Обнаружить одного-единственного возбудителя вирусной

Проект РФФИ и Фонда содействия МП НТС
С К ОЛ Ь К О В И Р У СО В В К А Р ТО Ш К Е ?
Обнаружить одного-единственного возбудителя вирусной инфекции в образце картофеля, томатов и некоторых других растений можно будет с
помощью метода, предложенного учеными Московского государственного
университета. При финансовой поддержке РФФИ и Фонда содействия МП
НТС вирусологам удалось разработать доступную и исключительно чувствительную технологию молекулярной диагностики вироидного и вирусных и
заболеваний растений, доступную для проведения массовых анализов.
Доп. информация: зав.лабораторией (внс) НИИ ФХБ МГУ им.М.В.Ломоносова доктор
химических
наук
Юрий
Федорович
Дрыгин,
(095)
939-55-29,
drygin@belozersky.msu.ru
Эффективную и чувствительную, а главное, доступную для массовых
анализов, технологию диагностики вирусных заболеваний растений разработали сотрудники МГУ им. М.В. Ломоносова под руководством академика
Иосифа Атабекова при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований. С ее помощью можно быстро выявить, есть ли в
образце растения возбудитель инфекции, а если есть – то и узнать, насколько
сильно поражено растение. Разработанная технология, объединяющая в себе
современные методы молекулярной диагностики, позволяет определить, например, больной или здоровый семенной материал посадят весной труженики сельского хозяйства. Технология, предлагаемая московскими вирусологами, в сравнении с другими, используемыми зарубежными агродиагностическими фирмами, при массовом анализе обещает быть и более дешевой, и более эффективной.
Итак, основные этапы анализа таковы.
Сначала надо подготовить анализируемые растения к диагностике, для
этого из образца растения берут сок. Авторы сделали соковыжималку особой
конструкции. Внешне она напоминает обычную «чеснокодавилку» - небольшое устройство в форме пресса. Однако сделано оно так, что с его помощью
даже из маленького полузасохшего кусочка растения можно получить микрокаплю клеточного сока, необходимую для проведения анализа. По уверениям авторов, это по силу даже ребенку – и сок получается прозрачным, без
мякоти.
Образец клеточного сока разбавляют раствором так называемого хаотропного агента. Он позволяет не только экстрагировать РНК с белками из
клеток растения, но и разрушает связь между молекулой РНК вируса и окружающими ее белками, и подавляет активность клеточных нуклеаз (ферментов, разрушающих РНК). Мощный хаотропный агент – это соединение давно
известное, а вот использовать его для освобождения РНК от белков москвичи
придумали первыми.
1
Проект РФФИ и Фонда содействия МП НТС
Далее освобожденную вирусную РНК из полученного клеточного экстракта выделяют. Для этого используют маленькие хроматографические колоночки (что-то вроде разовых шприцов, только без поршня), заполненные
дешевым и доступным, но никогда раньше для этого не применявшимся,
сорбентом. Наносят образец в верхнюю часть колонки и собирают раствор
РНК из нижней ее части. Чтобы сделать это быстро, делают это под небольшим вакуумом, а чтобы проанализировать сразу много образцов, например,
сто, используют специальное, тоже придуманное авторами приспособление.
В итоге можно получить раствор, содержащий РНК вируса, если таковой был в образце растения. Микролитр этой жидкости наносят на нитратцеллюлозную мембрану (на мембрану можно наносить десятки-сотни образцов - чем больше, тем дешевле анализ одного образца), фиксируют РНК УФсветом – и такую мембрану можно анализировать тут же, можно – через несколько месяцев, можно посылать по почте, например, в центральную или
районную лабораторию, или хранить для коллекции.
Теперь для диагноза подготовленные образцы на мембране надо проанализировать.
Для этого ученые используют комбинацию уже хорошо себя зарекомендовавших методов молекулярной диагностики вирусных заболеваний: с
помощью так называемых ДНК-зондов и иммуноферментного анализа. ДНКзонд – это молекула кДНК, комплементарная данной вирусной РНК, полученная и размноженная методами генной инженерии, и несущая метку. В условиях гибридизации нуклеиновых кислот кДНК узнает «родную» РНК среди миллионов других молекул и к ней присоединяется. Для мечения кДНК
ученые МГУ отдали предпочтение «отечественной» платиновой метке, разработанной совместно НИИ ИБХ РАН и НИИ медицинской радиологии.
На следующем этапе специфически связавшийся ДНК-зонд обнаруживают с помощью антител к комплексу «ДНК-метка» методом иммуноферментного анализа на мембранах. В этом анализе продукт ферментативной реакции фотоактивен, он засвечивает рентгеновскую пленку. В результате нанесенные на мембрану опытные и контрольный образцы, и для количественной оценки – пробы с известными количествами чистой вирусной РНК, можно наблюдать визуально (или с помощью сканера).
Таким образом, ДНК-зонд связывается с образцами инфицированных
растений и не связывается с образцами здоровых, а тяжесть инфекции можно
количественно оценить визуально или с помощью прибора.
Разумеется, за этим упрощенным рассказом – годы исследований. Теперь, по словам одного из авторов, доктора химических наук Юрия Дрыгина,
основная задача –повышение чувствительности метода до теоретически возможного максимума и расширение списка инфекций растений (банка ДНКзондов), которые можно этим методом определять. Ученые уже знают, как
2
Проект РФФИ и Фонда содействия МП НТС
добиться того, чтобы можно было обнаружить в анализируемом образце (и
даже в пробирочном растении) единичный вирус.
Пока анализ разработан для вироидного и вирусных и заболеваний картофеля и помидоров. В плане – диагностические системы для абрикосов,
сливы, вишни и цитрусовых. Возможно, именно эти исследования россиян
позволят наконец избавить растениеводов от размножения инфицированных
растений. Ведь авторы уверены – одно из преимуществ их метода – доступность, возможность его частичной автоматизации и соответствующее удешевление. В десятки раз по сравнению с известными и соизмеримыми по
чувствительности технологиями.
3