комплексный подход к биотехнологии получения бактериальных

УДК 616.981.42:576.851.42:576:8.077
КОМПЛЕКСНЫЙ ПОДХОД К БИОТЕХНОЛОГИИ
ПОЛУЧЕНИЯ БАКТЕРИАЛЬНЫХ АНТИГЕНОВ
НА МОДЕЛИ БРУЦЕЛЛ
Г.И. Григорьева
Нижегородская государственная сельскохозяйственная академия
Представлены принципы комплексного подхода к фракционированию
клетки бруцелл с позиций особенностей химической и антигенной структуры клетки и участия определенных антигенных комплексов в процессах
иммуно- и патогенеза. Определены биологические основы разработки безотходной технологии «разборки» клетки на антигенные и функционально
активные субклеточные фракции, реализованные при изготовлении диагностических и вакцинных препаратов.
Бруцеллез как зооантропонозное заболевание, несмотря на широкое распространение во всем мире, относится к числу управляемых инфекций, и степень надежности оздоровительных мероприятий во многом зависит от результатов эпизоотологического надзора, обусловливающих четкость прогнозирования характера бруцеллезных эпизоотий. Это определяет необходимость оптимизации системы эпизоотологического надзора и контроля при бруцеллезе сельскохозяйственных животных, а следовательно, необходимость дальнейшего совершенствования
таких основных звеньев, как диагностика и специфическая профилактика.
Современные представления о структуре клетки бруцелл, ее антигенном составе позволяют определить выбор рационального методического подхода к процессу выделения и очистки отдельных клеточных компонентов, необходимых для
конструирования эффективных диагностических препаратов с заданными свойствами, а также подойти к решению вопроса создания «идеальной» бруцеллезной
вакцины, обладающей высокой протективностью при отсутствии агглютиногенности и сенсибилизирующей активности. Биологические основы для создания
такой технологии сформулированы нами в предыдущих работах (Григорьева, Игнатов 1987, 1991; Григорьева, 1998).
В конечном итоге теоретические посылки и полученные нами экспериментальные данные позволили разработать технологию с заданными параметрами,
принципиальная схема которой (см. рис.) защищена авторским свидетельством
как способ получения антигенов из клетки бруцелл (Григорьева, Игнатов, Федоров, 1988).
Первый этап технологии включает получение протективного антигена (ПА)
бруцелл по методу, предложенному П.Е.Игнатовым (1984). Сущность метода заключается в том, что клетки бруцелл помещаются в условия, моделирующие условия пребывания патогена внутри макрофага, где микроб проявляет одно из своих патогенных действий — выделяет фактор (экзоцеллюлярный), ингибирующий
слияние фагосом с лизосомами и этим противостоит иммунному действию
35
Рис. Схема поэтапного фракционирования клеток бруцелл для выделения антигенов
(НОЖ – надосадочная жидкость)
36
макроорганизма (Riley, Robertson, 1984). Данный протективный антиген был
выделен, охарактеризован и использован для конъюгации с полимерным носителем, усиливающим иммунный ответ, в результате чего была сконструирована
бруцеллезная искусственная вакцина (БИВ) (Петров, и др., 1985). Последующие
экспериментальные и производственные испытания БИВ показали ее высокую
иммуногенность и, что особенно важно для противобруцеллезных вакцин, отсутствие индукции синтеза специфических антител и сенсибилизации, участвующих
в стандартных диагностических реакциях. Применение БИВ в Волгоградской области, самой неблагополучной по бруцеллезу крупного рогатого скота в России,
позволило резко ослабить напряженность эпизоотического процесса в этом регионе и добиться ликвидации значительного количества эпизоотических очагов
(Сочнев и др., 1999).
Дальнейшая работа (II этап) по выделению антигенов проводилась путем переработки бактериальной массы различными химическими агентами, позволяющими получать поверхностные антигены бруцелл липополисахарид-белковой
природы (ЛПС-ЭДТА) и белковый антиген (Б-АГ). Данные антигены использовали для конструирования тест-систем для иммуноферментного анализа (ИФА),
применяемого в серологической диагностике бруцеллеза крупного рогатого скота.
Полученные нами тест-системы для ИФА обеспечивали наибольшую диагностическую эффективность по сравнению с другими испытанными методами серологической диагностики при испытании в животноводческих хозяйствах Рязанской
области (Григорьева, Улицкая, 1990).
На III этапе технологии бактериальный материал, вышедший после проведения этапа II, обрабатывали жесткими реагентами с применением анионного детергента додецилсульфата натрия. Экстрагированную таким образом и затем отмытую белковую фракцию (SDS-экстракт) успешно использовали в качестве бруцеллезного аллергена при постановке аллергических реакций in vivo (внутрикожная проба) и in vitro (непрямая реакция лизиса лейкоцитов (НРЛЛ)) при проведении дифференциальной диагностики бруцеллеза и иерсиниоза в животноводческих хозяйствах Астраханской области (Григорьева, Сочнев, 1989).
Остаток переработанной на предыдущих этапах бактериальной массы представлял собой фракцию, обогащенную пептидогликаном, который может быть
использован в качестве иммуностимулятора при конструировании вакцин и иммуномодулирующих лечебных препаратов.
Таким образом, разработанная и апробированная технология ступенчатой
разборки клетки бруцелл на субклеточные фракции и компоненты позволяет провести практически безотходную переработку бактериальной массы с получением
специфических антигенов, пригодных для конструирования высокоэффективных
профилактических и диагностических систем. В целом такой комплексный подход позволяет значительно повысить эффективность производства бактериальных
препаратов, необходимых медицинской и ветеринарной практике.
ЛИТЕРАТУРА
Григорьева Г.И. Биологические основы получения и практического применения субклеточных фракций бактерий на модели бруцелл: Автореф. дисс. … докт. биол. наук. СПб.,
1998.
Григорьева Г.И., Игнатов П.Е. Факторы патогенности как протективные антигены
при конструировании вакцин // Сельхоз. биология. 1987. № 12. С. 100–104.
37
Григорьева Г.И., Игнатов П.Е., Федоров А.И. Способ получения антигенов из бактерий рода Brucella. А.с. № 1631786. СССР. 1988.
Григорьева Г.И., Игнатов П.Е. Антигенная структура бруцелл // Успехи совр. биологии. 1991. Т. III. Вып. 6. С. 890–904.
Григорьева Г.И., Сочнев В.В. Непрямая реакция лизиса лейкоцитов как аллерготест
при бруцеллезе // Бактер. и вирусн. болезни сельскохоз. животных и птиц в хоз-вах Сев.
Кавказа. Новочеркасск, 1989. С. 53–59.
Григорьева Г.И., Улицкая А.А. Применение иммуноферментного анализа для определения противобруцеллезных антител в сыворотке крови крупного рогатого скота // Вестник
сельскохоз. науки. 1990, № 2. С. 86–91.
Игнатов П.Е., Федоров А.И. Способ получения бруцеллезного антигена. А.с.
№ 1256258. СССР. 1984.
Петров Р.В., Хаитов Р.М., Игнатов П.Е. и др. Способ получения вакцины против
бруцеллеза. А.с. № 1518961. СССР. 1985.
Сочнев В.В., Филиппов Н.В., Григорьева Г.И. и др. Управление эпизоотическим процессом на модели бруцеллеза крупного рогатого скота в Нижнем Поволжье. Н. Новгород,
1999.
Riley L., Robertson D. Ingestion and intracellular survival of Brucella abortus in human and
bovine polymorphonuclear leycocytes // Infect. Immun. 1984. V. 46. № 1. Р. 224–230.
38