асептическую культуру. Выделенные апексы стерилизовали от сапрофитной микрофлоры и высаживали на питательную среду Мурасиге-Скуга. Одновременно экспланты проверяли на наличие латентной инфекции на VISS-среде, в состав которого входит: сахароза 10 г/л; гидролизат казеина 8 г/л; дрожжевой экстракт 4,0 г/л; КН2РО4 – 2,0 г/л; МgSO4∙7H2O – 0,15 г/л; джелрайт 6,0 г/л; рН раствора 6,9. Наблюдения за растениями, введёнными в культуру in vitro, проводили еженедельно, при этом учитывали число живых, погибших и инфицированных эксплантов [119]. При первом пассировании микропобегов на свежую среду, срезали базальные части побегов, помещали в чашки Петри на среду Viss и культивировали при температуре 25°С в течение 1-2 недель. В случае отсутствия эндофитной микрофлоры в эксплантах среда остается прозрачной, тогда как помутнение среды и рост колоний указывают на инфицированность микропобегов, которые следует сразу же отбраковывать. Дальнейшее микроклональное размножение проводили с проверенными асептическими растениями. 31 2.2.2 Метод микроклонального размножения груши Стерильные растения высаживали на питательную среду Мурасиге и Скуга с добавками, соответствующими культуре в ламинарном боксе (LABCONCO), стерилизованном кварцевой лампой. Наблюдения за растениями, введёнными in vitro, проводили еженедельно, при этом учитывали число живых, погибших и инфицированных эксплантов. Наблюдения и учёт проводили ежемесячно. Учитывали состояние и число образовавшихся побегов. Коэффициент размножения средний за 1 пассаж для каждого генотипа высчитывали по формуле: P= a/b∙c (1) a – количество вновь образовавшихся побегов b – количество побегов высаженных для размножения c – количество пассажей Для микроклонального размножения были взяты 20 сортов груши: Талгарская Красавица, Жаздык, Нагима, Любимица Клаппа и Лесная Красавица. Оптимизацию условий клонирования производили путем отчленения меристематических верхушек, терминальных и латеральных почек и посадки их на искусственные питательные среды. При этом проводили подбор минерального состава питательных сред, ауксинов, цитокининов и других регуляторов роста, способствующих введению эксплантов в культуру, пролиферации побегов. Вычисление апексов и пересадка при культивировании проводилась в ламинарных боксах предварительно стерилизованных кварцевой или бактериальной лампами. Микроклональное размножение проводили в термостатируемых комнатах при освещённости 40 μmol m-2s-1, 16-ти часовом фотопериоде, при температуре +25оС. Оптимизировали гормональный, минеральный состав питательных сред для введения в асептическую культуру и клонирования in vitro растений груши. Для оптимизации микроклонального размножения в культуре in vitro, на основе питательной среды МС с сочетаниями БАП, ИМК и ГК были приготовлены следующие варианты: 1) 2) 3) 4) 5) 6) БАП 0,5 + ИМК 0,1; БАП 1,0 + ИМК 0,1+ ГК 0,1; БАП 2,0+ ИМК 0,1; БАП 0,5; БАП 0,5+ ИМК 0,01+ ГК 0,1; БАП 0,5 + ИМК 0,5+ ГК 0,1; Питательные среды разливали в культуральные посуды и стерилизовали в автоклаве (ТЮМЕНЬ ВК – 75 – 01) при давлении 0,8-1,0 атмосфер в течение 25 мин. Образовавшиеся микропобеги ежемесячно пассировали, на свежую питательную среду для пролиферации и размножения. Учитывали число инфицированных, некротизированных и развивающихся растений. 32 Микроклональное размножение проводили в светокультуральной комнате при освещённости 40 μmol m-2s-1, 16-ти часовом фотопериоде и температуре (+23-25°С). На этапе микроразмножения использовали среды : Мурасиге и Скуга (MS), Ллойда и Маккоуна (L&M), и Pear Rootstock medium (PRS). Для оптимизации состава питательных сред микроклонального размножения in vitro груши изучали влияние минерального состава среды на побегообразование и пролиферацию побегов. Исследование проводили на сорте –Талгарская Красавица. Эксперименты проводили на основе 5 групп. 1 группа - (NH4NO3), 2 группа - (KNO3); 3 группа - (CaCl2, KH2PO4, MgSO4 * 7H2O); 4 группа - (MnSO4.5H2O, ZnSO4.7H2O, CuSO4.5H2O, KI, CoCl2.6H2O, H3BO3, Na2MoO4.2H2O); 5 группа - (FeSO4.7H2O, Na2EDTA) (Таблица 1). На каждые варианты питательных сред высаживали побеги в 3 повторностях. Оцениваемыми факторами были размножение побегов, высота побегов, общее качество, некроз верхушек побегов, каллус, количество узлов, некроз листьев, размер листа, физиологические отклонения. Каждые 3 недели снимали данные побегов учитывая их длину побегов, количество узлов, количество побегов, образования каллусов, окраску листа, пятен на листах а также некроз побегов. В каждом варианте МС среды: Сахароза – 30 г/л Мезоинозит – 100 мг/л Глицин – 2 мг/л Витамины В1, В6 и РР – по 0,5 мг/л ИМК – 0,1 мг/л БАП – 0,4 мг/л Агар – 3,5 г/л Джелрайт – 1,5 г/л рН= 5,8 33 Таблица 1 – Приготовление 5 различных минеральных солей Варианты Объем раствора на 1 л среды, мл Для изучения 1 группы: 1 Группа 1 Группа 2 Группа 3 Группа 4 Группа 5 25 мл/50% 50 мл/100% 50 мл/100% 50 мл/100% 50 мл/100% 1мл/100% 50 мл/100% 1мл/100% 50 мл/100% 1мл/100% 5 мл/100% 5 мл/100% 5 мл/100% 25 мл/50% 50 мл/100% 1мл/100% 50 мл/100% 75 мл/150% 50 мл/100% 1мл/100% 50 мл/100% 1мл/100% 50 мл/100% 50 мл/100% 50 мл/100% 25 мл/50% 1мл/100% 50 мл/100% 1мл/100% 75 мл/150% 1мл/100% 2 50 мл/100% 3 75 мл/150% Для изучения 2 группы: 4 50 мл/100% 5 50 мл/100% 6 50 мл/100% Для изучения 3 группы: 7 50 мл/100% 8 50 мл/100% 9 50 мл/100% Для изучения 4 группы: 10 50 мл/100% 50 мл/100% 50 мл/100% 0,5 мл/50% 11 50 мл/100% 50 мл/100% 50 мл/100% 1 мл/100% 12 50 мл/100% 50 мл/100% 50 мл/100% 1,5 мл/150% Для изучения 5группы: 13 50 мл/100% 50 мл/100% 50 мл/100% 1мл/100% 14 50 мл/100% 50 мл/100% 50 мл/100% 1мл/100% 15 50 мл/100% 50 мл/100% 50 мл/100% 1мл/100% 34 5 мл/100% 5 мл/100% 5 мл/100% 5 мл/100% 5 мл/100% 5 мл/100% 5 мл/100% 5 мл/100% 5 мл/100% 2,5 мл/50% 5 мл/100% 7,5 мл/150% 2.2.3 Метод хладохранения груши Условия хранения Растения умеренного климата могут храниться при температуре 4°С или ниже, тогда как для тропических культур требуется температура 15-25°С. Условиями освещения могут быть темнота или 12-16 часовой фотопериод с изменяющейся интенсивностью света. Для улучшения продолжительности хранения часто бывает необходима предобработка. Холодовая акклиматизация (одна неделя при: 8 ч, 22°С, день/16 ч, –1°С, ночь) значительно улучшает длительность хранения некоторых растений умеренного климата. Две недели на питательной среде, которая используется для хранения, в комнате для выращивания растений перед помещением в хладохранение улучшает длительность хранения растений. Постепенное обезвоживание перед хранением может быть эффективным для некоторых видов, адаптированных к регионам с сезонными различиями влажности воздуха. Некоторые растения хранятся лучше с корнями, тогда как для других корни не имеют никакого значения в продолжительности хранения. Могут быть использованы различные типы посуд для хранения. Особенно важно иметь посуды, защищающие от грибковой инфекции. Коробки, пробирки и банки различных видов могут использоваться для хранения. Крышка должна быть хорошо закрыта для сохранения влаги и предотвращения загрязнения. Разработаны специальные полупроницаемые пакеты для культуры тканей растений. Эти пакеты склеивают для исключения заражения, но при этом происходит газообмен, а водяной пар удерживается внутри пакета. Особенно важно запечатывать пакеты, когда колебания температуры могут вызвать занесение спор грибов из внешней среды [120,121]. Для хладохранения были размножены 15 сортообразцов груш в 130 мл стеклянных банках с крышками полиэтиленовой пленки на среде 20 мл MS (Мурасиге и Скуга с 3% сахарозы, 1,0 мг/л N6 бензиламинопурин (БАП), 0,5 мг/л ИМК и 0,7% агара, при рН 5,7. В течение недели растения культивировали в светокультуральной комнате при температуре 24ºС, 16-часовом фотопериоде, освещённости 25 μрол м-2с-1, затем неделю акклиматизировали при переменных температурах (8 час, при +4оС, 16 час, при +23оС). Прошедшие акклиматизацию растения помещали в хладокамеру с положительной низкой температурой (+4оС), освещенностью 7 μмол м-2с-1 и 10ти часовым фотопериодом, где еженедельно проводятся наблюдения. Для хладохранения на один сорт использовались по 15 побегов (в размере 3 см) на каждую среду MS с 0,8% агара в 5 камерных воздухопроницаемых пакетах побеги высаживались в 3 повторностях. Предварительно размноженные in vitro, хорошо сформированные асептические растения были пассированы на питательные среды в воздухопроницаемые пакеты (Рисунок 3). 35 Рисунок 3 – Воздухопроницаемые пакеты для хладохранения Учитывается состояние растений по 5-ти балльной шкале на основе внешнего вида растений: 5 баллов – состояние очень хорошее, растения ярко зелёные 4 балла – состояние хорошее, растения слабо этиолированные 3 балла – состояние удовлетворительное, растения этиолированные 2 балла – состояние плохое, растения желто-коричневые 1 балл – состояние плохое, растения коричневые с признаками некроза, в некоторых местах жёлтые 0 баллов – растения погибли На оптимизированных питательных средах в пластиковых воздухопроницаемых пакетах при температуре +4ºС, освещенностью 7 μмол м2 -1 с и 10-ти часовым фотопериодом растения хранятся без дополнительной пересадки (субкультивирования) от 6 до 40 месяцев в зависимости от вида растения [122]. Затем проводили исследования по криосохранению меристем, выделенных из размноженных в асептических условиях растений и регенерацию побегов из них. Оптимизацию восстановительных сред для криосохранённых меристем проводили подбором минерального состава питательных сред, фитогормонов и других регуляторов роста, способствующих восстановлению меристем после криосохранения в жидком азоте при –196°С. 1) Среда МС, содержащая БАП-0,5 мг/л, ИМК-0,1 мг/л; 2) Среда МС, содержащая БАП-0,1 мг/л, ГК-3,0 мг/л; 3) Среда МС с удвоенной концентрацией хелата железа – 20 мг/л, глицин-4 мг/л, АС 15 мг/л, поливинилпирролидон-25 мг/л, 50 мг/л глутамина, витамин В1 -10 мг/л, витамин В6 -0,5 мг/л, витамин РР-4 мг/л, БАП-0,5 мг/л, ИМК-0,1 мг/л; 36 4) Среда МС, содержащая глицин-20 мг/л, мезоинозит-10 мг/л, АС-50 мг/л, витамин В1-40 мг/л, витамин В6-50 мг/л, витамин-РР 50 мг/л, БАП-0,5 мг/л, ИМК-0,1 мг/л, ГК-3,0 мг/л; 5) Среда МС, содержащая витамин В1-40 мг/л, витамин В6-50 мг/л, витамин РР50 мг/л, без добавления гормонов. Все среды содержали 20 г/л глюкозы, рН 5,7. Восстановительные стерильные среды разливали в специальные планшеты с ячейками. Образовавшиеся микропобеги после шести недель культивирования пересаживали на свежие питательные среды для размножения. При переводе растений из асептических условий в нестерильные подбирали субстрат и способы его дезинфекции, а также проводили закалку растений, повышающую устойчивость к неблагоприятным факторам внешней среды, в том числе к патогенным микроорганизмам. 2.2.4 Метод криосохранения спящих почек Для создания криобанка гермоплазмы использованы почки холодостойких древесных растений умеренного климата – груши. Закаленные холодом ветки растений, после снижения температуры окружающей среды до -10°С и ниже, обезвожены до содержания влаги 30% и затем заморожены со скоростью 1°С/час до –25°С, оставлены при такой температуре на 24 часа, а затем погрузили в жидкий азот –196ºС. Контроль размораживания проведена при комнатной температуре. Восстановление роста осуществлено методом окулировки глазка с почкой на подвой или микроклональным размножением размороженной почки на искусственных питательных средах. С целью повышения жизнеспособности при криоконсервации и снижения периода подготовки почек к замораживанию поставлен ряд экспериментов по оптимизации криосохранения спящих зимующих почек. После снижения температуры окружающей среды до –10ºС или ниже (в зимние морозы), проведён сбор древесных черенков со спящими почками в Помологическом саду Института плодоводства и виноградарства. Для проведения опытов по замораживанию спящих почек определяли влажность образцов во влагомере KERN MLB 50-3 (Рисунок 4). 37 Рисунок 4 – Влагомер для определения влажности черенков груши Часть черенков были помещены для высушивания в климо камеру с температурой –5ºС (Рисунок 5) до снижения влажности почек до 30%, потеря влаги определяется 2 раза в неделю. Другая часть черенков не было высушена. Опыты по оптимизации методов криосохранения проведены с почками при естественной влажности и подсушенными до 30% содержания влаги. Черенки нарезали на сегменты с одной почкой размером 2 см, расположенной в середине, и помещены с размером 5-10 мл в криовайлы (Рисунок) а также испытано влияния криопротекторов и способов предобработки почек на жизнеспособность после замораживания: Процедура восстановления жизнеспособности: Пакеты и криовайлы вынули из жидкого азота и перенесели на 24 часа в холодную комнату с температурой +4oC. Сегменты с почками достали из криовайлов, промыли дистиллированной водой и поместили в чашки Петри во влажную камеру на 2-5 суток. 38 Рисунок 5 – Климатическая камера для высушивания черенков Диагностика жизнеспособности криосохраненных в жидком азоте спящих, зимующих почек груши. Жизнеспособность почек проверяют путём проращивания в воде или питательной среде, окулировки на подвой или гистологического анализа по характерному окрашиванию живых тканей. Для установки живых и погибших тканей в меристематических частях почек плодовых культур при криоконсервации провили тестирование жизнеспособности почек методом окрашивания в 1% растворе трифенил тетразол хлорида (ТТХ). Этот метод основан на восстановлении бесцветной формы ТТХ в формазон, имеющий карминно-красный цвет у живых клеток. Окрашивание ТТХ является одиним из надежных методов при визуальном анализе и достаточном для быстрой диагностики материала после криосохранения. Раствор 1% ТТХ готовят в 1/15 М N2НРО4 и 1/15M KH2PO4 (Буфер Зеренса). Черенки с почками погрузили в теплую воду (25-30º С) на сутки в термостат. Затем почки срезали с черенка и погружали в 1% ТТХ с буфером Зеренса (рН – 7,0-7,2). Почки оставили в растворе ТТХ в течение 24 час. Срезы меристемной ткани готовили вручную с помощью лезвия. Срезы просматривали и фотографировали под цифровым стереомикроскопом "Digital Microscope" фирмы «National». 39 Рисунок 6 – Предобработка криопротекторами в криовайлах Предобработка черенков (почки с естественной влажностью и 30%) (Рисунок 6). 1 вариант. Контроль 1 – замораживание без холодовой обработки; 2 вариант. Контроль 2 – замораживание с холодовой обработкой без криопротекторов. 3 вариант. Замачивание в криопротекторе, состоящего из мёда (замораживание с мёдом); 4 вариант. Замачивание в криопротекторе, состоящего из мёда + 15%ДМСО (замораживание с криопротектором); 5 вариант. Замачивание в криопротекторе PVS2 (30% глицерин, 15% этиленгликоль, 15% ДМСО в жидкой среде МС с 0,4М сахарозой, рН 5,7) в течение 3 часов (замораживание с криопротектором); 6 вариант. Замачивание PVS3 (50% глицерина + 50% сахарозы) в течение 3 часов (замораживание с криопротектором); 7 вариант. Замачивание PVS4 (35% глицерина + 20% ЭГ + 0,6М сахарозы) в течение 3 часов (замораживание с криопротектором); 8 вариант. Замачивание в криопротекторе Раствор Towill (35% глицерина + 10% ДМСО + 10% ПЭГ-8000+ 0,4М сахарозы) в течение 3 часов (замораживание с криопротектором); 9 вариант. Замачивание в криопротекторе ИББР-1 (50% глицерин, 50% глюкозы в жидкой среде МС с 0,4М сахарозой, рН 5,7) в течение 3 часов (замораживание с криопротектором). Повторность опыта 3х кратная по 5 почек в каждом варианте. Эксперименты проводили на почках с естественной и 30% влажностью. 40 2.2.5 Методы криосохранения апикальных меристем Асептические побеги культивировали в светокультуральном помещении при 16-часовом фотопериоде, интенсивности освещения 25 μmol m-2s-1 и контролируемой температуре 25ºС. Растения, выращенные на питательной среде Мурасиге и Скуга, рекультивировали на свежую питательную среду каждые 3 недели. В конце 3 недельного цикла культивирования растения были помещены в климатическую камеру для прохождения адаптации к холоду. Акклиматизацию побегов проводили в течение 1-6 недель в климатической камере (Lab-Line Environette, Melrose Park, IL,USA) при чередующемся режиме: 8 час +22ºС (интенсивность освещения 10 μmol m-2s-1), затем 16 час –1ºС (без освещения). А также в течение 1-4 месяцев при постоянной температуре +4ºС 8-ми часовом фотопериоде (интенсивность освещения 10µmol m-2 s-1). Апикальные меристемы (от 0,8 до 1,0 мм) вычленяли из акклиматизированных побегов и после соответствующей обработки погрузили в жидкий азот. Модификация метода витрификации с 0,3М сахарозой отличалась от стандартного метода исключением предобработки жидкой средой МС с 2М глицерином перед криосохранением. Для повышения эффективности криосохранения проведены эксперименты по усовершенствованию методов. Определяли оптимальные способы и время закаливания асептических растений, для сохранения жизнеспособности меристем после замораживания в жидком азоте (–196ºС). Изучали влияние закаливания при постоянной низкой положительной температуре +4ºС (8 часов освещенность 10 μmol m-2s-1, затем 16 час в темноте) в течение от 1 до 4 месяцев и переменной чередующейся температурой +22ºС 8 час / 16 час, –1ºС в течение 1-6 недель в климатической камере. Метод такого закаливания растений предложен E. Angelo [123, с. 478]. Определяли размеры апикальных меристем для криосохранения с высокой жизнеспособностью. Меристемы различных размеров выделяли с помощью бинокулярного стереомикроскопа (Lieder) в стерильном ламинарном потоке воздуха. Изучали оптимальную концентрацию сахарозы в среде для предобработки, что является исключительно необходимым этапом при криоконсервации [124, с.80].Молярность сахарозы использовали с 0,1 по 0,5 М раствора. При криосохранении методом инкапсуляции-дегидратации, меристемы выделенные из растений прошедших предварительное закаливание инкапсулировали в альгинатный гель и проводили дегидратацию инкапсулированных меристем в альгинатном геле, обработкой 0,75М сахарозой и последующей сушкой в потоке стерильного воздуха в ламинарном боксе. Замораживали путем быстрого погружения в жидкий азот (–196ºС). Размораживание проводили при комнатной температуре в течение 20 мин [125]. После криосохранения в течении шести недель определяли оценку жизнеспособности меристем по динамике роста и развития. 41 3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 3.1 Введение в асептическую культуру in vitro различных генотипов груши, инициированных из зимних почек и верхушечных побегов При проведении биотехнологических исследований, связанных с культурой in vitro, важным этапом является стерилизация исходного растительного материала, взятого из природных условий, так как его поверхностные ткани, заражены грибами и их спорами, а также бактериями. Известны работы по культуре in vitro листовых эксплантов плодовых и ягодных культур [126,127]. Однако у сортов груши, такие исследования в нашем регионе не проводились. Для стерилизации листовых эксплантов плодовых культур используют перекись водорода, спирт, гипохлорид натрия и другие [128,129]. Для этого исследования использовались спящие почки и активно растущие побеги сортов груши Нагима, Талгарская Красавица, Лесная Красавица, Жаздык и Шыгыс. Рисунок 7 – Пророщенные побеги из черенков груши В результате эксперимента установлено, что наиболее оптимальными стерилизующими агентами верхушек побегов груши при введении в асептическую культуру являются обработка: а) Белизна в соотношении 1:5 с экспозицией 5 мин. выход стерильных эксплантов составил при этом 93% жизнеспособных эксплантов; б) Доместос в соотношении 1:2 с экспозицией 4 минуты, выход стерильных эксплантов составил при этом 80%; в) Доместос 1:5 с экспозицией 15 минут жизнеспособных эксплантов составило 60% (Таблица 2). Таблица 2 – Стерилизация верхушечных побегов сорта Талгарская Красавица от сапрофитной микрофлоры Кол-во Способных Стерилизующи №п/ Экспозици побегов, регенерировать е агенты и п я, мин. штук концентрации штук % Контроль HgCl2 ( 0,2%) 3 15 8 53 % 2 HgCl2 (0,2%) 4 15 9 60% 3 Доместос 1:2 4 15 12 80% 4 Доместос 1:5 15 15 9 60% 5 Белизна 1:2 3 15 10 66% 6 Белизна 1:5 5 15 14 93% 7 Деохлор 1% 5 15 6 40% 15 15 5 33% 10 15 4 26,6% 15 15 6 40% 1 8 9 10 Vanish без разведения Мистер Мускул б/р Мистер Мускул б/р Использование остальных стерилизующих агентов как Деохлор 1 %, Мистер Мускул, Vanish без разведения приводило к некрозу побегов и их к гибели от бактериальной и грибковой инфекции. В этом случае у некоторых эксплантов проявились признаки грибковой инфекции, такие как потемнение основания побега и листьев, а также помутнение питательной среды, что приводило к гибели побегов. Вероятно, поверхностная стерилизация первичных эксплантов способствовала освобождению их от грибковой инфекции, но была малоэффективна против инфекции бактериальной. В данном исследовании было установлено, что из всех испытанных стерилизующих агентов лучшим стерилизующим и менее опасным являлся гипохлорид натрия «Белизна» в соотношении 1:5 с экспозицией 5 минут (Рисунок 8). Рисунок 8 – Использование стерилизующего раствора «Белизна» 1:5 с экспозицией 5 минут 3.1.2 Тестирование микропобегов груши На VISS среду была высажена базальная часть побегов груши сортов Нагима, Талгарская Красавица, Лесная Красавица, Жаздык и Шыгыс прошедших стерилизацию от сапрофитной микрофлоры. Следующим необходимым этапом получения асептического материала в культуре in vitro является выявление эндофитной (скрытой) микрофлоры. Защита тканей растений in vitro от микробной контаминации, а также предотвращение инфицирования, является залогом успешного проведения микроклонального размножения [130]. Бактериальную инфекцию часто трудно выявить визуально из-за ее локализации внутри растительных тканей. При этом контаминированные растения не проявляют видимых симптомов заражения, лишь замедляется скорость их размножения, однако в дальнейшем такой инфицированный растительный материал будет непригоден для криоконсервации и создания криобанка гермоплазмы. Выявляют эндофитную бактериальную инфекцию, помещая кусочки эксплантов на специализированные питательные среды в чашки Петри. В наших экспериментах для этих целей была использована среда Viss. В результате анализа проведенных экспериментов было установлено, что процент свободных от эндофитной микрофлоры растений зависит от конкретного образца (сорта). Было выявлено, что у некоторых сортов (Талгарская Красавица, Лесная Красавица, Жаздык, Нагима) низкий процент контаминации тканей эндофитной микрофлорой и, соответственно, высокий выход асептических растений – 80,0-100%. Тогда как в тканях сорта Шыгыс процент свободных от эндофитных бактерий растений не превышал 55% . Так, из-за высокой эндофитной контаминации этот сорт был потерян и в результате не было получено асептических растений этого сорта в культуре in vitro. Протестированные на скрытую бактериальную инфекцию и отобранные асептические растения груши были использованы в дальнейшем для микроклонального размножения. 3.1.3 Влияние минерального состава питательной среды для пролифирации побегов груши Известно, что, несмотря на широкое практичеcкое применение технологий микроразмножения у многих видов растений, имеется ряд проблем, снижающих их эффективность. Это высокая генотипическая зависимость процессов морфогенеза in vitro, образование каллуса при культивировании меристем, витрификация побегов, низкая частота адаптации in vivo и другие [131,132]. Рисунок 9 – Высаживание побегов груши на различные варианты минеральных солей Результаты эксперимента показали, что наиболее подходящая среда из 5 групп – RI в 3 вариантах RI 25 мл NH4NO3, RI 50мл NH4NO3 , RI 75 мл NH4NO3, то есть на среде содержащей 25%, 50%, 75% азота (Рисунок 9). Азот – наиболее широко используемый макроэлемент, важнейший строительный материал растений, увеличивает зеленую (вегетативную) массу растений, и как следствие - урожайность. Участвует в образовании белков. Как важная составная часть, находится в нуклеопротеидах и нуклеиновых кислотах, входит в состав молекулы хлорофилла, витаминов (например, тиамина), алкалоидов [133]. Поэтому считаем, что проведенные исследования значительно показали положительные результаты по измеренным показателям, такие как длина побегов, количество побегов, количество узлов, окраска листа, размер листа/ширина, пятнистость листа/некроз. Таким образом, в результате проведенных исследований были выявлены особенности влияния минеральных растворов питательной среды на развитие растений груши. Наиболее подходящая среда из 5 минеральных растворов являются 25%, 50%, 75% азот содержащие МС среды. Предложенный опыт даст возможность протестировать применение этого способа для улучшения in vitro размножения побегов груши. 3.1.4 Оптимизация состава питательных сред при введении микропобегов в культуру in vitro При оптимизации состава питательных сред для микроклонального размножения растений груши в условиях in vitro проводили эксперименты по изучению влияния различных концентраций регуляторов роста, на рост и развитие эксплантов на среде МС и PRS [134]. Важным фактором, имеющим значение для успешного микроразмножения, является гормональный состав питательной среды и вид экспланта. Решающую роль в этом играют концентрации и сочетание фитогормонов. Исследования показали, что асептические побеги груши через 7—10 дней после посадки на ростовые питательные среды начинали активно расти. На (таблице ) приведены результаты развития эксплантов сорта Талгарская Красавица на основе питательной среды МС, содержащей различное количество БАП, ИМК, и ГК. Таблица 3 – Развитие эксплантов груши сорта Талгарская Красавица на средах с различным сочетанием концентраций стимуляторов роста Показатели развития Сочетание регуляторов Коэффициент Длина Число роста (мг/л) размножения побега, мм листьев, шт. БАП 0,5 + ИМК 0,1 7,8±1,4 5,9±2,8 10,0±1,8 БАП 1,0 + ИМК 0,1+ ГК 0,1 3,8±0,2 6,2±0,2 12,1±2,0 БАП 2,0+ ИМК 0,1 3,3±0,2 4,3±0,8 9,8 ±2,0 БАП 0,5 6,5±0,3 6,1±1,8 10,4±0,7 БАП 0,5+ ИМК 0,01+ ГК 0,1 5,2±0,3 7,4±1,3 13,3±0,4 БАП 0,5 + ИМК 0,5+ ГК 0,1 5,4±0,9 5,6±1,7 11,5±2,1 Среди использованных сочетаний регуляторов роста наибольшую степень размножения (6,5±0,3) отмечали в присутствии в среде сочетания БАП 0,5 мг/л. Минимальная степень размножения проявилась при сочетании регуляторов роста БАП 2,0+ ИМК 0,1 (3,3±0,2). На рост побегов в длину существенное влияние оказало сочетание БАП 0,5+ ИМК 0,01+ ГК 0,1 мг/л. Данный вариант обеспечивал развитие длинных побегов, пригодных к укоренению. Средняя длина побегов в варианте составила 7,4 мм (Таблица 3). На этапе микроразмножения использовали среды : Мурасиге и Скуга (MS), Ллойда и Маккоуна (L&M), и Pear Rootstock medium (PRS) [134]. На коэффициент размножения побегов груши оказали влияние два фактора – состав питательных сред и генотип. На среде МС (контроль) максимальный коэффициент размножения был у сорта Лесная Красавица коэффициент размножения в среднем составил (5,2). На среде PRS высокая степень пролиферации отмечена у сортов Талгарская Красавица в среднем (7,2), Нагима (6,1) На среде (L&M) наиболее высокий коэфициент размножения был у сортов Талгарская Красавица (6,6) и Любимица Клаппа (4,4), (таб.4). Таблица 4 - Коэффициент размножения у эксплантов различных сортов груши в зависимости от минерального состава питательных сред Сорта груши Талгарская Красавица Жаздык Нагима Любимица Клаппа Лесная Красавица Питательная среда МС (контроль) 5,1±2,7 3,0±0,4 3,2±0,3 4,5±0,7 5,2±1,0 PRS 7,2±0,4 5,7±0,6 6,1±0,3 4,8±1,2 5,3±1,4 L&M 6,6±0,3 3,1±0,3 3,2±1,3 4,4±0,5 3,7±0,6 Наибольший рост побегов в длину был отмечен на среде PRS у сортов Талгарская Красавица, Лесная Красавица и Любимица Клаппа. Таким образом, для большинства сортов груши среды PRS и МС оказались оптимальными. На питательной среде PRS были получены лучшие результаты по таким показателям, как коэффициент размножения и длина побегов. Эта среда была пригодна для культивирования побегов без частого субкультивирования (Таблица 4). 3.1.5 Клональное размножение груши Микроклонирование груши основано на способности цитокининов снимать апикальное доминирование и вызывать адвентивное побегообразование. Использование данного подхода позволяет значительно увеличить коэффициент размножения в зависимости от вида растений и при этом сохранять все основные хозяйственно-ценные признаки исходного генотипа. На рисунке 10 показано микрочеренкование побегов груши при размножении на искусственных питательных средах. Для проведения дальнейшего исследования хладохранений и криосохранений груш были размножены 20 сортов груши. Таблица 5 – Результаты микроклонального размножения груши (среднее на 1 пассаж для каждого генотипа) Культура 1 Талгарская Красавица Лесная Красавица Карындас Любимица Клаппа Мраморная Урожайная Ашэ Бере Арданпон Краснокутская зимняя Млина Парпарота Вильямс Выстовачная Айдана Нагима Жаздык Жозефина Мехельинская Млеевская сочная Ароматная Бере Боск Количество, шт высаженные побеги 3 12 42 4 13 1 5 4 5 2 15 3 5 8 6 3 14 7 3 4 9 размноженные побеги 4 73 292 16 61 2 19 18 19 6 45 7 19 42 36 10 30 18 6 48 25 Коэффициент размножения 5 6,1 6,9 4,0 4,7 2,0 3,8 4,5 3,8 3,0 3,0 2,3 3,8 5,3 6,0 3,3 2,1 3,0 3,1 6,8 2,7 В результате эксперимента были определены, высокий коэфициент размножения in vitro размноженных растений груш. У сортов Лесная Красавица, Ароматная, Талгарская Красавица, Айдана, Ароматная были выявлены высокий коэфициент размножения (Таблица 5). Наименьшее размножение наблюдалось у сортов Жаздык, Бере Боск, Мраморная. Хорошо размноженные сорта груш использовались для дальнейшего исследования хладохранений и криосохранений. Рисунок 10 - Микрочеренкование побегов груши в культуре in vitro Рисунок 11 – Микроклональное размножение груши Рисунок 12– Размноженные растения груш в условиях in vitro Рисунок 13 – Процедура микроклонального размножения 3.1.6 Хладохранение груши Груша – растение умеренного климата храниться при температуре 4°С. Для хладохранения были размножены 15 сортообразцов груш: такие как Карындас, Лесная Красавица, Талгарская Красавица, Любимица Клаппа, Млеевская Сочная, Мраморная, Урожайная, Ароматная, Ашэ, Бере Арданпон, Краснокутская Зимняя, Млина, Парпарота, Выставочная, Вильямс. Эти сорта пересаживали в питательную среду МС с 8 опытными вариантами в специальные воздухопроницаемые стерильные пакеты. Одну неделю провели холодовую акллиматизацию при переменной температуре 8 ч, 22°С, днем /16 ч, –1°С,ночью, затем две недели держали в светокультуральной помещении при температуре 25°С, с целью улучшения длительности хранения. Прошедшие акклиматизацию растения помещали в хладокамеру с положительной низкой температурой (+4оС), освещенностью 7 μмол м-2с-1 и 10-ти часовым фотопериодом, где еженедельно проводятся наблюдения. Все опытные варианты хранили 36 месяцев. Каждые 3 меcяца проводили учетные наблюдения. Оценивали состояние растений по 5-ти балльной шкале на основе внешнего вида растений: 5 баллов – состояние очень хорошее, растения ярко зелёные 4 балла – состояние хорошее, растения слабо этиолированные 3 балла – состояние удовлетворительное, растения этиолированные 2 балла – состояние плохое, растения желто-коричневые 1 балл – состояние плохое, растения коричневые с признаками некроза, в некоторых местах жёлтые 0 баллов – растения погибли В результате исследования, выявлены, что побеги груш, оставались жизнеспособными в течение 9-15 месяцев без повторного культивирования на контрольной MС среде с 3% сахарозой без регуляторов роста. Некоторые варианты и культурные сорта в хладохранении хранились 18 – 27 месяцев. Сорт Мраморная успешно хранился до 33 месяцев в питательной среде (регуляторы роста+2 %сахароза + 2 %Маннит) (Рисунок 14). А также высокий результат выявлен у сорта Талгарская Красавица успешно хранился до 30 месяцев. Рисунок 14– Результаты хладохраненияя сорта Мраморная Таким образом, при +4°С хладохранении сорта груш были сохранены в пластиковых воздухопроницаемых пакетах с целью предотврощения бактериальных, грибковых болезней груши. 3.1.7 Криосохранение спящих почек груши В результате криосохранения спящих почек, были изучены влияние различных криопротекторов во время замораживания в жидком азоте на жизнеспособность криосохраненных почек груш. Были значительные различия в жизнеспособности среди сортов, влажностью и криопротекторов. Сорт с криопротектора взаимодействия было существенным, как было взаимодействие трех факторов (P≤0.002) (таблица 6). Жизнеспособность была значительно выше в естественной влажности, чем для 30% сухих сегментов .PVS3 криопротектор было значительно лучше, чем все остальные криопротекторы испытания. Сорта груш различались в их жизнеспособности например у сорта Талгарская Красавица были получены наиболее высокие жизнеспособные меристемы по сравнению с другими сортами. Значимого взаимодействия сорта по криопротектором было очевидно для нескольких сортов. Все четыре сорта хорошо реагируют и имели высокую жизнеспособность с PVS3 и естественной влажностью, но у сорта Лесная Красавица было обнаружено хорошая жизнеспособность меристем при 30% влажности. Сорта Нагима и Талгарская Красавица имели высокую жизнеспособность в криопротекторе PVS4 и сорт Жаздык один хорошо реагировал на криопротектор ИББР-1 с естественной влажностью. В целом все четыре сорта были лучше жизнеспособны при естественной влажности с криопротектором PVS3. Рисунок 15 – Влияние криопротекторов на жизнеспособность меристем груши Таблица 6 – Дисперсионный анализ (ANOVA) достоверные различия в жизнеспособности спящих почек Источник df Mean squares F-ratio p-value Сорта 3 3,136 6,385 0,001 Влажность 1 10,454 21,281 0,000 Криопротекторы 5 15,345 31,237 0,000 Сорта* Влажность 3 0,170 0,345 0,793 НД Сорта* 15 2,151 4,378 0,000 Криопротекторы Влажность* 5 0,751 1,529 0,188 НД Криопротекторы Сорта*Влажность* 15 1,331 2,710 0,002 Криопротекторы Итого 95 0,491 Примечание: НД- не достоверный результат; Было установлено, что наиболее подходящие криопротекторы для замораживания спящих почек груши – PVS3, PVS4, ИББР-1 (жизнеспособность почек составила 100%), а также Towill и криопротектор «Мед» (жизнеспособность почек составила 66%). Результаты тестирования жизнеспособности почек методом окрашивания с помощью 1% раствора трифенил тетразол хлорида (ТТХ), показывает, что вышеуказанные криопротекторы действительно эффективны для сортов груши. Живые почки окрашивались в розовый цвет. (Рисунок 16.) Рисунок 16- Окрашивание ТТХ живых почек груши в розовый цвет (криопротектор PVS3) Рисунок 17 – Не окрашенные почки груши (криопротектор PVS2) Рисунок 18 –Гистологический срез спящих почек Таблица 7- Влияние различных способов предобработки почек груши на эффективность замораживания Сорт Талгарская Красавица Влажность – 48 % Естественная влажность Всего Окрас Рост на Жив. среде шт Контроль 1 – замораживание без 3 холодовой обработки; Контроль 2 – замораживание с 3 холодовой обработкой без криопротекторов Мёд 3ч (замораж . с 5 мёдом) Мёд +15% ДМСО 3 ч (замораж . с 5 мёдом) PVS2 – 3 часа (замораж. с 5 криопротектором) PVS3 – 3 часа (замораж. с 6 криопротектором) PVS4 – 3 часа (замораж. с 5 криопротектором) Towill – 3 часа (замораж. с 6 криопротектором) ИББР-1 50% глюк +50глиц. 3 часа (замораж. с 5 криопротектором) 0 0 0 0 Жив. % 0 Всего Окрас 30% влажность Рост на Жив. среде шт Жив. % 3 0 0 0 3 0 0 0 3 3 60 5 2 2 40 0 0 0 5 0 0 0 2 2 40 5 0 0 0 4 66 5 3 3 60 2 2 40 5 2 2 40 3 3 50 6 3 3 50 0 5 0 0 0 4 0 + 0 + Сорт Нагима Влажность56.2% Контроль 1 – замораживание без холодовой обработки; 3 Контроль 2 – замораживание с 6 холодовой обработкой без криопротекторов Мёд 3ч (замораж . с 5 мёдом) Мёд +15% ДМСО 3 ч (замораж . с 3 мёдом) PVS2 – 3 часа (замораж. с 4 криопротектором) PVS3 – 3 часа (замораж. с 3 криопротектором) 50% глюк +50глиц. - 3 часа (замораж. с криопротектором) PVS4 – 3 часа (замораж. с 5 криопротектором) Towill – 3 часа (замораж. с 3 криопротектором) ИББР-1 50% глюк +50глиц. 3 часа (замораж. с 3 криопротектором) 0 0 0 3 0 0 0 3 3 50 3 1 1 33 1 1 20 - - - - 1 1 33 - - - - 0 0 0 3 0 0 0 3 100 3 3 3 100 5 5 100 3 0 0 0 2 2 66 3 0 0 0 1 1 33 3 0 0 0 3 + + Сорт Жаздык Влажность47% Контроль 1 – замораживание без холодовой обработки; 2 Контроль 2 – замораживание с 3 холодовой обработкой без криопротекторов Мёд 3ч (замораж . с 3 мёдом) Мёд +15% ДМСО 3 ч (замораж . с 2 мёдом) PVS2 – 3 часа (замораж. с 3 криопротектором) PVS3 – 3 часа (замораж. с 3 криопротектором) PVS4 – 3 часа (замораж. с 3 криопротектором) Towill – 3 часа (замораж. с 2 криопротектором) ИББР-1 50% глюк +50глиц. 3 часа (замораж. с криопротектором) 3 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 3 0 0 0 0 0 0 3 0 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 2 0 0 0 3 100 3 2 2 66 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 2 0 0 0 3 3 100 2 0 0 0 3 + + Сорт Лесная Красавица Влажность 53% Контроль 1 – замораживание без 3 холодовой обработки; Контроль 2 – замораживание с 3 холодовой обработкой без криопротекторов Мёд 3ч (замораж . с 3 мёдом) Мёд +15% ДМСО 3 ч (замораж . с 2 мёдом) PVS2 – 3 часа (замораж. с 3 криопротектором) PVS3 – 3 часа (замораж. с 3 криопротектором) PVS4 – 3 часа (замораж. с 3 криопротектором) Towill – 3 часа (замораж. с 2 криопротектором) ИББР-1 50% глюк +50глиц. 3 часа (замораж. с 2 криопротектором) 0 0 0 3 0 0 0 0 0 0 3 0 0 0 0 0 0 3 0 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 2 0 0 0 2 66 2 0 0 0 1 1 33 2 0 0 0 0 0 0 2 0 0 0 2 2 100 2 0 0 0 2 + - 3.1.8 Определение продолжительности закаливания меристем груши для замораживания в жидком азоте Для успешного криозамораживания меристем необходимо предварительное закаливание, которое используется для запуска природных механизмов устойчивости растений к холодной погоде. С целью оптимизации методов криосохранения груши изучали влияние длительности закаливания пробирочных растений на восстановление роста криосохраненных меристем. Акклиматизацию побегов груши проводили в климатической камере при чередующемся режиме: 8 час, 22°С, освещенность 7 μmol m-2s-1, затем 16 час, – 1°С, темнота. Длительность закаливания холодом варьировала от 1 до 6 недель. Контролем служили неакклиматизированные побеги in vitro. Рисунок 19 – Продолжительность закаливания при криоконсервации меристем груши Из приведённого рисунка видно, что наблюдается одинаковая реакция при закаливании переменным температурами для груши сортов Нагима и Талгарская Красавица. На восстановление роста меристем положительно влияет 3 и 4 недельное закаливание переменной температурой перед замораживанием в жидком азоте. В этом случае жизнеспособность составляет у сорта Нагима 88 и 84%, у сорта Талгарская Красавица 79 и 73%. Не закалённые растения после замораживания в жидком азоте не выживают. Закаливание в течение 1 недели приводит к выживаемости 12% сорта Нагима, 17% сорта Талгарская Красавица. Постепенно, с возрастанием периода закаливания после 5 недель жизнеспособность меристем после криоконсервации начинает снижаться. Таким образом, оптимальной длительностью закаливания переменными температурами для груши при криоконсервации является 3-4 недели. 3.1.9 Зависимость криосохранения меристем от концентрации сахарозы питательной среды Предобработка исключительно необходимый этап при криосохранении, так как она является критически важной процедурой для выживаемости тканей растений при криозамораживании, потому что криопротекторы сами по себе не могут защитить необработанные клетки или ткани для сохранения высокого процента жизнеспособности. Предобработка используется для того чтобы, растения выдерживали обработку криопротекторами и процедуру замораживания и размораживания [140, с.80]. Целью предобработки является постепенное обезвоживание клетки до введения высоко концентрированных и часто токсичных криопротекторов. Обезвоживание можно проводить разными способами: высушиванием стерильным потоком воздуха или использованием высушивающих веществ. Успешно криозамораживались растительные ткани и меристемы, при предобработки 2М глицерином в 0,4-0,6M сахарозе в течение 20 мин при комнатной температуре [141, с. 208]. Проводили определение оптимальной концентрации сахарозы в среде для предобработки замораживаемых меристем растений груши. Молярность сахарозы в опытах варьировала от 0,1 до 0,5 (Рисунок 20). В литературе приводится, что предварительное культивирование выделенных меристем на питательных средах, обогащенных сахарозой (0,3-0,7М), способствует накоплению сахаров, которые увеличивают стабилизацию мембран в условиях сильной дегидратации [142, с. 383]. Рисунок 20– Зависимость криосохранения меристем от концентрации сахарозы в питательной среде при предобработке После прекультивирования меристем на среде с 0,1М сахарозой выживаемость меристем после криосохранения в жидком азоте чёрной смородины сорта Талгарская составляет 39,0% у сорта Нагима составляет 33,2%. Повышение концентрации сахарозы до 0,2М приводит к незначительному повышению жизнеспособности меристем у сорта Талгарская Красавица (41,0%) Нагима (34,7%). А предобработка на среде с 0,3М сахарозой резко повышает жизнеспособность меристем сорта Талгарская до 92,1% Нагима (76,9%) (Рисунок 20). При повышении концентрации сахарозы до 0,4М и 0,5М резко снижает жизнеспособность меристем после криосохранения до 20,231,4% в зависимости от сорта. P. Palonen и O. Junttila [143] определили, что предобработка сахарозой в течение 14 дней при адаптации к холоду приводит к еще большему эффекту выносливости к холоду растений малины, чем постоянная температура +4ºС. Вначале думали, что сахара имеют осмотический эффект только снаружи клетки, но сейчас известно, что сахароза и другие дисахариды проникают в клетку и стабилизируют протеины и мембраны во время высыхания. 3.2 Влияние предобработки криопротекторами на жизнеспособность меристем Наибольшую опасность при замораживании растительных тканей представляет механическое повреждение кристаллами льда. Удаление воды приводит к повышению концентрации остающихся внутри клетки солей, при которых происходит денатурация белка (так называемый осмотический шок). Для предотвращения этих процессов повреждение мембран клеток образующимися кристаллами льда и денатурация белка с осмотическим шоком применяют криопротекторы – вещества, которые на этапе замораживанияразмораживания максимально уменьшают повреждения клеток от осмотического и механического стресса. Их отбирают по принципу наименьшей токсичности и оптимального эффекта. К криопротекторам относятся либо проникающие в клетки вещества – диметилсульфоксид, сахара и глицерин, либо непроникающие высокомолекулярные – поливинилпирролидон, сахарные спирты, полиэтиленгликоль. Эти вещества снижают температуру замерзания и могут изменять размеры кристаллов льда. Смесь проникающих и непроникающих криопротекторов может обеспечить коллигативную и проникающую защиту клеток и растений. Главная задача предобработки – обезвоживание клеток и стабилизация клеточных мембран [144, с. 102]. Криопротекторы должны на этапах замораживания и размораживания максимально уменьшать повреждение клеток от осмотического и механического стресса [145, с. 307]. Исходя из этого, эксперименты с криопротекторами PVS2, PVS3, PVS4, раствором Towill и криопротектором ИББР-1. В Японии группой Sakai разработана серия растворов PVS (plant vitrification solution). Раствор PVS1 – для замораживания клеточной суспензии и меристемных тканей Asparagus, раствор PVS2 изначально был предложен для криоконсервирования культуры клеток цитрусовых, однако сейчас успешно применяется для криоконсервирования апексов более 200 видов растений, включая картофель; раствор PVS3 – для криоконсервирования меристем Wasabi, Asparagus, Allium, а PVS4 – меристем Wasabi. В США группой исследователей под руководством Steponkus P.L. разработан раствор, включающий несвойственный растениям компонент – бычий сывороточный альбумин (БСА), который используется для криоконсервирования клеточной суспензии Brassica. Towill L.E. для замораживания меристем мяты и банана применял раствор, содержащий высокомолекулярный криопротектор полиэтиленгликоль-8000 (ПЭГ-8000). То есть для разных растений используют различные криопротекторы. Выбор состава криопротектора зависит от вида и сорта растения, а иногда от климатических условий места произрастания. Поэтому целью настоящих исследований являлся подбор оптимального состава криопротекторов при замораживании в жидком азоте апикальных меристем груши, произрастающей в условиях предгорий Заилийского Алатау. Для изучения влияния различных криопротекторов в качестве модельных растений использованы сорта груши Нагима и Талгарская Красавица. Асептические побеги в условиях in vitro размножали на среде Мурасиге и Скуга в течение 3 недель в факторостатной комнате при 23-25°С, освещенности 25 мкмол∙м-2∙с-1, 16-ти часовом фотопериоде. Через 3 недели растения помещали на трех недельную холодную акклиматизацию в климатическую камеру «LabLine Environette» при переменной температуре: 8 час при 22°С, освещенности 10 μmol m-2s-1 и 16 час при –1°С в темноте. Последующее криосохранение проводили методом витрификации с прекультивированием на среде с 0,3М сахарозой, разработанной Matsumoto T. и Sakai A. Выделяли апикальные верхушки побегов с меристематической частью, меристемы с 2-3 листовыми примордиями, размером 0,8-1,0мм. Меристемы помещали на среду МС, содержащую 0,3М сахарозу в климакамеру с переменной температурой на 48 часов. Для сравнения влияния состава криопротекторов в качестве подготовки растительного материала к криоконсервации, использовали серию растворов PVS: PVS2 (30% глицерин + 15% ЭГ + 15% ДМСО + 0,4М сахароза); PVS3 (50% глицерин + 50% сахароза); PVS4 (35% глицерин + 20% ЭГ + 0,6М сахароза) и раствор Towill (35% глицерин + 10% ДМСО + 10% ПЭГ-8000 + 0,4М сахароза) и криопротектор ИББР-1 (50% глицерин и 50% глюкоза). Из рисунка 24 видно, что для груши сортов Нагима и Талгарская Красавица на восстановление роста меристем положительно повлияла на криопротекторы PVS3 и ИББР-1. У сорта Нагима 96 % меристем хорошо реагировали на обработку с криопротектором PVS3 и 94,3 % меристем у сорта Талгарская Красавица, что является наиболее эффективным для криосохранения меристем, так как в его состав входят как проникающие (50% глицерин + 50% сахароза). А также кроме PVS3 наиболее оптимальным криопротектором является криопротектор ИББР-1 (50% глицерин и 50% глюкоза). Рисунок 21 – Влияние предобработки криопротекторами при криоконсервации груши В результате проведённых экспериментов было выявлено, что обработка криопротектором PVS3 и криопротектором ИББР-1 является наиболее эффективным приемом при подготовке апикальных меристем груши к замораживанию в жидком азоте. 3.2.1 Зависимость влажности инкапсулированных меристем в альгинатном геле Основной задачей предобработки растительных тканей перед криоконсервацией методом инкапсуляции-дегидратации является снижение количества свободной воды в клетках и межклеточных пространствах, предотвращение ее кристаллизации и, как следствие, уменьшение повреждающего действия льда на мембраны клеток. При использовании этого метода дегидратация инкапсулированных меристем в 0,75М сахарозе и последующее высушивание альгинатных шариков являются основным способом подготовки меристем к воздействию сверхнизкой температуры. В соответствии с методикой инкапсуляции-дегидратации, инкапсулированные меристемы в альгинатном геле высушивают в течение 3-4 часов до 20% влажности. Целью данного исследования было определить оптимальное содержание влаги в меристемах, при котором выживание после криосохранения было бы максимальным. На рисунке 22 приведены результаты экспериментов по криосохранению меристем сортов груши Нагима и Талгарская Красавица в зависимости от содержания влаги в опытных образцах. Рисунок 22 - Зависимость криосохранения меристем сортов Нагима и Талгарская Красавица от влажности инкапсулированных меристем в альгинатном геле В вариантах опыта влажность альгинатных шариков с инкапсулированными меристемами составляла: 12,80%, 15,90%, 16,80% и 19,60%. Определяли жизнеспособность меристем до погружения в жидкий азот (–196ºС) и после замораживания и оттаивания. Анализ полученных результатов показал, что при содержании воды в растительных тканях 19,60% все меристемы сохраняли способность к восстановлению роста до погружения в жидкий азот, однако после замораживания меристемы погибали. При увеличении времени высушивания и уменьшении содержания воды в тканях до 12,80% процент жизнеспособных меристем до замораживания сократился до 40,0%, однако количество выживших меристем после погружения в жидкий азот и оттаивания возросло до 37,50%. В результате проведенного эксперимента было установлено, что криосохранение с влажностью растительных тканей 15,90% и 18 часов дегидратации способствует повышению выживаемости меристем сорта Нагима (80,0%) и Талгарская Красавица (69,0%) после криосохранения. С целью повышения жизнеспособности меристем после замораживания проведены эксперименты по влиянию времени дегидратации альгинатных шариков в 0,75М растворе сахарозы на регенерацию растений груши. 3.2.2 Сравнение методов предобработки при криоконсервации изолированных меристем груши в жидком азоте (–196°С) Сравнение различных методов предобработки при криосохранении проводили для определения наиболее эффективного для наших условий генотипов и метода использования его при создании криобанка гермоплазмы. Эксперименты проводили на сортах груши Нагима, Любимица Клаппа, Карындас, Талгарская Красавица, Лесная Красавица из коллекции Помологического сада КазНИИ плодоводства и виноградарства. Для проведения экспериментов асептические побеги в условиях in vitro размножали на модифицированных нами питательных средах в течении 3 недель в светокультуральной комнате при 23-25°С, освещенности 25 мкмол∙м2∙с-1, 16-ти часовом фотопериоде. Через 3 недели растения помещали на трехнедельную акклиматизацию холодом в климатическую камеру «Lab-Line Environette» при переменной температуре: 8 час при 22°С, освещенности 10 μmol m-2s-1/ и 16 час при –1°С в темноте. Выделяли апикальные верхушки побегов с 2-3 листовыми примордиями, размером 0,8-1,0 мм. Затем меристемы на среде МС, содержащей 0,3М сахарозу, помещали на 48 часов в климакамеру с переменной температурой. Рисунок 23– Влияние методов криосохранения на жизнеспособность меристем груши (сорт Нагима) Примечание: 1. Витрификация с 0,3М сахарозой, 2М глицерином 2. Витрификация с 0,3М сахарозой 3. Витрификация с 5% ДМСО 4. Инкапсуляция–дегидратация Для определения оптимального метода криосохранения груши испытаны метод витрификации, состоящих из 4х модификаций: 0,3М сахароза, 2М глицерин + криопротектор РVS3, 0,3М сахароза + криопротектор РVS3, 5% ДМСО, а также метод инкапсуляции-дегидратации (Рисунок 23). Восстановление роста после криосохранения лучшие результаты получены при использовании метода витрификации c 0,3М сахарозой, 2М глицерином. Для сорта Нагима жизнеспособность меристем составила 88,5%. Криосохранение методами инкапсуляции и витрификации с 5% ДМСО была менее успешной и восстановление жизнеспособности у груши не всегда превышало 40% регенерацию. Полученные результаты свидетельствуют, что оптимальным методом криоконсервации меристем груши, подходящим для всех сортов является модифицированный метод витрификации – Витрификация с 0,3М сахарозой, 2М глицерином + криопротектор РVS3 (Рисунок 24). Рисунок 24 - Результаты модифицированной витрификации с 0,3М сахарозой, 2М глицерином + криопротектор РVS3. 3.2.3Определение состава восстановительных питательных сред, оптимальных для регенерации эксплантов груши С целью оптимизации состава питательных сред для регенерации эксплантов в культуре in vitro проводили испытание различных концентраций регуляторов роста. На основе среды МС испытывали различные варианты агаризованных питательных сред. Были изучены влияние гормонального состава сред на регенерационную способность груши после замораживания в жидком азоте. Исследования в условиях in vitro проводили на основе питательной среды Мурасиге и Скуга, содержащей различное количество БАП, ИМК и ГК (рисунок 25) Талгарская Красавица Нагима Коэффицент размножения 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 1 2 3 4 5 6 Питательные среды٭ 1 – 0,5 мг/л БАП, 0,1 мг/л ИМК; 2 – 1,0 мг/л БАП 0,1 мг/л ИМК, 0,1 мг/л ГК; 3 – 2,0 мг/л БАП, 0,1 мг/л ГК; 4– МС 0,5 мг/л БАП; 7 8 5 – 0,5 мг/л БАП; 0,01 мг/л ИМК; 0,1 мг/л ГК; 6 – 0,5 мг/л БАП, 0,5 мг/л ИМК, 0,1 мг/л ГК ; 7 – 0,5 мг/л БАП, 0,25 мг/л ИМК, 0,1 мг/л ГК; 8 – 0,6 мг/л БАП, 0,1 мг/л ИМК, 0,2 мг/л ГК, Рисунок 25– Оптимизация гормонального состава питательных сред МС для восстановления криосохранённых меристем груши В результате проведённого эксперимента было определено, для регенерации эксплантов в культуре in vitro груши оптимальной оказалась среда следующего состава: MС, 0,6 мг/л БАП; 0,1 мг/л ИМК; 0,2 мг/л ГК; 30 г/л сахарозы. Питательные среды для регенерации груши после замораживания отличались от оптимальных сред для введения эксплантов in vitro и клонального микроразмножения. 3.2.4 Выход тканей груши из состояния глубокого охлаждения С целью оптимизации режимов вывода тканей растений груши из состояния глубокого замораживания и регенерации из них целых растений проводили изучение влияния способов размораживания на жизнеспособность меристем, замороженных в жидком азоте (–196°С). Исследование проводили на сортах груши – Нагима, Карындас и Любимица Клаппа. Результаты опытов представлены в таблице 8. Результаты исследования показали, что при использовании метода витрификации наиболее эффективным способом вывода меристем груши из состояния глубокого охлаждения оказалось поэтапное размораживание сначала в контейнере с водой при температуре +45°С в течение 1мин., а затем в контейнере с водой при температуре +25°С в течение 1 мин. Выживаемость меристем сорта Нагима составила 100%, Карындас и Любимица Клаппа – 95%. Таблица 8 – Влияние способа размораживания на жизнеспособность меристем груши в жидком азоте Условия размораживания Количество Восстановление выживших меристем груши эксплантов, меристем, шт./ % шт. Нагима Карындас Любимица Клаппа Витрификация Комнатная температура + 20 3/15 2/10 3/15 25°С 5 мин. Контейнер с водой 20 14/70 13/65 14/70 + 45°С на 1 мин. Контейнер с водой 20 9/45 8/40 7/35 + 25°С на 1 мин. Контейнер с водой 20 20/100 19/95 19/95 + 45°С на 1мин., затем + 25°С на 1 мин. Инкапсуляция-дегидратация Комнатная температура + 20 20/100 18/90 19/90 25°С на 5 мин. Контейнер с водой 20 0 0 0 + 45°С на 1 мин. Контейнер с водой 20 5/25 2/10 4/20 + 25°С на 1 мин. Контейнер с водой + 45°С 20 4/20 4/20 3/15 на 1мин., затем + 25°С на 1 мин. При оттаивании в контейнере с водой при температуре +45°С в течение 1 мин. регенерация тканей сорта Нагима и Любимица Клаппа составила 70%, Карындас – 65%. При оттаивании в контейнере с водой при температуре +25°С в течение 1 мин. регенерация тканей снизилась до 25-45%. При размораживании в потоке стерильного воздуха в ламинар-боксе при температуре +25°С в течение 5 мин выживаемость составила от 15 %. Для метода инкапсуляции-дегидратации лучший способ оттаивания для груши – в потоке стерильного воздуха в ламинар-боксе при температуре +25°С в течение 5 мин. Регенерация меристем сорта Нагима составила 100%, Карындас и Любимица Клаппа – 90%. При размораживании в контейнере с водой при температуре +25°С в течение 1 мин восстановление меристем составляет от 10 до 25%. При размораживании в контейнере с водой при температуре +45°С в течение 1 мин., а затем в контейнере с водой при температуре +25°С в течение 1 мин. регенерации тканей не происходило. При оттаивании в контейнере с водой при температуре +45°С в течение 1 мин. регенерация составила 15-20%. Таким образом, при размораживании растений груши при криоконсервации методом витрификации максимальное количество жизнеспособных меристем обнаружено – сначала в контейнере с водой при температуре +45°С в течение 1мин., а затем в контейнере с водой при температуре +25°С в течение 1 мин. Для метода инкапсуляции-дегидратации лучший способ оттаивания меристем груши – в потоке стерильного воздуха в ламинар-боксе при температуре +25°С в течение 5 мин. 3.2.5 Регламент оптимизации криосохранения меристем груши Оптимизированный вариант метода витрификации с прекультивированием на среде с 0,3М сахарозой. Вычлененные апикальные меристемы из растений прошедших адаптацию к холоду в условиях переменной температуры (день +22ºС, ночь –1ºС) при 8-ми часовом фотопериоде в течение трех недель прекультивировать в условиях адаптации к холоду на среде МС с 0,3М сахарозой, в течение 2 суток (день +22ºС, ночь –1ºС) при 8-ми часовом фотопериоде. Предобработку меристем проводить в растворе 2 М глицерина в 0,4 М сахарозе 20 минут. Обрабатывать меристемы груши криопротектором PVS3 в жидкой среде MС с 0,3 М сахарозой при рН 5,8) 80 минут. После чего поместить в жидкий азот (–196ºС). Размораживание образцов проводить в водяной бане при температуре 45ºC в течение 1 мин., затем 1 мин. в воде при 22ºC. Меристемы промывать жидкой средой МС с 1,2М сахарозой дважды, высушить на фильтровальной бумаге и поместить на восстановительную питательную среду для регенерации. Оптимизированный метод инкапсуляции-дегидратации. Вычлененные меристемы из растений прошедших адаптацию к холоду в условиях переменной температуры (день +22ºС, ночь –1ºС) при 8-ми часовом фотопериоде в течение трех недель поместить в альгинатный раствор (3%, альгинат в жидкой среде МС с 0,75М сахарозой, рН 5,7). Альгинатные шарики полимеризировать в насыщенном растворе хлорида кальция, не более 20 мин. и поместить на 19 часов в жидкую среду Mурасиге и Скуга с 0,75М сахарозой при постоянном перемешивании на шейкере. После дегидратации насыщенном растворе сахарозы альгинатные шарики сушить в ламинарном боксе под стерильным потоком воздуха в течение 4-х часов до 15,9% содержания влаги, затем поместить в криопробирки и погрузить в жидкий азот. Размораживание криопробирок проводить при комнатной температуре в течение 20 мин. Меристемы с альгинатными шариками гидратировать в жидкой среде МС без гормонов в течение 5 мин. с последующей посадкой на восстановительную среду. Для создания криогенной коллекции ценных генотипов груши были использованы оптимизированные регламенты криоконсервации. 3.2.6 Экономическая эффективность На основе проведённых исследований создана криогенная коллекция, состоящая из отечественных и зарубежных сортов груши. Хранение плодовых культур один из важных направлении плодоводческой науки. Помимо полевых коллекции в настоящее время во всех развитых странах создаются криобанки криосохранения экономически важных растений. Экономические эффекты данного направления заключается поддающимся управлению и контролю хранения гермоплазмы, невозможности заноса сомнительных экземпляров. Так как, при генотипировании возможность содержания огромного количества сортов на минимальную площадь и использования их для клонирования при возникновении необходимости в селекции, в сфере международного обмена. Альтернативы данному методу в настоящее время нет. ЗАКЛЮЧЕНИЕ На основании проведенных исследований можно сделать следующие выводы: 1. Усовершенствован метод микроклонального размножения (способы стерилизации для введения в культуру in vitro 2. Подобрано оптимальная минеральная питательная среда для груши: наиболее оптимальной явились 50% и 75 % азот содержащая МС среда и PRS среда. 3. Изучены способы хладохранения груши при +4 0 С 4. Установлено, что эффективными методами предобработки меристем являются: – витрификация с PVS3 + 0,3М сахароза + 2М глицерин и инкапсуляция-дегидратация; 5. Выявлены высокоэффективные криопротекторы для глубокого замораживания меристем и спящих почек груши: криопротекторы PVS3 и ИББР-1 6. Создана криогенная коллекция ценных генотипов груши для использования в селекции, международного обмена генетическими ресурсами и для коммерческих целей ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 1. Образцы гермоплазмы груши, сохранённые в криобанке, рекомендуется использовать в селекционном процессе для создания новых и улучшения существующих сортов, а также для закладки элитных питомников. 2. При +4°С хладохранении успешно сохраняются в пластиковых воздухопроницаемых пакетах с целью предотврощения бактериальных, грибковых болезней груши. 3. Оптимизированные результаты криоконсервации рекомендуются использовать в учебном процессе при преподавании дисциплины «Биотехнология» на биологическом и агрономическом факультетах ВУЗов. 4. Результаты клонального микроразмножения растений груши рекомендуются для использования в хозяйствах питомниководческого направления. СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ 1 Ковальчук И.Ю. Сохранение генофонда плодовых культур методом криоконсервации // Юбилейный сб. трудов КазНИИ плодоводства и виноградарства. – Алматы, 2001. – Т. 16. – C. 29-34; 2 Seeds for Our Future. The U.S. National Plant Germplasm System. – 1996 - 20s.; Forsline P.L., Lamdboy W. США Recovery and Longevity of cryopreserved. Dormant. Apple Buds. Amer. Soc. Hort.Sci. – 1998 – 123 (3). – P. 365 – 370.; 3Сафина Г.Ф. Влияние низких и сверхнизких температур на жизнеспособность семян плодовых и ягодных растений. / Государственный научный центр РФ Всероссийский научно-исследовательский институт растениеводства им. Н.И. Вавилова РАСХН, Санкт-Петербург, Россия, Вестник ВОГиС. – 2008, № 4. – Т. 12. – С.38-45. 4 Туз, А.С. Груша. Биологическая характеристика и исходный материал для селекции: автореф. дисс....д-ра с.-х. наук / Туз А.С- Л., 1971 .- 54с. 5 Витковский, В.Л. Плодовые растения мира / В.Л. Витковский.- СПб.: Лань, 2003.- 592 с. 6 Нуртазин М.Т., Нуртазина Н.Ю. Генофонд плодовых культур КАЗНИИПиВ // Материалы Международной научно-практической конференции, посвященной 100-летию со дня рождения академика НАН РК, заслуженного деятеля науки Казахстана, доктора биологических наук, профессора А.Д. Джангалиева. – Алматы, 2013.С.121. 7 Сатибалов А.В. Зимостойкость груши в условиях склонов СевероКавказского региона / А.В. Сатибалов, Т.Ю. Беккиев // Садоводство и виноградарство. – 2008. – № 4. – С. 15-16. 8 Гучапшев Р.Х. Зимостойкость сортов груши в предгорьях Северного Кавказа / Р.Х.Гучапшев, А.В.Сатибалов // «Методологические аспекты создания прецизионных технологий возделывания плодовых культур и винограда» – Том I.Тематический сборник материалов Юбилейной конференции к 75-летию СКЗНИИСиВ. – Краснодар, СКЗНИИСиВ, 2006. – С. 171-175. 9 Тюрина М.М. Морозоустойчивость растений в состоянии вегетации и покоя. Автореферат дис. докт. биол. наук. – Л.:1975. -С.50. 10 Карпенчук Г.К. Частное плодоводство. Киев, 1984. -С.69-97. 11 Брежнев Д.Д. Семечковые. – М.: Колос, 1983. т.14. -С.126 12 Влияние приемов обрезки на рост и плодоношение разновозрастных насаждений груши: автореф. дис. канд. с/х наук: 06.01.07 - Плодоводство, виноградарство / Кампитова Г. А. - Алматы : 2001. 13 Колесников В.А. Плодоводство. М.: Колос, 1979. -С.144-334. 14 Степанов С.Н. Биологические и агротехнические основы ведения интенсивного садоводства. //Консервная и овощесущильная промышленность. –М., 1980. -С.22.Трусевич Г.В. Подвои плодовых пород. М.: Колос, 1964. - 492 с. 15 Андронов И.Г., Карычев К.Г. Сады на вегетативно-размножаемых подвоях в условиях юго-востока и юга Казахстана.//КазНИИПиВ. //Сб. науч. тр. – А-Ата: Кайнар. –1975, т.Ш. –С.90-99 16 Будаговский В.И. Культура слаборослых плодовых деревьев. –М.: Колос, 1976. -С.31-265 17 Степанов С.Н. Плодовый питомник. М.: Колос, 1981. -С.32. 18 Марченко М.С. Подвои груши в предгорьях Заилийского Алатау. Диссертация канд. с.-х наук. –А-Ата, 1991. -С.126. 19 Заремук Р.Ш. Оценка исходного материала в селекции груши. -Краснодар, 1997. -С.35 20 Матаганов Б.Г., Аяпов К.Д. Плодовые и ягодные культуры. – Алматы: Кайнар, 1997. –307 с. 21 Genebank standards. FAO/IPGRI. 1994. 22 Плеханова М. Н. Коллекции генетических ресурсов плодовых и ягодных культур: структура и проблемы сохранения в живом виде. //Материалы Мичуринских чтений. Мичуринск. 2002. С. 4. 23 Рахимбаев И.Р. Ковальчук И.Ю. Гермоплазма плодово-ягодных культур в Казахстане // Садоводство и виноградарство. – М., 1999. – С.20-22 24 Батыгина Т.Б., Васильева В.Е., Маметьева Т.Б. Проблемы морфогенеза in vivo и in vitro. Эмбриоидогенез у покрытосеменных растений // Бот. журн. 1978. Т. 63. № 1. С. 87-1 25 Бутенко Р.Г. Индукция морфогенеза в культуре тканей растений // Гормональная регуляция онтогенеза растений М.: Наука, 1984. С. 42-54.26 26 Gautheret R. Sur la culture d'extremites de raciness // C.r. soc. bil., Paris. 1932. Bd. 109. P. 1236-1238. 27 Murashige T. Plant propagation through tissue culture // Plant Tissue Cult. And Its Bio-technol. Appl., B. ets. N.Y.: Springer-Verlag, 1977. P. 392-403. 28 Катаева Н.В., Бутенко Р.Г. Клональное микроразмножение растений. М.: Наука, 1983. 96 с. 29 Бутенко Р.Г. Применение метода культуры изолированных верхушечных почек для изучения процесса роста и органогенеза растений // Физиол. раст. 1960. Т. 7. № 6. С. 715-723. 30 Шевелуха В.С., Калашникова Е.А., Дегтярев С.В. и др. Сельскохозяйственная биотехнология: Учеб. / Под ред. В.С. Шевелухи. М.: Высш. шк., 2003. 496 с. 31 Катаева Н.В., Бутенко Р.Г. Принципы микроклонального размножения растений на примере герберы // Изв. АН СССР. Сер. биол. 1982. № 1. С. 126130.) 32 Трушечкин В. Г, Высоцкий В. А., Олешко Е. В. Микроклональное размножение сортов и подвоев косточковых культур: Методические указания. М., 1983. С. 16 33 Методические рекомендации по использованию биотехнологических методов в работе с плодовыми, ягодными и декоративными культурами / Под ред. Е. Н. Джигадло. Орел, 2005. С. 50. 34 Salaš, P.: Proceedings of 9th International Conference of Horticulture, September 3rd– 6th 2001 Lednice, Czech Republic, ISBN 80-7157-524-0, Volume 2, p. 282-283, The role of clonal microropropagation in genbank preservation of fruit cultures and grape. Роль клонального микроразмножения в сохранении генофонда плодовых культур и винограда. Kovalchuk Irina Казахский научно-исследовательский институт плодоводства и виноградарства г. Алматы, Казахстан. 35 Матушкина О.В. Оптимизация процессов регенерации при размножении клоновых подвоев и сортов яблони и груши in vitro- Автореферат, Мичуринск, 2008. 36 Gazly R. / Recherches sur la croissance de Vitis rupestris Sheele Sain et court nové cultivé in vitro a difference temperatures// Ann Bot., 1980. V. 46. N 2. P.243248. 37 Mullin R.H. Schlegel D.E /Cold storage maintenance of strawberry meristem plantlets. Hort Set. 1976. V. 11. – P. 100-101 38 Новикова Т.И., Набиева А.Ю., Полубоярова Т.В. Сохранение редких и полезных растений в коллекции in vitro центрального сибирского ботанического сада. // Вестник ВОГиС, – 2008, – Том 12, № 4. Центральный сибирский ботанический сад СО РАН, Новосибирск 39 Pattnaik S. Chand P.K., 2000. Morphogenetic response of the alginateencapsulated axillary buds from in vitro shoot cultures of six mulberries. Plant Cell, Tiss. Org. Cult., 60: 177-85 40 Soneji J.R., Roa P.S., Mhatre M., 2002. Germination of Synthetic seeds of pineapple Ananas comosus L. Merr. Plant Cell Rep., 20: 891-4 41 Bekheet S.A. In vitro Preservation of Globe Artichoke Germplasm. Plant Tissue Cult. & Biotech. 17(1): 1-9, 2007 June 42 Рахимбаев И.Р., Ковальчук И.Ю., Кушнаренко С.В. Биотехнология криосохранения гермоплазмы плодовых растений // Сохранение и устойчивое использование растительных ресурсов. – Бишкек, 2003. – С. 234 - 238. 43 Lynch P.T., Benson E.E., Harding K. Climate change: the role of ex situ and cryoconservation in the future security of economically important, vegetatively propagated plants // J. Horticultural Science & Biotechnology – 2007. – V. 82 (2). – P. 157-160 44 Уизерс Л.А. Хранение ткани при биотехнологии растений // Биотехнология сельскохозяйственных растений. М., 1987. – С. 176-204 45 Reed B. M. The basics of in vitro storage and cryopreservation // National Clonal Germplasm Repository, Corvallis, O.R. USA. – 2002. – Р.34-46. 46 Розанов С.И. Место генетических криобанков в решении проблемы сохранения биоразнообразия. // Биофизика живой клетки. 1994. Т. 6. С. 8.) 47 Розанов С.И. Место генетических криобанков в решении проблемы сохранения биоразнообразия. // Биофизика живой клетки. 1994. Т. 6. С. 8.) 48 Сафина Г.Ф. Влияние низких и сверхнизких температур на жизнеспособность семян плодовых и ягодных растений. / Государственный научный центр РФ Всероссийский научно-исследовательский институт растениеводства им. Н.И. Вавилова РАСХН, Санкт-Петербург, Россия, Вестник ВОГиС. – 2008, № 4. – Т. 12 49 Международная программа ботанических садов по охране растений / Междунар. совет ботан. садов по охране растений. Botanic Gardens Conserv.Intern. М., 2000. 57 с. 50 Тихонова В.Л. Долговременное хранение семян // Физиология растений.1999. Т. 46, № 3. С. 467-476. 51 Данилова М.С. Хранение семян зерновых культур в зоне вечной мерзлоты // Бюлл. ВИР. 1982. № 118. С. 34 – 36 52 Федосенко В.А. Использование сверхнизких температур для длительного хранения семян (методы и техника). Бюл. ВИР, 1978, 77: 53-57. 4. 53 Молодкин В.Ю.Значение влажности семян некоторых зерновых и зерновых бобовых культур при криоконсервации в жидком азоте. Бюл. ВИР, 1986, 165: 22-24. 54 Молодкин В.Ю. Методы консервации семян культурных растений при низких и сверхнизких температурах. Автореф. канд. дис. Л., 1987: 18.) 55 (Matsumoto T., Sakai A. Cryopreservation of grape in vitro-cultured axillary shoot-tips by three step vitrification / Cryopreservation of Tropical Plant Germplasm // Engelmann F., Hiroko T. Ed. Int. Plant Genetics Resources Inst., Rome, Italy. – 2000. – P. 424-425. 56 Высоцкая О.Н., Попов А.С. Способ криосохранения меристем, изолированных из земляники садовой (Fragaria L.) in vitro // Пат. № 2220563 МПК4A01Н4/00 Россия. – Заявл. 24.05.02. Опубл. 10.01.04. – Бюл. №.1. 57 Шевченко Н.А. Влияние криопротекторов и режимов криоконсервирования на сохранность меристемных тканей растений // Автореф. дис. …канд. биол. наук. – Харьков, 2006. – 19 с.) 58 Попов А.С. Криогенное хранение культур клеток растений // Культура клеток растений. М., 1981. - С.150-162. 59 Plant Propagation by Tissue Culture. Handbook and Directory of Commercial Laboratories. Eds. Edwin F. Georg, Paul D. Sherrington. 1984. P. 695. 60 Петрова А.Д., Упадышев М. Т. Оздоровление и размножение садовых культур in vitro. //Садоводство и виноградарство, №4, 2002. С. 12-13. 61 Helliot B., Madur D., Dirlewanger E., M.T. de Boucaud. Evaluation of genetic stability of cryopreserved Prunus // In vitro Cell. Dev. Biol.-Plant – 2002 – V.38. – P.493-500. 62 Попов А.С. Некоторые механизмы криоповреждений клеток растений in vitro и особенности их криосохранения // Физ. раст. – 1993. – Т. 40, № 3. – С. 485 – 496. 63 Kartha K.K., Leung N.L., Paul K. Cryopreservation of strawberry meristems and mass propagation of plantlets // J. Am. Soc. Hort. Sci. – 1980. – V.105. – P. 481 – 484. 64 Kartha K.K., Leung N.L., Paul K. Cryopreservation of strawberry meristems and mass propagation of plantlets // J. Am. Soc. Hort. Sci. – 1980. – V.105. – P. 481 – 484. 65 Попов А.С. Криогенное хранение культур клеток растений // Культура клеток растений. М., 1981. - С.150-162. 66 Стрибуль T.Ф., Олейник С.T., Новиков A.Н., Григоращенко A.И. Оптимизация методов криосохранения меристем картофеля // Проблемы криобиологии. – 1999. - № 1. – С.57–60. 67 B.M.Reed. Survival of in vitro-grown apical meristems of Pyrus following cryopreservation. HortScience 25(1), 1990. P.111- 113. 68 Helliot B., M.T. de Boucaud. Effect of various parameters on the survival of cryopreserved Prunus Ferlenain in vitro plantlets shoot tips // Cryo-Letters. – 1997. – V.18. – P.133-142. 69 Sakai A. Development of cryopreservation techniques // Cryopreservation of tropical plant germplasm. Current research progress and application. Eds. Engelmann F& Takagi H., JIRCAS, Tsukuba & IPGRI, Rome 2000.- P.1-7 70 Niino T., Sakai A., Enomoto S., Magosi J., Kato S. Cryopreservation of in vitrogrown shoot tips of mulberry by vitrification // Cryo-Letters. – 1992. – V.13. – P. 303 – 312 71 Niino T., Sakai A., Yakuwa H., Nojiri K. Cryopreservation of in vitro-grown shoot-tips of apple and pear by vitrification // Plant Cell, Tissue and Organ Culture 1992. - V. 28. - P.261-266. 72 Lambardi M., Fabbri A., Caccavale A. Cryopreservation of white poplar (Populus alba L.) by vitrification of in vitro-grown shoot tips // Plant Cell Reports - 2000.- V. 19. - P.213-218. 73 Leigh E. Towill, Remi Bonnart, Gayle M. Volk. Cryopreservation of Arabidopsis thaliana shoot tips // CryoLetters, c/o Royal Veterinary College, London NW1 0TU, UK. CryoLetters. – 2006. №27 (6). – Р. 353-360. 74 Papiya Mukherjee, BB Mandal, KV Bhat, AK Biswas. Cryopreservation of asian Dioscorea bulbifera L. and D. alata L. by vitrification: importance of plant growth regulators // CryoLetters, c/o University of Bedfordshire, Luton LU2 8DL. CryoLetters. – 2009. – № 30 (2). – Р. 100-111. 75 Ghislaine Grenier-de March, Marie-Thruse de Boucaud, Paweł Chmielarz. Cryopreservation of Prunus aviumL. embryogenic tissues // CryoLetters, c/o Royal Veterinary Co. CryoLetters. – 2005. № 26 (6). – Р. 341-348. 76 Niino T., Hettiarachchi A., Takahashi J., Samarajeewa P. K. Cryopreservation of lateral buds of in vitro -grown innala plants (Solenostemon rotundifolius) by vitrification. CryoLetters. – 2000. № 21, – Р. 349-356 77 Dereuddre J., Scottez C., Arnaud Y., Duron M. Resistance of alginate-coated axillary shoot tips of pear tree (Pyrus communis L. cv. Beurre Hardy) in vitro plantlets to dehydration and subsequent freezing in liquid nitrogen // C. R. Acad. Sci. Paris. 1990. – V. 310. - P. 317 – 323 78 ZhaoY., Wu Y., Engelmann F., Zhou M., Zhang D. and Chen S. Cryopreservation of apple shoot tips by encapsulation-dehydration: effect of preculture, dehydration and freezing procedure on shoot regeneration // Cryo-Letters 20, 1999,103-108. 79 Paul H., Daigny G., Sangwan-Norreel B.S. Cryopreservation of apple (Malus x domestica Borkh.) shoot tips following encapsulation-dehydration or encapsulationvitrification // Plant Cell Reports - 2000. - V. 19. - P.768-774. 80 Remi Bonnart, Gayle M. Volk. Increased efficiency using the encapsulationdehydration criopreservation technique for Arabidopsis thaliana. CryoLetters. – 2010. № 31 (2). – Р. 95-100. 81 B.B. Mandal, Sangeeta Ahuja-Ghosh. Regeneration of Dioscorea Floribunda plants from criopreserved encapsulated shoot tips: effect of plant growth regulators // CryoLetters, c/o Royal Veterinary College, London NW1 0TU, UK. CryoLetters. – 2007. N 28 (5). – P. 329-336.) 82 Y. Bachiri, G.Q. Song, P. Plessis, A. Shoar Ghaffari, T. Rekab, C. Morisset. Routine cryopreservation of kiwifruit (Actinidia spp) germplasm by encapsulationdehydration: Importance of plant growth regulators // CryoLetters, c/o Royal Veterinary College, London NW1 0TU. CryoLetters. – 2001. N 22. – P. 61-74. 83 ZhaoY., Wu Y., Engelmann F., Zhou M. and Chen S. Cryopreservation of apple in vitro shoot tips by the droplet freezing method // Cryo-Letters 20, 109-112 (1999). 84 Lynch P.T., Benson E.E., Harding K. Climate change: the role of ex situ and cryoconservation in the future security of economically important, vegetatively propagated plants // J. Horticultural Science & Biotechnology – 2007. – V. 82 (2). – P. 157-160 85 Reed B. M. The basics of in vitro storage and cryopreservation // National Clonal Germplasm Repository, Corvallis, O.R. USA. – 2002. – Р.34-46.) 86 Розанов С.И. Место генетических криобанков в решении проблемы сохранения биоразнообразия. // Биофизика живой клетки. 1994. Т. 6. С. 8. 87 Ромаданова Н.В., Кушнаренко С.В. Влияние холодовой обработки побегов in vitro на криосохранение апикальных меристем яблони // Биотехнология. Теория и практика. Алматы. №3. - 2007г. - С. 39-44. 88 Wu Y., Engelmann F., Zhao Y., Zhou M., Chen S. Cryopreservation of apple shoot tips: importance of cryopreservation technique and of conditioning of donor plants // Cryo-Letters – 1999. – V. 20. – P. 121-130. 89 Paul H., Daigny G., Sangwan-Norreel B.S. Cryopreservation of apple (Malus x domestica Borkh.) shoot tips following encapsulation-dehydration or encapsulationvitrification // Plant Cell Reports. – 2000. – V. 19. – P. 768-774 90 Chang Y., Reed B.M. Extended alternating-temperature cold acclimation and culture duration improve pear shoot cryopreservation // Cryobiology. – 2000. – V.40. – P. 311-322 91 Helliot B., M.T. de Boucaud. Effect of various parameters on the survival of cryopreserved Prunus Ferlenain in vitro plantlets shoot tips // Cryo-Letters. – 1997. – V.18. – P.133-142. 92 Y.Chang, B.M.Reed. Extended cold acclimation and recovery medium alteration improve regrowth of Rubus shoot tips following cryopreservation. Cryo-Letters 20, 1999. P. 371-376. 93 Y. Chang, B.M.Reed. Extended alternating-temperature cold acclimation and culture duration improve pear shoot cryopreservation. Cryobiology 40, 2000. P.311322. 94 Crowe J.H., Crowe L.M., Carpenter J.F. et. al. Interaction of sugars with membranes. // Biochimica et Biophysica Acta. - 1989. -947.- P. 367-384. 95 Withers L.A., Street H.E. Freeze preservation of cultured plant cells: III. The pregrowth phase // Physiol. Plant – 1977. - V.39. – P.171-178. 96 Hirai D., Sakai A. Cryopreservation of in vitro grown meristems of potato by encapsulation-vitrification // Cryopreservation of tropical plant germplasm. Current research progress and application. Eds. Engelmann F& Takagi H., JIRCAS, Tsukuba & IPGRI, Rome. – 2000. – P. 205 – 211 97 Kartha K.K., Leung N.L., Paul K. Cryopreservation of strawberry meristems and mass propagation of plantlets // J. Am. Soc. Hort. Sci. – 1980. – V.105. – P. 481– 484. 98 Uragami A, Sakai A, Nagai M. Cryopreservation of dried axillary buds from plantlets of Asparagus officinalis L grown in vitro // Plant Cell Report. - 1990. -9.- P. 328-331 99 Sakai A., Kobayashi S., Oiyama I. Cryopreservation of nucellar cells of navel orange Citrus sinensis Osb.var. brasiliensis Tanaka) by vitrification // Plant Cell Reports. - 1990. -9.- P. 30-33 100 Hirai D., Sakai A. Cryopreservation of in vitro grown meristems of potato by encapsulation-vitrification // Cryopreservation of tropical plant germplasm. Current research progress and application. Eds. Engelmann F& Takagi H., JIRCAS, Tsukuba & IPGRI, Rome 2000.- P.205-211 101 Kim H.H., Cho E.G., Back H.J. et.al. Cryopreservation of garlic shoot tips by vitrification: effects of vitrification, rewarming, unloading and regrous conditions // CryoLetters. – 2004. -25.- Р.59-70. 102 Matsumoto T., Sakai A., Nako Y. A novel precutting for enhansing the survival of in vitro grown meristems of wasabi (Wasabia japonica) cooled to -196ºC by vitrification // CryoLetters. - 1998. -19.- P.27-36. 103 Takagi H. Recent development in cryopreservation of shoots apices of tropical species // Cryopreservation of tropical plant germplasm. Current research progress and application. Eds. Engelmann F& Takagi H., JIRCAS, Tsukuba & IPGRI, Rome 2000.- P.178-193. 104 Engelmann F., Benson E.E., Chabrillance N., Gonzalez Arnao M.T., Mari S., Michaux-Ferriere N., Paulet F., Glazmann J.C., Charrier A. Cryopreservation of several tropical plant species using encapsulation-dehydration of apices // Kluwer Academic Pubs. Current Issues of Plant and Cellular Biology. The Netherlands ed. M.Terzi. –1995. – P.315 –320. 105 Hirai D., Sakai A. Cryopreservation of in vitro-grown axillary shoot-tips meristems of mint (Mentha Spicata L.) by encapsulation-vitrification // Plant Cell Reports 1999. - V.19.-P.150-155. 106 Seufferheld M.J., Fitzpatrick J., Walsh T.M., Stushnoff C. Cryopreservation of dormant buds from cold tender taxa using a modified vitrification procedure // Abstr. 28th Annual Meeting. - Cryobiology. – 1991. – V.28(6). – P.576. 107 Sakai A., Nishiyama Y. Cryopreservation of winter vegetative buds of hardy fruit trees in liquid nitrogen // HortScience - 1978. - V. 13(3). - P. 225-227. 108 Tyler N.J., Stushnoff C. The effect of prefreezing and controlled dehydration on cryopreservation of dormant vegetative apple buds // Can. J. Plant Sci. - 1988. - V. 68. - P.1163-1167. 109 Forsline P.L., Towill L.E., Waddell J., Stushnoff C., Walters K., Lamboy W.F., McFerson J.R. Recovery and Longevity of cryopreserved dormant apple buds // J.Amer.Soc.Hort.Sci. – 1998. – V. 123(3). – P.365-370 110 Volk G. M., Bonnart R., Waddell J., Widrlechner M. P. Cryopreservation of dormant buds from diverse Fraxinus species. CryoLetters. – 2009. N 30 (4). – P. 262267 111 Chang Y., Reed B.M. Extended cold acclimation and recovery medium alteration improve regrowth of Rubus shoot tips following cryopreservation // Cryo-Letters. – 1999. – N. 20. – P. 371-376. 112 Сафина Г.Ф. Влияние низких и сверхнизких температур на жизнеспособность семян плодовых и ягодных растений // Государственный научный центр РФ Всероссийский научно-исследовательский институт растениеводства им. Н.И. Вавилова РАСХН, Вестник Санкт-Петербург. ВОГиС. – 2008. – Т. 12. – № 4. – C. 76-79. 113 Roca W.M., Bryan J.E., Roca M.R. Tissue culture for the international transfer of potato genetic resources // Amer Potato J., – 1979, – Vol. 56, N. 1. – P. 1-10. 114 Wilkin C.P., Bengochea T., Dodds J.H. The use of in vitro methods for plant genetic conservation // Outlook on Agriculture. – 1982. – Vol. 11, N. 2. – P. 67-72. 115 Калинин Ф.Л., Сарнацская В.В., Полищук В.Е. Методы культуры тканей в физиологии и биохимии растений. – Киев: Наук. Думка, 1980. – 487 с. 116 Криосохранение апикальных меристем плодовых и ягодных культур. Методические рекомендации / С.В. Кушнаренко, И.Ю. Ковальчук, Н.В. Ромаданова и др.- Алматы, 2008. 117 Доспехов Б.А. Методика полевого опыта (с основами статистической обработки результатов исследований). М.: Агропромиздат, 1985. – 351с. 118 Harvey A.E., Grasham J.L. Procedures and media for obtaining tissue culture of 12 conifer species // Can. J. – 1969. – Bot. 47, N. 4. – Р. 547-549. 119 VissP.R., Brooks E.M., Driver J.A. A simplified method for the control of bacterial contamination in woody plant tissue culture // In Vitro Cell. Dev. Biol. – 1991. – Vol. 27. – P. 42. 120 Reed B.M., N. Okut, J. D'Achino, L. Narver, and J. DeNoma. Cold storage and cryopreservation of hops (Humulus L.) shoot cultures through application of standard protocols. CryoLetters. – 2003.– 24:389-396 121 Reed B.M. Application of gas-permeable bags for in vitro cold storage of strawberry germplasm. Plant Cell Reports. –1991.–10:431-434. 122 ReedB.M., C.L. Paynter, J. DeNoma, and Y. Chang. Techniques for mediumand long-term storage of Pyrus L. genetic resources. Plant Genetic Resources Newsletter. –1998.–115: 1-4. 123 Angelo E., Iverson V.E. Studies on Some Factors Relating to Hardiness in the Strawberry // Univ. Minn. Agric. Sta., Tech. – 1939. – Vol. 101. – P. 473-497. 124 Reed B.M. Pretreatment strategies for cryopreservation of plant. In: Normah M.N., Narimah M.K., Clyde M.M (eds.) // In Vitro Conservation of Plants Genetic Resources. Universiti Kebangsaan Malaysia, Bangi, Selangor. – 1996. – P. 73-87. 125 Совершенствование биотехнологических методов криосохранения гермоплазмы ягодных культур: автореф.дисс.канд.биологических наук Турдиев Т.Т., Астана: 2010. 126 Высоцкий В.А. Регенерация плодовых и ягодных растений в культуре каллусной ткани, пыльников, листовых и стеблевых эксплантов// Садоводство и виноградарство. –2008. − №2. – С. 17-20. 127 Орлова С.Ю. Особенности размножения сортов вишни различного происхождения в культуре in vitro / С. Ю. Орлова, А. А. Юшев // Плодоводство на рубеже XXI века : Матер. междунар. конф., посвящ. 75- летию со дня образования Белорусского НИИ плодоводства – Минск, 2000. – С. 27-28. 128 Шорникова Д. Г. Совершенствование технологии размножения редких садовых растений в культуре in vitro и оценка их потенциала устойчивости к абиотическим стрессорам. дис. ... канд. с.-х. наук / Д. Г. Шорников. – М., 2008. – 192 с. 129 Верзилин А. В. Д. В. Иванов, Ю. В. Трунов // Использование биотехнол. методов для решения генет.-селекционных проблем. – Мичуринск, 1998. – С. 63-66. 130 Cassels A.C. Detection and elimination of microbial endophytes and prevention of cntamination in plant tissue culture // In: Plant Tissue Culture, Development, and Biotechnology. Eds. R.N. Trigiano and D.J. Gray.CRC Press.Taylor&Francis Group. – USA. – 2011. – P. 223-238. 131 Epstein, E. and A. Bloom. 2005. Mineral Nutrition of plants: principles and perspectives. Sinauer Associates, Sunderland, MA. 132 Niedz, R.P. and T.J. Evens. 2007. Regulating plant tissue growth by mineral nutrition. In Vitro Cell. Dev. Biol. Plant. 43: 370-381.]. 133 Agromage.com 2000-2014. Влияние и значение элементов на жизнедеятельность растений. 134 Reed, B.M., Wada, S., DeNoma, J., and Niedz, R.P. Improving in vitro mineral nutrition for diverse pear germplasm. In Vitro Cell. Dev. Biol.Plant. – 2013. – 49:343-355. 135 Reed B.M. Implementing cryogenic storage of clonally propagated plants // CryoLetters. – 2001. N. 22. – P. 97-104. 136 Dereuddre J., Scottez C., Arnaud Y., Duron M. Resistance of alginate-coated axillary shoot tips of pear tree (Pyrus communis L. cv. Beurre Hardy) in vitro plantlets to dehydration and subsequent freezing in liquid nitrogen // C. R. Acad. Sci. Paris. – 1990. – N. 310. – P. 317-323. 137 Matsumoto T., Sakai A., Nako Y. A novel precutting for enhansing the survival of in vitro grown meristems of wasabi (Wasabia japonica) cooled to –196ºC by vitrification // CryoLetters. – 1998. – N. 19. – P. 27-36. 138 Paul H., Daigny G., Sangwan-Norreel B.S. Cryopreservation of apple (Malus x domestica Borkh.) shoot tips following encapsulation-dehydration or encapsulationvitrification // Plant Cell Reports. – 2000. – Vol. 19. – P. 768-774 139 Niino T., Sakai A., Yakuwa H., Nojiri K. Cryopreservation of in vitro-grown shoot-tips of apple and pear by vitrification // Plant Cell, Tissue and Organ Culture. – 1992. – Vol. 28. – P. 261-266. 140 Reed B.M. Pretreatment strategies for cryopreservation of plant. In: Normah M.N., Narimah M.K., Clyde M.M (eds.) // In Vitro Conservation of Plants Genetic Resources. Universiti Kebangsaan Malaysia, Bangi, Selangor. – 1996. – P. 73-87. 141 Hirai D., Sakai A. Cryopreservation of in vitro grown meristems of potato by encapsulation-vitrification // Cryopreservation of tropical plant germplasm. Current research progress and application. Eds. Engelmann F& Takagi H., JIRCAS, Tsukuba & IPGRI, Rome. – 2000. – P. 205-211. 142 Crowe J.H., Crowe L.M., Carpenter J.F. Interaction of sugars with membranes // Biochimica et Biophysica Acta. – 1989. – Vol. 947. – P. 367-384. 143 Palonen P., Junttila O. Cold hardening of raspberry plants in vitro is enhanced by increasing sucrose in the culture medium // Physiologia Plantarum. – 1999. – N. 106. – P. 386-392. 144 Пушкарь Н.С., Шраго М.И., Белоус А.М., Калугин Ю.В. Криопротекторы // Наук. думка. – Киев, 1979. – 197с. 145 Dali T., Li Paul H. Classification of plant cell cryoprotectants // Journal Theoretical Biology. – 1986. – N. 123. – Р. 305-310. ПРИЛОЖЕНИЕ А Рисунок А. 1 – Выделение апикальных меристем груши Рисунок А.2 – Предобработка криопротекторов для замораживания в жидком азоте
