Иммуноокрашивание – общие принципы

Иммуноокрашивание – общие
принципы
Подгорный Олег
Институт биологии развития
им. Н.К. Кольцова, Москва
Cold Spring Harbor Laboratory, New York
В основе метода иммуноокрашивания
лежит специфическое связывание
антител с антигенами.
www.chemicon.com
Первые публикации об использовании
антител, меченных флуорохромами.
Coons, A. H., Creech, H. J., and Jones, R. N. (1941) Immunological
properties of an antibody containing a fluorescent group. Proc. Soc. Exp.
Biol. Med. 47, 200–202.
Albert H. Coons, Hugh J. Creech, R. Norman Jones and Ernst Berliner The
Demonstration of Pneumococcal Antigen in Tissues by the Use of
Fluorescent Antibody, The Journal of Immunology, 1942, 45: 159-170
Антиген пневмококка в
печени мыши. Окраска
антисывороткой против
пневмококка. Антитела
конъюгированы
флуоресцентным
красителем fluoresceinisocyanate.
Первые публикации об использовании
антител, меченных тяжелыми металлами.
Frank A. Pepe THE USE OF
SPECIFIC ANTIBODY IN ELECTRON
MICROSCOPY : I. Preparation of
Mercury-Labeled Antibody J Biophys
Biochem Cytol. 1961 December 1;
11(3): 515–520
Frank A. Pepe and H. Finck THE
USE OF SPECIFIC ANTIBODY IN
ELECTRON MICROSCOPY : II. The
Visualization of Mercury-Labeled
Antibody in the Electron Microscope
J Biophys Biochem Cytol. 1961
December 1; 11(3): 521–531.
Мышечное волокно. Окраска
антителами против миозина.
Антитела мечены атомами ртути.
Первые публикации об использовании
антител, меченных ферментами.
Nakane, P. and Pierce, G. (1966)
Enzyme-labeled antibodies:
preparation and application for the
localization of antigens. J.
Histochem. Cytochem. 14, 929–931
Paul K. Nakane and G. Barry
Pierce, Jr. (1967) ENZYME-LABELED
ANTIBODIES FOR THE LIGHT AND
ELECTRON MICROSCOPIC
LOCALIZATION OF TISSUE
ANTIGENS J Cell Biol. May 1; 33(2):
307–318.
Париетальная карцинома желточного мешка. Окраска антителами против
эпителиальной базальной мембраны. Антитела мечены пероксидазой хрена.
Световая микроскопия
Электронная микроскопия
Антитело.
Антиген.
Эпитоп.
Флуорохром.
Принципы иммунофлуоресцентного
окрашивания
Прямой метод окрашивания.
Primary
antibody,
fluorochrome
conjugated
Tissue
antigen
Принципы иммунофлуоресцентного
окрашивания
Непрямой метод окрашивания.
Secondary
antibody,
fluorochrome
conjugated
Primary
antibody
Tissue
antigen
Высокая
чувствительность
Можно выявлять
бесчисленное
количество антигенов,
не прибегая к тому,
чтобы каждый раз
метить первичные
антитела.
Принципы иммунофлуоресцентного
окрашивания
Непрямой метод окрашивания c усилением сигнала.
Streptavidinfluorochrome
complex
Biotinylated
secondary
antibody
Primary
antibody
Tissue
antigen
Классы иммуноглобулинов.
www.chemicon.com
Для иммуногистохимического
окрашивания используются
иммуноглобулины IgG и IgM.
Структура молекулы IgG1
papain
www.chemicon.com
pepsin
Получение антител
Иммунизация
Сыворотка крови
Очистка антител.
Осаждение сульфатом аммония.
Гельфильтрация
Ионно-обменная хроматография.
Аффинная хроматография.
Очищенные
антитела
Синтез антител.
http://nfs.unipv.it/nfs/minf/dispense/immunology/clonal_sel.jpg
Характеристики антител.
Специфичность
Кросс-реактивность
1
Антиген 1
Антиген 2
2
Антиген 1
Антиген 2
Способы повышения специфичности
антител для иммуноокрашивания.
Получение антител против фрагмента
антигена
Искусственный синтез уникального
фрагмента белкового антигена по
известной нуклеотидной
последовательности
Использование моноклональных антител
Получение моноклональных антител.
Каждая B-клетка
производит антитела
одного изотипа, которые
специфически связываются
только с одним эпитопом.
http://nobelprize.org/nobel_prizes/
medicine/laureates/1984/
http://www.mssm.edu/research/resources/hybridoma/
Поликлональные и моноклональные
антитела.
бóльшая интенсивность сигнала,
но меньшая специфичность
меньшая интенсивность сигнала,
но бóльшая специфичность
возможность идентифицировать
посттрансляционные изменения
белков
Флуоресценция и флуорохромы.
Присоединение флуоресцентных групп к
антителам.
isocyanate
isothiocyanate
sulfonyl chloride
urea
thiourea
sulfonamide
succinimidyl esters
carboxamide
tetrafluorophenyl (TFP) esters
http://www.invitrogen.com
лизин
Присоединение флуоресцентных групп к
антителам.
Сравнение флуоресценции конъюгатов антител,
связанных с FITC и Alexa 488 и TxR и Alexa 594 в
зависимости от количества флуоресцентных групп
на белок.
Panchuk-Voloshina et al., 1999
Что еще нужно знать о флуорохромах.
Квантовый выход ηfl – отношение числа испущенных фотонов к
числу поглощенных (измеряется в %).
Коэффициент экстинкции
I1 = I 0 ⋅ e
−ε max cl
Закон Бугера — Ламберта — Бера
Immunocytochemistry.
A Practical Guide for
Biomedical Research.
Burry, Richard W. 2010.
Springer.
Процедуры иммунофлуоресцентного
окрашивания.
Фиксация исследуемого объекта.
Обработка образца и приготовление срезов
Демаскирование антигена (antigen retrieval)
Повышение проницаемости (permeabilization).
Блокирование неспецифического связывания
антител.
Обработка препаратов антителами.
Заключение препаратов.
Фиксация исследуемого образца.
Критерии хорошей фиксации.
1. Максимальная сохранность структур
биологического объекта. Структуры не должны
быть набухшими или сморщенными. Не должно
меняться взаиморасположение структур.
2. Фиксация должна быть равномерной во всем
образце.
3. Максимальная сохранность химической природы
образца. Сохранность эпитопов. Выявляемые
антигены не должны вымываться из образца.
Не существует оптимального фиксатора на
все случаи жизни !!!
Фиксация исследуемого образца.
Коагулянты
метанол
этанол
ацетон
Выбор
фиксатора
Cross-linking agent
формалин
параформальдегид
глютаральдегид
Составные фиксаторы
Выбор
режима
фиксации
время экспозиции
температура
pH
Не существует оптимального фиксатора на
все случаи жизни !!!
Обработка образца и приготовление срезов
Whole-mount
Криосрезы
Flat-mount
Парафиновые срезы
Вибратомные срезы
Культуры клеток
Демаскирование антигена (antigen retrieval).
Инкубирование в р-рах кислот или
щелочей, буферах с кальциевыми
хелаторами, органических
растворителях, обработка протеазами.
CC
Нагревание (HIER, HIAR):
LV
Str
<90°С
~100°С, 120°С
микроволновка
1 час – 1сут
5 мин – 1 ч
BrdU
CC
в 10 mM цитратном буфере (10mM
Sodium Citrate, 0.05% Tween 20, pH
6.0, dH2O, adjust pH to 6.0 with 1N
HCl)
в Tris-EDTA буфере (10mM Tris
Base, 1mM EDTA Solution, 0.05%
Tween 20, pH 9.0)
LV
Str
PCNA
Повышение проницаемости
(permeabilization).
IgG 150 kDa
IgM 900 kDa
детергенты
Triton X100
Tween 20
http://media.wiley.com/CurrentProtocols/PS/ps0408/ps0408-fig-0001-1-full.gif
secondary
antibody
Чем может быть
вызвано
неспецифическое
окрашивание?
+++
correct
antigen
charge
groups
Fcendogenous
receptors antibodies
1. Связывание как первичных, так и вторичных антител с
Fc-рецепторами исследуемого образца.
2. Связывание вторичных антител с эндогенными
антигенами.
3. Ионные и гидрофобные взаимодействия между
антителами и эндогенными макромолекулами образца.
BSA
Сыворотка неиммунизированного животного – хозяина
вторичных антител.
Моновалентные Fab-фрагменты против первичных антител
secondary
antibody
normal serum IgG
from the same specie
as secondary antibody
monovalent
Fab
BSA
+++
correct
antigen
charge
groups
Fcreceptors
endogenous
antibodies
Блокирование неспецифического связывания
антител.
Блокирование неспецифического
связывания вторичных антител.
go α mo IgG Alexa 488
без обработки
go α mo IgG Alexa 488
0.5 mg/ml goat mono Fab
anti-mouse IgG 1:200
go α mo IgG Alexa 488
5% goat serum
go α mo IgG Alexa 488
20% goat serum
Обработка препаратов антителами.
www.chemicon.com
РАЗВЕДЕНИЕ АНТИТЕЛ
ВРЕМЯ: 5 мин – несколько дней
ТЕМПЕРАТУРА: 4°С, RT, 37°С
Заключение препаратов.
Среда для заключения:
Элемент оптической системы
микроскопа
Глицерин
На основе
глицерина + anti-fade
реагент
Молекулярное окружение
флуорохрома
На основе PVA +
anti-fade реагент
Коммерческие
водорастворимые
среды
DePex
Самый простой протокол
для окрашивания срезов.
Фиксация
Приготовление срезов и монтирование их
на стекла
Инкубирование в р-ре первичных антител
при +4°С или RT в течение ночи (0.1-5%
Triton X100, 1-20 % сыворотка животного –
хозяина вторичных антител, PBS)
Отмывание 3 раза по 5-10 мин в PBS
Инкубирование в р-ре вторичных антител
при комнатной т-ре в течение 2-х часов (0.11% Triton X100, PBS)
Отмывание 3 раза по 5-10 мин в PBS
Заключение под покровное стекло в
глицерин
Результат.
NeuN
Alexa 488
Alexa 546
Tyrosine
hydoxylase
GFAP
Texas Red
Cy2
S100ß
Двойное иммунофлуоресцентное
окрашивание (непрямой метод)
Первичные антитела:
мышиные
антитела против
1-го антигена
Вторичные антитела конъюгированные с
флуорохромами:
495
519
козьи антитела против
иммуноглобулинов мыши,
конъюгированные с Alexa 488
596
кроличьи
антитела против
2-го антигена
козьи антитела против
иммуноглобулинов кролика,
конъюгированные с Texas Red
615
Двойное иммуноокрашивание.
Alexa 488
Texas
Red
NeuN
GFAP
PCNA BLBP
vimentin nestin
http://www.microscopyu.com/tutorials/flash/spectralprofiles/index.html
Достоинства и недостатки
иммунофлуоресцентного окрашивания.
“+”
Высокая чувствительность
Окрашивание на несколько антигенов
Конфокальная микроскопия
Высокое и сверхвысокое разрешение
Трехмерная реконструкция
Изучение колокализации антигенов в пространстве
“-”
Выцветание и выгорание флуорохрома (препараты не вечны)
Автофлуоресценция.
Автофлуоресценция.
Собственная флуоресценция объекта.
Вызванная фиксацией.
Вызванная обработкой.
Способы борьбы с автофлуоресценцией.
Спектральное
исключение.
Выжечь.
Химическое
подавление
mouse liver
human brain tumor tissue
Neumann M, Gabel D. J Histochem Cytochem. 2002 Mar;50(3):437-9.
Химическое подавление
флуоресценции
липофусцина.
СuSO4 на 50 мМ ацетатном буфере рН 5
CGRP (Cy2)
Sudan Black на 70% спирте.
MOR1 (Cy3)
Schnell S.A. et al., Journal of Histochemistry and Cytochemistry, Vol. 47, 719-730, June 1999