ХИМИЯ РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ. 2008. №4. С. 47–50. УДК 543.635.2: 547.455 СРАВНЕНИЕ МЕТОДОВ ОПРЕДЕЛЕНИЯ РЕДУЦИРУЮЩИХ ВЕЩЕСТВ: МЕТОД БЕРТРАНА, ЭБУЛИОСТАТИЧЕСКИЙ И ФОТОМЕТРИЧЕСКИЙ МЕТОДЫ © В.А. Вешняков, Ю.Г. Хабаров*, Н.Д. Камакина Архангельский государственный технический университет, наб. Северной Двины, 17, Архангельск, 162002 (Россия). E-mail: khabarov@agtu.ru На примере растворов моносахаридов, гидролизатов после определения легкогидролизуемых углеводов в древесине разных пород и жидких сред сульфит-целлюлозного производства проведено экспериментальное сравнение трех методов определения редуцирующих веществ (Бертрана, эбулиостатического и нового фотометрического). Установлено, что они позволяют получать сопоставимые результаты. Фотометрический метод по сравнению с классическими обладает рядом преимуществ: меньшая трудоемкость, экспрессность и меньший расход реагентов. Ключевые слова: Редуцирующие вещества, углеводы, моносахариды, медно-щелочной раствор, реактив Фелинга, метод Бертрана, эбулиостатический метод, фотометрия, гидролизаты, сульфитные щелока. Введение Для определения сахаров уже более 150 лет используют так называемый медно-щелочной раствор, представляющий собой реактив Фелинга, состав которого в зависимости от способа определения редуцирующих веществ (РВ) может несколько различаться. В 1849 г. Г. Фелинг предложил для качественного определения восстанавливающих сахаров, для которых в растворах устанавливается равновесие циклических (пиранозных и фуранозных) и открытой (с оксо-группой) форм, реактив, главными компонентами которого являются сульфат меди(II), гидроксид натрия и сегнетова соль [1]. В ходе реакции Фелинга альдегидная группа, окисляясь до карбоксильной, восстанавливает медь(II) до меди(I). При этом выпадает осадок оксида меди(I) кирпично-красного цвета. В конце XIX в. эту реакцию начинают использовать для количественного определения сахаров. Первоначально осадок оксида меди(I) взвешивали [2]. Однако вскоре на смену гравиметрии пришла титриметрия. Широко известным и распространенным методом определения РВ стал метод, разработанный в 1906 г Бертраном [3, 4]. Он предложил отделять осадок оксида меди(I) и затем растворять его в растворе сульфата железа(III), подкисленном серной кислотой. При этом происходит окисление меди(I), а количество образовавшегося железа(II) определяют перманганатометрически. Недостатками метода Бертрана являются: большое число операций (проведение реакции при нагревании, отделение осадка оксида меди(I), последующее его растворение и титрование), свободный доступ кислорода воздуха к реагирующей жидкости, в результате чего окисляется оксид меди(I) и результаты искажаются, отсутствие возможности точно учитывать поправку на самовосстановление медно-щелочного раствора и необходимость использования эмпирических таблиц. Это приводит к затруднению воспроизведения условий анализа и тем самым снижает точность определения [4]. В 1959 г. был предложен эбулиостатический метод определения РВ, разработанный В.К. Низовкиным и И.З. Емельяновой [5]. В работе [4] отмечается, что эбулиостатический метод лишен недостатков метода Бертрана. Большое число операций было заменено непосредственным титрованием медно-щелочного раствора анализируемым раствором, т.е. стадия определения была совмещена с проведением реакции. Для исключения контакта кислорода воздуха с медно-щелочным раствором титрование производится в специаль* Автор, с которым следует вести переписку. 48 В.А. ВЕШНЯКОВ, Ю.Г. ХАБАРОВ, Н.Д. КАМАКИНА ном устройстве – эбулиостате, из которого атмосферный воздух вытесняется паром. Кроме того, при определении РВ эбулиостатическим методом не требуется использование эмпирических таблиц. В качестве индикатора в медно-щелочной раствор включен метиленовый голубой, а во избежание образования осадка оксида меди(I), мешающего фиксировать конец титрования, – желтая кровяная соль, образующая с медью(I) растворимый бесцветный комплекс. Эбулиостатический метод определения РВ сразу же был «принят в качестве стандартного метода определения редуцирующих сахаров в полупродуктах гидролизных и сульфитно-спиртовых заводов» [5]. В связи с чем он получил большое распространение в СССР [2, 4, 6, 7] и используется до сих пор. Если говорить о недостатках эбулиостатического метода, то можно выделить следующие: необходимо проводить ориентировочное титрование, так как его результат используют для выполнения окончательного титрования, необходимо строго выдерживать скорость титрования (1 капля/2 с при ориентировочном и 1 капля/6…7 с при окончательном титровании), так как отклонения будут завышать (при большей скорости) или занижать результаты. Кроме того, для анализа приходится использовать специальный прибор – эбулиостат. Оба метода, как метод Бертрана, так и эбулиостатический, являются достаточно трудоемкими: первый – главным образом из-за большого числа операций, а второй – из-за строгости поддержания постоянства скорости титрования. В 2008 г. в Архангельском государственном техническом университете авторами был разработан новый фотометрический метод определения РВ [8]. Метод отличается от двух классических, представленных выше, простотой выполнения, так как вместо титрования используется фотометрия. Новый фотометрический метод основан на измерении светопоглощения при 670 нм медно-щелочного раствора с добавкой анализируемого раствора сахаров до и после проведения реакции в течение 3 мин на кипящей водяной бане. По результатам холостого и рабочего определений по уравнению градуировочного графика вычисляют величину РВ. Используется такой же состав медно-щелочного раствора, как и в эбулиостатическом методе, но исключен индикатор метиленовый голубой. В таблице 1 представлены исходные характеристики рассматриваемых методов: метода Бертрана по [4], эбулиостатического по [5] и фотометрического по [8]. Как видно из таблицы 1, фотометрический метод является менее затратным: расход реагентов для него почти в 2 раза меньше, чем для эбулиостатического, и на порядок меньше, чем в методе Бертрана. Для экспериментального сравнения рассматриваемых методов были определены величины РВ в различных объектах. Таблица 1. Некоторые характеристики классических и фотомтерического методов определения РВ Характеристики Продолжительность нагревания, мин Определяемая концентрация РВ, мг/мл Объем анализируемого раствора, мл Точность анализа, мг/мл Метод Бертрана 3 (+ время до начала кипения) 0,025…2,5 Эбулиостатический метод 2 (+ время до начала кипения) 0,5…1,3 Фотометрический метод 3 20 ≈ 10…26 4,0 0,5…1,5 … ± 0,01 ±0,01 Расход реагентов, г: CuSO4·5H2O 0,80 0,10 0,0692 Метиленовый голубой – 0,0004 – Сегнетова соль 4,0 0,50 0,20 NaOH 3,0 0,75 0,30 K4[Fe(CN)6]·3H2O – 0,040 0,016 NH4Fe (SO4)2·12H2O 2,0 – – H2SO4 7,45 – – KMnO4 ≈ 0,013…0,050 – – Примечание: все характеристики приведены в расчете на 1 определение, т.е., включая ориентировочное – для эбулиостатического и холостое – для фотометрического методов. Экспериментальная часть Оборудование. Оптическую плотность растворов при 670 нм измеряли на фотоколориметре КФК-2МП в кюветах с толщиной рабочего слоя 1 см относительно дистиллированной воды. СРАВНЕНИЕ МЕТОДОВ ОПРЕДЕЛЕНИЯ РЕДУЦИРУЮЩИХ ВЕЩЕСТВ … 49 Реактивы. В работе были использованы реактивы следующих квалификаций: D-глюкоза, D-ксилоза, D-манноза, серная кислота, пентагидрат сульфата меди(II) – ч.; гидроксид натрия, железоаммонийные квасцы (додекагидрат сульфата железа(III)-аммония), метиленовый голубой – ч.д.а.; желтая кровяная соль (тригидрат гексцианоферрата(II) калия), перманганат калия, сегнетова соль (тетрагидрат тартрата калиянатрия) – х.ч.; вода – дистиллированная. Методика определения РВ фотометрическим способом Приготовление реактивов. В работе использовали 2 раствора: раствор 1 объемом 500 мл готовили растворением 8,650 г пентагидрата сульфата меди(II) в дистиллированной воде; раствор 2 объемом 500 мл готовили растворением 25,00 г сегнетовой соли, 2,00 г желтой кровяной соли и 37,5 г гидроксида натрия в дистиллированной воде. Проведение фотометрической реакции. В пробирке смешивали по 2,00 мл растворов 1 и 2 и 2,00 мл рабочего раствора, содержание РВ в котором находится в диапазоне 0,5…1,5 мг/мл (при необходимости рабочий раствор готовили разбавлением анализируемого раствора). Затем пробирку с реакционной смесью нагревали на кипящей водяной бане в течение 3 мин. Измерение оптических плотностей рабочего и холостого определений. Реакционную смесь, полученную после проведения реакции, сразу же переносили в кювету и измеряли оптическую плотность при 670 нм (рабочее определение). Также измеряли оптическую плотность при 670 нм аналогичной реакционной смеси, не подвергнутой нагреванию (холостое определение). Расчет концентрации РВ. Концентрацию РВ, мг/мл, в рабочем растворе вычисляли по формуле РВ' = Ахол - А раб + 0,012 0,2946 , где Ахол, Араб – оптические плотности при 670 нм, полученные в ходе соответственно холостого и рабочего определений; 0,012 – поправка, связанная с увеличением поглощения при 670 нм собственно меднощелочного раствора при нагревании в течение 3 мин; 0,2946 – абсолютное значение тангенса угла наклона градуировочной кривой. Расчет концентрации РВ (мг/мл) в анализируемом растворе производят с учетом степени разбавления: РВ = R·РВ', где R – степень разбавления исходного объекта. Объекты исследований. В качестве объектов исследования были использованы растворы глюкозы, маннозы и ксилозы, 4 гидролизата, полученных при определении легкогидролизуемых полисахаридов [2] в древесине березы, осины, ели и сосны, 7 производственных сульфитных щелоков, сульфит-спиртовая барда и последрожжевая бражка и 2 бисульфитных щелока. Обсуждение результатов В таблице 2 представлены средние значения величин РВ в чистых растворах глюкозы, маннозы, ксилозы, гидролизатах и производственных жидкостях сульфит-целлюлозного производства, определенные методами Бертрана, эбулиостатическим и новым фотометрическим. Каждое определение проведено с 2 параллельными. Отклонение результатов параллельных определений от среднего значения для всех методов не превышало ± 0,01 мг/мл, что соответствует указанной в [3] точности. Как видно из таблицы 2, все три метода дали одинаковые результаты при определении РВ в чистых растворах сахаров и в гидролизатах. В случае с жидкими средами сульфит-целлюлозного производства результаты немного различаются: эбулиостатический метод дает несколько завышенные результаты по сравнению с фотометрическим и методом Бертрана. Также стоит отметить, что результаты определения РВ в сульфитных щелоках фотометрическим методом и методом Бертрана практически полностью совпали. При использовании сульфит-спиртовой барды и последрожжевой бражки методы дали отличающиеся друг от друга результаты, что, по-видимому, связано с тем, что доля углеводов в сухих веществах этих растворов значительно снижена. Расхождение результатов определения РВ в бисульфитных щелоках также, вероятно, связано с низким содержанием моносахаридов и большим содержанием олигосахаридов и гемицеллюлоз. В подтверждение приведенных выше результатов и их объяснения был использован метод добавок. Были проанализированы растворы глюкозы и щелока, в которые предварительно внесли известное количество глюкозы. Результаты определения представлены в таблице 3, из которой видно, что все три метода позволили с большой точностью определить величину добавки глюкозы. Поэтому расхождение результатов (табл. 2) обусловлено поведением неуглеводных компонентов в условиях анализа. 50 В.А. ВЕШНЯКОВ, Ю.Г. ХАБАРОВ, Н.Д. КАМАКИНА Таблица 2. Результаты определения РВ классическими и фотометрическим методами в пересчете на глюкозу Объект R Раствор глюкозы Раствор маннозы Раствор ксилозы Гидролизат (береза) Гидролизат (осина) Гидролизат (ель) Гидролизат (сосна) Сульфитный щелок 1 Сульфитный щелок 2 Сульфитный щелок 3 Сульфитный щелок 4 Сульфитный щелок 5 Сульфитный щелок 6 Сульфитный щелок 7 Сульфит-спиртовая барда Последрожжевая бражка Бисульфитный щелок 1 Бисульфитный щелок 2 *при нагревании выпал осадок – – – 2,50 2,50 2,00 2,00 50,0 50,0 66,7 50,0 50,0 50,0 50,0 8,33 10,0 16,7 16,7 Концентрация РВ, мг/мл, определенная методом Бертрана эбулиостатическим фотометрическим 0,89 0,91 0,88 … 1,05 1,03 … 0,89 0,89 0,98 0,98 0,98 0,89 0,89 0,90 … 1,01 1,01 … 1,02 1,01 0,99 1,04 0,97 1,05 1,10 1,05 0,86 0,94 0,87 … 0,86 0,78 … 0,93 0,86 … 1,04 1,00 0,78 0,85 0,80 0,68 0,94 0,57 0,82 1,00 0,77 0,63 0,87 0,74 0,49 0,67 * Таблица 3. Результаты определения РВ классическими и фотометрическим методами в пересчете на глюкозу по схеме «введено-найдено» Объект «введено» Раствор глюкозы Сульфитный щелок 3 – 0,10 0,20 – 0,10 0,20 Концентрация РВ, мг/мл, определенная методом Бертрана эбулиостатическим фотометрическим определено «найдено» определено «найдено» определено «найдено» 0,89 – 0,91 – 0,88 – 0,99 0,10 1,00 0,09 0,98 0,10 1,11 0,22 1,11 0,20 1,09 0,21 0,88 – 0,95 – 0,85 – 0,99 0,11 1,03 0,08 0,93 0,08 1,09 0,21 1,12 0,17 1,04 0,19 Выводы Метод Бертрана, эбулиостатический и новый фотометрический методы дают близкие результаты при определении РВ в чистых растворах сахаров и гидролизатах. Они обладают одинаковой воспроизводимостью: отклонение параллельных определений от среднего составляет ± 0,01 мг/мл. Преимуществом нового фотометрического метода является простота выполнения анализа и небольшой расход реагентов. Список литературы 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. Химия: энциклопедия / под ред. И.Л. Кнунянц. М., 2003. 972 с. Оболенская А.В, Ельницкая З.П., Леонович А.А. Лабораторные работы по химии древесины и целлюлозы. М., 1991. 320 с. Bertrand M. Le dosage des sucres réducteurs // Mémoires presentes a la societe chimique. 1906. P. 1285–1299. Оболенская А.В., Щеголев В.П., Аким Г.Л, Аким Э.Л., Коссович Н.Л., Емельянова И.З. Практические работы по химии древесины и целлюлозы. М., 1965. 412 с. Низовкин В.К., Емельянова И.З. Эбулиостатический метод определения редуцирующих сахаров // Журнал прикладной химии. 1959. Т. 32. №11. С. 2516–2521. Емельянова И.3. Химико-технический контроль гидролизного производства. М., 1976. 322 с. Инструкция по химико-техническому контролю биохимической переработки сульфитных щелоков, предгидролизатов и гидролизатов (срок введения 1 июля 1982 г.). Пермь, 1982. 180 с. Хабаров Ю.Г., Камакина Н.Д., Вешняков В.А. Фотометрический метод определения редуцирующих веществ // Известия вузов. Лесной журнал. 2009 (в печати). Поступило в редакцию 29 сентября 2008 г.