На правах рукописи ПЕРСПЕКТИВНЫЕ ШТАММЫ БАКТЕРИЙ

На правах рукописи
АСАТУРОВА АНЖЕЛА МИХАЙЛОВНА
ПЕРСПЕКТИВНЫЕ ШТАММЫ БАКТЕРИЙ –
ПРОДУЦЕНТЫ МИКРОБИОПРЕПАРАТОВ ДЛЯ СНИЖЕНИЯ
ВРЕДОНОСНОСТИ ФУЗАРИОЗА НА ПОДСОЛНЕЧНИКЕ
06.01.11 – Защита растений
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург – 2009
Работа выполнена в Государственном научном учреждении Всероссийском
научно-исследовательском институте масличных культур имени В.С. Пустовойта
Российской
академии
сельскохозяйственных
наук
(ГНУ
ВНИИМК
Россельхозакадемии)
Научный руководитель: доктор биологических наук
Маслиенко Любовь Васильевна
Официальные оппоненты: доктор биологических наук
Смирнов Олег Всеволодович
кандидат биологических наук
Быкова Галина Александровна
Ведущая организация: Государственное научное учреждение Всероссийский
научно-исследовательский институт биологической защиты растений Российской
академии сельскохозяйственных наук
Защита состоится « 18 » июня 2009 г. в 10 часов на заседании диссертационного
совета Д 006.015.01 во Всероссийском научно-исследовательском институте защиты
растений по адресу: 196608, Санкт-Петербург-Пушкин, шоссе Подбельского, д. 3,
факс (812)470-51-10, e-mail: vizrspb@mail333.com
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийского научноисследовательского института защиты растений.
Автореферат разослан « 15 » мая 2009 г.
Ученый секретарь
Диссертационного совета,
кандидат биологических наук
Г.А. Наседкина
1
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Фитосанитарная нестабильность агробиоценозов, а
также ухудшение общей экологической ситуации в регионах России требуют новых
подходов в развитии и использовании средств и способов биологической защиты
(Павлюшин, 1995). Необходимо более широко использовать весь арсенал
экологизированной защиты растений, в том числе и микробиометод.
Микробиологические препараты могут и уже становятся альтернативой пестицидам
(Кандыбин, 2006). Кроме защитного эффекта, действующие агенты биопрепаратов
способны восстанавливать и активизировать природные регуляторные механизмы в
агробиоценозах. К достоинствам микробиологических средств защиты растений
можно отнести специфичность действия, высокую экологичность, возможность
решения проблемы резистентности популяций фитопатогенов к пестицидам.
В нашей стране, наряду с такими вредоносными болезнями подсолнечника, как
белая, серая, пепельная гнили, ложная мучнистая роса, альтернариоз, вертициллез и
фомопсис, все большее распространение получает фузариоз, вызывая корневые гнили
всходов, трахеомикозные увядания растений, а также загнивание корзинок и семян
(Маслиенко, Мурадасилова, 2000; Саукова, 2001; Антонова, 2002; Бородин, Котлярова,
Терещенко, 2006). Отмечается, что при проявлении болезни после цветения и
формирования семян потери урожая составляют 30,0-40,0 % (Выприцкий, Плахотник,
Выприцкая, 2006). Решение проблемы защиты подсолнечника от фузариоза связано с
разработкой комплекса эффективных мероприятий, включающего также и
микробиологический метод. В нашей стране зарегистрированы и рекомендованы для
защиты сельскохозяйственных культур от фузариозной корневой гнили биопрепараты
на основе штаммов бактерий: планриз, агат-25К, псевдобактерин-2, алирин-Б, гамаир,
фитоспорин-М, Елена, бактрил, бактофит, бисолбисан, бинорам (Справочник
пестицидов и агрохимикатов, разрешенных к применению на территории Российской
Федерации, 2008). За рубежом также существует ряд коммерческих биопрепаратов на
основе бактериальных штаммов для защиты зерновых, овощных, бобовых и
декоративных культур от возбудителей фузариоза (McSpadden Gardener, Fravel, 2002).
Анализ мировой литературы выявил отсутствие данных по микробиологической
защите подсолнечника от возбудителей фузариоза.
Поэтому в настоящее время является актуальным поиск и выделение
высокоактивных штаммов бактерий-антагонистов с целью создания на их основе
эффективных биофунгицидов комплексного действия для снижения вредоносности
фузариоза на подсолнечнике.
Цель и задачи исследований.
Цель настоящей работы – осуществить поиск, выделение и изучение
эффективных и экологически безопасных бактериальных биоагентов – продуцентов
биопрепаратов для снижения вредоносности фузариоза на подсолнечнике.
В задачу исследований входило:
1. Осуществить поиск и скрининг выделенных штаммов бактерий по
антагонистической, ростостимулирующей активности и защитному эффекту от
возбудителей фузариоза.
2
2. Изучить биологические особенности, спектр и механизм антагонистического
действия перспективных штаммов бактерий.
3. Оптимизировать процессы роста и развития перспективных штаммов
бактерий-антагонистов.
4. Разработать элементы технологии производства микробиопрепаратов.
5. Установить совместимость штаммов бактерий-антагонистов с пестицидами,
рекомендуемыми на подсолнечнике.
6. Разработать элементы технологии применения лабораторных образцов
микробиопрепаратов и их комбинаций для защиты семян и вегетирующих растений
подсолнечника от возбудителей фузариоза.
Научная новизна.
1. Впервые создана коллекция штаммов бактерий-антагонистов возбудителей
фузариоза подсолнечника, перспективных для создания новых полифункциональных
микробиопрепаратов.
2. В результате ступенчатого скрининга отобраны и идентифицированы новые
перспективные штаммы бактерий Fa 4-1 Bacillus subtilis, D 7-1 Bacillus subtilis, Sgrc-1
Pseudomonas fluorescens, Oif 2-1 Pseudomonas sp. для создания микробиопрепаратов
полифункционального типа действия.
3. Выявлен широкий спектр антагонистического действия новых перспективных
штаммов бактерий против основных возбудителей фузариоза и других патогенов
подсолнечника.
4. Изучены механизмы действия новых штаммов антагонистов в отношении
фитопатогенных грибов рода Fusarium.
5. Оптимизированы условия культивирования штаммов – продуцентов новых
микробиопрепаратов.
6. Впервые установлена эффективность новых микробиопрепаратов и их
комбинаций против возбудителей фузариоза и сохранение урожая подсолнечника.
7. Определена совместимость новых микробиопрепаратов с пестицидами с
целью применения в интегрированной системе защиты подсолнечника.
Научно-практическая значимость работы.
1. Создана коллекция перспективных штаммов бактерий-антагонистов родов
Bacillus и Pseudomonas – продуцентов новых полифункциональных биопрепаратов
для использования в сельскохозяйственной практике.
2. Разработаны элементы технологии производства и применения
лабораторных образцов микробиопрепаратов на основе перспективных биоагентов
для защиты семян и вегетирующих растений в интегрированной системе защиты
подсолнечника.
3. Инкрустирование семян подсолнечника микробиопрепаратами и их
комбинациями на фоне искусственного заражения возбудителем фузариоза в
лабораторных условиях в почве обеспечивало биологическую эффективность до
77,3 %, а в полевых условиях в зависимости от состояния популяции патогена и
складывающихся погодных условий до 48,7 %, при эффективности эталона виннера –
до 18,1 %. Величина сохраненного урожая от применения лабораторных образцов
микробиопрепаратов составляла до 0,47 т/га.
3
Апробация работы. Результаты исследований докладывались на ежегодных
методических комиссиях ГНУ ВНИИМК Россельхозакадемии по аттестации
аспирантов (2005-2008 гг.); Международной научно-практической конференции
«Технологии создания биологических средств защиты растений на основе
энтомофагов, энтомопатогенов, микробов-антагонистов и применения их в открытом
и закрытом грунтах», ВНИИБЗР, Краснодар, 2006 г.; VIII региональной научнопрактической
конференции
молодых
ученых
«Научное
обеспечение
агропромышленного комплекса», КубГАУ, Краснодар, 2006 г.; IV Международной
конференции молодых ученых и специалистов: «Актуальные вопросы селекции,
технологии и переработки масличных культур», Краснодар, 2007 г.; IV
Всероссийской научной конференции молодых ученых и студентов: «Современное
состояние и приоритеты развития фундаментальных наук в регионах», Анапа, 2007 г.;
Международной научно-практической конференции: «Новые технологии в
экспериментальной биологии и медицине», Ростов-на-Дону, 2007 г.; I Всероссийской
научно-практической конференции молодых ученых «Научное обеспечение
агропромышленного комплекса», КубГАУ, Краснодар, 2007 г.; VI международной
научной конференции: «Современное состояние и перспективы развития
микробиологии и биотехнологии», Минск, 2008 г.; конференции получателей грантов
регионального конкурса Российского фонда фундаментальных исследований и
администрации Краснодарского края «ЮГ», п. Агой, 2008 г.
Работа
выполнена
при
финансовой
поддержке
грантов
РФФИ
№ 08-04-99010-р_офи и программы У.М.Н.И.К. Фонда содействия развитию малых
форм предприятий в научно-технической сфере, государственный контракт № 7967.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 работ, из них одна в
издании, рекомендуемом ВАК.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 176 страницах
машинописного текста и состоит из введения, семи глав, выводов, практических
рекомендаций, списка литературы, приложений, содержит 21 таблицу, 35 рисунков.
Список библиографических источников включает 227 наименований, в том числе 114
на иностранных языках.
Место проведения работы. Научно-исследовательская работа проводилась на
центральной
экспериментальной
базе
(ЦЭБ)
Всероссийского
научноисследовательского института масличных культур имени В.С. Пустовойта Российской
академии сельскохозяйственных наук (г. Краснодар) в период 2005-2008 гг.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
1. Обзор литературы
Представлены сведения о распространении и вредоносности фузариоза на
подсолнечнике. Приведены данные по практическому применению штаммовантагонистов различных таксономических групп в качестве средств подавления
возбудителей фузариоза различных сельскохозяйственных культур.
Рассмотрены механизмы биологического контроля фитопатогенных грибов рода
Fusarium бактериями антагонистами. Собраны и представлены данные о
4
существующих в нашей стране и в мире микробиопрепаратах на основе бактерийантагонистов для защиты растений от возбудителей фузариоза.
2. Условия и методы исследований
Объектом исследований являлись: штаммы бактерий-антагонистов возбудителей
фузариоза, тест-культуры возбудителей болезней подсолнечника, лабораторные
образцы микробиопрепаратов и сорта подсолнечника – Р-453 и Бузулук.
Использованные в работе патогенные штаммы представителей рода Fusarium
(F. oxysporum var. orthoceras (App. et Wr.) Bilai, F. sporotrichiella Bilai var. poae (Pk.)
Wr. emend Bilai, F. semitectum Berk. et Rav., F. gibbosum App. et Wr. emend Bilai,
F. javanicum Koord, F. solani (Mart.) App. et Wr. и F. moniliforme Sheld.), а также ряда
других фитопатогенов, распространенных на подсолнечнике: Sclerotinia sclerotiorum
(Lib.) dBy, Sclerotium bataticola Taub., Alternaria sp. Nees, Phomopsis helianthi Munt.Cvet., Mihal. et Petr. и Verticillium dahliae Kleb. были взяты из коллекции
микроорганизмов лаборатории биометода ВНИИМК.
Для выделения бактерий, проявляющих антагонизм в отношении патогенных
фузариозных грибов, послужили образцы почв из центральной и предгорной зон
Краснодарского края, центральной зоны республики Адыгея, а также из ризосферы,
корней, семян больных и здоровых растений, листьев и растительных остатков
подсолнечника, пораженных фузариозом. Для этого использовали методы: ловушек,
почвенного разведения,
обрастания почвенных комочков, последовательного
отмывания корней, листьев и семян, прямой инокуляции различных частей растений
подсолнечника (Ваксман, 1947; Новогрудский, 1956; Егоров, 1957; Кураков, 2001;
Теппер, Шильникова, Переверзева, 2004; Марфенина, 2005).
Ступенчатый скрининг выделенных микроорганизмов включал: выявление
антагонистической активности выделенных штаммов in vitro методом встречных
культур (Егоров, 1957) на картофельно-сахарозном агаре (КСА) и среде Кинга В;
оценку биологической эффективности отобранных штаммов на фоне искусственного
заражения семян во влажной камере в лабораторных условиях (Зайчук, 1983);
определение колонизирующей активности и защитного эффекта корней проростков
подсолнечника (Антонова, Саукова, 2006); оценку активных штаммов бактерийантагонистов на фитотоксичность и ростостимулирующую активность, а также
полевые испытания.
Морфолого-культуральные
признаки
и
физиологические
свойства
перспективных штаммов бактерий-антагонистов изучали по общепринятым методам
(Градова, Бабусенко, Горнова, 2004; Теппер, Шильникова, Переверзева, 2004;
Нетрусов и др., 2005). Подбор оптимальных искусственных питательных сред и
условий культивирования на них перспективных штаммов бактерий-антагонистов
проводили на жидких питательных средах (мясо-пептонный бульон (МПБ), Кинга В,
Чапека для бактерий, пептон-дрожжевая, Тайлона 3).
Идентификацию перспективных штаммов бактерий-антагонистов проводили в
Центре «Биоинженерия» РАН (г. Москва).
Антибиотическую активность штаммов определяли методом разведений
(Егоров, 2004). Ферментативную активность штаммов бактерий-антагонистов
устанавливали с использованием различных тестов (Лысак, Добровольская,
5
Скворцова, 2003; Недорезков, 2003). Механизм взаимодействия штаммов бактерийантагонистов с возбудителями фузариоза изучали с помощью светового микроскопа
«Биолам». Фотографирование и видеосъемку проводили цифровым фотоаппаратом
по оригинальному методу.
Лабораторные образцы микробиопрепаратов на основе перспективных штаммов
бактерий были наработаны в лаборатории биометода ВНИИМК. Количество
колониеобразующих единиц (КОЕ) в жидкой культуре (ЖК) микробиопрепаратов
определяли методом Коха (Нетрусов и др., 2005).
Совместимость микробиопрепаратов на основе штаммов бактерий-антагонистов
с перспективными пестицидами определяли, используя модифицированный метод
диффузии в агар (Егоров, 1957; Маслиенко, 1999).
Оценку биологической эффективности микробиопрепаратов на основе штаммов
бактерий-антагонистов и их комбинаций проводили в лабораторных условиях на
фоне искусственного заражения F. oxysporum var. orthoceras, а также в полевых
(площадь делянки 28 м2, повторность трехкратная) и производственном (площадь
делянки 1,36 га) опытах на естественном фоне поражения болезнями на ЦЭБ
ВНИИМК и в Щербиновском районе Краснодарского края. Эффективность защитных
мероприятий определяли сравнением данных учетов в контроле и в вариантах опытов
по поражению растений болезнями и урожаю. Экономическую эффективность
применения лабораторных образцов микробиопрепаратов на основе штаммов
бактерий-антагонистов рассчитывали в лаборатории экономики ВНИИМК.
Математическую обработку опытных данных проводили с использованием
статистических расчетов (Лакин, 1980) и стандартных компьютерных программ.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
3. Поиск и отбор штаммов бактерий-антагонистов возбудителей фузариоза
подсолнечника
3.1 Выделение штаммов бактерий-антагонистов возбудителей фузариоза
подсолнечника из природных источников
В результате выполнения работы по поиску антагонистов возбудителей
фузариоза подсолнечника из различных источников в 2005 г. было выделено 425
штаммов бактерий (таблица 1).
Таблица 1 – Количество штаммов бактерий, выделенных из различных природных
источников
Краснодарский край, республика Адыгея, 2005 г.
Источник выделения
Ризосфера
Ризоплана
Растительные остатки
Листья
Семена
Всего
Количество выделенных штаммов, шт.
292
70
39
13
11
425
Максимальное количество бактерий выделено из ризосферы – 292 штамма,
минимальное – из семян и листьев – 11-13 штаммов.
6
3.2 Первичный скрининг выделенных штаммов бактерий
При испытании антагонистической активности штаммов бактерий in vitro в
качестве тест-объекта на начальном этапе скрининга был выбран патогенный и
токсичный изолят F. sporotrichiella var. poae.
В результате проведения скрининга выделено 16 перспективных штаммов, из
них только 3 бактериальных изолята выделены из корней здоровых растений, а
остальные 13 – из пораженных фузариозом растений и других образцов
растительного происхождения.
Впоследствии, среди этих 16 штаммов был проведен повторный скрининг к
патогенному изоляту F. oxysporum var. orthoceras как наиболее распространенному
виду возбудителей фузариоза подсолнечника. В результате исследованные штаммы
по механизму антагонистического действия на патогены разделили на две группы:
- штаммы, образующие стерильную зону антагонистического действия (таблица 2);
- штаммы, ингибирующие развитие патогенов, занимая бόльшую площадь
питательной среды чашки Петри (таблица 3).
Таблица 2 – Активность бактериальных штаммов, образующих стерильную зону
антагонистического действия, в отношении грибов рода Fusarium
Краснодар, ВНИИМК, 2005 г.
Штамм
Lf-1-1
Osrf 4-3
Osif 3-2
Oif 2-I
Sgc-2
Sgrc-1
Far-1
Диаметр зоны ингибирования, мм
F. sporotrichiella var. poae
F. oxysporum var. orthoceras
инкубация, сутки
инкубация, сутки
7-е
13-е
7-е
13-е
22,7 ± 0,7
18,0 ± 1,2
21,0 ± 2,1
13,0 ± 0,6
29,0 ± 1,0
27,7 ± 0,3
19,0 ± 0,6
12,3 ± 0,3
22,7 ± 1,5
22,7 ± 1,5
17,3 ± 0,3
13,0 ± 0,6
18,0 ± 1,2
12,3 ± 0,9
17,7 ± 0,3
10,7 ± 0,7
16,3 ± 1,3
13,7 ± 0,3
19,7 ± 0,7
16,3 ± 1,2
11,0 ± 1,0
5,0 ± 0
20,3 ± 0,9
9,0 ± 0,6
11,7 ± 0,3
10,3 ± 0,7
19,7 ± 0,9
14,3 ± 1,2
Таблица 3 – Активность бактериальных штаммов, ингибирующих развитие грибов
рода Fusarium
Краснодар, ВНИИМК, 2005 г.
Штамм
Контроль
Orf 1
D 1-1
D 1-3
D 7-1
D 10
Fa 4-1
Fa 4-2
Far 8
Fz 9
Рост мицелия патогена от посевного блока, мм
F. sporotrichiella var. poae
F. oxysporum var. orthoceras
инкубация, сутки
инкубация, сутки
-е
-е
-е
7
13
7
13-е
75,0 ± 0
75,0 ± 0
75,0 ± 0
75,0 ± 0
7,3 ± 0,3
11,0 ± 0,6
10,7 ± 1,8
19,7 ± 2,6
10,3 ± 1,9
11,3 ± 1,9
11,0 ± 1,0
19,3 ± 1,9
7,0 ± 2,1
7,7 ± 1,8
19,3 ± 2,3
23,0 ± 4,0
17,7 ± 0,7
27,3 ± 1,2
18,7 ± 0,7
26,7 ± 0,9
17,7 ± 1,2
23,0 ± 1,2
22,0 ± 0
34,7 ± 2,3
15,7 ± 0,3
18,7 ± 2,0
16,3 ± 1,9
22,7 ± 1,5
20,0 ± 1,2
23,3 ± 3,5
22,7 ± 2,7
27,0 ± 1,5
19,7 ± 0,7
24,3 ± 1,8
28,0 ± 0
30,7 ± 0,7
18,7 ± 1,7
22,3 ± 1,3
19,3 ± 0,7
30,0 ± 1,2
7
Исследование активных штаммов на возможное патогенное или токсичное
действие на культуру подсолнечника проводили методом замачивания семян и
проростков подсолнечника с подрезанной корневой системой в бактериальной
суспензии. Анализ данных показал, что тестируемые штаммы не оказывали
негативного влияния на энергию прорастания и всхожесть семян, а также не
вызывали увядания проростков подсолнечника.
Известно, что успешный биоагент должен обеспечивать не только защитный
эффект, но и стимулирующее действие на рост и развитие растения. Параметрами для
анализа служили длина и масса корня и побега.
Существенное увеличение длины корня и побега было отмечено лишь в
отдельных вариантах, но при этом практически все исследуемые штаммы
увеличивали массу корня на 41,2-100 % и массу побега – на 31,6-55,3 %, за
исключением штамма Osif 3-2 (таблица 4).
Таблица 4 – Влияние активных штаммов бактерий-антагонистов
на рост и развитие проростков подсолнечника сорта Р-453
Краснодар, ВНИИМК, 2006 г.
Вариант
Контроль
Lf-1-1
Osrf 4-3
Osif 3-2
Oif 2-I
Sgc-2
Sgrc-1
Far-1
Orf 1
D 1-1
D 1-3
D 7-1
D 10
Fa 4-1
Fa 4-2
Far 8
Fz 9
НСР05
г
0,17
0,28
0,27
0,18
0,30
0,27
0,26
0,25
0,27
0,25
0,28
0,31
0,25
0,29
0,29
0,34
0,24
0,06
Масса корня
в % к контролю
64,7
58,8
5,9
76,5
58,8
52,9
47,1
58,8
47,1
64,7
82,4
47,1
70,6
70,6
100
41,2
г
0,38
0,52
0,51
0,39
0,59
0,58
0,55
0,53
0,54
0,52
0,53
0,56
0,50
0,57
0,54
0,58
0,50
0,07
Масса побега
в % к контролю
36,8
34,2
2,6
55,3
52,6
44,7
39,5
42,1
36,8
39,5
47,4
31,6
50,0
42,1
52,6
31,6
Существенное увеличение массы корня проростков происходило за счет
интенсивного развития боковых корней у основания и/или по всей длине главного
корня.
3.3 Вторичный скрининг выделенных штаммов бактерий
Важным аспектом при отборе потенциальных биоагентов – продуцентов
биопрепаратов является не только проявление антифунгальной активности in vitro,
способности оказывать положительное влияние на рост и развитие культуры, но и
обеспечивать эффективную защиту семян и растений в лабораторных и полевых
условиях.
8
Вторичный скрининг был проведен на фоне искусственного заражения семян
подсолнечника сорта Р-453 патогенным микромицетом F. sporotrichiella var. poae методом
агаровых блоков в лабораторных условиях. При этом для каждого варианта апробировали
различные нормы расхода ЖК: 2,0, 3,0 и 4,0 л/т. На фоне поражения фузариозом в
контроле 92,3 % биологическая эффективность лучших вариантов (Osif 3-2, Sgrc-1, Oif 2-I,
Fa 4-1, D 7-1 и Far-1) из шестнадцати испытанных, составила от 21,7 до 36,1 %. При этом
максимальный защитный эффект был получен с нормой расхода 2,0-3,0 л/т.
Эффективность биологического агента во многом определяется не только его
способностью обеспечивать защиту семян, но и колонизировать растущий корень, это
особенно важно в случае биоконтроля почвенных патогенов, вызывающих корневые
гнили.
Для выявления защитного эффекта проростков подсолнечника посредством
колонизации активными штаммами корней, двухдневные проростки подсолнечника,
полученные при проращивании семян, обработанных ЖК биопрепаратов, размещали в
отверстиях перфорированной чашки Петри так, чтобы кончики корней касались колонии
патогенного изолята. Высокая колонизирующая активность корня и одновременно
защитный эффект на жестком фоне заражения F. sporotrichiella var. poae выявлена при
обработке семян ЖК штаммов Osif 3-2, Oif 2-I, Sgrc-1, Fa 4-1 и D 7-1 (таблица 5).
Таблица 5 – Влияние обработки семян подсолнечника сорта Р-453 жидкой культурой
бактериальных штаммов на степень поражения проростков, на фоне искусственного
заражения F. sporotrichiella var. poae
Краснодар, ВНИИМК, 2006 г.
Вариант
Поражено проростков, %
степень повреждения главного корня, баллы
0
1
2
3
4
5
6
Контроль без инфекции
100
Контроль с инфекцией
0,8
(F. sporotrichiella var. poae)
F. sporotrichiella var. poae + Osrf 4-3
5,0
F. sporotrichiella var. poae + Osif 3-2
0
F. sporotrichiella var. poae + Oif 2-I
0
F. sporotrichiella var. poae + Sgc-2
5,0
F. sporotrichiella var. poae + Sgrc-1
5,0
F. sporotrichiella var. poae + Far-1
5,0
F. sporotrichiella var. poae + Orf 1
5,0
F. sporotrichiella var. poae + D 1-1
15,0
F. sporotrichiella var. poae + D 1-3
15,0
F. sporotrichiella var. poae + D 7-1
0
F. sporotrichiella var. poae + D 10
0
F. sporotrichiella var. poae + Fa 4-1
0
F. sporotrichiella var. poae + Fa 4-2
5,0
F. sporotrichiella var. poae + Far 8
0
F. sporotrichiella var. poae + Fz 9
0
Примечание:
1-3 балла – жизнеспособные проростки;
4-6 балла – нежизнеспособные проростки.
9
-
-
-
-
-
-
8,3
11,7
20,0
38,3
19,2
0,8
30,0
40,0
45,0
35,0
45,0
10,0
25,0
25,0
30,0
50,0
40,0
45,0
20,0
10,0
15,0
25,0
25,0
45,0
35,0
20,0
20,0
10,0
30,0
25,0
35,0
25,0
20,0
15,0
40,0
40,0
25,0
25,0
10,0
15,0
30,0
65,0
50,0
20,0
0
15,0
15,0
20,0
25,0
40,0
40,0
15,0
0
0
10,0
0
0
10,0
10,0
30,0
0
20,0
15,0
35,0
10,0
5,0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
В этих вариантах бόльшая часть проростков оказалась жизнеспособна, тогда как
в контроле до 58,3 % проростков были нежизнеспособны.
Принимая во внимание положение о том, что успешный биоагент должен
обладать комплексом положительных свойств на растение (Боронин, 1998; Штерншис
и др., 2003), мы объединили весь спектр полученных экспериментальных данных по
скринингу активных штаммов бактерий-антагонистов (рис. 1).
Рисунок 1 – Защитный эффект и ростостимулирующее действие перспективных
штаммов бактерий-антагонистов при обработке семян подсолнечника
сорта Р-453 (2005-2006 гг.)
– Защитный эффект бактериальных штаммов прорастающего семени на фоне
искусственного заражения F. sporotrichiella var. poae
(количество здоровых растений);
– Защитный эффект и колонизирующая активность штаммов бактерий проростков
подсолнечника на фоне искусственного заражения F. sporotrichiella var. poae
(количество жизнеспособных растений);
– Ростостимулирующее действие (увеличение массы корня).
В результате анализа полученных данных для дальнейшей работы в качестве
основы биопрепаратов нами были отобраны штаммы Oif 2-1 и Sgrc-1, относящиеся к
флюоресцирующим представителям рода Pseudomonas, а также штаммы Fa 4-1 и
D 7-1, относящиеся к роду Bacillus, обеспечивающие на жестком фоне
искусственного заражения возбудителями фузариоза эффективную защиту семян и
проростков подсолнечника, активно колонизирующие корень и оказывающие
ростостимулирующее действие на культуру подсолнечника (увеличение массы корня
на 52,9-82,4 %, массы побега – на 44,7-55,3 %).
Отобранные штаммы и их комбинации испытывались на фоне искусственного
заражения F. oxysporum var. orthoceras в почве, так как способность обеспечивать
защиту от патогенов на ранних этапах вегетации растений является важным
критерием эффективности действия биоагентов против корневых гнилей (таблица 6).
10
Таблица 6 – Защитный эффект обработки семян подсолнечника сорта Р-453
микробиопрепаратами на основе штаммов бактерий-антагонистов на фоне
искусственного заражения F. oxysporum var. orthoceras в лабораторных условиях в почве
Краснодар, ВНИИМК, 2006-2007 гг.
Вариант
Контроль без инфекции
Контроль с инфекцией
(F. oxysporum var. orthoceras)
F. oxysporum var. orthoceras + Fa 4-1, ЖК
F. oxysporum var. orthoceras + D 7-1, ЖК
F. oxysporum var. orthoceras + Sgrc-1, ЖК
F. oxysporum var. orthoceras + Oif 2-I, ЖК
F. oxysporum var. orthoceras + Fa 4-1 + D 7-1, ЖК
F. oxysporum var. orthoceras + Fa 4-1 + Sgrc-1, ЖК
F. oxysporum var. orthoceras + D 7-1 + Sgrc-1, ЖК
F. oxysporum var. orthoceras + Sgrc-1 + Oif 2-I, ЖК
НСР05
Всхожесть,
%
Поражено
фузариозом, %
Биологическая
эффективность, %
Средняя
масса, г
97,8
2,2
-
0,91
0,18
66,7
55,0
-
1,00
0,07
87,8
71,1
77,8
90,0
73,3
71,1
78,9
71,1
24,9
46,1
33,6
12,5
34,3
47,7
26,7
39,8
54,7
16,2
38,9
77,3
37,6
13,3
51,5
27,6
1,20
1,12
1,13
1,35
1,20
1,11
1,11
1,13
0,13
0,12
0,08
0,10
0,16
0,11
0,11
0,10
0,13
0,05
побега корня
Анализ полученных данных выявил перспективный биоагент Oif 2-I,
проявивший максимальную биологическую эффективность – 77,3 %. В этом варианте
даже средняя масса корня растений подсолнечника на фоне заражения патогеном
существенно не отличалась от массы корня в контроле без внесения инфекции: 0,16 и
0,18 г соответственно. Хорошая биологическая эффективность отмечена в вариантах
со штаммами Fa 4-1 (54,7 %), Sgrc-1 (38,9 %) и сочетания штаммов D 7-1 + Sgrc-1
(51,5 %) и Fa 4-1 + D 7-1 (37,6 %).
4. Изучение новых штаммов бактерий-антагонистов
Основываясь на данных генетической идентификации, проведенной в центре
«Биоинженерия» РАН Кузнецовым Б.Б., штаммы Fa 4-1 и D 7-1 отнесены к виду
Bacillus subtilis, штамм Sgrc-1 – к Pseudomonas fluorescens, штамм Oif 2-1 – к
Pseudomonas sp. Штаммы депонированы в коллекции микроорганизмов
Всероссийского института защиты растений (ВИЗР).
4.1 Морфолого-культуральная характеристика перспективных штаммов
бактерий-антагонистов
Морфолого-культуральные признаки штаммов бактерий-антагонистов рода
Bacillus
Клетки палочковидные с закругленными концами, подвижные, одиночные или
соединены в цепочки. Размеры у штамма Fa 4-1 B. subtilis 0,8-1,0 х 2,2-3,0 мкм, у
штамма D 7-1 B. subtilis – 0,5-0,8 х 1,8-2,8 мкм. Имеются споры, расположенные в
клетке не строго центрально. Окраска по Граму положительная.
11
Культуральные признаки штаммов бацилл-антагонистов изучали на двух средах:
мясо-пептонном агаре (МПА) и КСА. На МПА форма колоний круглая с
фестончатым краем, поверхность гладкая, край волнистый. Колонии срастающиеся с
агаром, блестящие в центре и бархатистые по краю, бесцветные. Структура колоний
мелкозернистая, консистенция сухая. Диаметр колоний на вторые сутки инкубации 13 мм у штамма Fa 4-1 B. subtilis и 1-5 мм у штамма D 7-1 B. subtilis. На КСА у штамма
Fa 4-1 B. subtilis формируются колонии ризоидной формы с лопастным или
неправильным краем, тогда как у штамма D 7-1 B. subtilis колонии круглые с
фестончатым краем или ризоидные, край колоний зубчато-лопастной. Колонии так
же, как и на МПА, срастающиеся с агаром, блестящие в центре и бархатистые по
краю, бесцветные. Структура колоний струйчатая, консистенция сухая. Диаметр
колоний на вторые сутки инкубации у обоих штаммов 3-9 мм.
Морфолого-культуральные признаки штаммов бактерий-антагонистов
рода Pseudomonas
Клетки палочковидные, подвижные, одиночные или соединены попарно.
Размеры у штамма Sgrc-1 P. fluorescens 0,4-0,7 х 1,4-3,1 мкм, у штамма Oif 2-I
Pseudomonas sp. – 0,4-0,7 х 1,7-3,0 мкм. Споры отсутствуют. Окраска по Граму
отрицательная.
Культуральные признаки псевдомонад изучали на МПА и среде Кинга В. На
этих средах форма колоний круглая, поверхность гладкая. Профиль колоний
выпуклый, край на МПА гладкий, на среде Кинга В – гладкий, реже волнистый.
Колонии блестящие, просвечивающиеся, пигментированные (желто-зеленый
флюоресцирующий пигмент, диффундирующий в среду). Структура колоний
однородная, консистенция слизистая. Диаметр колоний на вторые сутки инкубации у
обоих штаммов на МПА 1-5 мм; на среде Кинга В – 2-6 мм.
4.2 Физиологические признаки перспективных штаммов бактерий-антагонистов
Разработка микробиопрепаратов комплексного действия предусматривает
изучение основных параметров культивирования перспективных штаммов бактерийантагонистов. Для этого были изучены физиологические признаки перспективных
биоагентов: температура культивирования и реакция среды, источники углеродного и
азотного питания.
Установлен температурный оптимум для культивирования перспективных
штаммов: Fa 4-1 B. subtilis – 30,0-35,0 0С, D 7-1 B. subtilis – 30,0 0С, Sgrc-1
P. fluorescens и Oif 2-1 Pseudomonas sp. – 20,0-25,0 0С. Существенным достоинством
псевдомонад по сравнению с бациллярными штаммами была способность к
активному росту при более низких температурах. Несмотря на то, что титр клеток
оставался высоким вне зависимости от температурного режима, повышение
температуры культивирования до 30,0-35,0 0С приводило к появлению клеток с
отсутствием желто-зеленого внеклеточного пигмента, что связано с потерей клетками
антифунгальной активности (Свешникова, 2003).
Определен оптимум рН для выращивания перспективных штаммов: D 7-1
B. subtilis – 6,0-7,0, Fa 4-1 B. subtilis, Sgrc-1 P. fluorescens и Oif 2-1 Pseudomonas sp. –
6,0-8,0. Установлены оптимальные источники углерода: для всех исследуемых
12
штаммов – глюкоза, сахароза, меласса, а для представителей рода Pseudomonas еще и
глицерин. Оптимальным источником азота для всех перспективных биоагентов был
азотнокислый натрий, для штамма Fa 4-1 B. subtilis также пептон и кукурузный
экстракт, для D 7-1 B. subtilis – дрожжевой и кукурузный экстракты, а для штаммов
Sgrc-1 P. fluorescens и Oif 2-1 Pseudomonas sp. – пептон и дрожжевой экстракт.
Полученные экспериментальные данные использованы для разработки
элементов технологии производства микробиопрепаратов комплексного действия на
основе перспективных штаммов бактерий-антагонистов с высокой антифунгальной и
ростостимулирующей активностью.
4.3 Спектр антагонистической активности перспективных штаммов бактерий в
отношении основных фитопатогенных грибов, распространенных на подсолнечнике
Установлено, что штаммы бацилл-антагонистов активно подавляют in vitro
развитие широкого круга фитопатогенных представителей рода Fusarium, в числе
которых F. oxysporum var. orthoceras, F. sporotrichiella var. poae, F. semitectum,
F. gibbosum, F. javanicum, F. solani и F. moniliforme. Тогда как бактериальные штаммы
флюоресцирующих представителей рода Pseudomonas интенсивно подавляют рост
F. oxysporum var. orthoceras, F. sporotrichiella var. poae и F. gibbosum, оказывая
ингибирующее действие на развитие других видов фузариев, распространенных на
подсолнечнике. Кроме того, все исследуемые штаммы бактерий оказывают
антифунгальное действие на ряд других фитопатогенов, распространенных на
подсолнечнике: Sclerotinia sclerotiorum, Sclerotium bataticola, Alternaria sp., Phomopsis
helianthi и Verticillium dahliae.
Анализируя полученные данные, можно сделать вывод о широком спектре
действия исследуемых перспективных штаммов в отношении ряда фитопатогенов,
распространенных на подсолнечнике.
5. Механизмы антагонистического действия перспективных бактерий на
фитопатогенные грибы рода Fusarium
5.1 Антибиотическая активность перспективных штаммов бактерийантагонистов
Механизмы антагонистических взаимодействий бактерий и грибных
фитопатогенов весьма различны. Для выявления возможных механизмов
антагонистических взаимодействий бактерий с грибами рода Fusarium была изучена
их антибиотическая активность. Пробы для анализа ЖК брали через 8, 16, 24, 36, 48 и
72 ч от начала культивирования. В качестве тест-объекта был выбран изолят
F. oxysporum var. orthoceras.
Установлено, что максимальное накопление антибиотических веществ для всех
исследуемых штаммов происходит к 48-72 ч периодического культивирования. При
этом отмечено не только замедление скорости роста тест-культуры микромицета, но и
отсутствие формирования воздушного мицелия и специфической окраски, а также
рост тонкого, паутинистого субстратного мицелия, тогда как в контроле без
добавления стерильной культуральной жидкости наблюдался нормальный рост и
развитие мицелия патогенного гриба.
13
5.2 Ферментативная активность перспективных штаммов бактерий-антагонистов
С целью анализа возможных механизмов антифунгальной активности бактерий
мы также изучили их способность продуцировать гидролитические ферменты, так как
миколитическая активность является одним из важнейших типов антагонизма
бактерий к почвенным микромицетам (таблица 7).
Таблица 7 – Продуцирование штаммами бактерий-антагонистов гидролитических
ферментов
Краснодар, ВНИИМК, 2006 г.
Штаммы
Fa 4-1 B. subtilis
D 7-1 B. subtilis
Sgrc-1 P. fluorescens
Oif 2-I Pseudomonas sp.
Примечание:
–
отсутствие активности;
+ слабая активность;
Протеаза
+++
+++
+
++
Ферменты
Липаза
++
+
+++
+++
Хитиназа
++
++
–
–
++ средняя активность;
+++ сильная активность.
У штаммов бацилл-антагонистов обнаружена способность к синтезу всех
трехгрупп ферментов, наиболее активными из которых оказались протеазы. Тогда как у
бактерий рода Pseudomonas не выявлен синтез хитиназ, однако, обнаружен активный
синтез липолитических ферментов. Важно отметить, что обязательным условием
эффективного лизиса патогенных грибов и/или использования грибного мицелия как
источника питания связано с комплексным действием различных гидролитических
ферментов (Кравченко и др., 2002).
5.3 Взаимодействие перспективных штаммов бактерий-антагонистов с
фитопатогенными грибами рода Fusarium
При изучении механизма взаимодействия перспективных штаммов бактерийантагонистов с грибами рода Fusarium в качестве тест-объекта был выбран изолят
F. oxysporum var. orthoceras.
Штаммы бацилл-антагонистов при совместной инкубации проявляли
положительный таксис в отношении F. oxysporum var. orthoceras. Уже на первые
сутки совместной инкубации отмечалось образование сферопластов (шарообразных
вздутий апикальных частей гиф) и в некоторых случаях их разрыв с выходом
содержимого (рис. 2, A) Непосредственный контакт между антагонистом и патогеном
зафиксирован нами на вторые сутки инкубации. При этом сорбция бактерий на
поверхности гиф приводила к разрушению клеточных стенок in situ с последующим
лизисом и растворением мицелия (рис. 2, B), а также индуцировала вакуолизацию и
сжатие цитоплазмы. Уже к 48-60 ч инкубации отмечалось массовое формирование
конидий фузария, что объясняется явными неблагоприятными условиями среды для
патогена. При этом в контроле без антагониста наблюдался нормальный рост
культуры гриба и начало спорообразования (рис. 2, D). К концу совместной
инкубации отмечалось разрушение не только отдельных клеток гиф, но и полная
деградация мицелия и конидий патогена, обнаруживались только следы субстратного
и высохший воздушный мицелий фузария (рис. 2, C).
14
При совместной инкубации штаммов псевдомонад с F. oxysporum var. orthoceras
уже на первые-вторые сутки культивирования была выявлена задержка удлинения
апекса гиф и впоследствии массовое образование раздвоенных уродливых вздутий
апекса (рис. 3, A). К третьим суткам культивирования отмечалась агрегация мицелия в
тяжи, а в непосредственной близости к колонии бактерии происходил интенсивный
лизис и деградация мицелия патогенного гриба (рис. 3, B). К седьмым суткам
совместной инкубации наблюдалось формирование одиночных интеркалярных
хламидоспор, многочисленных клеток хламидоспорового типа и клеток-гигантов. К
концу совместного культивирования в зоне взаимодействия антагониста и патогена
отмечено полное лизирование субстратного и высыхание воздушного мицелия фузария
(рис. 3, C). В контроле без антагониста наблюдался нормальный рост и развитие
культуры гриба (рис. 3, D).
Таким образом, механизмы действия для всех исследуемых штаммовантагонистов в отношении фитопатогенных грибов рода Fusarium включают синтез
антибиотических веществ и миколитических ферментов, а для бактерий рода Bacillus
еще и конкуренцию за питательные вещества вследствие быстрой динамики роста.
При этом у бациллярных антагонистов отмечена способность разрушать клеточную
стенку патогенного гриба при непосредственном контакте. Гибель мицелия
F. oxysporum var. orthoceras при совместном культивировании с бацилламиантагонистами наступала на пятые-седьмые, а с представителями рода Pseudomonas –
на седьмые-девятые сутки.
6. Разработка элементов технологии производства лабораторных образцов
микробиопрепаратов на основе перспективных штаммов бактерий-антагонистов
6.1 Подбор оптимальных питательных сред для культивирования штаммов
бактерий-антагонистов
Все штаммы получили хорошее развитие на МПБ, среде Чапека для бактерий и
пептон-дрожжевой среде, тогда как представители рода Pseudomonas также на среде
Кинга В, а бактерии рода Bacillus – на среде Тайлона 3. Таким образом, все указанные
среды содержат необходимые для развития микроорганизмов элементы питания и в
наиболее доступной для их утилизации форме, что и показал титр ЖК: 1,21,8х109 КОЕ/мл для бациллярных штаммов, 1,6 - 9,7х1012 КОЕ/мл для псевдомонад.
6.2 Кинетика роста штаммов бактерий-антагонистов при периодическом
культивировании
Установлено, что исследуемые штаммы при периодическом культивировании
претерпевают значительные изменения в течение всего периода роста, обусловленные
непрерывными изменениями окружающей среды и быстрой реакцией на них
бактериальных клеток. Пробы для анализа ЖК брали через 8, 16, 24, 36, 48, 72 и 96 ч
от начала культивирования. Изучение динамики роста перспективных штаммов
бактерий-антагонистов показало, что оптимальными сроками культивирования как
для бациллярных штаммов Fa 4-1 B. subtilis и D 7-1 B. subtilis (5,7х1010 2,5х1011 КОЕ/мл), так и для флюоресцирующих псевдомонад Sgrc-1 P. fluorescens и
Oif 2-1 Pseudomonas sp. (1,3 - 9,7х1012 КОЕ/мл) являются 36-48 ч.
15
2
1
1
2
10 мкм
10 мкм
А
B
1
1
1
2
10 мкм
10 мкм
C
D
Рисунок 2 – Мицелий возбудителя фузариоза F. oxysporum var. orthoceras (ориг.)
A – разрыв сферопласта патогена с выходом содержимого (1) на первые сутки
инкубации с D 7-1 B. subtilis;
B – сорбция бактерии D 7-1 B. subtilis на поверхности гиф патогена (1) и их
разрушение (2) на вторые сутки инкубации;
C – полная деградация субстратного мицелия (1) и высохший воздушный мицелий
патогена (2) на седьмые сутки инкубации с D 7-1 B. subtilis;
D – контроль (без антагониста): нормальный рост и спорообразование (1) культуры
гриба F. oxysporum var. orthoceras.
16
1
1
1
10 мкм
10 мкм
А
B
1
1
10 мкм
C
10 мкм
D
Рисунок 3 – Мицелий возбудителя фузариоза F. oxysporum var. orthoceras (ориг.)
A – нехарактерное ветвление гиф патогена (1) на вторые сутки инкубации с Oif 2-1
Pseudomonas sp.;
B – лизис и выход содержимого по всей длине гифы патогена (1) на третьи сутки
инкубации с Oif 2-I Pseudomonas sp.;
C – высохший воздушный мицелий F. oxysporum var. orthoceras (1) на десятые сутки
инкубации с Oif 2-I Pseudomonas sp.;
D – контроль (без антагониста): нормальный рост и спорообразование (1) культуры
гриба F. oxysporum var. orthoceras.
17
6.3 Хранение лабораторных образцов микробиопрепаратов на основе штаммов
бактерий-антагонистов в препаративной форме ЖК
Чувствительность микроорганизмов к условиям хранения вызывает
необходимость проведения исследований с целью изучения жизнеспособности и
активности штаммов-антагонистов при различных способах поддержания культур в
лабораторных условиях. Подобные исследования являются актуальными и с точки
зрения разработки элементов технологии производства микробиопрепаратов на
основе микробов-антагонистов, одним из недостатков которых является
непродолжительный срок хранения (Недорезков, 2003; Свешникова, 2003;
Маслиенко, 2005; Новикова, 2005; Коломбет, 2006; Шипиевская, 2006). Поэтому нами
изучалась жизнеспособность перспективных штаммов бактерий-антагонистов в ЖК в
качестве одной из возможных и наиболее технологичных препаративных форм
биопрепаратов (Штерншис и др., 2003). При этом влияние срока хранения на
жизнеспособность бактериальных клеток изучалось в условиях переменных и
пониженных температур, с доступом и без доступа воздуха.
Анализ
опытных
данных
показал,
что
лабораторные
образцы
микробиопрепаратов в препаративной форме ЖК на основе штаммов бациллантагонистов возможно хранить в течение девяти месяцев, а флюоресцирующих
псевдомонад – шести месяцев как при переменных, так и при пониженных
температурах без введения каких-либо питательных добавок и стабилизаторов.
Следует подчеркнуть, что к концу периода хранения титр и активность ЖК
снизились, но сохранялись на достаточно высоком уровне и к концу срока
хранения титр составил 4,6х108 - 3,3х109 КОЕ/мл для бацилл-антагонистов и 5,0х1010 9,6х1011 КОЕ/мл для псевдомонад, а это является дешевым и вполне технологичным
способом с точки зрения использования препарата в течение одного полевого сезона.
7. Разработка элементов технологии применения лабораторных образцов
микробиопрепаратов на основе перспективных штаммов бактерий-антагонистов
7.1 Совместимость микробиопрепаратов на основе перспективных штаммов
бактерий-антагонистов с пестицидами, рекомендованными для применения на
подсолнечнике
Установлено, что все штаммы-продуценты биопрепаратов совместимы с
инсектицидами, рекомендуемыми в настоящее время для обработки семян
подсолнечника против проволочников: круйзер, КС, (тиаметоксам, 350 г/л), семафор,
ТПС, (бифентрин, 200 г/л) и командор, ВРК, (имидаклоприд, 200 г/л).
Биопрепараты на основе псевдомонад оказались совместимы со следующим
рядом перспективных фунгицидов: апрон голд, ВЭ (мефеноксам, 350 г/л); ровраль,
СП (ипродион, 500 г/кг); ТМТД, ТПС (тирам, 400 г/л); винцит, СК (тиабендазол +
флутриафол, 25+25 г/л); альбит, ТПС (поли-бета-гидроксимасляная кислота + магний
сернокислый + калий фосфорнокислый + калий азотнокислый + карбамид,
6,2+29,8+91,1+91,2+181,5 г/кг); максим, КС (флудиоксонил, 25 г/л); виннер, СК
(тиабендазол+флутриафол, 25+25 г/л) и раксил, КС (тебуконазол, 60 г/л).
18
Микробиопрепараты на основе бациллярных штаммов были также совместимы с
указанными фунгицидами, за исключением препаратов винцит, СК (тиабендазол +
флутриафол, 25+25 г/л) и виннер, СК (тиабендазол + флутриафол, 25+25 г/л), которые
существенно задерживали рост бацилл, что исключает их совместное применение.
Препараты ровраль, СП (ипродион, 500 г/кг) и ТМТД, ТПС (тирам, 400 г/л) оказывали
незначительное ингибирующее действие на бациллярные штаммы.
Таким образом, установлена совместимость новых микробиопрепаратов с рядом
пестицидов, что позволяет применять их в сложных композиционных составах для
протравливания семян и обработки вегетирующих растений подсолнечника с целью
защиты их от комплекса вредителей и болезней.
7.2 Определение эффективности применения лабораторных образцов
микробиопрепаратов на основе перспективных штаммов бактерий-антагонистов на
фоне естественного поражения фузариозом в полевых условиях
Полевые испытания лабораторных образцов биопрепаратов в центральной зоне
Краснодарского края в 2006-2008 гг. показали зависимость биологической
эффективности от величины запаса инфекционного начала болезни и от
складывающихся погодных условий в период вегетации. Оценивалась эффективность
композиций на основе не только одного штамма, но и смеси из двух, трех и четырех
перспективных штаммов-антагонистов в различных комбинациях. Проводили как
обработку семян, так и комплексную обработку семян и вегетирующих растений,
титр микробиопрепаратов составлял 109-12 КОЕ/мл. Лучшие варианты опыта
представлены в таблице 8.
Так, на низком фоне поражения фузариозом со степенью 3 балла в 2006 г.
(15,2 %) и при достаточном запасе влаги в первой половине вегетации, но недостатке
влаги к концу периода вегетации максимальная биологическая эффективность
отмечена при обработке семян композицией на основе бацилл-антагонистов (Fa 4-1
B. subtilis и D 7-1 B. subtilis) – 25,7 и 48,7 %, при нулевой эффективности композиции
на основе виннера и 17,1 % – на основе раксила.
На среднем фоне поражения фузариозом в 2007 г. (37,1 %) и при дефиците влаги
на протяжении практически всего периода вегетации биологическая эффективность
обработки семян биопрепаратами и их смесями лучших вариантов составила от 18,3
до 25,9 %, при эффективности эталона виннера 18,1 % и раксила – 22,9 %.
На низком фоне поражения фузариозом в 2008 г. (11,7 %) и при благоприятных
условиях в вегетационный период, максимальная эффективность установлена при
инкрустировании семян композицией на основе монокультуры бациллы
D 7-1 B. subtilis (30,8 %) и смеси бациллы D 7-1 B. subtilis и псевдомонады Oif 2-1
Pseudomonas sp. (40,2 %), при нулевой эффективности эталона виннера и 28,2 % –
раксила.
Существенный дополнительный урожай при обработке семян подсолнечника
композициями на основе микробиопрепаратов был получен во все годы испытаний от
0,14 до 0,36 т/га. Дополнительный урожай при обработке эталоном виннером был
получен лишь в 2006 г. – 0,13 т/га.
19
Таблица 8 – Эффективность обработки семян и вегетирующих растений
подсолнечника сорта Р-453 композициями на основе микробиопрепаратов против
возбудителей фузариоза в полевых условиях
Краснодар, ЦЭБ ВНИИМК, 2006-2008 гг.
Вариант
Биологическая
эффективность,
против фузариоза, %,
по годам
2006
Контроль без обработки
Виннер, КС**, эталон
Раксил, КС**
Oif 2-I Pseudomonas sp., ЖК**
D 7-1 B. subtilis, ЖК**
Fa 4-1 B. subtilis, ЖК**
*
15,2
0
17,1
0
9,9
48,7
27,0
25,7
0
-
2007
*
37,1
18,1
22,9
25,9
14,8
11,6
0
1,9
4,9
18,3
20,8
20,5
29,1
2008
*
11,7
0
28,2
23,9
26,5
30,8
46,2
18,8
29,9
40,2
40,2
23,9
29,9
Урожайность,
т/га,
по годам
Дополнительный
урожай, т/га,
по годам
2006
2007
2008
2006
2007
2008
2,89
3,02
2,97
3,03
3,04
3,02
3,26
2,97
3,11
0,14
2,25
2,14
2,14
2,40
2,38
2,47
2,34
2,44
2,50
2,39
2,34
2,46
2,35
0,08
1,90
1,84
2,25
2,18
2,24
2,08
2,23
2,17
2,25
2,26
2,25
2,26
2,37
0,21
0,13
0,08
0,14
0,15
0,13
0,37
0,08
0,22
-
0
0
0,15
0,13
0,22
0,09
0,19
0,25
0,14
0,09
0,21
0,10
0
0,35
0,28
0,34
0,18
0,33
0,27
0,35
0,36
0,35
0,36
0,47
D 7-1 B. subtilis +
Oif 2-I Pseudomonas sp., ЖК**
Oif 2-I Pseudomonas sp.+
Sgrc-1 P. fluorescens, ЖК**
НСР05
Примечание:
* поражение в контроле фузариозом (3 балла);
**композиция для обработки семян включает микробиопрепарат на основе одного штамма
или их смеси (3,0 л/т; 2,0+2,0 л/т) или химический фунгицид виннер, КС (2,0 л/т), или
раксил, КС (0,5 л/т), препарат против ложной мучнистой росы апрон голд, ВЭ (3,0 л/т) и
препарат против проволочников – круйзер, КС (8,0 л/т);
ЖК – жидкая культура; КС – концентрат суспензии;
– обработка семян;
– обработка семян + обработка вегетирующих растений.
Обработка вегетирующих растений подсолнечника биопрепаратами в 2006-2007 гг.
повышала эффективность лишь в отдельных вариантах, тогда как в 2008 г. оказала
существенное положительное влияние на эффективность и урожайность, что объясняется
благоприятными условиями для приживаемости бактерий.
7.3 Производственные испытания лабораторных образцов микробиопрепаратов
на основе штаммов бактерий-антагонистов
Производственные испытания лабораторных образцов микробиопрепаратов на
основе штаммов бактерий-антагонистов проводились в ОАО «Лиманское»
Щербиновского района Краснодарского края в 2007 г.
Несмотря на условия экстремальной засухи, обработка семян подсолнечника
микробиопрепаратами повысила урожайность во всех вариантах опыта (таблица 9).
Максимальный дополнительный урожай получен в варианте с обработкой семян
микробиопрепаратом на основе штамма Oif 2-I Pseudomonas sp. – 0,34 т/га, а также с
микробиопрепаратом на основе штамма D 7-1 B. subtilis – 0,27 т/га.
20
Таблица 9 – Влияние обработки семян подсолнечника сорта Бузулук композициями
на основе микробиопрепаратов на урожайность
Производственные испытания,
Щербиновский район Краснодарского края, ОАО «Лиманское», 2007 г.
Вариант
Контроль без обработки
Раксил, КС*
Sgrc-1 P. fluorescens, ЖК*
Oif 2-I Pseudomonas sp., ЖК*
Fa 4-1 B. subtilis, ЖК*
D 7-1 B. subtilis, ЖК*
Sgrc-1 P. fluorescens + D 7-1 B. subtilis, ЖК*
Норма
расхода,
л/т
0,5
3,0
3,0
3,0
3,0
2,0+2,0
Урожайность, Дополнительный
т/га
урожай, т/га
1,08
1,01
1,16
1,42
1,30
1,35
1,30
0
0,08
0,34
0,22
0,27
0,22
Примечание:
* композиция для обработки семян включает микробиопрепарат или химический препарат
раксил, КС, препарат против ложной мучнистой росы апрон голд, ВЭ (3,0 л/т) и препарат
против проволочников – круйзер, КС (8,0 л/т);
ЖК – жидкая культура; КС – концентрат суспензии.
7.4 Экономическая эффективность применения лабораторных образцов
микробиопрепаратов на основе штаммов бактерий-антагонистов
Экономическую эффективность инкрустирования семян подсолнечника
композицией на основе штаммов D 7-1 B. subtilis и Oif 2-I Pseudomonas sp.
определяли на ЦЭБ ВНИИМК в 2008 г.
При ориентировочной стоимости одного литра ЖК микробиопрепарата на
основе штаммов D 7-1 B. subtilis и Oif 2-I Pseudomonas sp. 100 рублей и норме расхода
– 4,0 л/т (2,0+2,0 л/т), условный чистый доход на 1 га составил 2669,6 рублей,
рентабельность обработки композицией – 753 %.
Выводы
1. В результате скрининга выделенных штаммов бактерий отобраны и
идентифицированы четыре перспективных биоагента (Fa 4-1 B. subtilis, D 7-1
B. subtilis, Sgrc-1 P. fluorescens, Oif 2-1 Pseudomonas sp.) в качестве основы
микробиопрепаратов, обеспечивающие эффективную защиту семян и проростков
подсолнечника на жестком фоне искусственного заражения во влажной камере до
32,8 % и в почве до 77,3 %, а также активно колонизирующие корень, одновременно
оказывающие стимулирующее действие на культуру подсолнечника.
2. Установлен температурный оптимум для культивирования перспективных
штаммов бактерий: Fa 4-1 B. subtilis – 30,0-35,0 0С, D 7-1 B. subtilis – 30,0 0С, Sgrc-1
P. fluorescens и Oif 2-1 Pseudomonas sp. – 20,0-25,0 0С.
3. Определен оптимум рН для культивирования перспективных штаммов
бактерий: D 7-1 B. subtilis – 6,0-7,0, Fa 4-1 B. subtilis, Sgrc-1 P. fluorescens и Oif 2-1
Pseudomonas sp. – 6,0-8,0.
4. Установлены оптимальные источники углерода: для всех исследуемых штаммов
бактерий – глюкоза, сахароза, меласса, а для представителей рода Pseudomonas еще и
глицерин. Оптимальным источником азота для всех перспективных биоагентов был
азотнокислый натрий, для штамма Fa 4-1 B. subtilis также пептон и кукурузный экстракт,
для D 7-1 B. subtilis – дрожжевой и кукурузный экстракты, а для штаммов Sgrc-1
P. fluorescens и Oif 2-1 Pseudomonas sp. – пептон и дрожжевой экстракт.
21
5. Выявлен широкий спектр антагонистического действия перспективных
штаммов бактерий in vitro в отношении ряда фитопатогенных представителей рода
Fusarium, а также к Sclerotinia sclerotiorum, Sclerotium bataticola, Alternaria sp.,
Phomopsis helianthi и Verticillium dahlia.
6. Изучены механизмы действия бактериальных штаммов антагонистов в
отношении фитопатогенных грибов рода Fusarium: для всех штаммов синтез
антибиотических веществ и миколитических ферментов, а для бактерий рода Bacillus
еще и конкуренция за питательные вещества вследствие быстрой динамики роста.
Гибель мицелия F. oxysporum var. orthoceras при совместном культивировании с
бациллами-антагонистами наступала на пятые-седьмые, а с представителями рода
Pseudomonas – на седьмые-девятые сутки.
7. Подобраны оптимальные питательные среды для культивирования штаммов
бактерий. Все штаммы получили хорошее развитие на МПБ (1,3х109 2,2х1012 КОЕ/мл), среде Чапека для бактерий (1,4х109 - 2,6х1012 КОЕ/мл) и пептондрожжевой среде (1,6х109 - 4,1х1012 КОЕ/мл), тогда как представители рода
Pseudomonas также на среде Кинга В (6,7 - 9,7х1012 КОЕ/мл), а бактерии рода Bacillus
еще и на среде Тайлона 3 (1,2 - 1,4х109 КОЕ/мл).
8. Определены оптимальные сроки культивирования для всех штаммов –
продуцентов микробиопрепаратов – 36-48 ч с титром для представителей рода Bacillus
5,7х1010 - 2,5х1011 КОЕ/мл, а для бактерий рода Pseudomonas – 1,3 - 9,7х1012 КОЕ/мл.
9. Установлены оптимальные сроки хранения лабораторных образцов
микробиопрепаратов в препаративной форме ЖК. Срок хранения ЖК на основе бациллантагонистов девять месяцев (4,6х108 - 3,3х109 КОЕ/мл), а на основе псевдомонад –
шесть месяцев (5,0х1010 - 9,6х1011 КОЕ/мл) как при переменных, так и при пониженных
температурах без введения каких-либо питательных добавок и стабилизаторов.
10. Установлена совместимость лабораторных образцов микробиопрепаратов с
рядом перспективных пестицидов (круйзер, КС; семафор, ТПС; командор, ВРК;
апрон голд, ВЭ; ровраль, СП; ТМТД, ТПС; винцит, СК; альбит, ТПС; максим, КС;
виннер, СК и раксил, КС), обеспечивающая включение их в интегрированную
систему защиты подсолнечника от вредителей и болезней.
11. Инкрустирование семян подсолнечника микробиопрепаратами и их
комбинациями на фоне искусственного заражения возбудителем фузариоза в
лабораторных условиях в почве обеспечивало биологическую эффективность до
77,3 %, в полевых условиях на фоне естественного поражения, в зависимости от
состояния популяции патогенов и складывающихся погодных условий – до 48,7 %.
Величина сохраненного урожая от применения лабораторных образцов
микробиопрепаратов составляла до 0,47 т/га.
Практические рекомендации
1. Для создания микробиопрепаратов полифункционального типа действия
использовать новые перспективные штаммы бактерий-антагонистов: Fa 4-1 Bacillus
subtilis, D 7-1 Bacillus subtilis, Sgrc-1 Pseudomonas fluorescens, Oif 2-1 Pseudomonas sp.
2. С целью снижения вредоносности фузариоза на подсолнечнике рекомендуется
проводить инкрустирование семян смесью лабораторных образцов микробиопрепаратов на
основе штаммов D 7-1 B. subtilis и Oif 2-I Pseudomonas sp. Норма расхода каждого
микробиопрепарата – 2,0 л/т. Расход рабочей жидкости – 10-15 л/т. В композицию
рекомендуется включать препарат против проволочника (круйзер, КС (тиаметоксам,
350 г/л) или семафор, ТПС (бифентрин, 200 г/л), или командор, ВРК (имидаклоприд,
200 г/л)) и препарат против ложной мучнистой росы (апрон голд, ВЭ (мефеноксам, 350 г/л)).
22
Список опубликованных работ
1. Асатурова, А.М. Изучение кинетики роста штаммов бактерий-антагонистов
возбудителей фузариоза при периодическом культивировании / А.М. Асатурова
// Масличные культуры. Научно-технический бюллетень ВНИИМК. – Краснодар, 2008. –
Вып. 1 (138). – С. 79-82.
2. Асатурова, А.М. Поиск штаммов бактерий-антагонистов возбудителей фузариоза
подсолнечника / А.М. Асатурова // Фитосанитарное оздоровление экосистем: материалы
второго всероссийского съезда по защите растений, (5-10 декабря, 2005 г.). – СПб,
2005. – Т. II. – С. 148-150.
3. Асатурова, А.М. Скрининг штаммов бактерий, проявляющих антагонизм к
возбудителям фузариоза подсолнечника / А.М. Асатурова, Л.В. Маслиенко // Болезни и
вредители масличных культур. – Краснодар, 2006. – С. 82-89.
4. Маслиенко, Л.В. Потенциальные биоагенты для защиты подсолнечника от
возбудителей фузариоза / Л.В. Маслиенко, А.М. Асатурова // Биологическая защита
растений – основа стабилизации агроэкосистем: материалы межд. науч.-практ. конф.,
(20-22 сентября, 2006 г.). – Краснодар, 2006. – Вып. 4. – С. 246-248.
5. Асатурова, А.М. Спектр антагонистической активности перспективных штаммов
бактерий в отношении фитопатогенных грибов рода Fusarium / А.М. Асатурова
// Научное обеспечение агропромышленного комплекса: материалы VIII регион. конф.
молодых ученых (7-8 декабря, 2006 г.). – Краснодар, 2006. – С. 100-101.
6. Асатурова, А.М. Отбор перспективных агентов биологического контроля для защиты
подсолнечника от возбудителей фузариоза / А.М. Асатурова, Е.Ю. Шипиевская // Актуальные
вопросы селекции, технологии и переработки масличных культур: Сб. материалов 4-й межд.
конф. молодых ученых и специалистов (27-29 марта, 2007 г.). – Краснодар, 2007. – С. 8-12.
7. Асатурова, А.М. Антибиотическая и ферментативная активности перспективных
штаммов бактерий-антагонистов / А.М. Асатурова // Современное состояние и
приоритеты развития фундаментальных наук в регионах: труды IV Всероссийской науч.
конф. молодых ученых и студентов (1-4 октября, 2007 г.). – Краснодар, 2007. – С. 66-68.
8. Маслиенко, Л.В. Штаммы бактерий-антагонистов перспективные для создания
биофунгицидов против возбудителей фузариоза подсолнечника / Л.В. Маслиенко,
А.М. Асатурова // Новые технологии в экспериментальной биологии и медицине:
материалы межд. науч.-практ. Конференции (10-12 октября, 2007 г.). – Ростов-на-Дону,
2007, – С. 148-149.
9. Асатурова, А.М. Взаимодействие бактерий-антагонистов с фитопатогенными
грибами рода Fusarium / А.М. Асатурова // Научное обеспечение агропромышленного
комплекса: материалы I Всероссийской конф. молодых ученых (14-16 ноября, 2007 г.). –
Краснодар, 2007. – С. 81-82.
10. Маслиенко, Л.В. Ступенчатый скрининг штаммов бактерий-антагонистов – основа
разработки биофунгицидов комплексного действия / Л.В. Маслиенко, А.М. Асатурова,
Е.Ю. Шипиевская [и др.] // Современное состояние и перспективы развития миробиологии и
биотехнологии: материалы IV межд. науч. конф. (2-6 июня, 2008). – Минск, 2008. – С. 299-301.
11. Маслиенко, Л.В. Разработка экологически безопасного метода защиты
подсолнечника от возбудителей фузариоза / Л.В. Маслиенко, А.М. Асатурова,
Е.Ю. Шипиевская [и др.] // Вклад фундаментальных исследований в развитие
современной инновационной экономики Краснодарского края: материалы конференции
получателей грантов регионального конкурса Российского фонда фундаментальных
исследований и администрации Краснодарского края «ЮГ». – Краснодар, 2008. –
С. 146-147.
23