Криоконсервация овариальной ткани как метод сохранения

Криоконсервация
овариальной ткани как
метод сохранения
яйцеклеток ранних
стадий развития
Феськов В. А.
fesmankh@gmail.com + 3 8 066 17 18 777
Причины потери
овариального резерва
• Резекция яичников
• Гонадотоксическая терапия
Показания
Гормонзависимые опухоли
Онкогинекологическая патология
Солидные опухоли
Гемобластозы
Неонкологические заболевания
(экстрагенитальная патология с
агрессивным течением)
• Резекция яичника по поводу
доброкачественных образований
•
•
•
•
•
Криоконсервация
овариальной ткани
• Экспериментальный метод
• Более 30 рождённых детей
Andersen et al. 2007, 2008, 2009, 2011
Demeestere et al. 2007
Donnez et al. 2004, 2010, 2011
Meirow et al. 2005
Piver P. 2009
Dittrich et al. 2011
OTCP
(ovarian tissue cryopreservation)
• Медленная заморозка (Gosden RG, Boulton MI, Grant K, Webb
R. Follicular development from ovarian xenografts in SCID mice. J Reprod Fertil
1994;101,619–623.)
• Витрификация (J. Donnez VOL. 98 NO. 5 / NOVEMBER
2012, V. Keros, Human Reproduction, Vol.24, No.7 pp. 1670–1683,
2009, Advanced Access publication
on April 9, 2009
doi:10.1093/humrep/dep079)
Цель исследования
1. Провести витрификацию/
размораживание овариальной ткани
2. Оценить выживаемость овариальной
ткани после размораживания in-vitro
3. Трансплантация размороженной
овариальной ткани лабораторным
животным
Материалы и методы
1. 14 фрагментов коркового слоя
яичников женщин в возрасте от 21 до
30 лет
3 (21,4 %)
1 (7,1 %)
2 (14,3 %)
2 (14,3 %)
1 (7,1 %)
Эндометриоидная киста яичника
Эндометриоз
Фолликулярная киста яичника
Перекрут кисты яичника
Яичниковая беременность
1 (7,1 %)
2 (14,3 %)
2 (14,3 %)
Рак яичника
РШМ
Цистаденома яичника
Материалы и методы
2. Гистологическое исследование
фрагментов овариальной ткани с
окраской по Гематоксилин-Эозину до
витрификации и после размораживания
овариальной ткани
3. Культивирование фрагментов
овариальной ткани после
размораживания
Материалы и методы
4. Трансплантация размороженных
фрагментов овариальной ткани
лабораторным животным ( 4 молодые
половозрелые самки кроля)
5. Мониторинг гормонального профиля
после овариоэктомии, трансплантации
фрагментов овариальной ткани
6. Стимуляция фолликулогенеза
гонадотропными гормонами
Препарирование материала
Фрагменты
овариальной
ткани
Витрификация
• Компоненты: DMSO, EG, sucrose, HSA,
holding media (Sigma Aldrich)
• Методика: эквилибрация при комнатной
температуре (260С)
Разморозка
• basic solution t 37 С с понижающейся
концентрацией сахарозы
Гистологическое исследование
• Окраска по Гематоксилин-Эозин, фрагмент 0,3 х 0,3
см, 10 % формалин
• Критерии жизнеспособности фолликулов:
1. Целостность базальных мембран фолликулов
2. Плотность клеток гранулёзы
3. Отсутствие пикнотических тел
4. Целостность ооцита
(Victoria Keros, Human Reproduction, Vol.24, No.7 pp.
1670–1683, 2009, Advanced Access publication
on April 9, 2009 doi:10.1093/humrep/dep079)
Примордиальный фолликул до
витрификации, увеличение х 400,
окраска по Гематоксилин-Эозин
Ооцит 1-го
порядка
Целостная
базальная
мембрана
фолликула
Культивирование
овариальной ткани
Среда RPMI + 20 % SSS
Инкубирование при 5 % СО2 24 ч.
Лабораторные животные
• 4 молодые половозрелые самки
кролика
• Синдром преждевременного истощения
яичников вызван двусторонней
овариоэктомией
• Мониторинг уровня эстрадиола
Гормональный профиль
Лабораторных животных
• Уровень эстрадиола
№
До
животного овариоэктомии
Через 2 мес.
после
овариоэктомии
1
2
3
4
1,5 pg/ml
1,2 pg/ml
2,2 pg/ml
- pg/ml
40 pg/ml
34 pg/ml
43,5 pg/ml
38 pg/ml
Ортотопическая
ксенотрансплантация в
широкую связку матки
Ксенотрансплантация в
брюшину передней брюшной
сте
Гетеротопическая
ксенотрансплантация в
подкожноые карманы
Результаты
исследования
Анализ выживаемости
фолликулов после
размораживания
• 155 фолликулов от 14 гистологических
исследований
• 144 (93,5 %) – нормальной морфологии
• 9 (6,5 %) – с признаками повреждения
• Стромальный компонент без признаков
дезорганизации коллагеновых волокон;
Примордиальный фолликул после
витрификации, увеличение х 400,
окраска по Гематоксилин-Эозин
Целостная
базальная
мембрана
Ооцит
1-го
порядк
а
Примордиальный фолликул после
размораживания, Увеличение х 400
Разрыв базальной мембраны – 4
фолликула (2,5%)
Мониторинг уровня эстрадиола
после трансплантации
овариальной ткани
№1
№2
№3
№4
1 мес.
1,5 мес.
2,5 мес.
3 мес.
3,5 мес.
1,7
pg/ml
1,9
pg/ml
3,0
pg/ml
2,4
pg/ml
4,0
pg/ml
3,0
pg/ml
7,4
pg/ml
5,5
pg/ml
19,2
pg/ml
20,6
pg/ml
25,3
pg/ml
26,8
pg/ml
28,7
pg/ml
32,5
pg/ml
35,2
pg/ml
29,3
pg/ml
34,5
pg/ml
41,2
pg/ml
38,1
pg/ml
33,0
pg/ml
Стимуляция фолликулогенеза
(350 ЕД Пурегона)
Живот
ное/де
нь
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
№1
25
25
25
25
25
25
50
50
50
50
Е2,
34,5
37.4
41.2
62.0
pg/ml
№2
25
Е2,
41.2
25
25
25
25
45.0
25
50
50
50
49.1
50
64.3
pg/ml
№3
25
Е2,
38.1
25
25
25
25
42.6
25
50
50
50
44.8
50
57.1
pg/ml
№4
25
Е2,
33.0
pg/ml
25
25
25
37.1
25
25
43.9
50
50
50
50
59.2
Результаты лапаротомии
Животное №1:
фолликулы 3-5 мм № 4
6-8 мм № 2
10-12 мм №2
Животное №2:
фолликулы 3-5 мм № 5
6-8 мм № 2
10-12 мм №2
Животное №3:
фолликулы 3-5 мм № 3
6-8 мм № 1
Животное №4:
фолликулы 3-5 мм № 6
6-8 мм № 1
Выводы:
• Предложенный усовершенствованный
метод витрификации овариальной
ткани позволяет сохранить 93 %
фолликулов нормальной морфологии
• Жизнеспособность овариальной ткани
подтверждена методом
культивирования
Выводы:
• После ксенотрансплантации размороженной
овариальной ткани лабораторным животным
подтверждено восстановление эндокринной
функции.
Констатирован факт роста фолликулов в
ответ на стимуляцию гонадотропными
гормонами , что подтверждает
эффективность данной методики.
Перспектива дальнейших
исследований
Отработка методики
витрификации/размораживания,
трансплантации овариальной ткани,
экстраполяция результатов
исследования в клиническую практику
Благодарю
Благодарю
за
за
внимание!
внимание!
Феськов В.А.
К.б.н., с.н.с. Сомова Е.В.
К.б.н. Сотник Н.А.
Тищенко А.А.
Жилкова Е.С.
Егунькова Е.В.
Михайлова Е.В.
Клеймёнова Е.А.