Серологические реакции в вирусологии Методы иммуноанализа 1 • Все серологические реакции различаются только по способу выявления образовавшегося комплекса [Аг + Ат] 2 Индикация комплекса [Аг + Ат] • • • • • В РДП – это полоса преципитации В РТГА – это «пуговка» В РНГА – это «зонтик» В РСК – это гемолиз эритроцитов В РН – это отсутствие изменений в живой системе • В РИФ – свечение • В ИФА – изменение окраски субстратной смеси • И т.д. 3 • В РИФ и ИФА для выявления образовавшихся иммунных комплексов [антиген-антитело] используется метка, с которой предварительно связывается узнающий компонент (антиген или антитело). 4 Антигены • Слово антиген — представляет собой сокращение английского словосочетания antibody generation, что в переводе означает «выработка антител». • Антигены — это вещества, которые стимулируют иммунную систему организма к синтезу против них антител. • К антигенам относятся в первую очередь органические полимеры (белки, пептиды, полисахариды), а также ряд других веществ. 5 В иммуноферментных тест-системах используются антигены различной природы: • — натуральные вещества; • — рекомбинантные белки; • — синтетические пептиды. 6 Антитела • Антитела — иммуноглобулины — содержатся в глобулиновой фракции крови. Антитела циркулируют в кровяном русле и секретируются клетками слизистых оболочек. Они представляют собой довольно крупные белки с молекулярной массой от 150 до 190 кДа. • Обозначаются иммуноглобулины сочетанием двух латинских букв 7 «Ig». 8 9 • Антитела, как и многие другие белки организма, обладают видоспецифичностью, то есть пептидная последовательность молекулы иммуноглобулинов, например, IgG одного вида животных отличается от таковой другого вида. • Видоспецифичность антител обусловливает тот факт, что и сами антитела могут служить антигенами. Это происходит при искусственном введении их в 10 организм другого вида. • Необходимо отметить, что против иммуноглобулинов разных классов образуются антитела разной специфичности. • Например, антитела против IgG человека не распознают IgM, и наоборот. 11 моноклональные антитела • Искусственное слияние опухолевой клетки (В-лимфоцита) и одной специально отобранной антителопродуцирующей клетки иммунизированного животного (мыши) позволило получить так называемую гибридому, которая обладает беспредельной потенцией к делению и способностью продуцировать антитела строго определенной специфичности. 12 моноклональные антитела • Получаемые по данной технологии молекулы иммуноглобулинов идентичны друг другу как по строению, так и по специфичности и носят название моноклональные антитела. • Такая одинаковость обусловлена тем, что антитела вырабатываются клетками, у которых один общий 13 предшественник. моноклональные антитела имеют следующие основные преимущества перед поликлональными • полная стандартизация препарата антител; • высокая специфичность; • свободный выбор антигенных детерминант, к которым образуются антитела. 14 В диагностических тестсистемах в качестве узнающих и ловушечных применяются антитела класса IgG. 15 Реакция антиген-антитело • В результате реакции взаимодействия антигена с антителом происходит формирование иммунохимического комплекса. Необходимым условием успешного проведения анализа является полнота связывания реагентов. 16 Реакция антиген-антитело • Характеристика антител, определяющая прочность связывания Fab -фрагмента антитела с антигенной детерминантой, получила название аффинности. 17 Реакция антиген-антитело • Поскольку антитела и антигены чаще всего поливалентны, то есть одно антитело может связываться с несколькими антигенами и наоборот, то для суммарной характеристики степени их связывания используют термин авидность. 18 Основные принципы методов иммуноанализа • Реакция взаимодействия антигена с антителом как основа присутствует во всех методах иммуноанализа. • Однако, в зависимости от того, какой из этих реагентов является определяемым веществом, а другой — узнающим, от соотношения их количества, а также от характера взаимодействия стандартного и определяемого агентов, иммуноаналитические методы различаются по принципу связывания. 19 Как проводится исследование методом ИФА • В основе иммуноферментного анализа лежит иммунная реакция антигена с антителом,а присоединение к антителам ферментной метки позволяет учитывать результат реакции антиген-антитело по появлению ферментативной активности или по изменению ее уровня. В упрощенном виде механизм реакции можно представить следующим образом: 20 Конкурентный и ингибиторный ИФА 21 Сендвич-метод 22 23 Виды меток, используемых в иммуноанализе • 1) нерастворимые частицы (например, эритроциты, латексные гранулы, частицы графита); • 2) соли металлов и красителей (например, золото, Luminous Red G); • 3) радионуклиды (например, 125I, тритий — 3Н); • 4) вещества, рассеивающие электроны; • 5) бактериофаги; • 6) флуоресцентные красители; • 7) хемилюминесцентные и биолюминесцентные вещества; • 8) липосомы; • 9) простетические группы; • 11) субстраты ферментов; • 12) модуляторы ферментов; 24 • 13) ферменты. 25 Прямой твердофазный ИФА 26 27 Непрямой «сендвич»-ИФА 28 Твердофазный ИФА (сендвичвариант) 29 30 31 32 • С внесением на твердую фазу хромоген-субстратного раствора начинается ферментативная реакция, результаты которой определенным образом регистрируются. 33 • Таким образом, в иммуноферментном анализе кроме антигенов и антител используются следующие компоненты: твердая фаза, ферментная метка и субстрат. 34 35 Иммунный комплекс, связанный стекловолоконной матрицей 36 • Схема хода типичной реакции ИФАМ 37 Иммунокомб 38 39 Ферменты и субстраты в ИФА Конъюгирующи й реагент Конъюгирующи й реагент Конъюгирующий реагент Конъюгирующий реагент Пероксидаза хрена Хрен (Armoracia rusticana) О-фенилендиаминдигидро-хлорид (ОФД, 492 нм) Глутаральдегид Мета-периодат натрия N-сукцинимидил3 (2пиридилдитио) пропионат 5-аминосалициловая кислота (450 нм), диаминобензидин, одианизидин. Dгалактозидаза E. Coli О-нитрофенил-β-Dгалактозид (420 нм) Метамалеимидобензол-Nгидроксисукцинимид ный эфир β-Щелочная фосфотаза E. Coli, слизистая кишечника теленка Р-нитрофенилфосфат (405 нм), 5-Бром-4хлоро-3-индолил фосфат Глутаральдегид 40 В зависимости от того, какие антигены используются, все иммуноферментные тест-системы для выявления антител подразделяются на: • • • Лизатные — в которых используется смесь нативных антигенов (лизированный или обработанный ультразвуком возбудитель инфекции, полученный в культуре); Рекомбинантные — в которых используются полученные генно-инженерным способом белкианалоги определенных белковых антигенов возбудителя; Пептидные — использующие химически синтезированные фрагменты белков. 41