Конструирование рекомбинантных белков для
реклама
На правах рукописи СЫРКИНА Марина Сергеевна Конструирование рекомбинантных белков для диагностики и терапии онкологических заболеваний 03.01.03 – Молекулярная биология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2012 Работа выполнена Государственного в лаборатории Унитарного молекулярной Предприятия биологии Федерального «Государственный научно- исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов» НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ: Доктор биологических наук, профессор Вейко Владимир Петрович ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ: Носиков Валерий Федеральное Вячеславович, государственное доктор бюджетное биологических учреждение наук, профессор, науки Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН, заведующий лабораторией постгеномных молекулярно-генетических исследований. Лазарев Василий Николаевич, доктор биологических наук, доцент, Федеральное Государственное Учреждение «Научно-исследовательский институт физико- химической медицины», заведующий лабораторией генной инженерии. ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение «Медико-Генетический Научный Центр» РАМН. Защита состоится 11 «октября» 2012 г. в 14:00 на заседании Совета Д 501.001.76 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Московском государственном университете имени М.В.Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские Горы, МГУ, Биологический факультет, ауд.389. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова Автореферат разослан 10 «сентября» 2012 г. Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук И.А. Крашенинников ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы Учитывая уровень смертности от рака в мире (свыше 7,5 млн. человек в год, по данным ВОЗ, что составляет более 13 % всех случаев смерти), в последнее время все острее чувствуется потребность в эффективных противораковых препаратах и диагностических средствах. Накопленные к настоящему времени знания о механизмах злокачественной трансформации, функционировании и молекулярном составе клеток, претерпевших такую трансформацию, а также определенные успехи в исследовании онкомаркеров – молекул, позволяющих различить нормальные и опухолевые клетки, – формируют прочную теоретическую базу для создания агентов, способных к селективному воздействию на раковые клетки. Для отработки схемы получения рекомбинантных белков, которые могут быть использованы при создании бинарных противоопухолевых препаратов и диагностических средств, в качестве моделей нами были выбраны рак железистых органов и метастазирующая меланома человека. Эти два типа онкологических заболеваний обладают высоким метастатическим потенциалом и являются причиной летального исхода. Терапия рака железистых органов при помощи методов, реализуемых в клинической практике, не всегда проходит успешно: в частности, гиперэкспрессирующиеся на поверхности раковых клеток муциновые гликопротеиды создают гидрофильный барьер для многих химиотерапевтических препаратов. Успехи в области таргетной терапии, в основном, связаны с использованием препарата HerceptinTM (Герцептин) производства Roche (Швейцария), представляющего собой антитело, специфически узнающее маркер рака молочной железы Her-2/neu. Однако данный онкомаркер присутствует только у 25-30 % больных раком молочной железы, что указывает на необходимость дополнительного поиска маркеров для клеток данного типа злокачественного новообразования. Установлено, что при раке железистых органов в опухолевых клетках наблюдается гиперэкспрессия муцина MUC1. Кроме того, опухолевый MUC1 характеризуется нарушением апикальной локализации и аберрантным гликозилированием, приводящим к обнажению белкового кора в области тандемных повторов (VNTR) экстрацеллюлярного домена, в норме разветвленными олигосахаридами. Учитывая тот факт, что экранированного VNTR опухоль- ассоциированного муцина обладает иммуногенностью, приводящей к выработке у 1 ряда пациентов антител, взаимодействующих с дегликозилированной формой белка, можно было предположить, что VNTR, частично или полностью лишенный гликозилирования, применим при разработке противоопухолевых вакцин. В настоящее время продемонстрирована эффективность вакцин, содержащих пептиды из области VNTR муцина MUC1 человека. В частности, липосомальная вакцина StimuvaxTM (Стимувакс) производства Merck KGaA (Германия) проходит клинические испытания как препарат для активной специфической иммунотерапии немелкоклеточного рака легкого. Однако при получении вакцин часто используют короткие пептиды, содержащие около 1,5 повторов из области VNTR. Во многом это обусловлено возможностями и особенностями химического синтеза пептидов. Тем не менее, в ряде работ было показано усиление иммунного ответа на вводимый антиген при полимеризации антигенных детерминант. В связи с этим, получение белков, содержащих не менее пяти повторов из области VNTR муцина MUC1 человека является весьма существенным для разработки противораковых вакцин. Для усиления индукции иммунного ответа на вакцинирующий препарат применимы белки, обладающие характеристиками суперантигенов. С этой целью могут быть использованы бактериальные энтеротоксины, для которых продемонстрирована высокая способность к активации Т-лимфоцитов. В настоящее время достаточно подробно изучены энтеротоксины Staphylococcus aureus – определена их структура, функции и механизм активации иммунной системы. В экспериментах на мышах слитые бели, содержащие энтеротоксин А (SEA), продемонстрировали высокую эффективность при терапии солидных опухолей. Результаты этих экспериментов позволяют рассматривать энтеротоксины из S. aureus как перспективный иммуностимулирующий компонент вакцин, позволяющий существенно увеличить их эффективность. Одной из основных проблем терапии онкологических заболеваний является метастазирование, т.к. метастазы и микрометастазы трудноидентифицируемы. Тем не менее, существует ряд молекулярных маркеров, позволяющих выявить опухолевые клетки, приобретшие способность к метастазированию. Одним из таких маркеров является маркер агрессивной фазы развития меланомы – интегрин αvβ3. Было продемонстрировано, что в клетках меланомных линий человека, обладающих высоким метастатическим потенциалом, экспрессия интегрина αvβ3 увеличена в 50100 раз по сравнению с экспрессией в клетках меланомных линий с низким метастатическим потенциалом. 2 Исследования взаимодействия интегрина αvβ3 с внеклеточными лигандами позволили установить, что к высокоаффинному связыванию с экстрацеллюлярным доменом рецептора обладает трипептид Arg-Gly-Asp (RGD). На данный момент существует ряд противоопухолевых препаратов на основе RGD, некоторые из них уже проходят клинические испытания. Однако экспериментальные данные, полученные к настоящему времени, выявили ряд требований к пространственной организации и аминокислотному окружению RGD-мотива, выполнение которых обеспечивает высокую эффективность и селективность связывания агента на основе RGD с мишенью. Кроме того, необходимо подчеркнуть положительную роль «поливалентности» меланома-узнающего адреса в увеличении эффективности связывания RGDсодержащего агента. Резюмируя вышесказанное, следует отметить, что к настоящему времени при разработке противоопухолевых препаратов были достигнуты определенные успехи. Однако, результаты последних исследований открывают новые перспективы для создания эффективных терапевтических препаратов и диагностических средств, что определяет актуальность настоящей работы. Цель работы: 1) Конструирование генов и экспрессионных плазмид для микробиологического синтеза в клетках E. coli рекомбинантных белков, применимых в диагностике и терапии онкологических заболеваний человека. 2) Отработка методов выделения и очистки рекомбинантных белков. 3) Исследование биологических свойств и оценка терапевтического потенциала полученных рекомбинантных белков. Экспериментальные задачи: 1) создание экспрессионных конструкций для получения в клетках E.coli рекомбинантного белка His10-VNTR22, содержащего опухоль-ассоциированные антигенные эпитопы муцина MUC1 человека; 2) создание экспрессионных конструкций для получения в клетках E.coli энтеротоксинов из Staphylococcus aureus H (SEH) и B (SEB), слитого со стрептавидином (SAV-SEB), отработка метода выделения данных белков и исследование их иммуностимулирующей способности; 3) создание экспрессионных конструкций для получения в клетках E.coli слитых со стрептавидином белков (SdR), содержащих меланома-адресующие RGD3 пептиды, отработка метода выделения и очистки таких рекомбинантных белков, а также оценка их селективности по отношению к клеткам меланомных линий человека и мыши. Научная новизна и практическая ценность работы 1) Создана экспрессионная конструкция для получения в клетках E. coli нового слитого белка His10-VNTR22. С помощью иммуноферментного анализа показано, что моноклональные антитела, специфичные к природному дегликозилированному VNTR муцина MUC1, способны к связыванию рекомбинантного His10-VNTR22. Полученные данные указывают на подобие структуры и конформации данного белка опухоль-ассоциированному VNTR муцина MUC1 человека. Это дает возможность использования данного рекомбинантного белка при создании онковакцины. 2) Созданы экспрессионные конструкции для получения в клетках E. coli новых синтетических гибридных белков SdR, содержащих RGD-пептид, слитой со стрептавидином. Продемонстрировано селективное связывание таких гибридных белков с меланомными клетками человека и мыши. Этот факт позволяет предложить данные гибридные белки в качестве адресующих агентов при создании противомеланомных препаратов и диагностических средств. 3) Создана конструкция для гетерологичной экспрессии в клетках E. coli предшественника энтеротоксина H из S. aureus (SEH). Продемонстрировано, что лидерный пептид SEH обеспечивает транслокацию рекомбинантного белка в периплазматическое пространство клеток E. coli. Отработана методика хроматографической очистки рекомбинантного SEH. 4) Создана экспрессионная конструкция для получения в клетках E. coli энтеротоксина стафилококка B, слитого со стрептавидином (SAV-SEB). Структурное подобие SEB-компонента в составе химерного белка SAV-SEB природному SEB подтверждено результатами конкурентного связывания с антителами, полученными на природный SEB. Продемонстрировано, что белок проявляет SAV-SEB митогенную активность, характерную для природных энтеротоксинов из S. aureus. Этот факт позволяет иммуностимулирующего предложить агента при данный гибридный создании белок препаратов в для качестве адресной иммунотерапии рака, в том числе, двухфазной. Предложенные схемы выделения и очистки вышеупомянутых рекомбинантных белков могут послужить основой для разработки способов противораковых терапевтических агентов и диагностических средств. 4 получения Структура диссертации Диссертация состоит из глав «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», «Выводы». Работа содержит список цитируемой литературы (___ ссылок), 45 рисунков, 8 таблиц. Общий объем диссертации ___ страниц. Апробация работы и публикации Диссертационная работа была представлена на заседании секции «Молекулярная биология» Ученого Совета ФГУП «ГосНИИгенетика» 5 марта 2012 г. Результаты настоящей работы были представлены на конференциях: Conference for young scientists, PhD students and students on molecular biology and genetics (Kyiv, Ukraine, 2003), Conference for young scientists, PhD students and students on molecular biology and genetics (Kyiv, Ukraine, 2007), VII Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Молекулярная диагностика-2010» (Москва, Россия, 2010). По материалам диссертации опубликовано 3 статьи в отечественном журнале, входящем в перечень ВАК РФ. ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Перспективные подходы к созданию бинарных агентов для диагностики и терапии онкологических заболеваний Одним из перспективных направлений в диагностике и терапии онкологических заболеваний в настоящее время является использование адресующих (таргетных) молекул, специфически узнающих онкомаркеры на поверхности опухолевых клеток. Рис. 1. Схематическое изображение бинарного агента. Таргетные молекулы, как правило, представляют собой бинарные агенты, состоящие из адресующей части, узнающей онкомаркер на поверхности раковой 5 клетки, и действующей части – визуализирующей (диагностика) или разрушающей (терапия) клетку, с которой произошло связывание агента (рис. 1). Между адресующей и действующей частями бинарного агента может быть помещен «адаптор». В идеальном случае он должен представлять собой структуру, позволяющую легко комбинировать различные адресующие и действующие части, для получения широкого спектра противоопухолевых терапевтических препаратов и диагностических средств. В роли такого адаптора может выступать молекула стрептавидина, который обладает рядом характеристик, приближающих его к «идеальному» адаптору. Во-первых, стрептавидин, способен к высокоаффинному связыванию остатка dбиотина (Kd=10-15 М), что создает предпосылки для его модификации при помощи биотинилированных токсических, визуализирующих или адресующих агентов. Во-вторых, способность стрептавидина к тетрамеризации позволяет получать поливалентные структуры. Для поливалентных адресующих молекул в целом ряде случаев продемонстрировано увеличение эффективности связывания с мишенью. В случае визуализирующих или токсических агентов поливалентность может приводить к амплификации сигнала или увеличению токсичности, соответственно. Рис. 2. Схематическое изображение различных способов получения бинарных агентов, содержащих в роли «адаптора» стрептавидин: а – присоединение биотинилированного адресующего агента к гибридному белку SAVдействующий агент; б – присоединение биотинилированного визуализирующего/токсического агента к гибридному белку SAV-адресующий агент; в – присоединение биотинилированного адресующего и биотинилированного действующего агента к рекомбинантному стрептавидину. 6 Таким образом, использование стрептавидина в качестве адаптора при создании бинарных терапевтических и диагностических агентов может быть реализовано несколькими способами (рис. 2): а) конструирование гибридных белков стрептавидин – действующий агент, которым могут быть сообщены различные адресующие характеристики благодаря использованию биотинилированных адресующих молекул; б) конструирование гибридных белков стрептавидин – адресующий агент, которым могут быть приданы как токсические, так и диагностические свойства благодаря использованию биотинилированных «действующих» молекул; в) образование комплексов «свободных» биотинилированных адресующих и действующих агентов с рекомбинантным стрептавидином посредством стрептавидин-биотинового взаимодействия. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Ген vntr22 был получен рестрикцией плазмиды pEGFP-VNTR22 (сконструирована ранее в лаборатории) по сайтам XhoI и BamHI. ДНК-фрагменты, содержащиеся в рестриктной смеси, разделяли при помощи электрофореза в 1 % агарозном геле, и выделяли фрагмент vntr22 из агарозного геля. Ген энтеротоксина B (seb) и ген предшественника энтеротоксина H (pro-seh) из были получены PCR-амплификацией соответствующего фрагмента S. aureus геномной ДНК S. aureus с использованием специфических синтетических олигонуклеотидов, содержащих искусственно введенные сайты рестрикции для облегчения последующего клонирования. Гены меланома-адресующих пептидов d4k-rgd10, d4k-rgd13 и d4k-rgd15 были получены в результате отжига и PCR-достройки синтетических олигонуклеотидов, содержащих искусственно введенные сайты рестрикции для последующего клонирования. Экспрессионная конструкция pET16b-His10-VNTR22 была получена на основе вектора pET16b (Novagen, США). Для создания экспрессионной конструкции pLSEH был использован вектор pUC18Rudp, созданный ранее в лаборатории на основе плазмиды pUC18 (Fermentas, Литва) и содержащий последовательность промотор-операторной области гена уридинфосфорилазы E. coli. 7 Для создания экспрессионных конструкций, содержащих гены слитых со стрептавидином белков (pSAV-SEB, pSdR10, pSdR13 и pSdR15) была использована плазмида pflSAV19, созданная ранее в лаборатории на основе pUC18 (Fermentas, Литва) и содержащая ген предшественника стрептавидина (лишенный кодона терминирующего трансляцию про-стрептавидина) под контролем промотора уридинфосфорилазы E. coli. Ген seb был клонирован в составе экспрессионной конструкции pLSAV-SEB по сайту HindIII. Гены меланома-адресующих пептидов d4krgd10, d4k-rgd13 и d4k-rgd15 были клонированы в составе экспрессионных конструкций pSdR10, pSdR13 и pSdR15 по сайтам XhoI и HindIII, соответственно. Реакции PCR, рестрикции и лигирования, выделение плазмид, а также выделение фрагментов ДНК из агарозного геля осуществляли с помощью наборов фирмы Fermentas (Литва), следуя рекомендациям фирмы-изготовителя. Для продукции рекомбинантных белков полученными экспрессионными конструкциями трансформировали клетки штаммов E. coli MG1655 и BL21(DE3). В клетках штамма MG1655 E. coli осуществляли наработку белков SAV-SEB, SEH, SdR10, SdR13, SdR15. Трансформированные клетки культивировали в жидкой среде LB, содержащей 150 мкг/мл ампициллина, при +37 ºС в течение 14-18 часов в шейкере-инкубаторе (250 об/мин). Клетки осаждали центрифугированием, ресуспендировали в буфере (20 % сахарозы, 10 mM EDTA, 20 – 25 mM Tris, 1 мг/мл лизоцима; pH 8) и инкубировали при помешивании на +4 ºС в течение 20 – 30 минут, после чего центрифугировали и отбирали супернатант, содержащий белки периплазматической фракции. SEH очищали при помощи ионообменной хроматографии. Стрептавидин-содержащие белки очищали на 2-иминобиотин агарозе (Sigma-Aldrich, США), следуя рекомендациям фирмы-изготовителя. Наработку белка His10-VNTR22 осуществляли в клетках штамма E. coli BL21(DE3). Трансформированные клетки культивировали в жидкой среде LB, содержащей 150 мкг/мл ампициллина, при +37 ºС до достижения логарифмической фазы роста, после чего индуцировали 1mM IPTG в течение 3 - 6 часов. Затем клетки подвергали разрушению, инкубируя в дистиллированной воде в течение 20 минут при 80 – 90 ºС. Целевой белок выделяли из фракции растворимых белков, устойчивых к нагреванию, при помощи хроматографии на Ni-NTA (QiaGen), следуя рекомендациям фирмы-изготовителя. Все полученные белки фильтровали с использованием мембран ультрафильтрации (Amicon, США), лиофилизировали и хранили при -20 ºС. 8 для Моноклональные антитела на дегликозилированный муцин MUC1 человека, поликлональные антитела на природный SEB, а также моноклональные антитела на природные SEB и SEA, были получены в лаборатории иммунологии ФГУП «ГосНИИгенетика». Исследование пролиферативной активности Т-лимфоцитов в ответ на природные SEB, SEA и рекомбинантный SAV-SEB, иммуноферментный и радиоиммунологический анализ были SAV-SEB проведены в лаборатории иммунологии ФГУП «ГосНИИгенетика». Расщепление белков SdR10, SdR13 и SdR15 легкой цепью энтеропептидазы быка (Sigma-Aldrich, США) осуществляли, следуя рекомендациям фирмы- изготовителя. В работе были использованы клетки меланомных линий человека (MeWo) и мыши (B16F10), предоставленные РОНЦ им. Н.Н.Блохина, а также клетки немеланомных линий человека – рака шейки матки (линия HeLa) и первичные фибробласты (линия HEF1698), предоставленные лабораторией структурно- функциональной организации хромосом Института Биологии Гена РАН. Эксперименты по связыванию белков SdR10, SdR13 и SdR15 с клетками меланомных и немеланомных линий человека и мыши были проведены на кафедре молекулярной биологии биологического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Получение рекомбинантного белка His10-VNTR22, содержащего 22 тандемных повтора из области VNTR муцина MUC1 человека, для иммунотерапии рака железистых органов Одним из гликопротеид маркеров MUC1. выстилающего Этот протоки рака железистых полипептид желез, и органов является синтезируется в представляет собой муциновый клетках эпителия, гетеродимер. Экстрацеллюлярная N-концевая субъединица представлена, преимущественно, высокогликозилированной областью тандемных повторов (VNTR), содержащей 20 – 125 повторяющихся фрагментов, состоящих из 20 аминокислотных остатков (PDTRPAPGSTAPPAHGVTSA), и выполняет, в основном, функцию лубрификации железистого эпителия. Трансмембранная С-концевая субъединица содержит несколько сайтов фосфорилирования в цитоплазматическом домене и участвует в передаче сигнала в клетку, влияя на ее пролиферацию и выживаемость. 9 При злокачественной трансформации клеток происходит резкое увеличение экспрессии гена muc1, сопровождающееся аберрантным гликозилированием продукта экспрессии, а также потерей им апикальной локализации. Следствием аберрантного гликозилирования области VNTR MUC1 является обнажение участков белкового кора, в норме экранированного гликозидами, что переводит VNTR в разряд онкомаркеров. Учитывая тот факт, что VNTR опухоль-ассоциированного муцина обладает иммуногенностью, приводящей к выработке у ряда пациентов антител, взаимодействующих с дегликозилированной формой белка, можно было предположить, что VNTR, лишенный гликозилирования, применим при разработке противоопухолевых вакцин. Ранее в лаборатории была сконструирована экспрессионная плазмида, содержащая ген гибридного белка, в состав которого входил стрептавидин (SAV), и полипептид VNTR22, составленный из 22 повторов из области VNTR муцина MUC1 человека. Ген vntr22 был лигирования-расщепления сконструирован фрагментов tr, при помощи собранных последовательного из синтетических олигонуклеотидов. Фрагменты, лигировавшиеся в правильной ориентации, не подвергались расщеплению, так как содержали гибридный сайт рестрикции BamHI/BclI. Фрагменты, лигировавшиеся в неправильной ориентации, расщеплялись эндонуклеазами рестрикции BamHI и BclI и вновь подвергались лигированию. Рекомбинантный периплазматических белок белков был SAV-VNTR22 E. coli на выделен 2-иминобиотин из фракции агарозе. Была продемонстрирована способность SAV-VNTR22 к взаимодействию с антителами, специфичными к негликозилированным областям опухолевого муцина MUC1 человека. Это свидетельствует о структурном и конформационном соответствии фрагмента VNTR22 в составе рекомбинантного гибридного белка структуре и конформации VNTR природного опухоль-ассоциированного муцина MUC1. Кроме того, была установлена высокая иммуногенная активность гибридного SAV-VNTR22 при иммунизации мышей линии Balb/c. Существенным является также то, что антитела сывороток, полученных после иммунизации белком SAV-VNTR22, взаимодействуют с муцином MUC1 поверхности карциномных клеток человека (линия T-47D). Полученные результаты дали возможность предполагать, что прообразом вакцины могут являться повторы VNTR22 без стрептавидина. С этой целью были созданы экспрессионные конструкции на основе pET-16b, содержащие ген полипептида VNTR22 (клонированный по сайтам XhoI и BamHI) под 10 контролем промотора РНК-полимеразы бактериофага Т7 (PT7) (рис. 3, а). Для облегчения выделения и очистки синтезируемый белок содержал на N-конце 10 остатков гистидина. Рис. 3. Схематическое изображение экспрессионного вектора pET16b-His10-VNTR22 (а); электрофоретическое разделение в 12% ПААГ (б) и иммуноблоттинг с использованием моноклональных антител на область VNTR дегликозилированного муцина (в) белков цитоплазматической фракции штамма-реципиента (BL21(DE3)) (дорожка 1), белков цитоплазматической фракции штамма продуцента белка His10-VNTR22 (дорожка 2), выделенного и очищенного на Ni-NTA белка His10-VNTR22 (дорожка 3). PT7 – промотор РНК-полимеразы бактериофага Т7. ApR – ген устойчивости к ампициллину. В результате индукции 1 мМ IPTG в течение 6 часов в цитоплазме клеток происходит накопление белка His10-VNTR22. Для выделения целевого белка клеточную массу ресуспендировали в дистиллированной воде, инкубировали на водяной бане при 90-95 оC в течение 10 – 15 мин., медленно охлаждали раствор до комнатной температуры и осаждали денатурированные белки центрифугированием. Полипептид His10-VNTR22 выделяли из фракции устойчивых к нагреванию цитоплазматических белков с применением Ni-хелатной хроматографии (рис. 3, б). Соответствие выделенного белка области VNTR дегликозилированного природного муцина MUC1 человека было установлено при помощи иммуноблоттинга (рис. 3, в). Способность белка His10-VNTR22 к взаимодействию с антителами, полученными на дегликозилированный VNTR муцина MUC1 человека, указывает на правильную укладку полипептида, обеспечивающую презентацию узнаваемых моноклональными антителами антигенных эпитопов. Наличие таких антигенных эпитопов может свидетельствовать о наличии у полипептида His10-VNTR22 иммуногенных свойств, характерных для опухолевого муцина MUC1. Таким образом, данный полипептид 11 также может быть использован для создания противоопухолевых вакцинирующих препаратов. Кроме того, белок His10-VNTR22 был использован при создании панели моноклональных антител для диагностики рака железистых органов и дискриминации фаз развития онкологического заболевания. Данные антитела также могут быть конъюгированы с биотином для получения бинарных диагностических средств и препаратов для иммунотерапии рака железистых органов (рис. 2, а, в). Получение высокоселективных меланома-адресующих белковых молекул Было показано, что в клетках меланомных линий человека, обладающих высоким метастатическим потенциалом, экспрессия интегрина αvβ3 увеличена в 50100 раз по сравнению с экспрессией в клетках меланомных линий с низким метастатическим потенциалом, что явилось причиной повышенного интереса к интегрину как к специфическому маркеру рака кожи человека. Исследования взаимодействия интегрина αvβ3 с внеклеточными лигандами позволили установить первичную структуру короткого пептида, связывающегося с экстрацеллюлярным доменом рецептора, – это аминокислотная последовательность RGD. Для эффективного и селективного взаимодействия с рецепторами на поверхности меланомных клеток данный мотив должен быть стабилизирован в «изогнутой» конформации и иметь определенное аминокислотное окружение. Опираясь на результаты, полученные Hölig et al. при отборе с помощью фагового дисплея RGDсодержащих пептидов по способности связывания с клетками различных линий, нами были выбраны продемонстрировавшие пептиды высокую RGD10, RGD13 эффективность и (табл. RGD15 связывания с 1), клетками меланомных линий человека. Такие пептиды содержат RGD-мотив, фланкированный остатками цистеина, для его стабилизации в «изогнутой» конформации. название пептида RGD10 аминокислотная поледовательность DGARYCRGDCFDG название гена rgd10 RGD13 LSGCRGDCFEE rgd13 RGD15 DGFPGCRGDCSQE rgd15 нуклеотидная последовательность кодирующей цепи ДНК гена (5’→ 3’) GATGGCGCACGTTATTGCCGTGGTGAT TGCTTCGATGGTTGA CTGAGCGGCTGCCGTGGTGATTGCTTC CAGCAGTGA GATGGCTTCCCAGGTTGCCGTGGTGAT TGCAGTCAGGAATGA Таблица 1. Аминокислотные последовательности RGD-содержащих пептидов и нуклеотидные последовательности кодирующих их генов. Пунктирной линией подчеркнут мотив RGD, фланкированный остатками цистеина, и последовательность нуклеотидов, кодирующая данный пентапептид. 12 На основании первичных структур пептидов RGD10, RGD13 и RGD15 были выведены нуклеотидные последовательности кодирующих их генов (табл. 1), которые были получены в результате отжига и достройки синтетических олигонуклеотидов. Рис. 4. Схематическое изображение слитого гена pro-sav-d4k-rgd из плазмиды pSdR с расположением сайтов рестрикции, использовавшихся при конструировании, а также промотор уридинфосфорилазы E. coli (Pudp), контролирующий экспрессию данного гена. На базе плазмиды pLSAVdS(H), содержащей ген предшественника стрептавидина (pro-sav) под контролем промотора уридинфосфорилазы E.coli, были получены экспрессионные конструкции pSdR (10, 13, 15), содержащие ген прострептавидина (pro-sav), слитой с геном узнающего меланомные клетки RGDпептида (rgd10, rgd13, rgd15), и располагающуюся между генами pro-sav и rgd последовательность (d4k), кодирующую сайт расщепления энтеропептидазы (DDDDK) (рис. 4). Рис. 5. Электрофоретическое разделение в 12% ПААГ: а – белков периплазматических фракций клеток штамма E.coli MG1655, трансформированных плазмидой pUC18 (дорожка К); pSdR10 (дорожка 1), pSdR13 (дорожка 2), pSdR15 – (дорожка 3), очищенного рекомбинантного стрептавидина, rSAV (дорожка 4); б – растворов белков, полученных на различных стадиях хроматографической очистки белка SdR10: суммарные белки периплазматической фракции штамма-продуцента (дорожка 1); суммарные белки, не связавшиеся с сорбентом (дорожка 2); очищенного рекомбинантного белка (дорожка 3). 13 Данные конструкции давали устойчивую наработку слитых белков SdR в клетках штамма E.coli MG1655 (рис. 5, а). Полученные белки очищали методом аффинной хроматографии на 2-иминобиотин-агарозе (рис. 5, б). Структурный анализ белков методом MALDI-TOF масс-спектрометрии был выполнен в НИИ ФХБ им. А.Н.Белозерского МГУ. В результате исследования были определены молекулярные массы слитых белков SdR10 (18864±5 Да), SdR13 (18640±5 Да), SdR15 (18798±5 Да), а также rSAV(16616±5 Да). Кроме того, было установлено, что все проанализированные белки соответствуют заявленным структурам. Полученные белки анализировали с точки зрения функциональности отдельных компонентов в составе химеры. Сохранение у стрептавидина способности к тетрамеризации подтверждают данные электрофоретического разделения неденатурированных слитых белков. В отсутствие денатурирующих условий SdR10, SdR13 и SdR15, также как и рекомбинантный стрептавидин, представлены тетрамерами, которые существенно отличаются по электрофоретической подвижности от мономерных форм (рис. 6, а). Сохранение у стрептавидина в составе слитых белков способности к связыванию производных биотина оценивали по связыванию FITC-биотина (рис. 6, б). По молярному соотношению стрептавидина и FITC-биотина, участвующих в реакции связывания, и соотношению связанного и свободного FITC-биотина (определяемого визуально электрофоретическому по свечению разделению в продуктов реакции, неденатурирующих подвергшихся условиях) было установлено, что все биотин-связывающие сайты стрептавидина доступны для взаимодействия с производными биотина. Доступность RGD пептидов в составе слитого полипептида для белок-белковых взаимодействий оценивали по способности энтеропептидазы расщеплять слитые белки Sd10, 13 и 15 (рис. 6, в). Все слитые белки расщепляются энтеропептидазой, следовательно, их С-концевые меланома-адресующие фрагменты доступны для взаимодействия с рецепторами на поверхности клеток. 14 Рис. 6. Определение структурных характеристик слитых белков. а - Способность стрептавидина в составе слитых белков к тетрамеризации. Электрофореграмма неденатурированных (дорожки 1, 3, 5, 7) и денатурированных (дорожки 2, 4, 6, 8) белков SdR10, SdR13, SdR15, rSAV, соответственно. б - Доступность биотин-связывающих сайтов стрептавидина. Электрофореграмма реакционных смесей, содержащих очищенные белки на основе стрептавидина и FITCбиотин. Свечение FITC-биотина в неокрашенном геле при облучении ультрафиолетом (длина волны 312 нм). Взаимодействие FITC-биотина с: rSAV (дорожки 1, 2), SdR10 (дорожки 3, 4), SdR13 (дорожки 5, 6), SdR15 (дорожки 7, 8). Соотношение белок:FITCбиотин, равное 1:4 (дорожки 1, 3, 5, 7), 1:8 (дорожки 2, 4, 6, 8). Дорожка 9 – свободный FITCбиотин (40 нг). Закрашенная стрелка указывает на тетрамеры стрептавидинсодержащих белков; пустая стрелка указывает на свободный FITC-биотин. в - Доступность для взаимодействия С-концевой области слитого белка с энтеропептидазой. Электрофореграмма продуктов расщепления слитых белков SdR10, SdR13 и SdR15 легкой цепью бычьей энтеропептидазы. Дорожка 1 – rSAV; дорожки 2, 4, 6 – нерасщепленные белки SdR10, SdR13 и SdR15, соответственно; дорожки 3, 5, 7 – расщепленные белки SdR10, SdR13 и SdR15, соответственно. Закрашенная стрелка указывает на нерасщепленные белки SdR; пустая стрелка указывает на расщепленные белки SdR М – белки-маркеры. С помощью гель-фильтрации на носителе Superdex-200 было установлено, что рекомбинантные белки SdR10, SdR13 и SdR15, а также rSAV, не подвержены агрегации. Результаты эксперимента по оценке селективности связывания слитых белков SdR10, SdR13 и SdR15 с клетками меланомных и немеланомных линий человека и 15 мыши представлены на рис. 7 и 8. Для постановки эксперимента клетки линий MeWo (меланома человека) и B16F10 (меланома мыши), а также клетки двух контрольных линий (HEF1698 и HeLa) высевали на 6-ти луночные культуральные планшеты и растили в течение 13 – 15 часов. Исследуемые белки SdR10, SdR13 и SdR15 и контрольный белок rSAV растворяли в РBS, фильтровали через фильтр с диаметром пор 0,22 мкм и метили биотин – флуоресцеином. Рис. 7. Клетки меланомных и немеланомных линий человека и мыши после взаимодействия с FITC-мечеными слитыми белками. Снимки выполнены: 1 – при облучении образца возбуждающим светом с длиной волны 495 нм; 2 – в проходящем свете. Увеличение микроскопа – 400. Из лунок культуральных планшетов удаляли среду, промывали клетки 3 раза однократным PBS, после чего в лунки вносили DMEM без сыворотки и раствор исследуемых белков, меченых FITC, в соответствующей концентрации. Планшеты инкубировали в течение 1 часа при 37°С в атмосфере 5% СО2. Для удаления несвязавшихся белков клетки промывали 3 раза однократным PBS, после чего 16 вносили в лунки по 3 мл DMEM без сыворотки и незамедлительно анализировали полученные препараты с использованием флуоресцентного микроскопа Leica DMI6000 (Германия), оснащенного модулем для прижизненной съемки (37 °С, 5% СО2). Рис. 8. Флуоресценция клеток меланомных линий человека (MeWo) и мыши (B16F10) после взаимодействия с растворами FITC-меченых белков SdR различной концентрации. Снимки выполнены: 1 – при облучении образца возбуждающим светом с длиной волны 495 нм; 2 – в проходящем свете. Увеличение – 400. В случае каждой линии клеток было проанализировано 12 следующих экспериментальных точек в двух повторностях: 1 – «Контроль 1» (без SdR, без FITC-биотина, без rSAV) 2 – «Контроль 2» (5,4 мкМ раствор FITC-биотина) 3 – «Контроль 3» (0,625 мкМ раствор rSAV, меченый FITC) 4, 5, 6 – 0,125 мкМ, 0,625 мкМ и 1,25 мкМ раствор SdR10, меченого FITC, соответственно. 17 7, 8, 9 – 0,125 мкМ, 0,625 мкМ и 1,25 мкМ раствор SdR13, меченого FITC, соответственно. 10, 11, 12 – 0,125 мкМ, 0,625 мкМ и 1,25 мкМ раствор SdR15, меченого FITC, соответственно. По результатам связывания с клетками меланомных и немеланомных линий человека и мыши было установлено, что полученные слитые белки обладают селективностью по отношению к клеткам меланомных линий. Кроме того, выявлено, что селективность обусловлена наличием на С-конце таких белков RGD- содержащего пептида, так как рекомбинантный rSAV не связывает клетки ни одной из проанализированных линий (рис. 7). Наконец, эффективность связывания клеток меланомных линий человека существенно выше эффективности связывания клеток меланомных линий мыши (рис. 8), причем, в большей степени эффект наблюдается при взаимодействии клеток с FITC-биотинилированными белками SdR13 и SdR15. Таким образом, белки SdR13 и SdR15 могут быть использованы при создании противомеланомных препаратов и диагностических средств (рис. 2, б). Получение белков-суперантигенов для активной иммунотерапии онкологических заболеваний При разработке препаратов для иммунотерапии, в частности, для активной иммунотерапии онкологических заболеваний, возникает проблема выбора токсической части для эффективного уничтожения опухолевых клеток, несущих узнаваемые «адресующей» частью онкомаркеры. Одним из перспективных подходов является использование молекул, вызывающих индукцию пролиферации цитотоксических Т-клеток. В качестве таких молекул могут быть использованы т.н. «суперантигены» (SAg), обладающие уникальной способностью к активации иммунной системы. Данные белки участвуют в формировании трехкомпонентного комплекса, TCR-SAg-MHCII, имитирующего классическое распознавание чужеродных антигенов. Однако связывание SAg молекулами TCR и MHCII происходит за пределами областей связывания обычных антигенов, что приводит к поликлональной активации до 20 % всех периферических пролиферация, Т-клеток. стимуляция В и результате индукция такой активации происходит цитотоксических Т-клеток, сопровождающаяся продукцией хемокинов и цитокинов. 18 К семейству суперантигенов принадлежат энтеротоксины S. aureus. Механизм действия данных токсинов достаточно хорошо изучен, следовательно, они потенциально могут быть использованы в качестве иммуностимулирующих агентов при создании бинарных «адресующих» препаратов для иммунотерапии рака с целью привлечения цитотоксических экспрессирующих узнаваемые Т-клеток к «адресующей» местам частью скопления онкомаркеры. опухолей, Каждый энтеротоксин имеет «свои» участки связывания на молекулах TCR и MHC. В ряду энтеротоксинов S. aureus особенно выделяется SEH – в то время как сайты связывания других энтеротоксинов располагаются на β-цепи TCR, энтеротоксин H связывается с α-цепью рецептора. Такое разнообразие в механизмах связывания приводит к различиям в митогенной активации. Были созданы экспрессионные конструкции, одна из которых содержала ген энтеротоксина B, слитой с геном прострептавидина (prosav-seb) (рис. 9, а), а другая – ген предшественника энтеротоксина H (рис. 9, б). Рис. 9. Схематическое изображение экспрессионных векторов, содержащих гены энтеротоксинов S. aureus: а - pSAV-SEB содержит ген про-стрептавидина (pro-sav), слитой с геном энтеротоксина B (seb); б – pLSEH содержит ген про-энтеротоксина H (pro-seh). PUDP – промотор уридинфосфорилазы E. coli. ApR – ген устойчивости к ампициллину. Оба белка были выделены из смеси белков периплазматической фракции: SAVSEB – при помощи аффинной хроматографии на 2-иминобиотин агарозе (рис. 10, а), SEH – при помощи ионообменной хроматографии (рис. 10, б). Исследование свойств рекомбинантного SAV-SEB было проведено в лаборатории иммунологии ФГУП «ГосНИИгенетика». Пролиферативную активность 19 Т-лимфоцитов в ответ на обработку гибридным белком SAV-SEB, а также белками SEA и SEB, исследовали по включению 3Н-тимидина в ДНК клеток. Рис. 10. Электрофоретическое разделение в 12% ПААГ: а – белков периплазматической фракции штамма-реципиента (дорожка 1) и штаммапродуцента (дорожка 2) рекомбинантного слитого белка SAV-SEB; дорожка 3 – очищенный рекомбинантный белок SAV-SEB; б – белков периплазматической (дорожка 1) и цитоплазматической фракции (дорожка 2) штамма-реципиента, белков периплазматической (дорожка 3) и цитоплазматической фракции (дорожка 4) штамма-продуцента рекомбинантного слитого белка SEH; дорожка 5 – очищенный рекомбинантный белок SEH. M – белки-маркеры На основании полученных результатов, представленных на рис. 11, а, было установлено, что рекомбинантный SAV-SEB обладает способностью вызывать поликлональную пролиферацию -12 Т-клеток суперантигенов SEA и SEB (10 -10 -13 в дозах, сравнимых с дозами М). Вместе с тем, рекомбинантный белок обладает сниженным по сравнению с SEB и SEA «апоптозным» потенциалом – гибель Т-клеток наступает при концентрации SAV-SEB, превышающей концентрацию SEA и SEB более, чем в 50 раз. Согласно литературным данным, «токсический» эффект суперантигенов обусловлен вовлечением в образование комплекса токсина с TCR и MHCII костимуляторной молекулы CD28, сайт связывания которой был обнаружен у энтеротоксинов стафилококка A, B, С, H, TSST-1 и располагался в удалении от сайтов связывания TCR и MHCII. Было показано, что мыши CD28-, в отличие от мышей CD28+, не погибали от токсического шока, вызванного введением SEB, но при этом имели сравнимые уровни активации Т-лимфоцитов. Таким образом, есть основания предполагать, что благодаря наличию в слитой молекуле SAV-SEB стрептавидина и образованию тетрамерной структуры возникают пространственные препятствия, нарушающие взаимодействие SEB с костимуляторной молекулой CD28. 20 Кроме того, проводили оценку эффективности связывания нативного SEB и рекомбинантного SAV-SEB c иммобилизованными поликлональными антителами кролика, полученными на SEB, методом конкурентного РИА с использованием 125 I- SEB (рис. 11, б). Также осуществляли исследование характера взаимодействия иммобилизованных белков SEB и SAV-SEB с моноклональными антителами, полученными на различные конформационно-зависимые антигенные детерминанты природного SEB (рис. 11, в). Рис. 11. Эффективность и особенности активации пролиферации Т-клеток белком SAVSEB (а) и взаимодействие SAV-SEB белка с поли- и моноклональными антителами, специфичными к природному SEB (б, в): а - пролиферативный ответ нормальных Т лимфоцитов крови человека на SEA, SEB суперантигены и рекомбинантный белок SAV-SEB; б – ингибирование взаимодействия иммобилизированных поликлональных анти-SEB антител с 125I-SEB природным токсином SEB и рекомбинантным слитым белком SAVSEB; в – иммуноспецифичность взаимодействия анти-SEB (S4F11 и S4B2) и анти-SEA (S1) моноклональных антител с иммобилизованным на полистироле SEB и химерным белком SAV-SEB. 21 Полученные результаты позволяют сделать вывод об идентичности иммунохимических характеристик природного SEB и рекомбинантного SEB в составе слитого белка SAV-SEB. Конформационное подобие SEB-компонента в составе слитого белка SAV-SEB природному SEB в совокупности с его высокой митогенной активностью и сниженным «апоптозным» потенциалом позволяют рассматривать SAV-SEB как потенциальный терапевтический агент, применимый при создании препаратов для иммунотерапии рака. Химерному белку SAV-SEB могут быть сообщены адресующие свойства в результате присоединения биотинилированных адресующих молекул (рис. 2, а). В то же время, свободный SEH, выделенный из фракции периплазматических белков E.coli, может быть биотинилирован с целью получения конъюгатов со стрептавидином, обладающих токсическими характеристиками (рис. 2, б-в ). 22 ВЫВОДЫ Методом гетерологичной экспрессии в клетках E. coli получены рекомбинантные белки His10-VNTR22, SdR10, SdR13, SdR15, SEH, SAV-SEB, которые могут быть использованы как потенциальные компоненты противоопухолевых и диагностических агентов. 1. Установлено, что рекомбинантный белок His10-VNTR22, содержащий 22 тандемных повтора из области VNTR муцина MUC1 человека, формирует антигенные эпитопы, характерные для VNTR природного дегликозилированного муцина. Белок His10-VNTR22 может быть использован при получении онковакцины. 2. Продемонстрирована способность гибридных белков SdR10, SdR13 и SdR15, содержащих слитой со стрептавидином меланома-адресующий пептид (RGD10, RGD13 или RGD15, соответственно), к селективному узнаванию клеток меланомных линий человека (MeWo) и мыши (B16F10). Данные рекомбинантные белки могут найти применение в диагностике меланомы, а также при создании противомеланомных терапевтических агентов. 3. Показана способность лидерного пептида энтеротоксина H из S. aureus к транслокации рекомбинантного белка в периплазматическое пространство клеток E. coli. Установлена идентичность иммунохимических характеристик рекомбинантного SEH и природного SEH. Рекомбинантный SEH может быть использован в качестве компонента при создании бинарных агентов для иммунотерапии рака. 4. Продемонстрирована идентичность иммунохимических характеристик рекомбинантного SEB в составе слитого белка SAV-SEB и природного SEB. Установлена способность белка SAV-SEB к индукции цитотоксических Т- лимфоцитов, что позволяет использовать его в качестве токсического агента при создании бинарных агентов для активной иммунотерапии различных видов онкологических заболеваний. 23 СПИСОК РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Гулько Л.Б., Воюшин К.Е., Окорокова Н.А., Кривенко М.С., Ратманова К.И., Вейко В.П., Дебабов В.Г. Создание опухоль-адресованных генно-инженерных препаратов для иммунотерапии рака. I. Конструирование гибридного гена энтеротоксина В из Staphylococcus aureus, слитого с геном стрептавидина из Streptomyces avidinii, и его экспрессия в Escherihia coli. // Биотехнология. 2003. №5. C. 81-87. 2. Гулько Л.Б., Воюшин К.Е., Флуер Ф.С., Окорокова Н.А., Кривенко М.С., Вейко В.П.. Создание опухоль-адресованных генно-инженерных препаратов для иммунотерапии рака. II. Клонирование гена проэнтеротоксина Н (seh) из Staphylococcus aureus и его экспрессия в Escherihia coli. Исследование секреции энтеротоксина Н клетками E. coli. // Биотехнология. 2003. №6. C. 72-78. 3. Кривенко М.С., Гулько Л.Б., Окорокова Н.А., Вейко В.П. Создание опухольадресованных генно-инженерных препаратов для иммунотерапии рака. III. Конструирование экспрессионной плазмиды и получение на основе рекомбинантного штамма-продуцента E. сoli вакцинирующего онкопептида VNTR22 (MUC1) человека. // Биотехнология. 2005. № 2. C. 11-17. 4. Krivenko M.S., Voyushin K.E., Gul’ko L.B., Okorokova N.A., Levitsky S.A., Mukharyamova K.I., Veiko V.P. Cloning of mucin (MUC1) gene and studing of its expression in eucariotic cells. // Conference for young scientists, PhD students and students on molecular biology and genetics, dedicated to the golden jubilee of the double helix of the DNA and 30 annivrsary of the Institute of molecular biology and genetics NAS of Ukraine. Kyiv (Ukraine) 2003. P. 171. 5. Manuvera V.A., Cheremnyh A.M., Syrkina M.S., Yurin V.L., Veiko V.P. The development of anti-tumor agent based on staphylococcal enterotoxin B and anti-mucin monoclonal miniantibody. // Conference for young scientists, PhD students and students on molecular biology and genetics dedicated to 120th anniversary of M.I. Vavilov. Kyiv (Ukraine). 2007. P. 175. 6. Сыркина М.С., Широков Д.А., Вейко В.П. Разработка системы для конструирования диагностических и терапевтических противомеланомных препаратов. // VII Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Молекулярная диагностика – 2010». Москва (Россия) 2010. Т. 4. C. 134-137. 24
