ВЫДЕЛЕНИЕ ПОЛЕВОГО ИЗОЛЯТА ВИРУСА

ВЫДЕЛЕНИЕ ПОЛЕВОГО ИЗОЛЯТА ВИРУСА
ИНФЕКЦИОННОГО ГЕПАТИТА СОБАК
Абишов А.А., к.в.н.,
Казахский научно-исследовательский ветеринарный институт
Введение
Инфекционный гепатит собак – острое вирусное заболевание плотоядных,
сопровождающееся явлениями лихорадки, катара слизистых оболочек
дыхательных путей и кишечника, сопровождающееся воспалением и
некротическими изменениями в паренхиматозных органах, особенно в печени [1,
2].
Многообразие симптомов болезни затрудняет своевременную постановку
диагноза. Долгое время инфекционный гепатит собак диагностировали только на
основании эпизоотологических, клинических и патологоанатомических данных
[3]. В настоящее время для диагностики и идентификации возбудителя
инфекционного
гепатита
применяют
препараты,
выпускаемые
биопредприятиями дальнего зарубежья и России [4,5]. Отечественные
диагностические и профилактические препараты находятся на стадии
разработки. В отечественных литературных источниках отсутствуют данные о
выделении и изучении биологических свойств полевых изолятов вируса
инфекционного гепатита, циркулирующих на территории Республики Казахстан.
В связи с этим, целью наших исследований являлось выделение полевого
изолята вируса инфекционного гепатита и изучение его биологических свойств.
Материалы и методы
В исследованиях использовали 7 проб патологического материала (печень,
селезенка, кишечник, сердце, содержимое кишечника, кровь, носовые смывы),
собранные от больных и павших собак в возрасте от 2 до 18 месяцев с
клиническим признаками инфекционного гепатита. Все образцы патматериала
исследовали в реакции связывания комплемента (РСК) и диффузной
преципитации (РДП). Реакции ставили по общепринятым методикам с
использованием специфической сыворотки, изготовленной в лаборатории
вирусологии ТОО «КазНИВИ». Пробы вируса положительно выявленные в РСК
и РДП, вносили в монослой перевиваемой линии клеток МДСК для выделения и
изучения культурально-биологических свойств. Для полной идентификации
полевого изолята вируса ставили реакцию нейтрализации (РН) на культуре
клеток МДСК со специфической сывороткой против возбудителя
инфекционного гепатита.
Для определения спектра патогенности полевого изолята использовали
интактных взрослых кроликов, котят и щенков собак породы «Овчарка» 4-6 мес
возраста.
Результаты исследований и обсуждение
Исследованы 7 проб патологического материала, полученные от больных
и павших животных. В 5 пробах, исследованных в серологических реакциях,
1
возбудитель инфекции не удалось обнаружить, в 2 – в реакции диффузной
преципитации положительные результаты получены в цельном виде, а при
исследовании этих же проб в реакции связывания комплемента титры вируса
инфекционного гепатита колебались от 1:2 до 1:8.
Выделение полевого вируса инфекционного гепатита плотоядных из
патологического материала и его адаптацию проводили на перевиваемой линии
клеток МДСК. Для этого 10%-ой тканевой суспензией из печени инфицировали
культуру клеток МДСК. Для инфицирования использовали монослой клеток
трехсуточного возраста, без каких-либо деструктивных изменений. На 8-10
сутки после заражения в монослое клеток отмечались слабые
цитопатологические изменения. В последующих пассажах возбудитель
инфекции проявлял цитопатическое действие более активно, чем в первом
пассаже, которое характеризовалось округлением клеток и преломлением ими
светового потока с последующим отторжением от поверхности стекла. Всего в
культуре клеток проведено 3 последовательных пассажа. Результаты
исследований представлены в таблице 1.
Таблица 1 - Результаты изучения биологической активности полевого
изолята вируса инфекционного гепатита
№№
пассажей
Сроки
проявления
ЦПД, ч
Интенсивность
развития ЦПД, %
Титр вируса, lg ТЦД50/см3
I
II
III
72-96
72-96
48-72
45-60
60-75
70-80
3,25
4,50
5,25
Как видно из таблицы 1, при последовательном пассировании
цитопатогенное действие полевого изолята вируса инфекционного гепатита
повышалось в зависимости от пассажного уровня, вызывая характерные
цитопатогенные изменения в монослое клеток и накапливаясь в ней до 5,25 lg
ТЦД50/см3.
Идентификацию
возбудителя
болезни
проводили
в
реакции
нейтрализации. Реакцию ставили по общепринятой методике с использованием
референтных сывороток против инфекционного гепатита, чумы и
парвовирусного энтерита собак и антигена полевого изолята вируса чумы и
инфекционного гепатита. Для постановки реакции использовали вирусную
суспензию инфекционного гепатита, полученную на третьем пассаже.
Результаты проведенных исследований представлены в таблице 2.
2
Таблица 2 – Результаты постановки реакции нейтрализации
Наименование
вируса
Полевой изолят
№1
Разведение специфической сыво- Разведение специфической сывороротки против инфекционного тки против чумы плотоядных
гепатита
1:2
1:4 1:8 1:16
1:32
1:2
1:4
1:8
1:16 1:32
Разведение специфической сыворотки против парвовирусного энтерита
собак
1:2
1:4
1:8
1:16
1:32
----
++++
++++
++++
++++
- - - - - - - - - - - - ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++
--Примечания: «+» - наличие цитопатогенного действия вируса, «−» - отсутствие данного действия.
++++
++++
Полевой изолят №2
- - - - - - - - ++++
++++
++++
++++ ++++ ++++
-
3
++++
++++
Результаты, представленные в таблице 2, свидетельствуют о том, что
полевые изоляты инфекционного гепатита нейтрализованы со специфической
сывороткой в разведениях 1:8 и 1:16, а в реакции нейтрализации со
специфическими сыворотками против вирусов возбудителей чумы плотоядных и
парвовирусного энтерита собак отмечены характерные для возбудителя
инфекционного гепатита деструктивные изменения в монослое клеток, что
является свидетельством отсутствия специфического взаимодействия вируса с
антителом.
Для определения спектра патогенности полевых изолятов инфекционного
гепатита использовали по 5 голов взрослых кроликов, котят и щенков собак
породы «Овчарка». Все животные были свободны от антител против
возбудителя инфекционного гепатита. При подкожном инфицировании
животных клинические признаки, характерные для инфекционного гепатита,
отмечены только у щенят на 5-7 сутки после заражения, которые
характеризовались повышением температуры тела до 40,5ғС, рвотой с примесью
желчи, воспалением слизистых оболочек глаз, диареей с последующим
развитием запора. Из пяти инфицированных щенков трое пали на 14 сутки
после заражения, а 2 щенка выздоровели, но у одного из них отмечен
односторонний кератит – белое помутнение роговицы без явных признаков
гнойного воспаления конъюнктивы. При исследовании сыворотки крови
выздоровевших животных в РДП титры специфических антител достигали до
1:16. У остальных видов животных (кроликов и котят) признаки болезни не
отмечались, но исследования их сывороток в РДП также установили
серопозитивный ответ на введенный животным вирус инфекционного гепатита
собак.
Заключение
Вирусологическими исследованиями проб патологического материала
выделен вирусный возбудитель, который идентифицирован с помощью
биопробы на восприимчивых животных и в реакциях связывания комплемента,
диффузной преципитации и нейтрализации, в культуре клеток как вирус
инфекционного гепатита. Полевой изолят вируса инфекционного гепатита собак
обладает патогенностью только по отношению к щенкам собак, а у
инфицированных
кроликов
и
котят
индуцирует
образование
комплементсвязывающих, преципитирующих и вируснейтрализующих антител.
Литература
1.
Сюрин В.Н, Самуиленко А.Я., Соловьев Б.В., Фомина Н.В. Вирусные
болезни животных. М.: ВНИТИБП, 1998.-С. 268-283.
2.
Чижов В.А., Инфекционный гепатит песцов и серебристо-черных
лисиц /В кн.: Болезни пушных зверей, М. Колос, -1984. - С. 48-58.
3.
Сюрин В.Н, Белоусова Р.В., Фомина Н.В. Диагностика вирусных
болезней животных. М.: Колос, 1991. - С 177-183.
4.
Никольский Н.Н., Вахтин Ю.Б., Игнатова Т.Н. и др. Биология
клетки в культуре. Л.: НАУКА, 1984. - С 127-133.
4
5.
Эндрюс Х. Вирусы позвоночных. М. Колос, 1967. - С 237-245.
Түйін
Мақалада жүргізілген ғылыми жұмыстардың нәтижесінде иттердің
инфекциялық гепатиті қоздырғышының далалық штаммы бөлініп алынып,қайта
себілетін иттердің бүйрегінің жасушалар өсіндісінде МДСК бейімделіп,
бірқатар биологиялық қасиеттерін зерттеу нәтижелері келтірілген, және де осы
штаммның ауру тудыруда және ит күшіктерінің өлім-жітімге әкеліп соғатын
этиологиялық фактор екендігі анықталып, бөлініп алынған дала штаммы
комлементті байланыстыру, диффузиялы преципитация және бейтараптау
реакцияларында идентификацияланды. Инфекциалық гепатит вирусының
далалық штаммын жануарлардың басқа да түрлеріне (ақ қояндар мен мысықтар)
жұқтырғанда жергілікті штаммның ит күшіктеріне ғана патогенділігі жоғары
екендігі белгілі болды.
Сонымен қатар мақалада
комлементті байланыстыру, диффузиялы
преципитация және бейтараптау реакцияларының жануарлардың тірі кезінде
инфекциялық гепатитті басқа вирустық аурулардан ажыратуда тиімді және
диагностикалық бағалы әдістер екендігі келтірілген.
Summary
Infectious canine hepatitis is a contagious viral disease of carnivorous animals.
In recent years this infection occurred among dogs as mono disease and in association
with other infections. This article describes the results of research studies in outfluxing
of causing agent field isolate using a passaged culture line of MDSK canine kidney
cells and of its adaptation to this culture through consecutive passaging. Biological
properties of Infectious canine hepatitis field isolate had been studied and as the result
it was established that death and illness of dog puppies are caused by field infectious
canine hepatitis strain. Field virus strain excreted from vicious material had been
identified in complement fixation, diffuse precipitation and neutralization tests. When
infecting various animal species it was discovered that field canine hepatitis virus has
a disease-evoking power in dog puppies only, but in other animal species (rabbits and
kittens) it raises specific antibodies response.
The article also discusses various life-time diagnostics methods of infectious
canine hepatitis, such as Complement Fixation Test, HLG (Diffuse Precipitation Test)
and NT (Neutralization Test) and their effectiveness and diagnostic consideration with
infectious canine hepatitis. Use of specific serums allows to differentiate viral hepatitis
of carnivorous animals from other viral infections.
5
6