На правах рукописи ВЛИЯНИЕ ШАПЕРОНОВ И КРАУДИНГА НА
реклама
На правах рукописи
РОМАН СВЕТЛАНА ГЕОРГИЕВНА
ВЛИЯНИЕ ШАПЕРОНОВ И КРАУДИНГА
НА АГРЕГАЦИЮ БЕЛКОВ
03.01.02 − биофизика
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание учёной степени
кандидата физико-математических наук
Москва − 2012
Работа выполнена в отделе структурной биохимии белка Федерального государственного
бюджетного учреждения науки Института биохимии имени А.Н.Баха Российской академии
наук и на кафедре биофизики физического факультета Московского государственного
университета имени М.В. Ломоносова.
Научные руководители:
доктор биологических наук, Чеботарева Наталья Александровна
доктор биологических наук, профессор Шноль Симон Эльевич
Официальные оппоненты:
Лобышев
Валентин
Иванович,
доктор
физико-математических
наук,
профессор,
заведующий кафедрой физики Специализированного учебно-научного центра МГУ имени
М.В. Ломоносова
Ротанова Татьяна Васильевна, доктор химических наук, профессор, ведущий научный
сотрудник
лаборатории
химии
протеолитических
ферментов
Федерального
государственного бюджетного учреждения науки Института биоорганической химии имени
М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук
Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное образовательное
учреждение высшего профессионального образования «Российский университет дружбы
народов»
Защита состоится «19» апреля 2012 года в 14 часов на заседании диссертационного
совета
Д501.001.96
при
Московском
государственном
университете
имени
М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Россия, Москва, Ленинские горы 1/12, МГУ,
биологический факультет, кафедра биофизики, «Новая» аудитория.
С
диссертацией
можно
ознакомиться
в
библиотеке
биологического
факультета
Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова.
Автореферат разослан «12» марта 2012 года
Учёный секретарь диссертационного совета
доктор биологических наук
М.Г. Страховская
2
Общая характеристика работы
Актуальность исследований
Исследование проблемы агрегации белков представляет собой одно из актуальных
направлений
современной
биологии.
Агрегация
белков
–
процесс,
постоянно
происходящий в клетке. Каждый белок отличает только ему присущая трехмерная
структура. И будучи в этой, называемой нативной, конформации белок может правильно
функционировать. Однако генетические мутации и ошибки при синтезе белков на
рибосоме могут приводить к образованию неправильно свернутых белковых структур.
Даже для нативных белков всегда существует вероятность частичного разворачивания,
особенно в условиях стресса (например, теплового, окислительного или осмотического).
При нарушении нативной структуры белки становятся функционально неактивными,
менее стабильными и склонны агрегировать, что может приводить к широкому спектру
патологических состояний клетки и целого организма. Агрегации ненативных белков
способствует содержание большого количества внутриклеточных макромолекул (белки,
липиды, полисахариды), так называемые условия молекулярного краудинга (crowding). В
совокупности макромолекулы, присутствующие в клетке, занимают значительную часть
ее объема (до 40%), вследствие чего доступный объем в клетке (жидкая среда)
сокращается. Показано, что условия молекулярного краудинга влияют на кинетику
клеточных процессов, стимулируя реакции, приводящие к увеличению доступного
объема, в том числе, процессы агрегации белков.
Согласно современным представлениям процесс агрегации белков в клетке не
является неконтролируемым и потому не приводит к катастрофическим последствиям.
Предотвращение агрегации или направление процесса агрегации белков по пути
образования
нетоксичных
агрегатов
осуществляет
система
белков
шаперонов
(chaperones), включающих малые белки теплового шока. Понимание молекулярных
механизмов, лежащих в основе антиагрегационной активности шаперонов и малых
белков
теплового
шока,
чрезвычайно
актуально,
так
как
позволит
объяснить
патологические аспекты так называемых «конформационных» заболеваний человека,
связанных
с
агрегацией
белков
(катаракта,
сахарный
диабет
второго
типа,
нейродегенеративные заболевания).
В настоящее время все предположения о механизме действия шаперонов и малых
белков теплового шока основаны на результатах исследований in vitro, проведенных на
модельных системах в условиях, сильно отличающихся от условий молекулярного
краудинга. Ставится под сомнение, насколько верно эти предположения отражают
3
реальное функционирование этих белков in vivo. Поэтому очень важно в модельных
экспериментах
имитировать
условия
краудинга,
добавляя
высокие
концентрации
краудинг-агентов к изучаемой системе. При этом для понимания детального механизма
антиагрегационного действия шаперонов и малых белков теплового шока важно
разрабатывать такие тест-системы, которые позволяют прямое наблюдение их влияния
на процесс агрегации ненативных белков.
Кроме того, актуально сопоставление механизмов действия белковых шаперонов и
так
называемых
«химических
шаперонов»,
например
пролина.
Пролин
–
это
низкомолекулярное соединение, для которого показано его стимулирующее действие на
ренатурацию различных белков. Однако какой вклад в повышение ренатурации белков
под действием пролина составляет ингибирование процесса агрегации пролином,
остается невыясненным.
Цель и задачи исследований
Целью настоящей работы было изучение механизма защитного действия шаперонов
на тепловую агрегацию мышечной гликогенфосфорилазы b и изучение влияния краудинга
на агрегацию белков и антиагрегационную активность малых белков теплового шока (на
примере α-кристаллина). В соответствии с данной целью были поставлены следующие
задачи:
1. изучить влияние GroEL и пролина на тепловую денатурацию и агрегацию
гликогенфосфорилазы b,
2. разработать на основе УФ-облученной гликогенфосфорилазы b тест-систему, с
использованием которой можно изучать влияние различных агентов непосредственно на
стадию агрегации белковых молекул,
3. с использованием тест-системы, основанной на агрегации УФ-облученной
гликогенфосфорилазы b, изучить влияние пролина, α-кристаллина и краудинга на
процесс агрегации и влияние краудинга на антиагрегационную активность α-кристаллина.
Для
выполнения
экспериментальные
сканирующая
поставленных
методы:
калориметрия,
задач
динамическое
скоростная
были
использованы
светорассеяние,
седиментация,
следующие
дифференциальная
гель-фильтрация
и
электрофорез.
Научная новизна
Предложена новая тест-система для испытания агентов, оказывающих влияние на
агрегацию
белков.
Система
основана
на
агрегации
гликогенфосфорилазы
b,
денатурированной УФ излучением. В отличие от тест-систем, предложенных ранее в
4
литературе (тепловая агрегация; агрегация, сопровождающая рефолдинг; агрегация,
индуцируемая низкими концентрациями гуанидингидрохлорида и мочевины, и др.), новая
тест-система позволяет исследовать влияние изучаемых агентов непосредственно на
стадию агрегации белковых молекул. С использованием тест-системы, основанной на
агрегации
УФ-облученной
гликогенфосфорилазы
b,
впервые
экспериментально
продемонстрированы стимулирующее действие краудинга на стадии агрегации белков и
способность
пролина
подавлять
агрегацию
белков.
Экспериментально
доказано
образование в условиях краудинга двух типов комплексов α-кристаллина с белковым
субстратом: высокомолекулярных комплексов, агрегация которых усиливается в условиях
краудинга, что приводит к уменьшению антиагрегационной активности α-кристаллина в
присутствии краудинг-агентов, и комплексов, которые включают диссоциированные
формы α-кристаллина и проявляют меньшую склонность к агрегации в условиях
краудинга.
Практическая значимость работы
Выполненные исследования имеют фундаментальное значение, поскольку при
изучении закономерностей функционирования живых систем необходимо учитывать то
обстоятельство, что все процессы в клетке протекают в условиях краудинга. Согласно
современным представлениям малые белки теплового шока играют важную роль в
регуляции внутриклеточных процессов, и это позволяет рассматривать их в качестве
перспективных терапевтических агентов при лечении заболеваний, развитие которых
сопровождается образованием белковых агрегатов (катаракта, нейродегенеративные и
другие заболевания). Проведенные исследования особенностей функционирования
малых белков теплового шока в условиях, приближенных к физиологическим, позволяют
более детально охарактеризовать клеточные регуляторные механизмы, реализующиеся с
участием малых белков теплового шока.
Разработанная
на
основе
агрегации
УФ-облученного
белка
тест-система
представляет практическую ценность для поиска агентов, способных эффективно
подавлять агрегацию белков. Агенты с подобными свойствами находят применение при
решении биотехнологических задач, в частности, при разработке методов стабилизации
белковых препаратов медицинского назначения.
Апробация результатов работы
Результаты
работы
были
представлены
на
XV
Международной
научной
конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов – 2008», (Москва,
2008), 19-ом Международном симпозиуме по аналитическому ультрацентрифугированию
5
(Уппсала, 2009), VIII Международной конференции «Проблемы биологической физики»
(Москва, 2009), V Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Петрозаводск, 2011) и
Ежегодной научной конференции ИНБИ РАН (Москва, 2011).
По материалам диссертации опубликовано 7 работ, из них 3 публикации в
рецензируемых журналах из Перечня ВАК и 4 − тезисы в трудах российских и
международных конференций.
Структура и объем диссертации
Диссертация состоит из введения, пяти глав, заключения и выводов, списка
литературы (215 наименований) и приложения. Работа изложена на 129 страницах,
включает 48 рисунков и 4 таблицы.
Краткое содержание работы
Введение
Во
введении
дано
обоснование
темы
диссертационной
работы,
показана
актуальность рассматриваемой проблемы, сформулированы цели исследований.
Глава 1. Обзор литературы
Раздел
1.1
посвящен
обзору
литературы
в
области
теоретических
и
экспериментальных исследований молекулярного краудинга. В разделе 1.2 приведены
экспериментальные данные о структуре и свойствах белкового шаперона GroEL и малого
белка
теплового
шока
α-кристаллина
и
данные
о
существующих
моделях
их
функционирования. Раздел 1.3 освещает известные экспериментальные данные о
действии пролина как «химического шаперона». В разделе 1.4 дано описание структуры и
свойств мышечной гликогенфосфорилазы b, модель ее агрегации при повышенной
температуре
и
механизм
действия
α-кристаллина
на
тепловую
агрегацию
гликогенфосфорилазы b.
Глава 2. Материалы и методы
Гликогенфосфорилазу b (Phb) из скелетных мышц кролика выделяли по методу
Фишера и Кребса (Fisher and Krebs, 1962) с некоторыми модификациями. GroEL был
любезно предоставлен к.б.н. И.Н. Налетовой (отдел биохимии животной клетки, Институт
физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского МГУ имени М.В. Ломоносова). αКристаллин был любезно предоставлен к.б.н. Н.Б. Полянским (лаборатория физикохимических основ рецепции, Институт биохимической физики имени М.Н. Эмануэля РАН).
Молярные концентрации белков в тексте диссертации указаны в расчете на следующие
6
массы: для Phb – 97.4 кДа, для α-кристаллина – 20 кДа, для GroEL – 800 кДа.
Значения коэффициентов преломления растворов измеряли на рефрактометре
ИРФ-22 (Россия). Плотность растворов измеряли на плотномере DMA 4500 (Anton Paar,
Австрия). Динамическую вязкость растворов измеряли на микровискозиметре «Anton
Paar» (Австрия).
Ферментативную активность Phb в направлении синтеза гликогена определяли
турбидиметрическим методом, предложенным в работе (Sugrobova et al., 1983).
Облучение Phb проводили в 1-см термостатируемой кварцевой кювете при 10 °С
светом от ртутно-кварцевой лампы ДРК-120 (ОИ-18А, Россия), с выделенным диапазоном
длин волн 270−390 нм.
Калориметрические исследования проводили совместно с к.б.н. С.Ю. Клейменовым
(лаборатория молекулярной организации биологических структур, Институт биохимии
имени
А.Н.
Баха
РАН)
на
дифференциальном
адиабатическом
сканирующем
микрокалориметре ДАСМ-4М (Институт биологического приборостроения РАН, Пущино,
Россия) с капиллярными платиновыми ячейками при постоянном давлении 2.2
атмосферы. Скорость прогрева в экспериментах по изучению действия пролина и УФ
облучения на тепловую денатурацию Phb составляла 1 °С/мин, в экспериментах по
изучению действия GroEL – 2 °C/мин.
Эксперименты
по
скоростной
седиментации
проводили
на
аналитической
ультрацентрифуге «Spinco E» (Beckman, США), с использованием абсорбционной
оптической
сканирующей
системы
при
длине
волны
280
нм.
Коэффициенты
седиментации рассчитывали с помощью программы SEDFIT (Schuck, 2000; Brown and
Schuck, 2006). Полученные коэффициенты седиментации приводили к стандартным
условиям (растворитель с плотностью и вязкостью воды при 20 °C), как было описано
ранее (Kurganov et al., 2000).
Кинетику агрегации Phb в буферном растворе в отсутствие и в присутствии
шаперонов
или
краудинг-агентов
изучали
методом
динамического
лазерного
светорассеяния (ДЛС). Измерения проводили на установке Photocor (Photocor Instruments
Inc., США) с He-Ne лазером, мощностью 10 мВт и длиной волны падающего света 632.8
нм, в качестве источника света (Coherent, США, модель 31-2082). Температура образцов
поддерживалась
при
помощи
пропорционально-интегрально-дифференциального
регулятора температуры в пределах ±0.1 °С. Измерения проводили под фиксированным
углом рассеяния 90°. Корреляционные функции исследовали с помощью программы
полидисперсного анализа DynaLS (Alango, Израиль).
Степень чистоты белков и белковый состав агрегатов Phb в буферном растворе в
7
отсутствие и в присутствии α-кристаллина или краудинг-агентов проверяли методом
электрофореза в 12.5 % ПААГ в присутствии ДДС-Na по методу Лэммли (Laemmli, 1970).
Гель-фильтрационные исследования проводили совместно с д.б.н. К.О. Мурановым
и к.б.н. Н.Б. Полянским (лаборатория физико-химических основ рецепции, Институт
биохимической физики физики имени М.Н. Эмануэля РАН) при 20 °С и скорости элюции
1.3 мл/мин.
Глава 3. Влияние GroEL и пролина на тепловую агрегацию Phb
3.1 Влияние GroEL на тепловую агрегацию Phb
Кинетику агрегации Phb и GroEL и их смеси изучали методом ДЛС при 48 °С.
Агрегация Phb проявляется в увеличении интенсивности рассеянного света (I) во
времени (t). Рис. 1А демонстрирует подавление агрегации Phb под действием GroEL.
Падение интенсивности при больших временах вызвано оседанием агрегатов большого
размера на дно кюветы. Как видно из рис. 1А, основной эффект GroEL проявляется в
увеличении промежутка времени, в течение которого агрегация белковых частиц
продолжается без преципитации.
Для того чтобы охарактеризовать механизм и скорость тепловой агрегации Phb, был
использован подход, разработанный ранее в отделе структурной биохимии белка
Института биохимии РАН для тепловой агрегации Phb (Меремьянин и др., 2007).
Начальные участки зависимости I(t) (рис. 1Б) могут быть описаны следующим
квадратичным уравнением:
Рис. 1. Действие GroEL на агрегацию Phb (1.54 μМ;
80 мM Hepes буфер, рH 6.8; 0.2 мM EDTA, 0.1 M
NaCl) при 48 °С. (А) Зависимости интенсивности
рассеянного света (I) от времени (t), полученные при
следующих концентрациях GroEL: 0 (1), 0.36 μМ (2) и
3.6 μМ (3). (Б) Анализ начальных участков
зависимостей I(t) с помощью уравнения (1).
Зависимости
I(t)
получены
при
следующих
концентрациях GroEL: 0 (1), 0.125 (2), 0.36 (3), 0.72
(4), 1.44 (5) и 3.6 μМ (6). Точками обозначены
экспериментальные данные, сплошные кривые
проведены согласно уравнению (1).
8
I = Kagg (t – t0)2 , t > t0,
где
Kagg
–
параметр,
продолжительность
характеризующий
лаг-периода,
т.е.
начальную
момент
(1)
скорость
времени,
в
агрегации,
который
t0
–
наблюдается
начальный прирост интенсивности светорассеяния. Значения параметров Kagg и t0
приведены в таблице 1. Видно, что длительность лаг-периода возрастает с увеличением
концентрации GroEL, а начальная скорость агрегации, характеризующаяся значением
параметра Kagg, в присутствии GroEL уменьшается.
Таблица 1. Значения параметров, характеризующих процесс агрегации Phb (1.54 μM) при
48 °С в отсутствие и в присутствии GroEL (80 мM Hepes буфер, рH 6.8; 0.2 мM EDTA, 0.1
M NaCl).
Метод
[GroEL],
μM
t 0,
мин
Kagg,
(фотоотсчет/с)/мин2
1/t2R,
мин-1
0
0.125
0.36
0.72
1.44
3.61
2.25 ± 0.05
2.61 ± 0.05
3.4 ± 0.1
4.1 ± 0.1
4.4 ± 0.1
5.0 ± 0.1
(17.7 ± 0.2)⋅103
(5.40 ± 0.04)⋅103
(5.51 ± 0.03)⋅103
(4.98 ± 0.04)⋅103
(3.34 ± 0.03)⋅103
(2.28 ± 0.03)⋅103
2.85 ± 0.07
0.085 ± 0.002
0.055 ± 0.001
0.029 ± 0.001
0.017 ± 0.001
0.011 ± 0.001
ДЛС
позволяет
оценить
гидродинамический
радиус
(Rh)
частиц,
образующихся в ходе агрегации. На рис. 2А показана зависимость значений Rh белковых
частиц от времени для агрегации Phb (1.54 μМ) при 48 °С. Начальный участок этой
зависимости может быть описан линейной функцией:
Rh = Rh,0 {1 + (t – t0)/t2R} , t > t0,
(2)
где Rh,0 – гидродинамический радиус агрегатов в момент начального прироста
интенсивности рассеянного света (т.е. при t = t0), t2R – интервал времени, на протяжении
которого гидродинамический радиус увеличивается от Rh = Rh,0 до Rh = 2Rh,0. Обратное
значение параметра t2R также характеризует скорость агрегации (чем выше величина
1/t2R, тем выше скорость агрегации).
Ранее в работе (Meremyanin et al., 2008) было установлено, что при тепловой
агрегации Phb зависимость Rh(t) становится степенной при определенном значении
времени, обозначенном как t*:
Rh = Rh* {1 + K1(t – t*)}1/df , t > t*,
(3)
где Rh* соответствует значению Rh в момент времени t = t*, K1 – константа с
размерностью мин−1, df – фрактальная размерность агрегатов. При тепловой агрегации
Phb df ≅ 1.8. Фрактальная размерность является структурной характеристикой агрегатов,
9
Рис. 2. Зависимости гидродинамического радиуса
(Rh) белковых частиц от времени (t) при агрегации
Phb (1.54 μМ; 80 мM Hepes буфер, рH 6.8; 0.2 мM
EDTA, 0.1 M NaCl) при 48 °С. (А) Агрегация Phb в
отсутствие GroEL. Сплошная кривая проведена
согласно уравнению (3) для t > 9 мин. На вставке
показан начальный участок зависимости Rh(t);
прямая линия проведена согласно уравнению (2).
(Б) Агрегация Phb в присутствии 0.36 (1) и 1.44 μМ
(2) GroEL. Пунктирная кривая соответствует
зависимости Rh(t) в отсутствие GroEL. Сплошные
кривые проведены согласно уравнению (4).
образующихся в результате неупорядоченных взаимодействий (случайная агрегация).
Теория агрегации коллоидных частиц предсказывает, что величина df, равная 1.8,
свидетельствует о диффузионно-контролируемом кинетическом режиме, при котором
вероятность слипания для сталкивающихся частиц равна единице (diffusion-limited clustercluster aggregation) (Weitz et al., 1985).
В присутствии GroEL рост значений гидродинамических радиусов белковых
агрегатов со временем можно описать экспоненциальным законом. Это указывает на то,
что агрегация протекает в так называемом режиме reaction-limited cluster-cluster
aggregation (Weitz et al., 1985). Включение молекул GroEL в состав агрегатов приводит к
уменьшению количества «липких мест» на их поверхности, и вероятность слипания
сталкивающихся частиц становится меньше единицы. В качестве примера, на рис. 2Б
показаны зависимости Rh(t), полученные при концентрациях GroEL 0.36 и 1.44 μМ ([Phb] =
1.54 μМ).
Экспоненциальный характер зависимостей Rh(t), полученных при агрегации Phb в
присутствии GroEL, был проанализирован с помощью уравнения, предложенного ранее
для описания зависимости Rh(t) при тепловой агрегации Phb в присутствии малого белка
теплового шока, α-кристаллина (Meremyanin et al., 2008):
Rh = Rh,0 [exp { ln2 (t – t0)/t2R}] , t > t0,
(4)
где t2R – интервал времени, на протяжении которого гидродинамический радиус
увеличивается в два раза. Полученные обратные значения параметра t2R для кинетики
тепловой агрегации Phb в отсутствие и в присутствии GroEL приведены в таблице 1.
10
Уменьшение значения 1/t2R при увеличении концентрации GroEL свидетельствует о
подавлении скорости агрегации Phb шапероном. Тот факт, что в присутствии GroEL
значение интенсивности рассеянного света в момент преципитации крупных агрегатов
значительно больше, имеет простое объяснение: присутствующий GroEL вовлекается в
процесс агрегации Phb, приводя к увеличению общего количества белковых агрегатов.
Дополнительная информация о взаимодействии Phb и GroEL при повышенной
температуре была получена методом скоростной седиментации. Этот метод позволяет
изучать олигомерное состояние белков. Известно, что молекула нативной Phb
представляет собой устойчивый димер, состоящий из двух идентичных субъединиц с
молекулярной массой 97.4 кДа. Коэффициент седиментации димера Phb равен 8.8 S (1 S
= 10-13 c). Молекула GroEL состоит из 14 одинаковых субъединиц с молекулярной массой
57 кДа, и, по литературным данным, 14-мер GroEL имеет коэффициент седиментации 22
S. Седиментационные исследования не показали каких-либо изменений в олигомерном
состоянии нативной Phb и GroEL при инкубации смеси этих белков при комнатной
температуре (22 °С). Результаты опытов по скоростной седиментации, проведенных при
46
°С,
представлены
на
рис.
3.
Приведенное
к
стандартным
условиям
дифференциальное распределение по коэффициентам седиментации c(s) для Phb (2.36
μМ) содержит единственный пик со значением коэффициента седиментации 5.3 S, что
Рис. 3. Седиментационное поведение Phb, GroEL и
смеси этих белков при 46 °С (80 мM Hepes буфер,
рH 6.8; 0.2 мM EDTA, 0.1 M NaCl). (А)
Распределение c(s) для 2.36 μМ Phb. На вставке
показано соответствующее распределение с(М). (Б)
Распределение c(s) для 2.22 μМ GroEL. (В)
Распределения c(s) для смеси 2.22 μМ GroEL и Phb,
взятой в концентрации 1.18 μМ (сплошная кривая) и
2.36 μМ (пунктирная кривая). Растворы Phb, GroEL и
их смеси были предварительно прогреты в течение
4 ч при 46 °С до опыта. Опыт проведен при 46 °С.
Все распределения c(s) приведены к стандартным
условиям. Скорость вращения ротора 48000 об/мин.
Числа возле кривых соответствуют значениям
коэффициентов седиментации.
11
соответствует
мономерам
Phb
(рис.
3А).
Минорные
пики
с
коэффициентами
седиментации 5.2 S и 7.7 S на распределении c(s) для GroEL (2.22 μМ, рис. 3Б)
соответствуют небольшим олигомерным формам GroEL, тогда как основной пик с
коэффициентом седиментации 25.9 S может соответствовать комплексу 14-мера GroEL с
продуктами диссоциации GroEL, частично развернутыми в результате действия
повышенной температуры. Стоит отметить, что, согласно данным кругового дихроизма,
при равномерном повышении температуры с постоянной скоростью (1 °С/мин)
температура полуперехода GroEL из олигомерного состояния в мономерную форму
составлет 46 °С (Сурин и др., 1999). На рис. 3В представлено седиментационное
поведение смеси GroEL (2.22 μМ) и Phb (1.18 и 2.36 μМ). Пик с коэффициентом
седиментации 8.0 S, наблюдаемый на обоих распределениях c(s) для смеси Phb/GroEL,
полученных при двух различных концентрациях Phb, скорее всего, соответствует
комплексам денатурированных мономеров Phb с продуктами диссоциации GroEL. Это
предположение подтверждает и тот факт, что амплитуда этого пика возрастает, в то
время как амплитуда основного пика GroEL уменьшается, с увеличением концентрации
Phb.
Обнаруженные
денатурированными
комплексы
молекулами
между
Phb
диссоциированными
проявляют
формами
относительную
GroEL
и
устойчивость
к
агрегации, и поэтому их образование вносит дополнительный вклад в замедление
процесса тепловой агрегации Phb в присутствии GroEL.
3.2 Влияние пролина на тепловую агрегацию Phb
Методом ДЛС было изучено влияние пролина на тепловую агрегацию Phb. На рис. 4
представлены зависимости I(t) для агрегации Phb при 48 °C в отсутствие и в присутствии
пролина. Как видно из этого рисунка, пролин (0.3–1 М) подавляет рост интенсивности
светорассеяния (кривые 2–4). Анализ зависимостей I(t) для различных концентраций
пролина показал, что начальные участки этих зависимостей так же, как и в случае
тепловой агрегации Phb в присутствии GroEL, могут быть описаны уравнением (1).
Рассчитанные значения параметров Kagg и t0 представлены в таблице 2.
Рис. 4. Кинетика тепловой агрегации Phb (3.0 μМ; 80
мM Hepes буфер, pH 6.8; 0.2 мM ЭДТА, 0.1 M NaCl) при
48 °C. Зависимости интенсивности светорассеяния (I)
от времени (t) в отсутствие пролина (1) и в присутствии
различных концентраций пролина: 0.3 (2), 0.6 (3) и 1.0
M (4).
12
Таблица 2. Значения параметров, характеризующих процесс агрегации Phb (3.0 μM) при
48 °С в отсутствие и в присутствии пролина (80 мM Hepes буфер, pH 6.8; 0.2 мM ЭДТА,
0.1 M NaCl).
[Пролин],
М
0
0.3
0.6
1.0
t 0,
мин
2.8 ± 0.1
4.2 ± 0.1
4.7 ± 0.1
4.5 ± 0.1
Kagg,
(фотоотсчет/с)/мин2
(11.6 ± 0.2)⋅103
(7.81 ± 0.07)⋅103
(4.14 ± 0.08)⋅103
(1.68 ± 0.08)⋅103
1/t2R,
мин-1
df
1.63 ± 0.07
2.02 ± 0.08
1.76 ± 0.07
2.12 ± 0.08
1.79 ± 0.02
1.81 ± 0.02
1.79 ± 0.02
1.80 ± 0.02
Начальные участки зависимостей Rh(t) при агрегации Phb (48 °С) в присутствии
пролина остаются линейными, и агрегация протекает в диффузионно-контролируемом
режиме, на что указывают рассчитанные с помощью уравнения (3) значения фрактальной
размерности агрегатов, df. Значения 1/t2R и df приведены в таблице 2. Видно, что в
отличие от GroEL пролин не оказывает сильного эффекта на начальную скорость
агрегации (значение параметра 1/t2R).
Так как механизм разворачивания молекулы Phb, вызванного высокой температурой,
включает в себя стадию обратимой диссоциации димера Phb на мономеры, то
представляло интерес изучить влияние пролина на эту стадию. Изучение олигомерного
состояния Phb при инкубации фермента при 48 °С в отсутствие и в присутствии пролина
методом скоростной седиментации показало, что пролин препятствует диссоциации Phb,
вызываемой повышением температуры. На рис. 5А показано распределение c(s, f/f0),
полученное для Phb, когда время инкубации фермента в отсутствие пролина при 48°С
составляло
2.5
ч.
Из
рисунка
видно,
что
значительная
доля
фермента,
Рис. 5.
Дифференциальные распределения по
коэффициентам седиментации, c(s, f/f0) и c(s), для Phb
(4.1 μМ; 80 мM Hepes буфер, pH 6.8; 0.2 мM ЭДТА, 0.1
M NaCl), прогретой в течение 2.5 ч в отсутствие
пролина (А) и в присутствии 1 М пролина (Б) при 48 °С.
Распределения приведены к стандартным условиям. В
случае распределения c(s, f/f0) (А) представлено
главное распределение, c(s,*). Скорость вращения
ротора
48000
об/мин.
Числа
возле
кривых
соответствуют
значениям
коэффициентов
седиментации.
13
седиментирующего при скорости вращения ротора 48000 об/мин, находится в виде
мономеров. При инкубации Phb в этих же условиях в присутствии пролина (рис. 5Б)
большая часть фермента остается в виде димерной формы. При изучении влияния
пролина на тепловую денатурацию Phb методом ДСК было показано, что пролин в
высоких концентрациях (более 1 М) повышает температуру максимума теплового
перехода Phb с 58.2 до 59.5 °C. Это означает, что высокие концентрации пролина
оказывают стабилизирующий эффект на тепловую денатурацию Phb.
Таким образом, видимое по подавлению интенсивности светорассеяния замедление
процесса агрегации Phb в присутствии пролина происходит преимущественно в
результате действия пролина на стадии, предшествующие стадии собственно белковой
агрегации, а именно стадии диссоциации димеров Phb на мономеры и последующей
денатурации мономеров, что не позволяет однозначно судить о действии пролина на
стадию агрегации белков. Поэтому в дальнейших исследованиях было предложено
использовать
тест-систему,
основанную
на
агрегации
Phb,
предварительно
денатурированной действием ультрафиолетового света.
Глава 4. Влияние α-кристаллина и пролина на агрегацию УФ-облученной Phb
4.1 Характеристика УФ-облученной Phb (УФ-Phb)
Раствор Phb с концентрацией белка 15.4 μМ облучали до получения суммарной
дозы 13.5 Дж/см2. Было показано, что при этой дозе молекулы Phb не имели
ферментативной активности и практически полностью утрачивали нативную структуру
(рис. 6).
Рис. 6. Индуцированная ультрафиолетовым светом денатурация Phb (15.4 μМ; 80 мM Hepes
буфер, pH 6.8; 0.1 M NaCl). (А) Зависимость относительной ферментативной активности (А/А0, А0
– значение ферментативной активности необлученной Phb) от дозы УФ облучения (D). Измерение
активности было проведено при 30 °С. Точками обозначены экспериментальные данные,
сплошная кривая проведена согласно уравнению A/A0=exp(–kD). (Б) Зависимость избыточной
теплоемкости (Cpex) от температуры для необлученной Phb (1) и Phb, получившей следующие
дозы УФ облучения: 2.4 (2), 5.9 (3), 13.5 (4) и 27 Дж/см2 (5). Cpex была рассчитана на димер Phb с
молекулярной массой 194.8 кДа. Скорость нагрева 1 °С/мин.
14
Методом ДЛС было установлено, что денатурированные в ходе УФ облучения
молекулы Phb образуют частицы относительно небольшого размера, со средним
значением Rh, равным 10.4 нм (20 °С, рис. 7). Было установлено, что размер этих частиц
остается неизменным в течение как минимум 2 ч при 20 °С.
Рис. 7. Распределение белковых частиц по
размерам для УФ-Phb (15.4 μМ; 80 мM Hepes
буфере, pH 6.8; 0.1 M NaCl; D = 13.5 Дж/см2) при 20
°С.
4.2 Влияние α-кристаллина на агрегацию УФ-облученной Phb
Для проверки антиагрегационной активности α-кристаллина на новой тест-системе
была индуцирована агрегация УФ-Phb повышением температуры до 37 °С. Из
литературных данных известно, что антиагрегационная активность α-кристаллина
зависит от температуры и максимальна при температурах, близких к физиологической (37
°С). На рис. 8А представлены зависимости I(t) для агрегации УФ-Phb (1.5 μМ) в отсутствие
и в присутствии различных концентраций α-кристаллина. Видно, что защитное действие
α-кристаллина увеличивается с его концентрацией. При сравнении значений Rh белковых
агрегатов, обнаруживаемых в отсутствие и в присутствии α-кристаллина (7.5 μМ), было
Рис. 8. Защитное действие α-кристаллина при агрегации УФ-Phb (1.5 μМ; 80 мM Hepes буфер, pH
6.8; 0.1 M NaCl; D = 13.5 Дж/см2) при 37 °С. (А) Зависимости интенсивности рассеянного света (I)
от времени (t) при концентрациях α-кристаллина 0 (1), 3.8 (2), 7.5 (3) и 50 μМ (4). На вставке
показана зависимость I(t) для агрегации УФ-Phb в присутствии 7.5 μМ α-кристаллина. (Б)
Зависимость гидродинамического радиуса (Rh) белковых агрегатов от времени в присутствии 7.5
μМ α-кристаллина. Пунктирная кривая соответствует агрегации 1.5 μМ УФ-Phb в отсутствие αкристаллина. (В) 1 – необлученная Phb; 2 – смесь УФ-Phb/α-кристаллин до прогрева; 3 и 4 –
супернатант и осадок прогретого раствора α-кристаллина, соответственно; 5 и 6 – супернатант и
осадок прогретого раствора УФ-Phb, соответственно; 7 и 8 – супернатант и осадок прогретого
раствора смеси УФ-Phb/α-кристаллин, соответственно. Условия прогревания: 5 ч при 37 °С. Во
всех образцах [УФ-Phb] = 1.5 μМ и [α-кристаллин] = 7.5 μМ.
15
установлено, что в присутствии α-кристаллина образуются агрегаты меньшего размера
(рис. 8Б). Стоит отметить, что при агрегации УФ-Phb в присутствии α-кристаллина
наблюдается расщепление зависимости Rh(t) на две ветви. Например, при концентрации
α-кристаллина 7.5 μМ подобное расщепление становится заметным спустя 30 мин (рис.
8Б). Значения Rh для агрегатов малого размера возрастают с 12 до 25 нм за временной
промежуток 40–400 мин, тогда как значения Rh для агрегатов большего размера
увеличивается с 40 до 160 нм за тот же промежуток времени.
Для
анализа
белкового
состава
обнаруженных
двух
типов
агрегатов
был
использован метод электрофореза. При инкубации смеси УФ-Phb/α-кристаллин при 37 °С
в течение 5 ч образуются достаточно крупные агрегаты, относящиеся к верхней ветви
зависимости Rh(t) (см. рис. 8Б), которые могут быть осаждены центрифугированием. При
инкубации УФ-Phb в отсутствие α-кристаллина практически весь белок осаждается (рис.
8В, полоса 6), тогда как α-кристаллин при прогревании в аналогичных условиях остается
в растворе (рис. 8В, полоса 3). Полосы 7 и 8 на рис. 8В соответствуют супернатанту и
осадку прогретой смеси УФ-Phb/α-кристаллин. Как можно видеть на полосе 8, помимо УФPhb осадок содержит α-кристаллин. Это позволяет предположить, что α-кристаллин
входит в состав нерастворимых крупных агрегатов.
Методом
аналитической
гель-фильтрации
были
разделены
компоненты,
присутствующие в смеси УФ-Phb и α-кристаллина, прогретой в течение 1 ч при 37 °С.
После осаждения тяжелых агрегатов центрифугированием надосадочный раствор (6 мл)
нанесли на колонку. Из данных электрофореза в ПААГ следует, что основной пик (2) на
рис. 9А, для которого среднее значение молекулярной массы близко к 800 кДа,
соответствует свободному α-кристаллину (рис. 9Б, полоса 5). Это согласуется с
литературными данными, указывающими на то, что α-кристаллин существует в виде
полидисперсного набора крупных олигомеров с различным количеством субъединиц. На
основании результатов электрофореза можно сделать вывод, что пики 1, 3 и 4
соответствуют комплексам УФ-Phb с α-кристаллином (полосы 4, 6 и 7 на рис. 9Б,
соответственно). Осадок, образовавшийся при прогревании смеси α-кристаллина и УФPhb, также содержит не только фосфорилазу, но и α-кристаллин (рис. 9Б, полоса 3). Эти
данные указывают на то, что взаимодействие между УФ-Phb и α-кристаллином может
приводить к образованию нерастворимых агрегатов, содержащих оба белка.
Дополнительная информация о комплексах α-кристаллина и УФ-Phb была получена
методом
скоростной
седиментации.
На
рис.
10
представлены
приведенные
к
стандартным условиям распределения c(s) для α-кристаллина и его смеси с УФ-Phb,
16
Рис.
9.
(А)
Аналитическая
гель-фильтрация
супернатанта смеси α-кристаллина (50 μМ) и УФ-Phb (10
μМ; 80 мM Hepes буфер, pH 6.8; 0.1 M NaCl; D = 13.5
Дж/см2), прогретой в течение 1 ч при 37 °С.
Нерастворимые агрегаты осадили центрифугированием
при 14500 g, супернатант нанесли на колонку (общий
объем раствора, нанесенного на колонку, составлял 6
мл). Стрелки указывают на времена элюции нативной
Phb и α-кристаллина. (Б) Электрофорез УФ-Phb, αкристаллина и их смеси в 12.5 % ПААГ в присутствии
ДДС-Na: 1 – α-кристаллин; 2 – нативная Phb; 3 – осадок
прогретой смеси α-кристаллина и УФ-Phb; 4–7 – пики 1–
4, соответственно. Слева от полосы 1 указаны
молекулярные
массы
стандартных
белков
(в
килодальтонах).
прогретой в течение 4 ч при 37 °С. Распределение c(s) для УФ-Phb отсутствует, т.к. после
такого прогрева облученный белок оседал в процессе ускорения ротора. Распределение
c(s) для α-кристаллина содержит пики с коэффициентами седиментации 20 и 25.1 S. В
смеси
α-кристаллин/УФ-Phb
были
обнаружены
четыре
пика
со
следующими
коэффициентами седиментации: 9.6, 18.1, 21.0 и 26.0 S. При сравнении распределений
c(s) для α-кристаллина и его смеси с УФ-Phb можно заключить, что пики на
распределении c(s) для смеси соответствуют, главным образом, комплексам αкристаллина с облученным белком. Наличие пика с коэффициентом седиментации 9.6 S
указывает
на
существование
комплекса,
образованного
денатурированной
фосфорилазой с диссоциированными формами α-кристаллина. Нельзя также исключить
Рис. 10. Взаимодействие α-кристаллина с УФ-Phb
(80 мM Hepes буфер, pH 6.8; 0.1 M NaCl; D = 13.5
Дж/см2). Дифференциальные распределения по
коэффициентам седиментации, c(s), были получены
для 8.5 μМ α-кристаллина и его смеси с 8.2 μМ УФPhb при 37 °С и приведены к стандартным
условиям. Все образцы были прогреты в течение 4 ч
до опыта при 37 °С. Скорость вращения ротора
40000 об/мин. Числа возле кривых соответствуют
значениям коэффициентов седиментации.
17
того, что пики с коэффициентами седиментации 18.1 и 21.0 S содержат помимо
комплексов УФ-Phb–α-кристаллин небольшое количество свободного α-кристаллина.
На основании результатов скоростной седиментации и аналитической гельфильтрации смеси УФ-Phb и α-кристаллина, инкубированных в течение некоторого
промежутка времени при 37 °С (рис. 9 и 10), и данных по кинетике агрегации УФ-Phb в
присутствии α-кристаллина (рис. 8), предлагается следующая схема взаимодействия αкристаллина с белком-мишенью:
Схема 1.
Предполагается, что добавление α-кристаллина (α) к белку-мишени (первичные агрегаты
УФ-Phb; Р) приводит к быстрому образованию комплекса (α⋅Р)* (комплекс I). Хорошо
известно, что α-кристаллин обладает динамичной четвертичной структурой и олигомеры
α-кристаллина могут свободно обмениваться субъединицами. Благодаря высокой
подвижности α-кристаллина комплекс I неустойчив и претерпевает структурные
изменения, приводящие к образованию двух типов комплексов: комплексу αi⋅p,
состоящему из диссоциированных форм α-кристаллина, αi, и диссоциированных форм
белка-мишени p (на схеме 1 этот тип комплексов обозначен как комплекс II), и
высокомолекулярному водорастворимому комплексу α-кристаллин−белок-мишень, α⋅Р
(комплекс III). Комплекс II (αi⋅p) достаточно стабилен и не склонен к агрегации; комплекс III
(α⋅Р), напротив, склонен агрегировать, и агрегация этого комплекса объясняет появление
больших агрегатов, размер которых монотонно увеличивается со временем (верхняя
ветвь зависимости Rh(t), рис. 8Б). При достижении размеров порядка нескольких
микрометров эти агрегаты оседают. Комплекс (α⋅Р)n (комплекс IV на схеме 1)
соответствует оседающим агрегатам.
4.3 Влияние пролина на агрегацию УФ-облученной Phb
На тест-системе, основанной на агрегации УФ-Phb, была проверена способность
пролина подавлять агрегацию белков. На рис. 11 показаны зависимости I(t) при агрегации
УФ-Phb при 37 °С в отсутствие и в присутствии 1 М пролина. Видно, что пролин
18
подавляет агрегацию УФ-Phb. Таким образом, новая тест-система позволила наблюдать
ингибирующее действие пролина на стадию агрегации денатурированного белка.
Рис. 11. Зависимость интенсивности рассеянного света
(I) от времени (t) для агрегации УФ-Phb (1.5 μМ; 80 мM
Hepes буфер, pH 6.8; 0.1 M NaCl; доза УФ облучения D
= 13.5 Дж/см2) при 37 °С в отсутствии (1) и в
присутствии 1 М пролина (2).
Глава 5. Влияние краудинга на агрегацию УФ-облученной Phb и антиагрегационную
активность α-кристаллина
5.1 Влияние краудинга на агрегацию УФ-облученной Phb
Как уже было отмечено ранее, агрегаты Phb, образующиеся в процессе УФ
облучения, достаточно стабильны при 20 °С. Однако они склонны к быстрой агрегации в
условиях краудинга, создаваемых высокими концентрациями краудинг-агентов различной
природы (рис. 12). Добавление таких широко используемых для создания условий
краудинга in vitro высокомолекулярных соединений, как полиэтиленгликоль (ПЭГ-20000) и
Рис. 12. Действие краудинг-агентов на агрегацию УФ-Phb (3.0 μМ; 80 мM Hepes буфер, pH 6.8; 0.1
M NaCl; доза УФ облучения D = 13.5 Дж/см2) при 20 °С. Зависимости интенсивности рассеянного
света (I) от времени (t) для агрегации УФ-Phb в присутствии ПЭГ-20000 (А), ТМАО (Б), Фиколл70000 (В) и зависимости гидродинамического радиуса (Rh) агрегатов от времени в присутствии
ПЭГ-20000 (Г), ТМАО (Д), Фиколл-70000 (Е). Концентрация ПЭГ-20000 на рис. (А) и (Г): 0 (1), 20
(2), 30 (3) и 40 мг/мл (4). Концентрация ТМАО на рис. (Б) и (Д): 0 (1), 0.5 (2), 0.75 (3) и 1 М (4).
Концентрация Фиколл-70000 на рис. (В) и (Е): 0 (1), 100 (2), 125 (3) и 200 мг/мл (4).
19
Фиколл-70000, и низкомолекулярного соединения − триметиламин N-оксида (ТМАО) −
стимулирует рост интенсивности рассеянного света для раствора УФ-Phb (рис. 12А–В).
Как показывают эксперименты с использованием метода ДЛС, рост интенсивности
вызван образованием крупных агрегатов (рис. 12Г–Е). Гидродинамический радиус (Rh)
агрегатов достигает при этом значений ≥1000 нм. Подобное ускоряющее действие
краудинг-агентов согласуется с теоретическими предсказаниями действия краудинга.
5.2 Влияние краудинга на антиагрегационную активность α-кристаллина
При изучении антиагрегационной активности α-кристаллина в условиях краудинга
методом ДЛС был получен парадоксальный результат. При повышении концентрации
краудинг-агентов в растворе (рис. 13) α-кристаллин утрачивал свою способность
предотвращать агрегацию белка-мишени.
Рис. 13. Действие краудинга, создаваемого
присутствием ПЭГ-20000 (А) или ТМАО (Б), на
антиагрегационную активность α-кристаллина при
37 °С при агрегации УФ-Phb (80 мM Hepes буфер,
pH 6.8; 0.1 M NaCl; D = 13.5 Дж/см2). (А) Зависимости
интенсивности рассеянного света (I) от времени (t)
для агрегации УФ-Phb (1.5 μМ) в отсутствие ПЭГ20000 (1) и в присутствии 20 (2) и 30 мг/мл ПЭГ20000 (3). Кривые 4–6 соответствуют агрегации УФPhb в присутствии α-кристаллина (7.5 μМ) и 0, 20 и
30
мг/мл
ПЭГ-20000,
соответственно.
(Б)
Зависимости I(t) для агрегации УФ-Phb (3.0 μМ) в
отсутствие ТМАО (1) и в присутствии 0.5 (2) и 1 М
ТМАО (3). Кривые 4–6 соответствуют агрегации УФPhb в присутствии α-кристаллина (15.0 μМ) и 0, 0.5 и
1 М ТМАО, соответственно.
Возник вопрос о том, образуются ли в условиях краудинга комплексы УФ-Phb и αкристаллина. Для того чтобы дать ответ на этот вопрос, были проведены эксперименты
по скоростной седиментации. На рис. 14А и 14Б показано седиментационное поведение
α-кристаллина и его смеси с УФ-Phb, прогретой в течение 4 ч при 37 °С в присутствии
краудинг-агентов. Можно предположить, что пики с коэффициентами седиментации 10.1,
15.7, 21.1 и 35.0 S на распределении c(s) для смеси УФ-Phb с α-кристаллином в
присутствии 1 М ТМАО (рис. 14А) соответствуют, главным образом, комплексам αкристаллина с белком-мишенью. Наличие пика с коэффициентом седиментации 10.1 S
20
Рис. 14. Влияние краудинга на взаимодействие УФPhb и α-кристаллина при 37 °С. Распределения c(s)
для α-кристаллина (8.5 μМ) и его смеси с УФ-Phb
(8.2 μМ) в присутствии 1 М ТМАО (А) или 30 мг/мл
ПЭГ-20000 (Б). Все образцы были прогреты в
течение 4 ч до опыта при 37 °С. Опыт проведен при
37 °С. Скорость вращения ротора 40000 об/мин.
Все распределения приведены к стандартным
условиям (20 °С, вода). Числа возле кривых
соответствуют
значениям
коэффициентов
седиментации.
указывает на возможное существование комплекса денатурированной фосфорилазы с
диссоциированными формами α-кристаллина. Эти комплексы образуются и в условиях
краудинга, создаваемых присутствием 30 мг/мл ПЭГ-20000, как следует из наличия пиков
с коэффициентами седиментации 8.9 и 13.7 S на распределении c(s), полученном для
смеси УФ-Phb и α-кристаллина (рис. 14Б). Таким образом, комплексы денатурированной
фосфорилазы с диссоциированными формами α-кристаллина сохраняются после
инкубации смеси α-кристаллин/УФ-Phb в течение 4 ч в условиях краудинга.
Для того чтобы изучить влияние краудинга на комплексы α-кристаллин–белокмишень, были поставлены эксперименты с использованием метода ДЛС, в которых
краудинг-агенты добавляли в раствор, содержащий предварительно сформированные
комплексы УФ-Phb и α-кристаллина. Как видно из рис. 15А, при концентрации αкристаллина 75 μМ, значительно превосходящей концентрацию УФ-Phb (1.5 μМ),
агрегация УФ-Phb при 37 °С полностью подавлена (сравните кривые 1 и 2). Добавление
краудинг-агентов различной химической природы (ПЭГ-20000, ТМАО и Фиколл-70000)
вызывает отчетливо выраженный рост интенсивности светорассеяния. Расчет размера
частиц, присутствующих в смеси УФ-Phb/α-кристаллин/краудинг-агент, показал, что сразу
после добавления краудинг-агента появляются большие агрегаты с радиусом Rh ≈ 130160
нм.
Дальнейшее
слипание
этих
агрегатов
объясняет
наблюдаемый
рост
интенсивности рассеянного света. Типичная картина, наблюдаемая при достаточно
высокой концентрации ПЭГ-20000 (30 мг/мл), представлена на рис. 15Б. Сразу после
добавления краудинг-агента происходит расщепление зависимости Rh(t) на две ветви:
21
Рис. 15. Уменьшение антиагрегационной активности
α-кристаллина
в
условиях
краудинга.
(А)
Зависимости интенсивности рассеянного света (I) от
времени (t) при агрегации УФ-Phb (1.5 μМ; 80 мM
Hepes буфер, pH 6.8; 0.1 M NaCl; D = 13.5 Дж/см2)
при 37 °С в отсутствие (1) и в присутствии 75 μМ αкристаллина (2). На вставке показаны начальные
участки кривых 1 и 2. Кривые 3–5 соответствуют
агрегации УФ-Phb, наблюдаемой в присутствии αкристаллина (75 μМ) после добавления 30 мг/мл
ПЭГ-20000, 1 М ТМАО и 90 мг/мл Фиколл-70000
(указаны конечные концентрации), соответственно.
Стрелкой указан момент добавления краудингагентов. (Б) Средние значения гидродинамических
радиусов частиц, присутствующих в растворе смеси
1.5 μМ УФ-Phb и 75 μМ α-кристаллина при 37 °С.
Стрелкой указан момент добавления ПЭГ-20000 до
конечной концентрации 30 мг/мл.
размер одних белковых частиц начинает быстро расти, тогда как размер других частиц
практически не изменяется (Rh ≈ 12 нм) в течение всего времени наблюдения.
Возникает вопрос, не распадаются ли при добавлении краудинг-агентов комплексы
УФ-Phb–α-кристаллин. На рис. 16А показан профиль гель-фильтрации УФ-Phb в смеси с
избыточной концентрацией α-кристаллина, прогретой при 37 °С в течение 20 мин в
отсутствие ТМАО и затем в течение 10 мин в присутствии 1 М ТМАО. Как и в случае
профиля гель-фильтрации для смеси УФ-Phb и α-кристаллина, полученного в отсутствие
краудинг-агента (рис. 9), основной пик (1) соответствует свободным олигомерам αкристаллина, что следует из данных электрофореза (рис. 16Б, полоса 4). При этом
наблюдаются комплексы УФ-Phb–α-кристаллин меньшие по размеру, чем исходные
олигомеры α-кристаллина (рис. 16А, пик 2). Данные электрофореза (рис. 16Б, полоса 5)
подтверждают тот факт, что оба белка входят в состав этих комплексов. Осадок,
образующийся при прогревании смеси α-кристаллина/УФ-Phb в присутствии краудингагента, также содержит не только фосфорилазу, но и α-кристаллин (рис. 16Б, полоса 3).
Эти данные указывают на то, что в условиях краудинга существуют как растворимые
комплексы УФ-Phb и α-кристаллина, так и комплексы, образующие нерастворимые
агрегаты.
Таким образом, принимая во внимание схему 1, можно утверждать существование
двух типов антиагрегационной активности α-кристаллина. Один путь проявления
22
Рис.
16.
(А)
Аналитическая
гель-фильтрация
супернатанта смеси α-кристаллина (50 μМ) и УФ-Phb (10
μМ), прогретой при 37 °С в течение 20 мин, а затем в
течение еще 10 мин в присутствии 1 М ТМАО.
Нерастворимые агрегаты осадили центрифугированием
при 14500 g, супернатант нанесли на колонку (общий
объем раствора, нанесенного на колонку, составлял 6
мл). Стрелки указывают на времена элюции нативной
Phb и α-кристаллина. (Б) Электрофорез УФ-Phb, αкристаллина и их смеси в 12.5 % ПААГ в присутствии
ДДС-Na: 1 – α-кристаллин; 2 – нативная Phb; 3 – осадок
прогретой смеси α-кристаллина и УФ-Phb; 4 и 5 – пики 1
и 2, соответственно. Слева от полосы 1 указаны
молекулярные
массы
стандартных
белков
(в
килодальтонах).
антиагрегационной
активности
связан
с
образованием
относительно
устойчивых
комплексов αi⋅p (путь 1), тогда как другой путь (путь 2) приводит к образованию
высокомолекулярных комплексов α⋅Р, проявляющих меньшую склонность к агрегации по
сравнению с исходным белком-мишенью в отсутствие краудинг-агентов. Становится
ясным,
что
исчезновение
антиагрегационной
активности
в
условиях
краудинга,
наблюдаемое по светорассеянию (рис. 13), может быть объяснено ускорением агрегации
комплексов α⋅Р. Что касается комплексов αi⋅p, то эти комплексы более устойчивы к
условиям краудинга, как следует из данных скоростной седиментации и аналитической
гель-фильтрации. Таким образом, эффект краудинга на антиагрегационную активность αкристаллина может быть представлен следующей схемой:
Схема 2.
23
Выводы
1. Установлено, что замедление процесса тепловой агрегации гликогенфосфорилазы b в
присутствии белкового шаперона GroEL связано с переходом процесса агрегации из
диффузионно-контролируемого
режима
в
кинетический
режим,
при
котором
вероятность слипания частиц при столкновении становится меньше единицы.
Обнаружено образование относительно устойчивых к агрегации комплексов между
денатурированной гликогенфосфорилазой b и продуктами диссоциации GroEL.
Показано, что подавление тепловой агрегации гликогенфосфорилазы b пролином
частично или полностью обусловлено снижением скорости денатурации белков в
присутствии «химического шаперона».
2. Для исследования влияния различных агентов исключительно на стадию агрегации
белков
предложена
тест-система,
основанная
на
агрегации
УФ-облученной
гликогенфосфорилазы b. На примере этой тест-системы впервые экспериментально
продемонстрированы стимулирующее действие краудинга на стадию агрегации
белков и способность пролина подавлять процесс агрегации.
3. Продемонстрировано уменьшение антиагрегационной активности α-кристаллина в
условиях краудинга. Доказано существование двух типов комплексов между αкристаллином и УФ-облученной гликогенфосфорилазой b: а) высокомолекулярных
комплексов α-кристаллина и УФ-облученной гликогенфосфорилазы b, агрегация
которых усиливается в условиях краудинга, что объясняет наблюдаемое уменьшение
антиагрегационной активности α-кристаллина в присутствии краудинг-агентов, и б)
комплексов, которые включают диссоциированные формы α-кристаллина и проявляют
меньшую склонность к агрегации в условиях краудинга. Предполагается, что
благодаря образованию двух типов комплексов α-кристаллина с белком-мишенью
возможна реализация двух механизмов антиагрегационной активности α-кристаллина,
различающихся по чувствительности к условиям краудинга.
24
Список публикаций по теме диссертации
Статьи в резензируемых журналах:
1. Eronina T.B., Chebotareva N.A., Bazhina S.G., Makeeva V.F., Kleymenov S.Yu., Kurganov
B.I. “Effect of proline on thermal inactivation, denaturation and aggregation of glycogen
phosphorylase b from rabbit skeletal muscle”, Biophysical Chemistry 2009, 141(1):66-74.
2. Eronina T.B., Chebotareva N.A., Bazhina S.G., Kleymenov S.Yu., Naletova I.N., Muronetz
V.I., Kurganov B.I. “Effect of GroEL on thermal aggregation of glycogen phosphorylase b
from rabbit skeletal muscle”, Macromolecular Bioscience 2010, 10(7):768-74.
3. Roman S.G., Chebotareva N.A., Eronina T.B., Kleymenov S.Yu., Makeeva V.F., Poliansky
N.B., Muranov K.O., Kurganov B.I. “Does crowded cell-like environment reduce the
chaperone-like activity of α-crystallin?” Biochemistry 2011, 50(49):10607-23.
Тезисы докладов:
1. Бажина С.Г. “Влияние пролина на тепловую денатурацию, инактивацию и агрегацию
мышечной гликогенфосфорилазы b”. XV Международная научная конференция
студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов – 2008», Москва 2008, стр.28.
2. Bazhina S.G., Eronina T.B., Chebotareva N.A., Kleymenov S.Yu., Naletova I.N., Kurganov
B.I. “Effect of GroEL on thermal aggregation of glycogen phosphorylase b from rabbit
skeletal muscle”. The 18th International AUC conference, Uppsala (Sweden) 2009, p.41.
3. Бажина С.Г., Еронина Т.Б., Чеботарева Н.А., Клейменов С.Ю., Налетова И.Н.,
Курганов Б.И. “Влияние GroEL на тепловую агрегацию гликогенфосфорилазы b из
скелетных
мышц
кролика”.
VIII
Международная
конференция
«Проблемы
биологической физики», Москва 2009, стр.9.
4. Роман С.Г., Чеботарева Н.А., Еронина Т.Б., Макеева В.Ф., Клейменов С.Ю., Филиппов
Д.О.,
Курганов
использованием
Б.И.
“Оценка
тест-системы,
шапероноподобной
основанной
активности
на
α-кристаллина
агрегации
с
облученного
ультрафиолетовым светом белкового субстрата”. V Российский симпозиум «Белки и
пептиды», Петрозаводск 2011, стр. 381.
25
Список использованных сокращений и обозначений:
D – доза облучения ультрафиолетовым светом
I – интенсивность рассеянного света
Phb – гликогенфосфорилаза b
Rh – гидродинамический радиус
ДДС-Na – додецилсульфат натрия
ДЛС – динамическое лазерное светорассеяние
ДСК – дифференциальная сканирующая калориметрия
ПААГ – полиакриламидный гель
ПЭГ-20000 – полиэтиленгликоль с молекулярной массой 20000 Да
ТМАО – триметиламин N-оксид
УФ-Phb – облученная ультрафиолетовым светом гликогенфосфорилаза b
ЭДТА – этилендиаминтетрауксусная кислота
Благодарности
Автор выражает глубокую благодарность своим научным руководителям, д.б.н. Н.А.
Чеботаревой и д.б.н., проф. С.Э. Шнолю, за постоянную помощь в работе и
всестороннюю поддержку. Автор от всей души благодарит д.х.н., проф. Б.И. Курганова за
многочисленные обсуждения результатов работы. Автор признателен к.б.н. Т.Б.
Ерониной
и
к.б.н.
В.Ф.
Макеевой
за
обучение
биохимическим
методам
экспериментальной работы, к.б.н. С.Ю. Клейменову − за помощь в проведении
дифференциальной сканирующей калориметрии, к.б.н. Н.Б. Полянскому и д.б.н. К.О.
Муранову − за сотрудничество в проведении исследований по аналитической гельфильтрации. Автор благодарит д.б.н., проф. Д.И. Левицкого и д.б.н., проф. Б.Я. Гурвиц за
ценные замечания и обсуждение результатов работы.
26
