ИНСТРУКЦИЯ «РИБО-золь-D» АмплиСенс

ИНСТРУКЦИЯ
по применению комплекта реагентов
для экстракции РНК из клинического материала
«РИБО-золь-D»
АмплиСенс
Федеральное бюджетное учреждение науки
«Центральный научно-исследовательский
институт эпидемиологии»,
Российская Федерация, 111123,
город Москва, улица Новогиреевская, дом 3а
ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ................................................................................................... 3
НАЗНАЧЕНИЕ .................................................................................................................... 3
ПРИНЦИП МЕТОДА .......................................................................................................... 3
ФОРМЫ ВЫПУСКА КОМПЛЕКТА РЕАГЕНТОВ ............................................................... 3
МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ ....................................................................................... 4
ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ ............................................... 5
ВЗЯТИЕ, ТРАНСПОРТИРОВАНИЕ И ХРАНЕНИЕ ИССЛЕДУЕМОГО МАТЕРИАЛА .... 6
СОСТАВ.............................................................................................................................. 6
ЭКСТРАКЦИЯ РНК ИЗ ИССЛЕДУЕМЫХ ОБРАЗЦОВ ..................................................... 7
СРОК ГОДНОСТИ. УСЛОВИЯ ТРАНСПОРТИРОВАНИЯ И ХРАНЕНИЯ ..................... 10
СИМВОЛЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ В ПЕЧАТНОЙ ПРОДУКЦИИ ........................................ 11
Форма 1 REF К2-18-100 / VER 03.10.11 / стр. 2 из 12
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
В настоящей инструкции применяются следующие сокращения и обозначения:
НК
– нуклеиновые кислоты
ОКО
– отрицательный контрольный образец
ОТ
– обратная транскрипция
ПКО
– положительный контрольный образец
ПЦР
– полимеразная цепная реакция
РНК
– рибонуклеиновая кислота
– Федеральное бюджетное учреждение науки
ФБУН ЦНИИ
«Центральный научно-исследовательский институт
Эпидемиологии
эпидемиологии» Федеральной службы по надзору в сфере
Роспотребнадзора
защиты прав потребителей и благополучия человека
НАЗНАЧЕНИЕ
Комплект реагентов предназначен для выделения (экстракции) тотальной РНК из
лейкоцитов крови (по методу Хомчинского) для последующего исследования
методом ОТ (обратной транскрипции) и ПЦР (полимеразной цепной реакции).
ПРИНЦИП МЕТОДА
Клинический образец обрабатывается лизирующим раствором, в результате
чего происходит деструкция клеточных мембран, высвобождение нуклеиновых
кислот (НК) и клеточных компонентов. При последовательном добавлении всех
необходимых реагентов происходит разделение раствора на водную фазу,
содержащую РНК, и фенольную фазу, содержащую ДНК и белки. Далее, водную
фазу раствора переносят в отдельную пробирку, проводят осаждение РНК, отмывку
и высушивание полученного осадка. При добавлении раствора для элюции НК к
высушенному осадку происходит растворение РНК и переход их в раствор. В
результате указанной процедуры получается высокоочищенный препарат РНК,
свободный от ингибиторов реакции амплификации, что обеспечивает высокую
аналитическую чувствительность ПЦР-исследования и длительное хранение при
температуре не выше минус 68 °С в течение 1 года.
ФОРМЫ ВЫПУСКА КОМПЛЕКТА РЕАГЕНТОВ
Комплект реагентов выпускается в 2 формах комплектации:
Форма 1 включает комплект реагентов «РИБО-золь-D» вариант 100.
Форма 2 включает наборы реагентов оптом, расфасованные по отдельным
реагентам, с маркировкой реагентов на их оптовой фасовке.
Форма комплектации 2 предназначена для производственных целей для
последующей маркировки на языке заказчика и комплектации по наборам.
Форма 1 REF К2-18-100 / VER 03.10.11 / стр. 3 из 12
ВНИМАНИЕ! Использование формы комплектации 2 производится только в
соответствии
с
регламентом,
утвержденным
ФБУН
ЦНИИ
Эпидемиологии
Роспотребнадзора.
МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ
Работа должна проводиться в лаборатории, выполняющей молекулярнобиологические
(ПЦР)
исследования
клинического
материала
на
наличие
возбудителей инфекционных болезней, с соблюдением санитарно-эпидемических
правил СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III–IV групп
патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней», СанПиН
«Санитарно-эпидемиологические
2.1.7.2790-10
требования
к
обращению
с
медицинскими отходами» и методических указаний МУ 1.3.2569-09 «Организация
работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при
работе с материалом, содержащим микроорганизмы I–IV групп патогенности».
При работе всегда следует выполнять следующие требования:
-
Следует рассматривать исследуемые образцы как инфекционно-опасные,
организовывать
работу
и
хранение
в
соответствии
«Безопасность
работы
с
микроорганизмами
III–IV
с
СП
групп
1.3.2322-08
патогенности
(опасности) и возбудителями паразитарных болезней».
-
Убирать и дезинфицировать разлитые образцы или реактивы, используя
дезинфицирующие средства в соответствии с СП 1.3.2322-08 «Безопасность
работы
с
микроорганизмами
III–IV
групп
патогенности
(опасности)
и
возбудителями паразитарных болезней».
-
Удалять неиспользованные реактивы в соответствии с СанПиН 2.1.7.2790-10
«Санитарно-эпидемиологические требования к обращению с медицинскими
отходами».
-
Применять набор строго по назначению, согласно данной инструкции.
-
Допускать к работе с набором только специально обученный персонал.
-
Не использовать набор по истечении срока годности.
-
Использовать одноразовые перчатки, лабораторные халаты, защищать глаза во
время работы с образцами и реактивами. Тщательно вымыть руки по окончании
работы.
-
Избегать контакта с кожей, глазами и слизистой оболочкой. При контакте
немедленно промыть пораженное место водой и обратиться за медицинской
помощью.
Форма 1 REF К2-18-100 / VER 03.10.11 / стр. 4 из 12
-
Листы безопасности материалов (MSDS – material safety data sheet) доступны по
запросу.
ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ
1. «ГЕМОЛИТИК» (ТУ 9398-097-01897593-2010) – реагент для предобработки
цельной периферической и пуповинной крови.
2. Бокс абактериальной воздушной среды (ПЦР-бокс).
3. Система очистки воды качества MilliQ (например, Milli-Q Advantage, Millipore,
США).
4. Термостат для пробирок типа «Эппендорф» от 25 до 100 °С (например, «ТЕРМО
24-15», «Биоком», Россия).
5. Вакуумный
отсасыватель
медицинский
с
колбой-ловушкой
для
удаления
надосадочной жидкости (например, «ОМ-1», г. Ульяновск, Россия).
6. Микроцентрифуга для пробирок типа «Эппендорф» до 16 тыс об/мин (например,
MiniSpin, Eppendorf, Германия).
7. Вортекс (например, «ТЭТА-2», «Биоком», Россия).
8. Отдельный набор автоматических дозаторов переменного объема (например,
«Ленпипет», Россия).
9. Одноразовые полипропиленовые завинчивающиеся или плотно закрывающиеся
пробирки на 1,5 мл (например, Axygen, США).
10. Штативы для пробирок на 1,5 мл (например, «ИнтерЛабСервис», Россия) и
наконечников (например, Axygen, США).
11. Одноразовые наконечники для дозаторов переменного объема с фильтром до
200 мкл и до 1000 мкл (например, Axygen, США).
12. Одноразовые наконечники для дозаторов переменного объема до 200 мкл и до
1000 мкл (например, Axygen, США).
13. Холодильник от 2 до 8 °С с морозильной камерой не выше минус 16 °С для
выделенных проб ДНК.
14. Отдельный халат, шапочки, обувь и одноразовые перчатки по МУ 1.3.2569-09.
15. Емкость для сброса наконечников.
Форма 1 REF К2-18-100 / VER 03.10.11 / стр. 5 из 12
ВЗЯТИЕ, ТРАНСПОРТИРОВАНИЕ И ХРАНЕНИЕ ИССЛЕДУЕМОГО МАТЕРИАЛА
Перед началом работы следует ознакомиться с методическими рекомендациями
«Взятие,
транспортировка,
хранение
клинического
материала
для
ПЦР-
диагностики», разработанными ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, Москва, 2008 г.
СОСТАВ
Комплект реагентов «РИБО-золь-D» вариант 100 – комплект реагентов для
экстракции РНК из клинического материала – включает:
Реактив
Раствор А
Раствор В
Раствор С
Раствор D
Раствор Е
Раствор для отмывки 3
РНК-элюент bcr-abl
Описание
Прозрачная вязкая
жидкость желтого цвета
Прозрачная бесцветная
жидкость
Прозрачная бесцветная
жидкость
Прозрачная бесцветная
жидкость
Прозрачная бесцветная
жидкость
Прозрачная бесцветная
жидкость
Прозрачная бесцветная
жидкость
Объем (мл)
Кол-во
48
1 флакон
10
2 флакона
48
1 флакон
48
1 флакон
1,5
4 пробирки
100
1 флакон
0,4
10 пробирок
К комплекту реагентов прилагаются следующие реагенты:
Реактив
тРНК 1 мкг/мкл
Гликоген 1%
Описание
Прозрачная бесцветная
жидкость
Прозрачная бесцветная
жидкость
Объем (мл)
Кол-во
0,06
5 пробирок
1,2
1 пробирка
Комплект реагентов рассчитан на выделение РНК из 120 образцов, включая
контроли.
Форма 1 REF К2-18-100 / VER 03.10.11 / стр. 6 из 12
ЭКСТРАКЦИЯ РНК ИЗ ИССЛЕДУЕМЫХ ОБРАЗЦОВ
ВНИМАНИЕ! Для работы с РНК необходимо использовать только одноразовые
стерильные пластиковые расходные материалы, имеющие специальную маркировку
RNase-free, DNase-free.
Порядок работы
1. Лизис.
Клетки периферической крови
Вариант 1. Кровь с ЭДТА
А. Обработка крови реагентом «ГЕМОЛИТИК»
Отобрать необходимое количество одноразовых пробирок объемом 10 мл.
Внести в каждую пробирку 7,0 мл гемолитика и добавить 2,5 мл цельной крови.
Полученный раствор перемешать на вортексе и центрифугировать 5 мин при 3000 g.
Осторожно отобрать надосадочную жидкость, не задевая осадок. Добавить в каждую
пробирку с осадком клеток 800 мкл раствора D. Лизированный таким образом образец
может храниться до дальнейшей обработки при температуре не выше минус 16 °С в
течение 1 мес и при температуре не выше минус 68 °С в течение 1 года. Разделить
полученный лизат на 2 равные части: для этого отобрать по 400–450 мкл лизата в
чистые пробирки объемом 1,5 мл.
Б. Обработка клеток крови «лейкоцитарного кольца» (без использования реагента
«ГЕМОЛИТИК»)
Пробирку с кровью центрифугировать в течение 20 мин при 800-1600 g при
комнатной температуре не позднее 48 часов с момента взятия крови (при
условии хранения цельной крови при температуре от 2 до 8 °С). Все белые клетки
крови (белая пленка на поверхности отстоявшейся эритроцитарной массы)
аккуратно отобрать (до общего объема образца 200 мкл, захват эритроцитов и
плазмы допустимы), немедленно поместить в пробирку с 800 мкл раствора D и
перемешать.
Лизированный
таким
образом
образец
может
храниться
до
дальнейшей обработки при температуре не выше минус 16 °С в течение 1 мес и при
температуре не выше минус 68 °С в течение 1 года. Разделить полученный лизат на
2 равные части: для этого отобрать по 400–450 мкл лизата и внести в чистые пробирки
объемом 1,5 мл.
Вариант 2. Кровь с РНК-стабилизатором
Обработку начать с разделения образца на 2 равные части. Для этого в
2 отдельные пробирки объемом 5 мл внести по 4,5 мл образца. Провести
центрифугирование в течение 10 мин при 3500–5000 g. Отобрать надосадочную
Форма 1 REF К2-18-100 / VER 03.10.11 / стр. 7 из 12
жидкость, не задевая осадок. Добавить к осадку 4 мл воды milliQ, перемешать на
вортексе до растворения осадка. Допускается наличие небольших количеств
нерастворившегося клеточного дебриса. Центрифугировать в течение 10 мин при
3500-5000 g. Отобрать надосадочную жидкость полностью. Добавить в каждую
пробирку с осадком 400 мкл раствора D.
Клетки пунктата костного мозга
200 мкл пунктата костного мозга немедленно после взятия поместить в пробирку
с 800 мкл раствора D и перемешать. Пробирки центрифугировать 5 мин при 2000 g
и, в случае наличия осадка, надосадочную жидкость перенести в новую пробирку
(далее работать с надосадочной жидкостью). Лизированный таким образом образец
может храниться до дальнейшей обработки при температуре не выше минус 16 °С
до 1 мес и при температуре не выше минус 68 °С в течение 1 года. Разделить
полученный лизат на 2 равные части. Для этого отобрать по 400–450 мкл лизата и
внести в чистые пробирки на 1,5 мл.
ВНИМАНИЕ! После добавления раствора D проба может раствориться неполностью.
Полное растворение происходит после добавления раствора Е и раствора А.
2. Подготовить положительные и отрицательные контроли экстракции (согласно
инструкции к используемому набору реагентов).
3. Добавить к образцам, лизированным в растворе D, по 40 мкл раствора Е.
Перемешать на вортексе. Центрифугировать для удаления капель с крышки
пробирки.
4. Добавить в пробирки по 400 мкл раствора А, перемешать на вортексе.
Центрифугировать для удаления капель с крышки пробирки.
5. Добавить в пробирки по 130 мкл раствора В. Перемешать на вортексе 1–2 мин
(раствор может быть от молочно-белого цвета до цвета какао с молоком в
зависимости от количества попавших в образец эритроцитов).
6. Поставить пробирки в морозильную камеру с температурой не выше минус 16 °С
на 10 мин.
7. Центрифугировать пробирки 10 мин при 10–16 тыс g (если количество пробирок
нечетное, уравновесить центрифугу пробиркой на 1,5 мл, содержащей примерно
1 мл воды). В процессе центрифугирования раствор разделится на две фазы:
нижнюю, содержащую белки и ДНК, и верхнюю – водную, содержащую РНК.
8. Во время центрифугирования образцов отобрать новые пробирки объемом
1,5 мл в количестве, соответствующем количеству обрабатываемых образцов,
Форма 1 REF К2-18-100 / VER 03.10.11 / стр. 8 из 12
включая контроли. Внести в каждую пробирку по 400 мкл раствора С и по 10 мкл
гликогена 1%.
ВНИМАНИЕ! В пробирки, предназначенные для экстракции положительных и
отрицательных контролей необходимо внести по 10 мкл тРНК 1 мкг/мкл (препарата
нагрузочной РНК).
9. С образцов после центрифугирования аккуратно отобрать верхнюю фазу
(приблизительно 400 мкл), используя наконечники с фильтром и перенести в
пробирки,
содержащие
раствор
С.
Верхнюю
фазу
положительных
и
отрицательных контролей перенести в пробирки, содержащие раствор С,
тРНК 1 мкг/мкл и гликоген 1%.
10. Перемешать на вортексе, центрифугировать для удаления капель с крышки
пробирки и поставить в морозильную камеру с температурой не выше минус
16 °С на 20 мин.
11. Поместить флакон с раствором для отмывки 3 в морозильную камеру с
температурой не выше минус 16 °С.
12. Центрифугировать пробирки 10 мин при 10–16 тыс g. Визуально найти положение
осадка РНК (если пробирка была помещена в центрифугу «хвостиком» или
меткой на крышке пробирки вверх, то осадок после центрифугирования будет
находиться на дне пробирки строго под «хвостиком» или меткой). Аккуратно
отобрать надосадочную жидкость, не задевая осадок, используя вакуумный
отсасыватель и отдельный наконечник для каждой пробы. Если осадок не виден,
отобрать надосадочную жидкость, не касаясь стенок, оставив на дне пробирки
примерно 20 мкл.
13. Осадок ресуспендировать в 800 мкл холодного раствора для отмывки 3.
Перемешать на вортексе, центрифугировать 10 мин при 10–16 тыс g. Отобрать
надосадочную жидкость, не задевая осадка.
14. Подсушить осадок в термостате для микропробирок при температуре 56 °С в
течение 5-7 мин. При этом крышки пробирок должны быть открыты.
15. Растворить осадок в 30 мкл РНК-элюента bcr-abl, прогреть при температуре
56 °С в течение 2-3 мин. Надосадочная жидкость содержит очищенную РНК.
Пробы готовы к постановке реакции обратной транскрипции и ПЦР.
Раствор РНК можно хранить при температуре не выше минус 68 °С в течение
года.
Форма 1 REF К2-18-100 / VER 03.10.11 / стр. 9 из 12
СРОК ГОДНОСТИ. УСЛОВИЯ ТРАНСПОРТИРОВАНИЯ И ХРАНЕНИЯ
Срок годности. 12 мес. Комплект реагентов с истекшим сроком годности
применению не подлежит. Срок годности вскрытых реагентов соответствует сроку
годности, указанному на этикетках для невскрытых реагентов, если в инструкции не
указано иное.
Транспортирование. Комплект реагентов транспортировать при температуре от 2 до
8 °С не более 5 сут. При получении разукомплектовать.
Хранение. Комплект реагентов хранить при температуре от 2 до 8 °С. РНК-элюент
bcr-abl и тРНК 1 мкг/мкл хранить при температуре от минус 24 С до минус 16 С.
Условия отпуска. Для лечебно-профилактических и санитарно-профилактических
учреждений.
Рекламации на качество комплекта реагентов «РИБО-золь-D»
направлять на
предприятие-изготовитель ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора (111123
г. Москва, ул. Новогиреевская, д. 3а) в отдел по работе с рекламациями и
организации
обучения
(тел.
(495)
974-96-46,
факс
(495)
916-18-18,
e-mail:
products@pcr.ru)1.
1
Отзывы и предложения о продукции «АмплиСенс» вы можете оставить, заполнив анкету
потребителя на сайте: www.amplisens.ru.
Форма 1 REF К2-18-100 / VER 03.10.11 / стр. 10 из 12
СИМВОЛЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ В ПЕЧАТНОЙ ПРОДУКЦИИ
Номер в каталоге
Осторожно!
Обратитесь к
сопроводительной
документации
Код партии
Максимальное
число тестов
Изделие для in vitro
диагностики
Использовать до
Дата изменения
Обратитесь к
руководству по
эксплуатации
Ограничение
температуры
Не допускать
попадания
солнечного света
Производитель
Дата изготовления
Форма 1 REF К2-18-100 / VER 03.10.11 / стр. 11 из 12
Лист вносимых изменений
Редакция
03.06.11
RT
16.08.11
LA
03.10.11
VV
Место внесения
изменений
Суть вносимых изменений
СП 2.1.7.728-99 «Правила сбора, хранения и удаления
отходов лечебно-профилактических учреждений»
Меры
заменены на СанПиН 2.1.7.2790-10 «Санитарнопредосторожности
эпидемиологические требования к обращению с
медицинскими отходами»
В пункте 9 предложение «Верхнюю фаза
положительных и отрицательных контролей
Экстракция РНК из перенести в пробирки, содержащие раствор С и
исследуемых
тРНК 1 мкг/мкл» заменено на «Верхнюю фазу
образцов
положительных и отрицательных контролей
перенести в пробирки, содержащие раствор С,
тРНК 1 мкг/мкл и гликоген 1%»
В таблицу реагентов, содержащих опасные вещества
добавлен раствор А
Меры
предосторожности Добавлена расшифровка обозначений факторов риска
и мер предосторожности для фенола
Добавлен раздел «Символы, используемые в
печатной продукции»
По тексту
Изменено название института на ФБУН ЦНИИ
Эпидемиологии Роспотребнадзора
Формы выпуска
комплекта
Добавлена форма 2 – комплектация наборов оптом
реагентов
Титульная
Добавлен символ, обозначающий «изделие для in
страница
vitro диагностики»
Нижний
«Кат. №» и «дата изменения» заменены на
колонтитул
соответствующие символы
Добавлены символ, наименование и адрес
производителя
Титульная
Значок «Изделие для in vitro диагностики» перемещен
страница
в правый нижний угол страницы
Удалена информация из нижнего колонтитула
Меры
предосторожности
Удалена таблица реагентов, подлежащих маркировке
как содержащие опасные вещества
Форма 1 REF К2-18-100 / VER 03.10.11 / стр. 12 из 12