(Anti-Yersinia enterocolitica WESTERNBLOT (IgA))

Anti-Yersinia enterocolitica WESTERNBLOT (IgA), EUROIMMUN AG
1
_____________________________________________________________________________________________________
Йерсинии IgA Вестерн-блот
(Anti-Yersinia enterocolitica WESTERNBLOT (IgA))
Набор для качественного определения in vitro антител класса IgA к факторам вирулентности патогенных
штаммов Yersinia enterocolitica в сыворотке или плазме крови человека методом Вестерн-блота.
Номер по каталогу:
DY 2173-1601 A (набор на 16 определений)
DY 2173-3001 A (набор на 30 определений)
НАЗНАЧЕНИЕ
Набор Анти-Yersinia enterocolitica (IgA) WESTERNBLOT предназначен для качественного определения in
vitro антител класса IgA человека к факторам вирулентности патогенных штаммов Yersinia enterocolitica в
сыворотке и плазме крови.
ПОКАЗАНИЯ К ПРИМЕНЕНИЮ
Диагностика ревматоидных заболеваний (реактивный артрит) и узловатой эритемы.
ПРИНЦИП МЕТОДА
Тест Anti-Yersinia enterocolitica (IgA) WESTERNBLOT основан на методе Вестерн-блота. Набор содержит
тестовые стрипы с электрофоретически разделенными факторами вирулентности патогенных штаммов
Yersinia enterocolitica. Тестовые стрипы инкубируют на первой стадии реакции с образцом разведенной
сыворотки или плазмы крови пациента. В случае если образец положительный, специфические антитела
класса IgA (а также классов IgG и IgM) будут связываться с соответствующими антигенами. Для
обнаружения связанных антител проводится вторая инкубация с использованием ферментного конъюгата
(антитела к IgA человека, меченные щелочной фосфатазой), который способен вызывать развитие цветной
реакции.
МАТЕРИАЛЫ И РЕАГЕНТЫ
Состав набора
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
Компонент
Тестовые стрипы
Полоски с электрофоретически разделенными
факторами вирулентности Yersinia enterocolitica
Оценочный шаблон с контрольным стрипом
1 тестовый стрип, проинкубированный с
положительной контрольной сывороткой
Ферментный конъюгат
Антитела козы к IgА человека, конъюгированные с
щелочной фосфатазой; 10×концентрат
Универсальный буфер
10×концентрат
Раствор субстрата
Нитроголубой тетразолий хлорид/5-бром-4-хлор3-индолил-фосфат (NBT/BCIP), готов к
использованию
Оценочный протокол
Лоток для инкубации
Пластиковая пленка
Инструкция по применению набора
Серия
Для in vitro диагностики
Количество
Количество
Обозначение
16 × 1
30 × 1
STRIPS
1 шт.
1 шт.
–
1 × 3 мл
2 × 3 мл
1 × 50 мл
1 × 100 мл
BUFFER 10×
1 × 30 мл
1 × 50 мл
SUBSTRATE
1 шт.
2 × 8 каналов
1 шт.
1 шт.
2 шт.
–
2 шт.
1 шт.
CONJUGATE 10 ×
–
TRAY
–
–
Температура хранения
Невскрытый набор использовать до
Хранение и стабильность набора: Набор следует хранить при температуре от +2 °С до +8 °С. Не
замораживать. Невскрытые компоненты набора сохраняют стабильность в течение всего указанного срока
годности набора.
Удаление отходов: Неразведенную сыворотку крови пациентов и тестовые стрипы после инкубации
следует рассматривать как инфицированные отходы и обращаться с ними соответствующим образом. Все
реагенты следует удалять в соответствии с действующими официальными инструкциями.
_____________________________________________________________________________________________________
 Перевод на русский язык ЗАО «АНАЛИТИКА», Москва, 2005
тел.: 737-0363, факс: 737-0365, e-mail: info@analytica.ru
Anti-Yersinia enterocolitica WESTERNBLOT (IgA), EUROIMMUN AG
2
_____________________________________________________________________________________________________
ПОДГОТОВКА И СТАБИЛЬНОСТЬ РЕАГЕНТОВ
Примечание: Все компоненты каждой серии набора специально подобраны друг к другу. Чтобы обеспечить
правильное выполнение теста, используйте только компоненты одной серии. Обратите внимание, что на
пакете с тестовыми стрипами, кроме номера серии, отпечатан дополнительный номер партии стрипов. Этот
номер, относящийся только к партии стрипов, отпечатан также на соответствующем оценочном шаблоне с
контрольным стрипом. Правильность оценки результатов анализа может быть гарантирована только в том
случае, когда оба эти номера на пакете со стрипами и на шаблоне совпадают.
Перед использованием температуру всех реагентов необходимо довести до комнатной (от +18 °С до +25 °С)
в течение 30 минут.
- Тестовые стрипы, покрытые антигенами: Готовы к использованию. Во избежание конденсации влаги
на стрипах, не вскрывайте пакет до тех пор, пока он не нагреется до комнатной температуры. Вынув
необходимое количество стрипов, остальные неиспользованные стрипы немедленно плотно закройте в
той же защитной упаковке и храните при температуре от +2 °С до +8 °С. После первого вскрытия
упаковки плотно упакованные вновь стрипы с антигенами можно хранить минимум 2 месяца в сухом
месте при температуре от +2 °С до +8 °С. Для обеспечения правильной оценки результатов следите,
чтобы номер пакета со стрипами совпадал с номером на шаблоне.
-
Ферментный конъюгат: Поставляется в виде 10-кратного концентрата. Отберите необходимое
количество жидкости из флакона с концентратом с помощью чистой пипетки и разведите 1:10
универсальным буфером. Например, для проведения анализа на 1 тестовом стрипе, смешайте 0,15 мл
концентрата ферментного конъюгата с 1,35 мл универсального буфера. Разведенный раствор
ферментного конъюгата следует использовать до конца рабочего дня.
-
Универсальный буфер: Поставляется в виде 10-кратного концентрата. Для приготовления готового к
использованию универсального буфера отберите необходимое количество жидкости из флакона с
концентратом с помощью чистой пипетки и разведите 1:10 деионизированной или дистиллированной
водой. Например, для проведения анализа на 1 тестовом стрипе разведите 1,5 мл концентрата
универсального буфера в 13,5 мл деионизированной или дистиллированной воды. Разведенный
универсальный буфер следует использовать до конца рабочего дня.
Раствор субстрата: Готов к использованию. После отбора необходимого количества реагента из
флакона немедленно вновь закройте его, так как раствор чувствителен к свету.
Внимание! Использованная в шаблоне контрольная сыворотка была проверена на отсутствие антигена
гепатита В, а также антител к вирусам ВИЧ-1 и ВИЧ-2 и вирусу гепатита С методами иммуноферментного
анализа и непрямой иммунофлуоресценции. Тем не менее, все используемые материалы следует считать
потенциально опасными и обращаться с ними, соблюдая необходимые меры предосторожности. Избегайте
контакта с кожей.
-
ПОДГОТОВКА И СТАБИЛЬНОСТЬ ИССЛЕДУЕМЫХ ОБРАЗЦОВ
Материал образцов: Сыворотка или плазма (ЭДТА, гепарин или цитрат) крови человека.
Стабильность: Исследуемые образцы, предназначенные для анализа этим методом, можно хранить до 14
о
о
дней при температуре от +2 С до +8 С. Разведенные образцы необходимо использовать в течение одного
рабочего дня.
Разведение образцов: Исследуемые образцы разводят 1:51 универсальным буфером. Например:
разведите 30 мкл исследуемого образца в 1,5 мл универсального буфера и тщательно перемешайте на
вортексе (пипетка для перемешивания не пригодна).
ПРОЦЕДУРА ИССЛЕДОВАНИЯ
Блокировка стрипов
Заполните каналы пластикового лотка для инкубации в соответствии с
количеством исследуемых образцов пациентов разведенным универсальным
буфером (по 1,5 мл буфера на один канал). Выньте из упаковки требуемое
количество тестовых стрипов и поместите каждый стрип в отдельный канал. При
этом должен быть виден номер стрипа, указанный в его нижней части.
Инкубируйте 15 минут при комнатной температуре на шейкере-качалке. Затем
удалите всю жидкость из каждого канала.
Инкубация образцов
(1-я стадия)
Внесите в каждый канал по 1,5 мл разведенного образца сыворотки или плазмы
крови и инкубируйте при комнатной температуре в течение 30 минут на
шейкере-качалке.
Промывка
Удалите жидкость из каждого канала и затем промойте 3 раза по 5 минут на
_____________________________________________________________________________________________________
 Перевод на русский язык ЗАО «АНАЛИТИКА», Москва, 2005
тел.: 737-0363, факс: 737-0365, e-mail: info@analytica.ru
Anti-Yersinia enterocolitica WESTERNBLOT (IgA), EUROIMMUN AG
3
_____________________________________________________________________________________________________
шейкере-качалке, внося каждый раз по 1,5 мл разведенного универсального
буфера на канал.
Инкубация конъюгата
(2-я стадия)
Внесите в каждый канал по 1,5 мл разведенного ферментного конъюгата
(меченные щелочной фосфатазой антитела к IgА человека). Инкубируйте в
течение 30 минут при комнатной температуре на шейкере-качалке.
Промывка
Удалите жидкость из каждого канала и затем промойте 3 раза по 5 минут на
шейкере-качалке, внося каждый раз по 1,5 мл разведенного универсального
буфера на канал.
Инкубация с субстратом
(3-я стадия)
Внесите в каждый канал по 1,5 мл раствора субстрата. Инкубируйте в течение
10 минут при комнатной температуре на шейкере-качалке.
Остановка реакции
Удалите жидкость из каждого канала и затем промойте 3 раза по 1 минуте
деионизированной или дистиллированной водой.
ОЦЕНКА И ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ Теста Анти-Yersinia enterocolitica (IgA) WESTERNBLOT
Регистрация результатов реакции
После остановки реакции деионизированной или дистиллированной водой выньте из лотка
проинкубированный тестовый стрип и, придерживая его двумя пинцетами, поместите в соответствующее
место, расположенное на разлинованном и покрытом листом прозрачного пластика поле оценочного
протокола, предназначенном для стрипов. Пока стрип влажный, его можно на пластике передвинуть. После
высыхания стрипы прочно закрепятся на пластике. После того, как вы поместите все тестовые стрипы в
оценочный протокол, их необходимо крепко прижать листом фильтровальной бумаги. Если вы собираетесь
получить результат в цифровом выражении, сканируя стрип с помощью EUROLINESCAN, поместите стрипы
на пластик, как описано выше. После сканирования высохших стрипов их следует для дальнейшего
хранения закрыть сверху другим листом пластиковой пленки.
После этого приложите оценочный шаблон к тестовым стрипам на пластике так, чтобы черные полосы,
расположенные над номерами блотовых стрипов, совпадали с черной полосой сравнения (alignment bar)
контрольного стрипа на оценочном шаблоне. При этом номер на оценочном шаблоне должен совпадать
с номером используемой партии блотовых стрипов. В оценочном протоколе следует отметить ясно
различимые полосы на блотовых стрипах, совпадающие с отмеченными полосами антигенов контрольного
стрипа.
Примечание: На стрипах под номером расположена контрольная полоса. Интенсивное окрашивание
этой контрольной полосы свидетельствует о правильности проведения инкубации.
Антигены:
Источником антигенов для тестов Анти-Yersinia enterocolitica WESTERNBLOT являются патогенные для
человека штаммы Y. enterocolitica, содержащие плазмиду размером приблизительно 70 тысяч пар
оснований. В этой плазмиде закодированы наиболее важные вирулентные или патогенные факторы. В
условиях недостатка кальция часть этих факторов вирулентности секретируется в питательную среду (1, 2).
Эти факторы вирулентности описаны как «белки наружной мембраны Yersinia» (Yersinia outer membrane
proteins, Yop) или как «секретируемые белки» (release proteins, RP). Отличительной чертой этих факторов
вирулентности является то, что они специфичны для Yersinia и не выявляются ни у каких других бактерий. В
противоположность этому патогенные для человека штаммы Yersinia enterocolitica (О:3, О:8, О:9, О:5,27 и
т.д.) всегда несут вирулентную плазмиду. Факторы вирулентности, закодированные в этой плазмиде, имеют
минимальные различия в молекулярной массе, зависящие от конкретного штамма Y. enterocolitica. Для
группы патогенных для человека штаммов характерна высокая степень взаимных перекрестных реакций
факторов вирулентности. Поэтому при тестировании на наличие антител к факторам вирулентности одного
из патогенных штаммов гарантирована чувствительность и специфичность относительно факторов
вирулентности другого патогенного штамма. Источник антигенов теста EUROIMMUN WESTERNBLOT для
определения антител к факторам вирулентности Y. enterocolitica – очищенные факторы вирулентности
штамма О:3 Y. enterocolitica. Штамм О:3 был выращен в условиях дефицита кальция, факторы
вирулентности выделены из супернатанта культуральной жидкости. Очищенные факторы вирулентности
растворяли додецилсульфатом натрия. Растворенные белки были разделены по молекулярной массе
методом прерывистого электрофореза в полиакриламидном геле, и разделенные белки были перенесены
на нитроцеллюлозную мембрану тестовых стрипов. Два стрипа из каждого набора были проинкубированы с
контрольной сывороткой и окрашены. Один из двух окрашенных стрипов был включен в набор в качестве
контрольного, а второй – оставлен с целью документирования в компании EUROIMMUN.
_____________________________________________________________________________________________________
 Перевод на русский язык ЗАО «АНАЛИТИКА», Москва, 2005
тел.: 737-0363, факс: 737-0365, e-mail: info@analytica.ru
Anti-Yersinia enterocolitica WESTERNBLOT (IgA), EUROIMMUN AG
4
_____________________________________________________________________________________________________
Характеристика антигенов, нанесенных на стрипы (3)
Антиген
(молекулярная масса,
аббревиатура)
46 кДа (р46)
44 кДа (р44)
38 кДа (р38)
36 кДа (р36)
Номенклатура
(альтернативное
название)
YopM (Yop2a)
YopН (Yop2b)
LorV (V antigen)
YopD (Yop4a)
34 кДа (р34)
30 кДа (р30)
25 кДа (р25)
YopN (Yop4b)
YopP (Yop30)
YopE (Yop5)
Функция
Ингибирование агрегации тромбоцитов
Предотвращение фагоцитоза макрофагами
Амплификация цитотоксических эффектов YopE
или транслокация YopE мембраной эукариотической клетки
Цитотоксический эффект на клетках
усиление фагоцитоза макрофагами
HeLa,
Антитела классов IgA и IgG к факторам вирулентности Yersinia enterocolitica
Антитела классов IgA, IgG и IgМ могут быть выявлены на ранней стадии после контакта с факторами
вирулентности Y. enterocolitica. Титры антител классов IgA и IgМ снижаются через несколько месяцев.
Антитела класса IgG обычно присутствуют дольше и могут быть определены в сыворотке крови через 12
месяцев и более после первичного контакта. При хронических формах заболевания и
иммунопатологических осложнениях антитела классов IgG и даже IgA могут выявляться и на протяжении
еще большего периода времени (4).
В целом может быть применена следующая схема оценки результатов. Прилагаемый контрольный стрип
используется для сравнения интенсивности окраски полос. Полоса р46 (YopM или Yop2a) является
примером отчетливой полосы с интенсивной окраской. Интенсивность окраски других полос на стрипе
варьирует от средней (см. полосу р25) до очень слабой (см. полосу р38). Интенсивность окраски полосы р25
считается пограничной. При меньшей интенсивности окраски полосы результат считается отрицательным.
Антитела класса IgA
Результат
Отрицательный
Пограничный
Положительный
Описание
Отсутствие полосы.
По меньшей мере одна полоса. Опыт показывает, что основной иммунный
ответ при тестировании на антитела класса IgA направлен на антиген р36.
По меньшей мере одна четкая интенсивная полоса.
Антитела класса IgG
Результат
Отрицательный
Пограничный
Положительный
Описание
Отсутствие полосы или одна полоса средней интенсивности.
Одна четкая интенсивная полоса или по меньшей мере две полосы средней
интенсивности.
По меньшей мере две четких интенсивных полосы.
АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ
Диапазон определения: Метод WESTERNBLOT является качественным, диапазон определения не дается.
Принято, что предельный титр антител устанавливается при разведении образца 1:51.
Перекрестные реакции: Качество используемых антигенов (факторов вирулентности) и источников
антигенов (Y. enterocolitica) гарантирует высокую специфичность наборов WESTERNBLOT. Определение
перекрестной реактивности данного набора WESTERNBLOT не требуется, поскольку специфические
реакции и неспецифические или перекрестные реакции могут быть определены непосредственно данным
тестом.
Влияние гемоглобина, триглицеридов и билирубина: Не отмечено искажения результатов при
исследовании данным набором гемолизированных, липемических или желтушных образцов сывороток.
Воспроизводимость результатов между опытами и в пределах одного опыта: Воспроизводимость
результатов между опытами оценивали многократным повторным исследованием одних и тех же
охарактеризованных образцов в течение нескольких дней, воспроизводимость в пределах одного опыта –
многократным исследованием охарактеризованных образцов в течение одного дня. В каждом случае
интенсивность полос находилась в пределах установленного диапазона. Таким образом, данный тест
WESTERNBLOT показывает очень высокую воспроизводимость в пределах одной постановки и между
постановками.
_____________________________________________________________________________________________________
 Перевод на русский язык ЗАО «АНАЛИТИКА», Москва, 2005
тел.: 737-0363, факс: 737-0365, e-mail: info@analytica.ru
Anti-Yersinia enterocolitica WESTERNBLOT (IgA), EUROIMMUN AG
5
_____________________________________________________________________________________________________
Распространенность: Образцы сыворотки крови 12 пациентов с артритом, вызванным Y. enterocolitica, и
200 здоровых доноров крови исследовали с помощью набора Анти-Yersinia enterocolitica WESTERNBLOT.
Специфические антитела класса IgA выявлены у 50% пациентов с артритом, вызванным Y.enterocolitica, а
специфические антитела класса IgG - у всех пациентов с артритом, вызванным Y. enterocolitica.
Распространенность антител к Y. enterocolitica в образцах сыворотки здоровых доноров крови коррелирует с
данными из литературных источников (7).
Образцы сыворотки
Распространенность
IgА
IgG
50%
100%
14%
33%
n
Артрит, вызванный Yersinia
Здоровые доноры крови
12
200
КЛИНИЧЕСКИЕ СИМПТОМЫ ИНФЕКЦИИ Yersinia enterocolitica
В семейство энтеробактерий Enterobacteriaceae входят 3 вида Yersinia: Y. pestis, Y. pseudotuberculosis и Y.
enterocolitica. Известно более 60 различных сероваров Y. enterocolitica. Патогенные серовары несут
вирулентную плазмиду, содержащую приблизительно 70 тысяч пар оснований. Основными инфекционными
агентами Y. enterocolitica являются серовары О:3, О:9, О:5,27 и О:8 (распространенные в основном в США).
Приблизительно в 75 % случаев штамм О:3 (биовар 4) и в 20 % случаев штамм О:9 (биовар 2) ответственны
за инфекции Y. enterocolitica в Европе(5,6). Клинические симптомы инфекции могут быть разделены на
энтеритную и экстрамезентериальную формы (4).
Наиболее часто встречающейся формой инфекции Y. enterocolitica в детском и юношеском возрасте
является энтерит в сочетании с мезентериальным аденитом, болями в животе, повышенной температурой и
диареей, а также псевдоаппендицит. У взрослых могут дополнительно наблюдаться значительная инфекция
подвздошной кишки (илеит) и толстой кишки (колит). Приблизительно у 20 – 25 % взрослых пациентов
экстрамезентериальные инфекции протекают с или без предшествующего энтерита. Основной
характеристикой этих инфекций является септическая форма, отличающаяся перитонитом,
множественными абсцессами в органах, васкулитом, лихорадкой, гепатитом и лимфаденопатией с
лихорадкой, спленомегалией и потерей веса.
Инфекция, вызванная Y. enterocolitica, сопровождается иммунопатологическими симптомами, среди которых
наиболее часто встречаются реактивный артрит и узловатая эритема. В случае реактивного артрита, как
правило, поражаются нижние конечности. Иногда артрит излечивается за 3 -12 месяцев, но чаще могут
развиваться хронические и возвратные формы артрита. При этом Y. enterocolitica может годами
существовать в слизистой кишечника и в лимфатических тканях. С таким постоянным присутствием
инфекционного агента может быть связано наличие в сыворотке специфических антител, принадлежащих к
иммуноглобулинам класса А (IgA). У 60 - 80 % пациентов с реактивным артритом можно обнаружить антиген
гистосовместимости HLA-B27. Реактивный артрит часто ассоциирован с узловой эритемой, особенно если
пациент женщина. Кожные симптомы возникают через 4 – 6 недель после инфицирования Y. enterocolitica.
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
Список литературы приведен в оригинале инструкции на английском языке.
Внимание! Перевод сделан с английского оригинала инструкции. Перед постановкой исследования
сверьте номер и дату издания вложенного в набор оригинала с указанными в настоящем переводе (см.
внизу справа). При несовпадении номеров или дат обратитесь в «Аналитику» за новым переводом, либо
руководствуйтесь оригиналом инструкции.
Anti-Yersinia_enterocolitica_WB (IgA)_DY 2173A_rus.doc
25.10.2005 11:21
Оригинал: DY_2173A_A_UK_C03.doc
05.07.05 09:29
_____________________________________________________________________________________________________
 Перевод на русский язык ЗАО «АНАЛИТИКА», Москва, 2005
тел.: 737-0363, факс: 737-0365, e-mail: info@analytica.ru
Anti-Yersinia enterocolitica WESTERNBLOT (IgA), EUROIMMUN AG
6
_____________________________________________________________________________________________________
EUROIMMUN Анти-Yersinia enterocolitica WESTERNBLOT
Протокол инкубации
Блокировка:
Поместите блотовый стрип в канал лотка для инкубации, содержащий
1,5 мл универсального буфера
15 мин
При встряхивании
1. Инкубация образца:
Удалите жидкость, внесите в канал
1,5 мл разведенного образца сыворотки (1:51)
30 мин
При встряхивании
Промывка: 3 × 5 мин
2. Инкубация с конъюгатом:
Удалите жидкость, внесите в канал
1,5 мл ферментного конъюгата (1:10)
30 мин
При встряхивании
Промывка: 3 × 5 мин
3. Инкубация с субстратом:
Удалите жидкость, внесите в канал
1,5 мл раствора субстрата
10 мин
При встряхивании
Остановка реакции:
Удалите жидкость, промойте водой
Визуальная оценка
_____________________________________________________________________________________________________
 Перевод на русский язык ЗАО «АНАЛИТИКА», Москва, 2005
тел.: 737-0363, факс: 737-0365, e-mail: info@analytica.ru