57 пролиферативная реакция глиальных опухолевых клеток на

реклама
медицина
ПРОЛИФЕРАТИВНАЯ РЕАКЦИЯ ГЛИАЛЬНЫХ
ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК НА ДЕЙСТВИЕ ФАКТОРА
СТАРЕНИЯ МЛЕКОПИТАЮЩИХ
Л.И. Кондакова1, В.А. Зуев2, Б.В. Рубцов1, А.С. Халанский1
1
НИИ морфологии человека РАМН (Москва);
2
НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН (Москва)
PROLIFEROUS REACTION OF GLIAL TUMOR CELLS
ON MAMMALIAN AGING FACTOR ACTION
L.I. Kondakova, V.A. Zuev, B.V. Rubtsov, A.S. Kholanski
Исследовано действие экстрактов головного мозга и сывороток крови молодых и старых мышей на митотическую активность клеточной линии глиобластомы мыши ЭПНТ-5. Показано,
что экстракты головного мозга и сыворотки крови увеличивают
митотический индекс клеток глиобластомы. Образцы, полученные от старых животных, увеличивают митотический индекс в
два раза более, чем образцы, полученные от молодых. Обсуждается связь этих различий с накоплением в организме животных
фактора старения, оказывающего стимулирующее действие на
пролиферацию глиальных клеток.
It was researched effect of brain extracts and blood sera of young
and old mice in mitotic activity of glioblastomic cell line EPNT-5. Has
been demonstrated that brain extracts and blood sera stimulated of cell
proliferation process in culture. Samples from old animals stimulated
mitotic index in twice more that young one. Discussed connection
these differences with increase in animal organism aging factor, that
stimulates action on glial cell proliferation.
Хорошо известно, что морфологические изменения, происходящие в головном мозге животных
и человека при старении и при прионных болезнях, имеют много общего и главное – отличаются
характерной триадой: гибелью нервных клеток
(нейронов), усиленной пролиферацией клеток глии
(глиозом) и формированием губкообразного состояния мозговой ткани (спонгиозом) [10, 12, 13].
В этой связи В. А. Зуевым [3] была высказана
гипотеза о ведущей роли глиоза в цепи этих событий при старении. Предполагалось, что в отличие от
прионных болезней, при которых гибель нейронов
связывают с действием инфекционного агента, при
старении отсутствие инфекционного агента не дает
оснований для первичной гибели нейронов. Вместе
с тем, именно усиленная пролиферация клеток глии
в замкнутом пространстве может легко нарушить
питание нейронов. В отличие от других клеток организма, нервные клетки млекопитающих получают
из крови кислород, питательные и строительные
вещества не непосредственно, а через посредника,
каковым является звездчатая глипальная клетка
– астроцит [11]. К тому же, как известно, эта связь
является довольно хрупкой [9]. Поэтому активное
размножение окружающих клеток глии может
легко разрушить связь между астроцитом и нейроном, с одной стороны, и астроцитом и капилляром
– с другой, обрекая, тем самым, нервную клетку на
«голодную смерть» [3, 4]. Поскольку при старении
инфекционный агент не был обнаружен в ткани
мозга, то очевидно глиоз должен индуцироваться
неким «фактором», активирующим пролиферацию
клеток глии.
Действительно, такой фактор обнаружен сначала в экстрактах мозга [5], а затем и в сыворотке крови
старых животных и человека и назван «фактором
старения» [7]. Как оказалось, он отличается малой
молекулярной массой, термостойкостью и видовой
специфичностью действия [7]. В тканях молодых
животных этот фактор отсутствует, а по мере старения накапливается в организме млекопитающих
во все больших количествах [4,7]. Введение молодым мышам экстрактов головного мозга старых
животных приводило к их ускоренному старению
и сопровождалось гибелью нейронов на фоне интенсивного глиоза. Добавление таких экстрактов к
первично диссоциированным культурам глиальных
клеток нормального мозга и к культурам глиальных
опухолевых клеток оказывало резкое стимулирующее влияние на их пролиферацию [6].
Сопоставление этих фактов подтверждает
предположение о первичной роли глиоза в процессе
старения мозга. Это послужило основанием для продолжения исследований, в которых мы специально
оценивали влияние экстрактов головного мозга и
сыворотки крови молодых и старых животных на
параметры митотической активности клеток глиобластомы мыши ЭПНТ-5 – мышиной глиальной опухоли из коллекции НИИ морфологии человека [8].
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
25-процентные экстракты мозга молодых 2-месячных мышей и экстракты мозга старых 18-месячных
мышей получали путем растирания мозговой ткани с
электрокорундом в ростовой среде (среда Игла DМЕМ
с глютамином – 3%, сыворотка крови эмбрионов ко-
ВЕСТНИК РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ ЕСТЕСТВЕННЫХ НАУК
2008/3
57
медицина
ров – 10% и гентамицин – 100 ед/мл) в фарфоровой
ступке. Суспензию разводили ростовой средой в 5 раз
и осветляли центрифугированием при 3000 об/мин в
течение 10 мин. Надосадочную жидкость пропускали
через фильтры «Millipor» (0,45 мкм).
Сыворотку крови молодых мышей и сыворотку крови старых мышей получали стандартным
способом: путем ретракции сгустка с последующим
центрифугированием и отсасыванием сыворотки,
которую затем разводили в 10 раз ростовой средой
и пропускали через фильтр Millipore.
Цитопролиферативную активность сывороток
крови и экстрактов мозга оценивали по их действию
на клеточную линию ЭПНТ-5. Для этого к 1 мл взвеси клеток (100 тыс/мл) в ростовой среде добавляли
по 0,1 мл испытуемого раствора мозгового экстракта
или разведения сыворотки крови и смесь инкубировали при 37о С в атмосфере 5% СО2. Контролем служили пробы клеток, к взвеси которых добавляли по
0,1 мл ростовой среды. После инкубации в течение
3–4 суток клетки в каждой пробе подсчитывали в
камере Горяева и определяли индекс пролиферации,
который вычисляется как отношение урожая, т.е.
количества размножившихся клеток к их количеству
в посадочной дозе.
Для проведения цитологических исследований
клетки культивировали в той же среде и в тех же
условиях, но на покровных стеклах в пробирках Лейтона. В определенные сроки после начала инкубации
покровные стекла извлекали из пробирок Лейтона,
помещали их для фиксирования в жидкость Карнуа,
а затем окрашивали гематоксилином и эозином.
Параметры митотического режима, отражающие пролиферативную активность клеток исследовали согласно методическим указаниям И.А. Алова
[1]. На окрашенных покровных стеклах подсчитывали процент клеток, находящихся в фазе митоза
– митотический индекс. Кроме того, учитывали
процент делящихся клеток с различными типами
патологии митоза (К-митозы, рассеивание хромосом, мосты, многополюсные митозы и др.) – индекс
патологических митозов и процент полиморфных
(гигантских и многоядерных) клеток – индекс клеточного полиморфизма.
Статистическую обработку результатов проводили с помощью пакета программ Exсel, используя
t-критерий Стьюдента. На рис. 1 показаны средние
значения измеряемых величин и указаны 95% доверительные интервалы.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В первой серии опытов исследовали цитопролиферативную активность мозговых экстрактов и
сывороток крови молодых и старых мышей (рис. 1).
Общий характер контрольной и опытных кривых
совпадает и отражает известные закономерности
роста клеточных культур in vitro. На кривых можно
выделить три фазы: латентный период, продолжающийся около двух суток после внесения клеток в
58
пробирки Лейтона, фазу экспоненциального роста
с резким увеличением числа митозов в клеточной
линии (2–3 сутки) и фазу снижения митотической
активности с постепенным замедлением роста
культуры. Для подробного анализа митотического
режима клеточной линии глиобластомы мы выбрали
фазу экспоненциального роста, в которой различия
между кривыми проявляются наиболее ярко. Они
носят, в основном, количественный характер и выражаются в резком увеличении значений митотического индекса в опытных культурах по сравнению с
контрольными. В латентном периоде и в фазе снижения митотической активности различия между
кривыми, отражающими уровень клеточной пролиферации, менее выражены. Отметим только, что
в латентной фазе имеется тенденция к ускорению
роста клеток в опытных культурах. В фазе снижения
митотические индексы в опытных образцах также
существенно выше, чем в контроле.
Наибольшие различия между опытными вариантами и контролем приходятся на 2–3-и сутки и
соответствуют фазе экспоненциального роста культуры. Так, на вторые сутки экстракт мозга старых
мышей увеличивает митотические индексы более
чем в 3 раза по отношению к контролю, а экстракт
мозга молодых мышей – только в 1,5 раза. Сыворотка крови старых мышей также увеличивает митотитческие индексы культуры клеток в 2 раза, тогда
как сыворотка крови молодых мышей практически
не влияет на митотические индексы при сравнении
с контрольными значениями.
На третий день культивирования, соответствующий пику метаболической активности клеток, наибольший эффект также наблюдается при добавлении
в среду культивирования сыворотки и экстрактов
мозга, полученных от старых животных: в присутствии экстракта мозга старых мышей и сыворотки
крови старых мышей митотический индекс возрастает в два раза. Культивирование же клеток с образцами, полученными от молодых животных, оказывает
меньший эффект. Экстракт мозга молодых мышей
увеличивает митотический индекс только в 1,4 раза,
а сыворотка крови молодых мышей – в 1,8 раза.
Таким образом, можно заключить, что экстракты мозга и сыворотки крови старых мышей обладают вдвое более высокой митогенной активностью,
чем полученные от молодых животных.
Интересно отметить, что сыворотка крови молодых животных на пике пролиферации культуры
(третий день культивирования) в большей мере,
чем экстракт мозга молодых мышей, стимулирует
митотическую активность клеток глиобластомы, в то
время как стимулирующие пролиферацию эффекты
сыворотки крови и экстракта мозга cтарых животных
практически совпадают. Можно предположить, что у
старых животных уровень содержания фактора старения как в крови, так и в головном мозге достаточно
высок, чтобы вызывать максимальный митогенный
эффект in vitro. У молодых животных сыворотка
ВЕСТНИК РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ ЕСТЕСТВЕННЫХ НАУК
2008/3
медицина
Рис.1. Митотические индексы клеточной линии глиобластомы мыши ЭПНТ-5 в присутствии экстрактов мозга и сывороток
крови молодых и старых животных
крови содержит известные термочувствительные
ростовые факторы, присутствие которых характерно
для молодых млекопитающих, что давно и широко
используется для размножения и поддержания клеток
и тканей в системах in vitro. Этим можно объяснить
несколько более высокую митотическую активность
не прогретых сывороток крови молодых мышей
по сравнению с активностью мозговых экстрактов
мышей того же возраста. Возвращаясь к выявленной
значительно более высокой митогенной активности
мозговых экстрактов и сывороток крови старых
мышей, напомним, что накопление фактора старения
было обнаружено не только в мозговой ткани стареющих мышей, но, как было показано недавно, и в их
лимфоидных клетках селезенки [2].
Что касается других параметров пролиферации
клеток, а именно, индекса патологических митозов и
индекса клеточного полиморфизма, то мы не обнаружили достоверного отличия их значений в опытных
образцах по сравнению с контролем. Соответственно,
можно сделать вывод, что экстракты головного мозга
и сыворотки крови мышей любого возраста не оказывают токсического действия на пролиферирующие
клетки, в то время как митогенный эффект образцов
биологического материала, полученного от старых
животных, достоверно выше, чем от молодых.
ЛИТЕРАТУРА
1. Алов М.Е., Аспиз М.Е., Казанцева И.А. Определение
митотического режима ткани в патологической
диагностике предраковых процессов и рака.
Методические указания. М., 1973. С. 1–14.
2. Бабаева А.Г., Зуев В.А. Явление переноса признаков
старения молодым мышам лимфоидными клетками
селезёнки старых сингенных доноров // Бюл.
эксперим. биол. и мед. 2007. Т. 144. № 7. С. 100–102.
3. Зуев В.А. Новая концепция механизма старения и
гибели мозга // Российской академии естественных
наук – 10 лет. Научные доклады. М., 2000. С. 106–114.
4. Зуев В.А. От прионных болезней к проблеме старения
и смерти // Вестник РАМН. 2001. № 11. С. 46–49.
5. Зуев В.А., Автандилов А.А., Игнатова Н.Г., Быковская
С.И. Искусственное старение мышей // Бюл.
эксперим. биол. и мед. 2003. Т. 135. № 9. С. 325–327.
6. Зуев В.А., Викторов И.В., Бородина Н.П. и др.
Накопление в стареющем мозге млекопитающих
фактора, резко стимулирующего пролиферативную
активность глии // Бюл. эксперим. биол. и мед. 2000.
Т. 129, № 3. С. 317–320.
7. Зуев В.А., Игнатова Н.Г., Автандилов Г.Г.
Накопление фактора старения в организме
млекопитающих, включая человека // Успехи
геронтол. 2005. Т. 17. С. 108–116.
8. Кондакова Л.И., Чудиновская Н.В., Брусованик В.И.
Влияние гидрокортизона на активность -глицероф
осфатдегидрогеназы в клетках глиобластомы мыши
ЭПНТ-5 // Архив анат., гистол. и эмбриол. 1981. Т. 80.
№ 5. С. 86–90.
9. Cortina M.I. Nedergaard M. Astrocytes in the aging
brain // J. Neurosci. Res. 2002. Vol. 67. P. 1–13.
10. Fraser H., McBride P.A. Paralleles and contrests between
scrapie and dementia of the Alzheimer type and aging
strategies and problems for experiments involving life
span studies // Srnilr dementia of the Alzheimer type.
Eds. J. Traber and W.H. Gispen. Berlin, Heidelberg. 1985.
P. 250–268.
11. Magistretti P.J., Pellerini L., Rothman D.L. Energy on
demand // Science. 1999. V. 283. P. 496–497.
12. Masters C.L., Multhaup G., Simms G. et al. Neuronal
origin of a cerebral amyloid: neurofibrillary tangles of
Alzheimer`s disease contain the same protein as the
amyloid ofplaque cores and blood vessels // EMBO J.
1985. Vol. 4. P. 2757–2763.
13. Sobel H. Ageing and age-associated disease // Lancet.
1970. Vol. 2(7684). P. 1191–1192.
ВЕСТНИК РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ ЕСТЕСТВЕННЫХ НАУК
2008/3
59
Скачать