Учебно-методическое - Южный федеральный университет
реклама
Учебно-методическое пособие БОЛЬШОЙ ПРАКТИКУМ ПО БИОХИМИИ Часть 2 Сорокина И. А., Вечканов Е. М. Ростов-на-Дону 2010 год МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РФ ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ АВТОНОМНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «ЮЖНЫЙ ФЕДЕРАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ» И. А. СОРОКИНА, Е. М. ВЕЧКАНОВ УЧЕБНО-МЕТОДИЧЕСКОЕ ПОСОБИЕ Большой лабораторный практикум Часть 2 Биохимия белков и пептидов Ростов-на-Дону 2010 1 УДК577.112. Рецензент: д.б.н., профессор кафедры биохимии и микробиологии биологопочвенного факультета ЮФУ Корниенко И. В. Печатается по постановлению редакционной комиссии по биологическим наукам биолого-почвенного факультета ЮФУ. Протокол № 3 от 01 июня 2010 г. доц. каф. биохимии и микробиологии ЮФУ, к.б.н. Сорокина И. А. ст. преп. каф. биохимии и микробиологии ЮФУ, к.б.н. Вечканов Е.М Большой лабораторный практикум по биохимии. Часть 2. Биохимия белков и пептидов. Учебметод, пособие для вузов / И.А. Сорокина, Е.М. Вечканов. Ростов-на-Дону: Изд-во: «КОПИ-ЦЕНТР», Ростов-на-Дону, 2010. 96 с. Учебно-методическое пособие предназначено для студентов дневной и заочной форм обучения специальности биология, очно- специализирующихся по биохимии. Данное учебно-методическое пособие рассматривает современные методы качественного и количественного определения аминокислот, пептидов и белков и их характеристику. УДК 577.112. 2 ОГЛАВЛЕНИЕ Введение в лабораторный практикум по биохимии белков и пептидов----------------- 7 МОДУЛЬ № 1.Особенности подготовки биологического материала для фракционирования, очистки и хранения белков---------------------------------------------- 8 Комплексная цель----------------------------------------------------------------------------------------- 8 Содержание------------------------------------------------------------------------------------------------- 8 1.1 Разрушение клеток и экстракция--------------------------------------------------------------- 8 1.2 Методы фракционирования аминокислот, пептидов и белков-------------------------- 14 1.3 Фракционирование по молекулярной массе------------------------------------------------- 14 1.3.1 Фракционирование с помощью мембран---------------------------------------------- 14 1.3.1.1 Диализ-------------------------------------------------------------------------------- 15 1.3.1.2 Ультрафильтрация----------------------------------------------------------------- 16 1.3.2 Гельфильтрация----------------------------------------------------------------------------- 19 Фракционирование с использованием свойств растворимости------------------------- 22 1.4.1 Высаливание--------------------------------------------------------------------------------- 22 1.4.2 Изоэлектрическое осаждение------------------------------------------------------------ 24 1.4.3 Осаждение органическими растворителями------------------------------------------ 25 1.4.4 Осаждение нагреванием------------------------------------------------------------------- 26 1.4.5 Осаждение белков минеральными и органическими кислотами----------------- 26 1.4 ПРОЕКТНОЕ ЗАДАНИЕ К МОДУЛЮ № 1 Практическое задание к модулю № 1. Сравнительная характеристика методов осаждения белков плазмы крови ----------------------------------------------------------------------- 27 Оборудование, материалы, реактивы к модулю № 1----------------------------------------------- 27 Тест рубежного контроля к модулю 1----------------------------------------------------------------- 29 МОДУЛЬ № 2.Количественное определение белка в биологическом материале-- 31 Комплексная цель---------------------------------------------------------------------------------------- 31 Содержание------------------------------------------------------------------------------------------------- 31 2.1 Определение содержания общего белка в сыворотке крови биуретовым методом---------------------------------------------------------------------------------------------- 32 2.2 Определение содержания белка методом Лоури------------------------------------------- 34 2.3 Количественное определение белка в коротковолновом ультрафиолете-------------- 36 2.4 Количественное определение содержания белка в сыворотке крови по Брэдфорду------------------------------------------------------------------------------------------- 37 ПРОЕКТНОЕ ЗАДАНИЕ К МОДУЛЮ № 2----------------------------------------------------------------- 38 Оборудование, материалы, реактивы к модулю № 3----------------------------------------------- 38 3 Практическое задание № 1 к модулю № 2. Сравнительное количественное определение белка в плазме крови, гомогенате печени и мозга экспериментальных крыс различными методами----------------------------------------------------------------------------------------------------- 38 Практическое задание № 2 к модулю № 2. Количественное определение альбумина в плазме крови экспериментальных крыс колориметрическим методом на основе реакции с бромкрезоловым зелѐным------------------------------------------------------------------- 39 Практическое задание № 3 к модулю № 2. Характеристика основных методов количественного определения белков ---------------------------------------------------------------- 40 Вопросы рубежного контроля к модулю 3----------------------------------------------------------- 40 Тест рубежного контроля к модулю 3-------------------------------------------------------------- 41 МОДУЛЬ № 3.Состав, строение, свойства и функции пептидов. Количественное определение глутатиона-------------------------------------------------------------------------------- 43 Комплексная цель---------------------------------------------------------------------------------------- 43 Содержание------------------------------------------------------------------------------------------------- 43 3.1 Состав, строение, и свойства пептидов------------------------------------------------------- 43 3.2 Метод количественного определения глутатиона------------------------------------------ 45 ПРОЕКТНОЕ ЗАДАНИЕ К МОДУЛЮ № 3 Практическое задание к модулю № 3. Определение содержания глутатиона в плазме крови и гомогенатах печени крысы-------------------------------------------------------------------- 46 Оборудование, материалы, реактивы к модулю № 3----------------------------------------------- 46 Тест рубежного контроля к модулю 2-------------------------------------------------------------- 47 Назначение теста и критерий оценки----------------------------------------------------------------- 47 МОДУЛЬ № 4.Технологии очистки белка и определение его характеристик------ 47 Комплексная цель---------------------------------------------------------------------------------------- 47 Содержание------------------------------------------------------------------------------------------------- 47 4.1 Электрофоретические методы разделения белков-------------------------------------------- 47 4.1.1 Общая теория электрофореза------------------------------------------------------------ 47 4.1.2 Факторы, влияющие на подвижность белков----------------------------------------- 48 4.1.3 Общие методы электрофореза и применяемое оборудование-------------------- 51 4.1.4 Способы визуализации (окраски) белковых фракций------------------------------ 55 4.1.5 Элюция белков из геля-------------------------------------------------------------------- 56 4.1.6 Изоэлектрическое фокусирование. 2D- электрофорез----------------------------- 57 4.2 Блоттинг----------------------------------------------------------------------------------------------- 58 4.3 Хроматографические методы разделения белков-------------------------------------------- 63 4.3.1 Общие принципы хроматографии------------------------------------------------------4 63 4.3.2 Хроматография высокого давления----------------------------------------------------- 65 4.3.3 Ионообменная хроматография --------------------------------------------------------- 66 4.3.4 Аффиннная хроматография -------------------------------------------------------------- 69 4.3.5 Гидрофобная хроматография------------------------------------------------------------ 72 4.3.6 Адсорбционная хроматография--------------------------------------------------------- 72 4.3.7 Тонкослойная хроматография----------------------------------------------------------- 74 4.4 Идентификация белка. Масс-спектрометрические методы анализа---------------------- 75 4.4.1 Общие принципы масс-спектрометрического анализа----------------------------- 75 4.4.2 Масс-спектрометрический анализ в протеомике------------------------------------ 76 4.4.3 Международные банки данных белков (PDBи др.) --------------------------------- 87 ПРОЕКТНОЕ ЗАДАНИЕ К МОДУЛЮ № 4. Практическое задание № 1 к модулю № 4. Электрофоретический анализ смеси белков с помощью градиентного гель-электрофореза в денатурирующих условиях----------------- 89 Оборудование, материалы, реактивы к модулю № 4----------------------------------------------- 89 Тест рубежного контроля к модулю 4-------------------------------------------------------------- 94 Назначение теста и критерий оценки----------------------------------------------------------------- 94 Список литературы-------------------------------------------------------------------------------------- 95 5 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ВЭЖХ – высокоэффективная жидкостная хроматография Да - дальтон – 1,661•10-24 г. ДСН (SDS) – додецилсульфат натрия ДТНБК – 5,5 дитиобис-(2-нитробензойная кислота) ДТТ - дитиотрейтол ИОХ – ионообменная хроматография ИЭТ – изоэлектрическая точка МАЛДИ (MALDI) – матрично-активированная лазерная десорбция (ионизация) МС (MS) – масс-спектрометрия β-МЭ – β-меркаптоэтанол НК – нуклеиновые кислоты ПАВ – поверхностно активные вещества ПААГ – полиакриламидный гель ПЭГ - полиэтиленгликоль ЭДТА – этилендиаминтетрауксусная кислота ЭСИ (ESi) – электроспрей-ионизация APCI – химическая ионизация APPI – фотохимическая ионизация FPLC– высокоэффективная жидкостная ионообменная хроматография GSH – восстановленный глутатион GSSG – окисленный глутатион HPLC – высокоэффективная жидкостная гидрофобная хроматография Ig - иммуноглобулин MS/MS – тандемная масс-спектрометрия PES -полиэфирсульфон PVDF – поливинилиден фторид TOF – времяпролѐтный детектор 6 ВВЕДЕНИЕ В ЛАБОРАТОРНЫЙ ПРАКТИКУМ ПО БИОХИМИИ БЕЛКОВ И ПЕПТИДОВ Огромные успехи биохимии в значительной степени обусловлены совершенствованием методик исследования, разработанных для изучения свойств и строения белков, и без преувеличения их можно назвать фундаментом современной биохимии. Исследования строения и функций белков предполагает наличие высокоочищенных препаратов. Получение белка в гомогенном состоянии достаточно сложная задача. Как правило, биологический материал, являющийся источником выделения, содержит большое число белков, их комплексов друг с другом и другими биополимерами. Близкие свойства компонентов этой смеси требуют при выделении индивидуальных белков использования разнообразных методов и различных их сочетаний. Трудности получения чистого белка связаны также с лабильностью белков и опасностью их денатурации, что сужает круг возможных методов выделения. Данное методическое пособие содержит краткое описание основных приемов очистки, фракционирования и характеристики белков и довольно простые объяснения теории происходящих при этом процессов. Предполагается, что студенты знакомы с основами биохимии, органической, аналитической и физической химией. Материал настоящего учебно-методического пособия подбирался исходя из конкретных задач, стоящих перед биохимиком в практической работе. После краткого рассмотрения теоретических основ какого-либо раздела дается описание конкретных методов. Пособие состоит их четырех разделов (модулей): 1. Особенности подготовки биологического материала для фракционирования, очистки и хранения белковых препаратов. 2. Количественное определение белка в биологическом материале. 3. Количественное определение некоторых пептидов. 4. Технологии очистки белка и определение его физико-химических характеристик. Первый раздел знакомит студентов с наиболее используемыми методами подготовки биологического материала к последующему белковому анализу. Второй раздел призван помочь студентам освоить колориметрические и спектрофотометрические методы определения концентрации белка, а также познакомится с критериями чистоты полипептидов. В третьем разделе описаны методы определения концентрации некоторых пептидов. В четвѐртом разделе студенты знакомятся с современными методами фракционирования белка, включая электрофоретические и хроматографические методы, метод изоэлектрофокусирования и масс-спектрометрии. В этом же разделе описаны подходы к определению молекулярной массы белков посредством гельхроматографии и электрофореза в полиакриламидном геле. Приведенные в практикуме методики максимально используют доступное лабораторное оборудование и реактивы. 7 МОДУЛЬ № 1. ОСОБЕННОСТИ ПОДГОТОВКИ БИОЛОГИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА ДЛЯ ФРАКЦИОНИРОВАНИЯ, ОЧИСТКИ И ХРАНЕНИЯ БЕЛКОВ Комплексная цель Усвоение знаний в области особенностей подготовки биологического материала к последующему белковому анализу. Содержание 1.1 Разрушение клеток и экстракция Методологическая база современной химии белка (протеомика) позволяет получать высокоочищенные белки и пептиды практически из любой живой материи. Однако, наиболее востребованными в практической химии белка, являются следующие группы биологического материала: 1. Биологический материал животного происхождения, включающий ткани животных: (сердце, скелетные мышцы, печень, мозг, тестикулы, реже селезѐнка и лѐгкие), не инвазивные (слюна, моча, слезная жидкость и др.) и инвазивные (кровь, лимфа, ликвор) жидкости. 2. Биологический материал растительного происхождения (мягкие ткани/паренхима), меристематические ткани (стеблевые, листовые и корневые апексы, интеркалярный и раневой камбий). 3. Биологический материал микробного и вирусного происхождения, состоящий из биомассы бактерий, дрожжей и вирусных систем. Животные ткани различаются по своей прочности: легко разрушаются эритроциты, а в кровеносных сосудах, напротив, содержится жесткий коллагенсодержащий материал. Успешным является замораживание ткани в жидком азоте и измельчение ее в замороженном состоянии. Ряд белков можно извлечь из тканей после обработки их ацетоном или другими органическими растворителями. Растительные клетки труднее разрушаются, так как содержат целлюлозную оболочку. Некоторые бактерии легко разрушаются под действием осмотического шока, а более устойчивые с толстой клеточной стенкой требуют механического воздействия, например ультразвуком. Таким образом, способы разрушения клеток можно разделить на следующие группы (см. табл. 1.1): 8 Таблица 1.1 Методы разрушения различных клеток № 1 2 3 4 5 6 7 8 Способы гомогенизации Пример Мягкое воздействие Принцип метода Осмотическое разрушение клеточной мембраны Ферментный гидролиз полисахаридных цепей Обработка бактерий муреиновой клеточной Ферментативный лизис лизоцимом стенки, что приводит к осмотическому разрыву клеточной мембраны Клеточная стенка и мембрана частично растворяется под действием химических Химическая Экстракция дрожжей растворителей, солюбилизация и автолиз толуолом освобождающиеся при этом литические ферменты завершают процесс. Трѐхкратное замораживание и Криодеградация оттаивание в жидком азоте (метод Растительные ткани (-272 0С) приводит к замораживания/оттаивания) механическому разрыву клеточной стенки и мембраны Суспендированные клетки (биомассу) насыщают газообразным азотом при Животные ткани и высоком давлении, затем клетки, граммдавление резко сбрасывают, Метод «азотной бомбы» отрицательные при этом азот проникает в бактерии цитоплазму клеток и, выделяясь в газообразном виде «взрывает» клеточные стенки и мембраны. Холодный ацетон растворяет Ткани мозга, фосфолипидный слой Метод ацетоновых железистые мембран клеток и вызывает порошков структуры. частичную денатурацию и агрегация белков. Клетки продавливают через Ткани мозга, печени, узкий зазор гомогенизатора и Ручная гомогенизация железистые создают силу сдвига, что структуры. приводит к разрушению мембран. Ткани мозга, печени, Клетки разрушают в процессе железистые растирания тканей в ступке Растирание структуры, мышечные под воздействием силы ткани. сдвига. Физический лизис клеток Лизис эритроцитов 9 Продолжение таблицы 1.1 Воздействие средней силы 1 Лопастной гомогенизатор (типа Уоринга Поттера) Большинство животных и растительных тканей 2 Растирание с абразивом (песок, окись алюминия, измельчѐнное стекло) Растительные ткани, биомасса дрожжей и бактерий. Происходит механическое измельчение клеток тканевых структур и их отделение друг от друга. Разрушение клеточных стенок происходит благодаря созданию силы сдвига и наличия в частицах абразива мелких шероховатостей. Сильное воздействие 1 Пресс Френча Бактерии, растительные ткани 2 Вибрационная шаровая мельница Суспензии клеток 3 Ультразвуковая дезинтеграция Суспензии клеток Клетки продавливаются через маленькие отверстия под большим давлением, происходит разрушение клеточных стенок и мембран под воздействием силы сдвига. Разрушение клеточной стенки происходит под действием сильной вибрации шариков Ультразвуковые волны создают высокий локальный градиент давления, в результате клетки разрушаются под действием напряжения сдвига и кавитации. 1. Мягкое воздействие, которое включает лизис клеток с помощью осмотического шока, разрушение под действием ферментов (лизоцима и др.), химическую солюбилизацию (например, экстракция дрожжей толуолом, при которой частично растворяется клеточная стенка), гомогенизацию вручную (клетки продавливают через зазор). 2. Воздействие средней силы, при котором используют лопастной гомогенизатор или растирание с абразивом (песком, стеклянными шариками). 3. Сильное воздействие с помощью пресса, ультразвука или шаровой мельницы. Выбор раствора для экстракции зависит от особенностей белка. Для растворимого белка используют буферные растворы. Обычно объем раствора в 2-3 раза превышает объем ткани. После экстракции белка массу центрифугируют при 10.000-20.000 об/мин на центрифуге с охлаждением. Смесь до центрифугирования называют гомогенатом (рис. 1.1). 10 Рис. 1.1 Общая схема разрушения клеток и экстракции. Жидкая фаза после осаждения нерастворимого материала (надосадочная жидкость или супернатант) носит название «экстракт». При гомогенизации необходимо соблюдать следующие условия: 1. Избегать крайних значений рН растворов, т.к. это может привести к полной или частичной денатурации белков. 2. Соблюдать низкий температурный режим (+40С) в ходе проведения дезинтеграции и экстракции биологического материала, т. к. при гомогенизации происходит деструкция лизосом с высвобождением лизосомальных ферментов. 3. Учитывать природу экстрагирующего буфера. Белки из гомогената (экстракта) извлекают 3 способами: I. Экстракция водой. Вода экстрагирует не все белки. Например, существуют водорастворимые фракции крови – альбумины и солерастворимые фракции – глобулины. II. Экстракция 8-10% растворами нейтральных солей. Клетки содержат разные соли и много нерастворимого, несущего заряд материала – белки, нуклеиновые кислоты. Ионная сила в цитоплазме клетки колеблется в пределах 0,15-0,2 М. В этих условиях 11 цитоплазматические белки «растворимы» в том смысле, что могут перемещаться в клетке. III. Экстракция буферными растворами, с соответствующим рН. Для того чтобы быть уверенным, что все «растворимое» содержимое клетки перешло в экстракт, следует использовать буфер с ионной силой, близкой к физиологической и с соответствующим значением рН. Обычно используют следующие буферные системы: 20-50 мМ фосфатный буфер, рН 7,0-7,5 0,1 М Трис/НСl, рН 6,8-8,0 Как правило, буфер содержит Na2 –ЭДТА(1-5 мМ) для связывания ионов металлов с изменяющейся степенью окисления, с целью предотвращения протекания окислительных процессов, а также DTT, для сохранения сульфидных групп белков и «консервации» белков в нативном состоянии. Экстракция белков, связанных с мембраной представляет особую проблему. Иногда выделение таких комплексов удается провести с использованием детергентов, в состав которых входят липофильные (алифатические или ароматические) цепи, взаимодействующие с гидрофобными поверхностями белка и вытесняющие его из комплекса с нормальной мембраной. Из детергентов наиболее широко применяются дезоксихолат, додецилсульфат натрия (анионный детергент), тритон Х-100 и др. Ниже в таблице 1.2 кратко приведены основные характеристики детергентов. Таблица 1.2 Общая характеристика некоторых детергентов Название Структура Анионные ПАВ Характеристика Додецил сульфат натрия (SDS), лаурилсульфат натрия, ириум, SDS Вызывает разрушение клеточных стенок грамотрицательных бактерий. Используется для отделения белков от нуклеиновых кислот и ДНК, солюбилизирует белки и создаѐт на них сильный отрицательный заряд, широко используется в электрофорезе. Саркозил (Na-cольлаурилсаркозина) Солюбилизирует белки, создаѐт сильный отрицательный заряд. Неионогенные ПАВ Тритоны: Полиоксиэтилен-n- Тритон - это торговое название целой серии в 12 (трет-октил)фенол Тритон-Х-100 ПЭГ (n = 9,10) M = 625 Нонидет Р40 ПЭГ (n = 9) Твин-20 ПЭГ (n = 20), сорбитанмонолаурат Твин-80 ПЭГ (n = 20), сорбитанмоноолеат большинстве своем неионных детергентов на основе полиоксиэтилен-n(трет-октил)фенола. Лучший реагент, позволяющий максимально увеличить число и выход растворимых компонентов мембран, выделяемых в не денатурирующих условиях. Используется для солюбилизации липидного материала Используется для дополнительной обработки мембран с целью удаления периферийных белков. Используется для фракционирования тканей клеточных культур Если экстракция была проведена из микробных или растительных источников или из ядер животных клеток, раствор содержит большие количества нуклеиновых кислот. Для удаления этих полианионов, взаимодействующих с белками изменяют рН раствора или добавляют такие соединения как протаминсульфат или стрептомицин. Нуклеиновые кислоты могут быть удалены также обработкой РНК-азами и ДНК-азами с последующим удалением низкомолекулярных соединений. После центрифугирования на поверхности экстракта могут плавать частицы жира. Его можно удалить фильтрацией через стекловату или плотную ткань. Сложности работы с растительными экстрактами состоят в том, что большинство растений содержат фенольные соединения, которые легко окисляются под действием эндогенных фенолоксидаз с образованием темных пигментов. Эти пигменты ковалентно соединяются с белками и инактивируют многие ферменты. Кроме того, они мешают определению количества белка в экстрактах, так как такие классические методы как метод Лоури основаны на реакциях с ароматическими аминокислотами. Известны два способа решения этой проблемы. Во-первых, добавление какого-либо тиолового соединения, например β-меркаптоэтанола, сводящего до минимума действие фенолоксидаз. Во-вторых, добавление порошкообразного поливинилпирролидона, адсорбирующего фенольные соединения. Если экстракт, содержащий значительную часть исследуемого белка, получен, из него удалены частицы и небелковый материал, можно приступать к концентрированию и очистке белка. 13 1.2 Методы фракционирования аминокислот, пептидов и белков. Существует ряд методов фракционирования, основные из них представлены на рисунке 1.2 Рис. 1.2 Основные методы фракционирования аминокислот, пептидов и белков. 1.3. Фракционирование по молекулярной массе 1.3.1 Фракционирование с помощью мембран В биохимической практике часто возникает необходимость сконцентрировать водные растворы белков и удалить из них мелкие неорганические ионы. Самый распространенный способ концентрирования веществ — использование специальных мембран. Такие мембраны обладают хорошей проницаемостью для небольших молекул и практически непроницаемы для крупных. Диффузия небольших молекул через мембраны обеспечивается следующими факторами: а) разностью концентраций подлежащего удалению вещества в исследуемом растворе и чистом растворителе, находящихся по разные стороны мембраны (диализ); б) разностью гидростатических давлений по обе стороны мембраны, обеспечивающей диффузию молекул растворителя через мембрану (ультрафильтрация); в) при переносе ионов через мембрану — приложенным внешним электрическим полем (электродиализ). 14 В каждом из вышеперечисленных случаев раствор диффундирующего через мембрану вещества условно называется ультрафильтратом. 1.3.1.1 Диализ Чтобы удалить из исследуемого раствора молекулы растворенного вещества, его помещают в целлюлозный мешочек и погружают в чистый растворитель (воду или буферный раствор). Малые молекулы будут выходить из мешочка в растворитель до тех пор, пока их концентрации по обе стороны мембраны не станет одинаковой. Для ускорения диффузии площадь поверхности диализного мешочка делают как можно большей, помня, однако, о возможной потере макромолекул в результате сорбции их на мембране, а слои раствора, примыкающего к мембране, постоянно заменяют, перемешивая растворитель, а иногда и раствор. Рекомендуется также регулярно сменять растворитель. Если осмотическое давление в исследуемом растворе и растворителе неодинаково, то по мере выхода из диализного мешочка растворенного вещества молекулы чистого растворителя будут проникать внутрь мембраны (явление осмоса), что приведет к разведению исследуемого раствора. Растворы макромолекул можно концентрировать путем диализа против растворов высокомолекулярных веществ, таких, например, как полиэтиленгликоль (карбовакс). Простейший диализатор представляет собой мешочек из коллодия (полупроницаемого материала), в котором находится диализируемая жидкость. Мешочек погружают в растворитель (например в воду). Постепенно концентрации диализирующего вещества в диализируемой жидкости и в растворителе становятся равными. Меняя растворитель, можно добиться практически полной очистки от нежелательных примесей (рисунок 1.3). Рис. 1.3 Схема проведения диализа 15 В продаже имеются диализные трубки различного диаметра, обычно они не пропускают молекулы крупнее 15000-20000 Да. Для более полного удаления низкомолекулярных веществ в процессе диализа необходима смена буферного раствора в диализате. Диализ является длительной процедурой, ставят его обычно на ночь. Удаление солей и замену буфера предпочтительней проводить более быстрым методом гельфильтрации. 1.3.1.2 Ультрафильтрация Разность давлений по обе стороны мембраны создается путем повышения давления со стороны фильтруемого раствора или понижения его в ультрафильтрате. Фирменные приборы для ультрафильтрации состоят из камеры особой конструкции, в которой создается положительное давление, и, как правило, снабжены магнитными мешалками. При ультрафильтрации небольших объемов материала (в клинических лабораториях) разность давлений может создаваться при использовании вакуум-насоса или при центрифугировании образца. Метод основан на применении полупроницаемых мембран с определенными размерами пор, при этом вода и малые молекулы проходят через мембрану, а по другую сторону мембраны остается концентрированный раствор белка. Основными материалами мембран являются: 1. Целлюлоза 2. Поливинилиден фторид PVDF 3. Полиэфирсульфон PES 4. Гидрофильный и гидрофобные PTFE Смешанные эфиры целлюлозы. Это наиболее широко используемые фильтры для общих целей лабораторной фильтрации. Они являются гидрофильными, могут быть белыми и черными, с сеткой и без, размер пор от 0,025 – 8,0 мкм (рис. 1.4 а). Поливинилиден фторид (PVDF).Используется в основном для стерилизующей фильтрации белковых растворов, антибиотиков и сред. Характеризуется ничтожно малой сорбцией белков, совместимостью со спиртами и мягкой органикой, гидрофильностью и размером пор – 0,1 – 5 мкм (рис. 1.4 б). Полиэфирсульфон (PES).Используется для фильтрации культур тканей, сывороток и сред, обладает высокой пропускной способностью (скоростью фильтрации) за счет ассиметричного строения пор (рис. 1.5), имеет низкое связывание белков, размер пор 0,22 – 0,45 мкм (рис. 1.4 в). 16 Гидрофобная и гидрофильная мембрана PTFE. Гидрофильная мембрана разработана специально для ВЭЖХ, очистки фракций с содержанием кислот, оснований (рис. 1.4 г). Устойчива к органическим растворителям. а б в г Рис. 1.4 Микрофотографии мембран, применяемых для фильтрации и ультрафильтрации. Рис. 1.5 Строение пор у полиэфирсульфона. Коническое строение пор у мембраны на основе полиэфирсульфона улучшает фильтрацию белков через такую мембрану Чрезвычайно эффективным методом фильтрации небольших объѐмов белковых смесей, является фильтрация через специальные одноразовые стерильные насадки Millex, выпускаемые в различных конфигурациях с различными мембранами и размерами пор. Насадка надевается на шприц, и раствор пропускается через фильтр (рисунок 1.6). Рис. 1.6 Насадки Millex, содержащие различные мембраны. 17 Другим методом фильтрации является фильтрация с использованием вакуумного оборудования (насос разрежения) или оборудования, создающего давление (насос нагнетания) (рисунок 1.7). 6а 6б 6в Рис. 1.7 Системы для фильтрации и ультрафильтрации 7а – стальной фильтродержатель для фильтрации давлением; 7б – фильтродержатель для фильтрации вакуумом; 7в – вакуумно-нагнетательный насос. Одним из способов ультрафильтрации является фильтрация через мембраны, с использованием центробежной силы. Раствор белка помещают в стандартную пробирку с вкладышем, содержащим мембрану. При центрифугировании под действием центробежной силы раствор продавливается через мембрану (рисунок 1.8). Выпускаются различные мембраны, осуществляющие отсечение белков 3, 10, 30, 50, 100 кДа, время центрифугирования колеблется 5-10 мин при скорости 16000 об/мин. 7а 7б Рис. 1.8 Центрифужные пробирки с вкладышем для ультрафильтрации 8а - вкладыш для ультрафильтрации, 8б – схема процесса концентрирования и ультрафильтрации белков. 18 1.3.2 Гельфильтрация Гель-фильтрация позволяет разделять белки по величине и форме молекул. Разделение проводят в хроматографических колонках, заполненных сферическими частицами набухшего геля (размером 10-500 мкм) из полимерных материалов. Частицы геля проницаемы благодаря внутренним каналам, которые характеризуются определенным средним диаметром. Носителем для хроматографии является гель, который состоит из поперечно-сшитой трехмерной молекулярной сетки, сформированной в виде шариков (гранул) для удобства наполнения колонок. Так сефадексы - это поперечно-сшитые декстраны (α-1→6-глюканы микробиального происхождения) с заданными размерами пор. Сшиты цепи декстрана трехуглеродными мостиками с помощью эпихлоргидрина (рисунок 1.9). Рис. 1.9 Структура сефадекса Чем больше поперечных сшивок, тем меньше размеры отверстий. Полученный таким образом гель играет роль молекулярного сита. При пропускании раствора смеси веществ через колонку, наполненную набухшими гранулами сефадекса, крупные частицы, размер которых превышает размер пор сефадекса, будут двигаться быстро. Мелкие молекулы, например соли, будут двигаться медленно, поскольку в процессе движения они проникают внутрь гранул. Колонка, наполненная сефадексом, характеризуется общим объѐмом Vo, который складывается из внутреннего объема Vв, находящегося внутри гранул, объема наружного Vн, занимающего пространство между гранулами, и объема Vм, отражающего массу геля: Vо=Vв+Vн+Vм Распределение вещества между внутренним и внешним объемами характеризуется коэффициентом распределения Кр, равным Кр = (Vэ–Vн)/ Vв Если вещество не проникает внутрь глобул, объем элюции равен наружному объему и Кр=0. Если же вещество равномерно распределено внутри гранул и между ними, объем 19 элюции равен сумме внутреннего и наружного объемов и Кр=1. Существуют различные марки сефадексов, отличающиеся размером пор, обозначаемые как G-10, 15, 25, 50, 75 и т.д. Чем меньше номер, тем больше число поперечных сшивок/ Смесь белков вносят в колонку с гелем и элюируют буферным раствором. Белковые молекулы, не способные проникать в гранулы геля, будут перемещаться с высокой скоростью. Средние и небольшие белки будут в той или иной степени удерживаться гранулами геля. На выходе колонки элюат собирают в виде отдельных фракций. Объем выхода того или иного белка зависит в основном от его молекулярной массы (рисунок 1.10, 1.11). Рис. 1.10 Принцип гельфильтрации 20 Рис. 1.11 Хроматография смеси фрагментов, полученной после триптического гидролиза TEF-G на колонке с ультрагелем. 1 пик – фрагмент с Mr 75 кДа, 2 пик фрагмент с Mr 43 кДа, 3 пик фрагмент с Mr 26 кДа. Ниже приведены основные материалы, применяемые для гельфильтрации (таблица 1.3, 1.4): 1. Декстраны с поперечными сшивками эпихлоргидрином и полиакриламидными сшивками (Сефадексы, сефакрилы) 2. Агарозные гели с полиакриламидными поперечными сшивками (сефароза, биогели, сагавак) 3. Полистиролы (Био-Бидз S) 4. Пористые стеклянные шарики (биоглас) 5. Пористый кварц (порасил) 6. Полиакрилолилморфин (энзокрил-гель) 7. Производные поливинилового спирта (тойоперл) Для целей гельфильтрации наиболее широко применяется сефадекс G-25. 21 Таблица 1.3 Типы сефадексов Тип геля Область разделения по молекулярному весу в Дальтонах Поглощение воды г/г сухого геля до 700* до 1500* 100-5000* 1000-5000** 500-10000* 1500-30000** 1000-50000* 3000-80000** 1000-100000** 4000-150000** 1000-150000* 5000-300000** 1000-200000* 5000-600000** 1,0 1,5 2,5 2,5 5,0 5,0 7,5 7,5 10,0 10,0 15,0 15,0 20,0 20,0 G-10 G-15 G-25 G-50 G-75 G-100 G-150 G-200 Объѐм набухшего геля см3/г сухого геля 2 3 5 5 10 10 12-15 12-15 15-20 15-20 20-30 20-30 30-40 30-40 * - для полисахаридов с произвольной пространственной структурой ** - для пептидов и глобулярных белков Таблица 1.4 Свойства сефарозных гелей Тип геля Сефароза 2В Сефароза 4В Сефароза 6В Приблизительная концентрация агарозы в % Приблизительная область разделения, Да. полисахариды 20 х 106 5 х 106 1 х 106 2 4 6 белки 40 х 106 20 х 106 4 х 106 1.4 Фракционирование с использованием свойства растворимости 1.4.1 Высаливание Растворимость белков сильно зависит от концентрации солей (от ионной силы). В дистиллированной воде белки чаще всего растворяются плохо, однако их растворимость возрастает по мере увеличения ионной силы. При этом все большее количество гидратированных неорганических ионов связывается с поверхностью белка и тем самым уменьшается степень его агрегации (засаливание). При высокой ионной силе молекулы белков лишаются гидратирующих оболочек, что приводит к агрегации и выпадению белка в 22 осадок (высаливание) (рис. 1.12). Используя различие в растворимости, можно с помощью обычных солей, разделить (фракционировать) смесь белков. Рис. 1.12 Высаливание Разделение белков на основе их различной растворимости является классическим методом. Так фракционирование солями основывается на избирательном разделении белков вследствие их различной растворимости в растворах солей. Соль подбирается в соответствии со следующими требованиями: она должна обладать достаточной растворимостью, которая не меняется значительно в зависимости от температуры, при добавлении соли не должен заметно меняться рН раствора, она легко отделяется от белка и не оказывает денатурирующего действия. Наиболее эффективными являются соли, анионы которых имеют большой заряд. По способности к высаливанию анионы располагаются в ряд Гоффмейстера, который для некоторых обычных анионов выглядит следующим образом: SCN- < I- < ClO4 - < NO3- < Br- < Cl- < CH3 COO- < SO42- < PO43Хотя, судя по положению в этом ряду, фосфат более эффективен, чем сульфат, на практике при нейтральном значении рН фосфат состоит из смеси ионов РО 42- и Н2РО4 -, которые менее эффективны, чем РО43-. Что касается эффективности действия катионов на осаждение белков, то моновалентные ионы можно расположить в следующий ряд: NH4+ > K+ > Na+. Таким образом, из обычных солей эффективными осадителями белков являются сульфаты, фосфаты и цитраты. Наиболее часто употребляемой солью для фракционирования белков является сульфат аммония. Обычно проводят фракционное осаждение белков возрастающими концентрациями сульфата аммония. При описании методов выделения количество сульфата аммония выражают в процентах насыщения и часто употребляют выражения вроде "фракция, осажденная между 55 и 60% насыщения". Высаливание при добавлении необходимого количества сульфата аммония для осаждения всех белков является 23 эффективным способом концентрирования – при условии, что образец, который нужно сконцентрировать, не слишком разбавлен. Для получения раствора, приблизительно 85%го насыщения удобно растворить 60 г сульфата аммония в 100 мл. При такой концентрации немногие белки имеют растворимость выше 1 мг/мл. Но если исходная концентрация белка в растворе ниже 1мг/мл, то перед высаливанием следует повысить ее, например, с помощью ультрафильтрации. На растворимость белков оказывает влияние ряд факторов: Влияние ионной силы и температуры: При низкой ионной силе (<0.2M) растворимость белка увеличивается при повышении концентрации соли, так как экранирование притяжения противоположно заряженных групп приводит к разрыхлению структуры белка. При высокой ионной силе (>0.2M) - растворимость белка понижается из-за высаливания и обезвоживания. Она падает экспоненциально с повышением ионной силы: Влияние pH. При низкой ионной силе (<0.2M) растворимость белка минимальна при pH равном изоэлектрической точке белка. При высоких концентрациях (NH4)2SO4 растворимость повышается с повышением pH, так как при низких pH сульфат-ион компактизует белок, взаимодействуя с положительно заряженными группами. Влияние начальной концентрации белка Белки бывают двух типов. Для типа I растворимость не зависит от исходной концентрации белка; для типа II - зависит сильно. 1.4.2 Изоэлектрическое осаждение Растворимость можно рассматривать как результат полярного взаимодействия растворѐнного вещества с водным растворителем и ионных взаимодействий его с присутствующими солями, а также, в некоторой степени, как результат электростатических сил отталкивания между одноимѐнно - заряженными молекулами или небольшими (растворимыми) агрегатами молекул. Некоторые белки образуют осадок при ионной силе от нуля до физиологического значения, вследствие того, что силы отталкивания между молекулами недостаточны. Например, если поверхность глобулы характеризуется как гидрофобная, то это значит, что лишь малая еѐ часть взаимодействует с растворителем и соответственно меньшее число заряженных групп реагирует с солями. Заряд белков обусловлен в первую очередь остатками аспартата и глутамата (отрицательный заряд) и остатками лизина и аргинина (положительный заряд). По мере 24 повышения рН различными способами заряд белков проходит от положительных к отрицательным значениям и в изоэлектрической точке оказывается равен нулю. Если заряд молекулы снижается до нуля, изоэлектрическое отталкивание уменьшается и по мере приближения к изоэлектрической точке молекулы притягиваются друг к другу. Этот процесс и носит название изоэлектрическое осаждение. В смеси белков ситуация осложняется соосаждением: разные белки со сходными свойствами агрегируют и осаждаются при достижении pI. Осадки образуются в тканевом экстракте при понижении рН до значений 6,0 до 5,0. При этом агрегируют не только растворимые белки, но и частицы, например рибосомы и фрагменты мембран. Увеличение растворимости белка (при данных рН и температуре) с повышением концентрации соли, известно как «высаливание». 1.4.3 Осаждение органическими растворителями Это один из старых методов. Он играет важную роль при очистке белков в промышленных масштабах. Чаще всего используют такие растворители как этанол и ацетон, реже – изопропанол, метанол, диоксан. Основной механизм процесса: по мере возрастания концентрации органического растворителя снижается способность воды к сольватации заряженных гидрофильных молекул фермента. Происходит снижение растворимости белков до уровня, при котором начинается агрегация и осаждение. Важным параметром, влияющим на осаждение, является размер молекулы белка. Чем больше молекула, тем ниже концентрация органического растворителя, вызывающая осаждение белка. Используемый растворитель должен полностью смешиваться с водой, не реагировать с белками и обладать хорошим осаждающим действием. Одно из преимуществ фракционирования с помощью органических растворителей заключается в том, что его можно проводить при температуре ниже нуля, так как все смешивающиеся с водой растворители образуют смеси, замерзающие при температуре значительно ниже 0°С. Это очень важное свойство, так как в ходе фракционирования необходимо поддерживать низкую температуру. Наиболее часто для осаждения белков используется ацетон. Он обладает меньшим денатурирующим действием, чем этанол, отчасти потому, что при минусовой температуре требуются несколько более низкие его концентрации, чтобы получить такое же осаждение, как и при использовании этанола. Он также более летуч, что позволяет легко удалять его из растворенного осадка при пониженном давлении. Методика осаждения состоит в следующем: образец обычно охлаждают до 0° С в ледяной бане со льдом. Концентрация белка может быть 5-30 мг/мл, а концентрация соли не должна быть высокой. Высокая концентрация соли снижает электростатическую агрегацию, и требуются более высокие концентрации растворителя, что увеличивает вероятность 25 денатурации. При низкой концентрации соли может образоваться тонкая взвесь, которую трудно осадить. Оптимальная концентрация соли – 0,05-0,2 М. Растворитель добавляют медленно, чтобы избежать разогрева. Большинство белков осаждается при добавлении 2050% растворителя (по объему). Следует отметить, что «процентное содержание» не совсем точный термин. Если к 50 мл ацетона добавить 50мл воды, то общий объем жидкости составит только 95 мл. После уравновешивания смеси в течение 10-15 минут осадок отделяют центрифугированием. Затем осадок растворяют в холодном буфере. Обычно объем буфера в 2 раза превышает объем осадка. Небольшие количества органического растворителя (около 10% по объему) не мешают дальнейшему фракционированию. Если температура при фракционировании органическими растворителями высока, происходит денатурация белка. Однако некоторые ферменты обладают высокой стабильностью, и денатурация носит избирательный характер. Осаждение белков спиртом обратимо при условии, если процесс проводили без нагревания, и воздействие реагента было кратковременным. Продолжительный контакт белка со спиртом ведет к необратимому осаждению, денатурации. 1.4.4 Осаждение нагреванием Белки являются термолабильными соединениями и при нагревании свыше 50-60 0С денатурируются. Сущность тепловой денатурации заключается в разрушении гидратной оболочки, разрыве стабилизирующих белковую глобулу связей и развертывании белковой молекулы. Наиболее полное и быстрое осаждение происходит в изо электрической точке (когда заряд молекулы равен нулю), поскольку частицы белка при этом наименее устойчивы. Белки, обладающие кислыми свойствами, осаждаются в слабокислой среде, а белки с основными свойствами - в слабощелочной. В сильнокислых или сильнощелочных растворах денатурированный при нагревании белок в осадок не выпадает, т.к. его частицы перезаряжаются и несут в первом случае положительный, а во втором - отрицательный заряд, что повышает их устойчивость в растворе. Иногда на начальном этапе очистки для разделения белков иногда используют тепловую обработку. Она эффективна, если белок относительно устойчив в условиях нагревания, в то время как сопутствующие белки денатурируют. При этом варьируют рН раствора, продолжительность обработки и температуру. 1.4.5 Осаждение белков минеральными и органическими кислотами. Концентрированные минеральные кислоты (азотная, серная, соляная) вызывают резкую дегидратацию белковых частиц и нейтрализацию их заряда, при этом происходит 26 образование комплексных соединений. Все это ведет к необратимой денатурации белка. Ортофосфорная кислота не образует осадков с белками. Осадки, вызванные действием минеральных кислот, растворяются в избытке серной и соляной кислот, но не растворяются в азотной. Органические кислоты необратимо осаждают белок из растворов. Различные кислоты отличаются по силе действия. Наиболее эффективно и специфично действие сульфосалициловой и трихлоруксусной кислот (рис. 1.13). Рис. 1.13 Строение трихлоруксусной и сульфосалициловой кислот Под действием трихлоруксусной кислоты осаждаются только белки, сульфосалициловая же кислота, кроме белков, осаждает также высокомолекулярные продукты их распада — пептоны и полипептиды. ПРОЕКТНОЕ ЗАДАНИЕ К МОДУЛЮ № 1 Оборудование, материалы, реактивы к модулю № 1 Таблица 1.5 Список необходимых химреактивов № 1. 2. 3. 4. 5. 6. Наименование Центрифуга до 3000 об/мин (NH4)2SO4 NaCl Этанол Трихлоруксусная кислота Сульфосалициловая кислота Ед. изм. Кол-во г г мл г г 50 50 50 50 20 Практическое задание № 1. Сравнительная характеристика методов осаждения белков плазмы крови Произвести осаждение белков различными методами. Составить итоговую таблицу 1.5, характеризующую осаждение белков различными способами. 27 1. Осаждение глобулинов сульфатом аммония. 1. В пробирку, содержащую 3 мл плазмы крови добавить равный объем насыщенного раствора сернокислого аммония (2,4 М раствор) и перемешать. Инкубировать раствор в течение 20 мин при слабом перемешивании. 2. Полученный преципитат отцентрифугировать 10 мин 3000 об/мин 3. Супернатант декантировать. 4. Наличие белка в супернатанте (альбуминовая фракция) доказать биуретовой реакцией. 2. Осаждение альбуминов хлористым натрием 1. В пробирку, содержащую 3 мл плазмы крови добавить равный объем хлористого натрия. Инкубировать раствор в течение 20 мин при слабом перемешивании. 2. Полученный преципитат альбуминов отцентрифугировать 10 мин 3000 об/мин. 3. Супернатант декантировать. 3. Обратимое осаждение белков спиртом на холоду 1. В пробирку, содержащую 3 мл плазмы крови добавить равный объем холодного этанола. Инкубировать раствор на холоду в течение 10 мин. 2. Супернатант декантировать, полученный осадок растворить в 3 мл 0,9% хлористого натрия 4. Осаждение белков трихлоруксусной кислотой 1. К3 мл плазмы добавить 1/10 объѐма 100% ТХУ 2. Инкубировать 30 минут на льду или 15 минут при -20oC 3. Центрифугировать в течение 10 мин 3000 об/мин 4. Декантировать супернатант 5. Промыть осадок 1мл смеси этанол-эфир 1:1, осадок подсушить и растворить в нужном буфере. Таблица 1.6 Сравнительная характеристика различных способов осаждения белков. № Наименование метода Исследуемый препарат 1 Осаждение сульфатом аммония Плазма крови 2 Осаждение хлористым натрием Плазма крови 3 Осаждение холодным этанолом Плазма крови 28 Характеристика и особенности метода Осаждение трихлоруксусной кислотой Осаждение сульфосалициловой кислотой 4 5 Плазма крови Плазма крови Вопросы рубежного контроля к модулю 1 Подготовьте развѐрнутый ответ по следующим вопросам: 1. Опишите способы гомогенизации и разрушения клеток? 2. Что такое детергент? 3. Какие виды детергентов существуют? 4. Как удалить нуклеиновые кислоты из раствора белков? 5. Опишите основные методы фракционирования белков? 6. Что такое диализ? 7. Опишите строение простейшего диализатора? 8. Что такое ультрафильтрация? 9. Охарактеризуйте основные виды мембран? 10. Что такое гельфильтрация? 11. Какова структура сефадекса? 12. Опишите принцип гельфильтрации? 13. Какие типы сефадексов вы знаете? 14. Опишите метод высаливания? 15. Какие факторы влияют на растворимость белков? 16. Что такое изоэлектрическое осаждение? 17. В чѐм особенности осаждения органическими растворителями? 18. В чѐм особенности в осаждении трихлоруксусной и сульфосалициловой кислотами? Тест рубежного контроля к модулю № 1 Тест содержит задания. Выберите один или несколько правильных, по вашему мнению, вариантов ответа и отметьте их любым значком в бланке ответов. 1.Стабильность внеклеточных белков связана с: Высокой молекулярной массой c Субъединичной структурой наличием в структуре b d Водородными связями дисульфидных мостиков 2.Измельчѐнная ткань в буферном растворе (смесь до центрифугирования) называется: a a экстрактом c гомогенатом b супернатантом d вытяжкой 7. Неионный детергент Тритон Х-100 применяется: a как водоотнимающее средство при c 29 как ингибитор эндогенных кристаллизации белков фенолоксидаз растений при экстракции белков, связанных d с мембраной 8. 100 мл раствора белка с концентрацией 1 мг/мл в 1 М NаCl сконцентрирован ультрафильтрацией до 10 мл. Конечная концентрация раствора над мембраной a белок 10 мг/мл, 1М NаCl c белок 10 мг/мл, 0,1М NаCl b b белок 1 мг/мл, 0,1М NаCl d 9. Наиболее употребимая соль для фракционирования белков. a карбонат натрия c хлорид бария b сульфат аммония d хлорид 10. При осаждении белков органическими растворителями высокая концентрация соли в растворе… не влияет на процесс a повышает скорость осаждения c осаждения снижает электростатическую повышает электростатическую b d агрегацию молекул белка агрегацию молекул белка 11. Методом гель-фильтрации разделяют макромолекулы в соответствии с их… a зарядом c растворимостью b размерами d 12. Какие вещества можно фракционировать с помощью изоэлектрического фокусирования? a амфотерные c гидрофобные b высокомолекулярные d низкомолекулярные Назначение теста и критерий оценки Тест может использоваться для проведения рубежной оценки знаний студентов по модулю 3. Стоимость одного правильного ответа составляет 1 балл. При ответе на 8 баллов, тестируемому выставляется оценка 5; при ответе на 6-7 баллов, тестируемому выставляется оценка 4; при ответе на 5 баллов, тестируемому выставляется оценка 3. 30 МОДУЛЬ № 2. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ БЕЛКА В БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ Комплексная цель Усвоение знаний в области структурной организации и функции белков, ознакомление с методами их количественной оценки содержания в биологических жидкостях. Содержание Белки, (или протеины) - это высокомолекулярные, нелинейные, нерегулярные, неразветвленные природные полимеры, построенные из α-аминокислот, соединенных пептидными связями. Белки могут состоять из одной или нескольких полипептидных цепей, связанных между собой как ковалентно, так и нековалентно. В состав белков входят 20 генетически кодируемых аминокислот. В некоторых белках, помимо основных, обнаруживается не менее 50 минорных аминокислот. Для анализа белков и пептидов применяется весь арсенал современных физико-химических методов исследования: спектральных, электрофоретических и хроматографических. Как при выделении и очистке белков, так и при проведении разнообразных биохимических исследований необходимо количественное определение содержания белка в исследуемой фракции, в выделенном или исследуемом образце. Кроме того, анализ содержания белков в биологических жидкостях (крови) имеет важное биомедицинское значение и используется в диагностических целях. Количественное определение белка проводится, как правило, высокочувствительных с небольшим методов детекции. количеством Наиболее материала широко и требует распространены колориметрические и спектрофотометрические методы количественного определения белка Клинико-биохимический анализ обычно начинается с определения содержания общего белка в плазме (сыворотке) крови. Потребность установления его концентрации во многом обусловлена той многообразной и важной физиологической ролью, которую играют белки плазмы в организме. Благодаря им, поддерживается вязкость, текучесть крови, формируется ее объем в сосудистом русле, а форменные элементы удерживаются во взвешенном состоянии. Белки плазмы осуществляют транспорт многочисленных экзо- и эндогенных веществ, участвуя в связывании гормонов (кортизола и др.), минеральных компонентов (кальция, железа, меди и др.), липидов (неэстерифицированных жирных кислот), пигментов (свободного и конъюгированного билирубина) и других биологически важных соединений. Будучи амфотерным полиэлектролитом, они играют важную роль в регуляции кислотно-основного состояния организма, являются факторами свертывания 31 крови, антителами. Поэтому изменение их содержания в крови приводит к нарушению гомеостаза (в частности, водно-электролитного обмена, гемостаза) и специфической реактивности организма. Представление об уровне общего белка в плазме крови позволяет сделать более информативной трактовку протеинограммы — картины разделения белков по фракциям: благодаря выражению распределения альфа-1-, альфа-2-, бета- и гамма-глобулинов не в относительных, а в абсолютных единицах (г/л). Содержание общего белка в сыворотке (плазме) крови можно характеризовать понятиями «нормо-», «гипер-» и «гипопротеинемия», под которыми подразумеваются состояния, сопровождающиеся нормальной (не выходящей за пределы физиологических колебаний), повышенной и пониженной его концентрацией в крови. Изменения уровня общего белка могут быть как абсолютными, так и относительными. Последние обычно наблюдаются при увеличении (уменьшении) объема крови (плазмы). Так, гидремия (нагрузка водой, «водное» отравление) приводит к относительной гипопротеинемии, дегидратация (обезвоживание) — к относительной гиперпротеинемии. В связи с этим, при трактовке показателей общего белка в сыворотке (плазме) крови следует обязательно учитывать нарушения водного обмена: дегидратация может скрыть абсолютную гипопротеинемию, поскольку при данном сочетании концентрация белка в плазме крови не всегда отличается от нормы. Отсюда следует, что причиной гипо- и гиперпротеинемии может быть не только нарушение равновесия между поступлением, биосинтезом белка, его катаболизмом и удалением, но и изменение объема внутрисосудистого пространства за счет жидкой (водной) части крови. Понятно, что патогенез этих изменений различен. 2.1 Определение содержания общего белка в сыворотке крови биуретовым методом (метод Кингслея—Вейксельбаума). Принцип метода: Из колориметрических способов особого внимания заслуживают методы, основанные на биуретовой реакции, впервые описанной в 1914 г. Сущность метода состоит в том, что в щелочной среде ионы меди образуют с белками комплексы фиолетового цвета. При отщеплении атома водорода от енольной группы пептидной связи появляется отрицательный заряд, обеспечивающий связывание атома кислорода с ионом меди (в формировании комплекса имеет значение и связь иона меди с атомами азота за счет свободных электронных пар). При этом различие в интенсивности окрашивания комплексов, образованных альбумином и глобулинами, незначительно. Биуретовую реакцию дают не только белки, но и пептиды, состоящие из 3 и более аминокислот. Для выполнения реакции содержащий белок раствор подщелачивают 32 добавлением сегнетовой соли, после чего в него вносят избыток сульфата меди. Через некоторое время измеряют интенсивность окрашивания, зависящую от содержания белка. Концентрацию белка устанавливают обычно по интенсивности светопоглощения при длине волны 540—580 нм. Предел чувствительности биуретового метода, т. е. предел обнаружения белка в пробе, ограничивается концентрацией 300 мг/л, что в большинстве случаев делает невозможным его использование для определения концентрации белка в нативной моче. В дальнейшем последовал ряд модификаций этого метода, направленных на увеличение стабильности биуретового реактива Реактивы 1 . Раствор хлористого натрия (изотонический). 0,9 г NaCl растворяют в 100 мл дистиллированной воды. 2. 0,2 н раствор едкого натра, освобожденный от углекислого газа. 20 мл 1 н раствора NaOH доводят до объема 100 мл дистиллированной водой. 3. Биуретовый реактив. 4,5 г сегнетовой соли растворяют в 40 мл 0,2 н NaOH. После растворения прибавляют 1,5 г CuSO4х5H2O и 0,5 г KI. Раствор доводят до 100 мл 0,2 н NaOH. Хранят в темном месте (или в посуде из темного стекла),Реактив пригоден около месяца. 4. Щелочной раствор йодистого калия. 0,5 г KI растворяют в 100 мл 0,2 н NaOH. Хранят в посуде из темного стекла не более двух недель. 5. Рабочий раствор биуретового реактива. 20 мл биуретового реактива (3) смешивают с 80 мл раствора KI(4).Хранят в темном месте не более двух недель. 6. Стандартный раствор альбумина (из человеческой или бычьей сыворотки). 1,0 г альбумина растворяют (в небольшом цилиндре или точной мерной пробирке) в 6—7 мл изотонического раствора NaCl с последующим доведением им до конечного объема 10 мл. Для полного растворения белка содержимое пробирки выдерживают при комнатной температуре в течение 30 мин. Ход определения: 1. К 5 мл рабочего раствора биуретового реактива добавляют, избегая образования пены, 0,1 мл сыворотки крови. 2. Через 30 мин, пробу колориметрируют на фотоколориметре в кювете с длиной оптического пути 10 мм при зеленом светофильтре (с максимумом пропускания при длине волны 540—560 нм, лучше 546 нм). 3. Показатели абсорбции учитывают в сравнении с таковыми контрольной пробы, которую готовят путем добавления к 5 мл рабочего раствора биуретового реактива 0,1 мл реактива 1 (практически раствор NaCl можно и не добавлять). Расчет ведут по калибровочной кривой. 33 4. Для построения калибровочного графика из основного стандартного раствора белка (реактив 6)готовят 3 серии рабочих стандартных растворов (0,1 мл основного стандартного раствора содержит 0,01 г белка). Из каждого разведения берут по 0,1 мл рабочего раствора и вносят в пробирки, содержащие 5,0 мл рабочего биуретового реактива. Через 30 мин замеряют оптическую плотность стандартных проб, учитывая абсорбцию контрольной пробы. Интерпретация результатов (таблица 2.1) Таблица 2.1 Концентрация белка в плазме крови у людей различных возрастных групп, полученная с использованием биуретового метода № 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. Наименование Взрослые люди в возрасте до 60 лет Новорожденные доношенные Новорожденные недоношенные Новорожденные (в крови из пуповины) Дети в возрасте до 1 недели Дети в возрасте до 7 месяцев – 1 год Дети в возрасте до 1 – 2 года Дети в возрасте до 3-6 лет Ед. изм. г/л г/л г/л г/л г/л г/л г/л г/л Количество 65-85 46-70 36-60 40-80 44-76 51-73 56-75 56-85 2.2 Определение содержания белка методом Лоури Принцип метода. В основе метода Лоури (1951) лежит реакция с реагентом Фолина—Чокалтеу, активным компонентом которого является комплекс «молибдат—вольфрамат—фосфорная кислота». Возникающее в ходе ее окрашивание раствора обусловливается одновременным протеканием биуретовой реакции и процесса восстановления реактива Фолина циклическими аминокислотами — тирозином, триптофаном и другими, входящими в состав белковых молекул. Метод Лоури оказался примерно в 100 раз чувствительнее биуретового в его обычном исполнении и в 10—20 раз — метода, основанного на измерении поглощения белком ультрафиолетового света с длиной волны 263 и 280 нм. Благодаря простоте исполнения и высокой чувствительности метод определения белка по Лоури нашел использование при выполнении научных исследований. Существенным недостатком его является сравнительно невысокая специфичность. Многие присутствующие в анализируемых образцах вещества мешают определению белка с реактивом Фолина. К ним относятся: мочевая кислота, гуанин, ксантин, фенолы (за исключением нитрофенола), аминокислоты глицин, тирозин, гистидин, цистин; гидразин, сульфат аммония. Реакция развивается и с аденином, аденозином. цитозином, цитидином, урацилом, тимидином. Определение белка методом Лоури затрудняют тиоловые соединения, углеводы, глицерин, детергенты, хелатные 34 реактивы, дисульфидные реагенты, ионы калия, ацетилацетон, салицилаты, антибиотики, гистамин и другие физиологически активные амины. Присутствие в белковых препаратах продуктов перекисного окисления липидов также может дать значительную ошибку. Некоторые из веществ, используемых для приготовления буферных растворов, способны влиять на определение белка по Лоури. Так, широко распространенный трис-буфер, помимо образования неспецифического окрашенного соединения, подавляет взаимодействие реактива Лоури с белками. Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), применяющаяся обычно в качестве антикоагулянта, мешает определению белка по Лоури уже при концентрации 0,5 ммоль/л. На результатах определения сказывается влияние детергентов, используемых для солюбилизации белков. Таким образом, при использовании метода Лоури большое число различных соединений может исказить картину действительного содержания общего белка и его фракций. Реактивы 1. Реактив А: 0,5% раствор CuSO4∙5H2O в 1% растворе Na-K-виннокислого. 2. Реактив B: 2% раствор Na2CO3 в 0,1Н растворе NaOH. 3. Реактив С: в день определения 1 мл реактива А смешивают с 50 мл реактива В. 4. Реактив D: к 1мл готового реактива Фолина прибавляют 17 мл H2O. 5. Стандартный раствор альбумина: 20 мг альбумина растворяют в 100 мл 0,9% NaCl. Ход определения К 0,1 мл сыворотки крови (готовят две параллельные пробы) приливают по 0,4 мл изотонического раствора NaCl, затем по 0,1 мл реактива С, перемешивают и оставляют на 10 мин в темноте. Затем приливают 4 мл реактива D, тщательно перемешивают и помещают в темноту на 40 мин. Растворы колориметрируют при красном светофильтре (680-750 нм) против контроля на реактивы (0,5 мл NaCl, 1 мл реактива С и 4 мл реактива D). Построение стандартной кривой Для построения стандартной кривой в 6 пробирок (по 2 параллельных) приливают по 0,2; 0,3; 0,4 мл стандартного раствора белка, затем соответственно 0,3; 0,2; 0,1 мл NaCl (для получения во всех пробирках равного объема). Далее во все пробирки добавляют по 1 мл реактива С (10 мин в темноте) и 4 мл реактива D (40 мин в темноте). Колориметрируют против контроля на реактивы. Расчет Количественного содержания белка в сыворотке крови ведут по стандартной кривой. Количество белка выражают в г/л. Примечание. 35 Ввиду высокой чувствительности данного метода сыворотку крови следует разводить минимум в 100 раз. Разведение учитывать при расчете! 2.3 Количественное определение белка в коротковолновом ультрафиолете. Принцип метода. В 1962 г. Элманн предложил при определении содержания белка биуретовым методом использовать ультрафиолетовое излучение с длиной волны 263 нм, что привело к 10—15кратному возрастанию чувствительности метода по сравнению с таковой способа, основанного на измерении светопоглощения в видимой области спектра. Итцхэки и Гилл (1964) рекомендовали замерять оптическую плотность анализируемых образцов при длине волны 310 нм, поскольку, как выяснилось, в присутствии значительных количеств ДНК регистрация абсорбции при 263 нм может дать существенную ошибку. Так как на биуретовую реакцию не влияет присутствие в крови ароматических аминокислот (тирозина, триптофана), фенолов, мочевой кислоты, этот метод по праву считается самым специфичным, точным и практически доступным. В ультрафиолетовой области спектра все белки, кроме протаминов, имеют широкую полосу поглощения — в пределах длин волн 275—280 нм. Определив на спектрофотометре интенсивность поглощения света раствором белка, можно установить и его концентрацию. При использовании кюветы с шириной слоя 10 мм оптическая плотность раствора, в 1 мл которого содержится 1 мг «усредненного» белка, составляет 1,0 (при длине волны 280 нм). Соответственно при содержании белка 0,5 мг/мл оптическая плотность в растворе составляет 0,5 и т.д. Ход определения: 1. Сыворотку крови развести изотоническим раствором в 250 раз. Для этого 0,1 мл сыворотки крови довести до 25 мл. 2. Полученный раствор внести в стандартную прямоугольную кварцевую кювету. Оптическую плотность измерить при длине волны 280 нм (желательно выполнять параллельные исследования). Найденную величину умножить на число, показывающее разведение сыворотки. Таким образом рассчитать концентрацию белка в г/л. 3. В общем виде формула расчета содержания «полного» белка в биологической жидкости имеет вид: С (г/л) = А • F (1) где С — концентрация белка в г/л, А — показатель абсорбции, F — степень разведения. 36 2.4 Количественное определение содержания белка в сыворотке крови по Брэдфорду Принцип метода. В последнее время все более широкое применение находит предложенный Брэдфордом (Bradford, 1976) чувствительный, простой и удобный в исполнении способ определения белка в биологических жидкостях с помощью красителя Кумасси бриллиантового синего (КБС) G-250. Важной особенностью этого красителя является способность связываться с пептидами, содержащими не менее 15 аминокислот, благодаря чему он не дает окрашенного комплекса со свободными аминокислотами и низкомолекулярными олигопептидами. Этот краситель в нейтральной среде имеет синюю окраску, в кислой — оранжевую, с максимумом поглощения при длине волны 465 нм. Комплекс «белок—краситель» также имеет синий цвет. В слабокислых растворах КБС G-250 приобретает два отрицательных заряда и легко связывается с основными аминокислотами — лизином, аргинином, гистидином. Предполагается, что молекула красителя образует своеобразный мостик между положительно заряженными молекулами белка, реагируя с ними двумя отрицательно заряженными группами (SО32-) индикатора, в результате чего формируется относительно крупный комплекс «белок—краситель». Важную роль в формировании окрашенного комплекса играют пространственное расположение аминокислот и размеры молекул белка. Реактивы: 1. Реактив Брэдфорда. Содержит 100 мг красителя КумассиG-250, 59 мл этанола (96%) и 100 мл концентрированной ортофосфорной кислоты (85%, 850 г/кг) в 1 л дистиллированной воды. После перемешивания смесь тщательно отфильтровать для освобождения от не растворившихся частиц. Реактив стоек при комнатной температуре в течение 2 недель. 2. Стандартный раствор альбумина (1 г/л) Ход определения: 1. К 0,1 мл плазмы добавить 5,0 мл реактива Брэдфорда и через 2 мин измерить абсорбцию при 595 нм в кювете с длиной оптического пути 1 см. 2. Расчѐт результатов провести по калибровочной кривой, для построения которой используют данные таблицы 2.2. в каждую из пробирок вносят по 0,1 мл раствора стандарта альбумина с концентрацией белка от 0,1 г/л до 0,5 г/л. 37 Таблица 2.2 Построение калибровочного графика для определения содержания белка плазмы крови № Стандартный раствор 1 2 3 4 5 6 7 8 к 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 - Изотонический раствор NaCl, мл 9,0 8,0 7,0 6,0 5,0 4,0 3,0 2,0 1,0 Концентрация белка, г/л 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 - ПРОЕКТНОЕ ЗАДАНИЕ К МОДУЛЮ № 2 Оборудование, материалы, реактивы к модулю № 2 Таблица 2.3 Список необходимых химреактивов № Наименование Фотоколориметр или спектрофотометр Кювета 10 мм Бычий сывороточный альбумин NaCl NaOH Сегнетова соль (Na-K-виннокислый) CuSO4 KI Na2CO3 Реактив Фолина Уксусная кислота Бромкрезоловый зелѐный Цитрат натрия Ед. изм. мг г г г г г г мл мл мг г Практическое задание № 1 к модулю № 2. Сравнительное количественное определение белка в плазме крови, гомогенате печени и мозга экспериментальных крыс различными методами. Определить концентрацию белков в плазме крови, гомогенате печени и мозга экспериментальных крыс. По результатам исследований заполнить таблицу 2.4 38 Таблица 2.4 Концентрация белка в плазме крови, гомогенате печени и мозга экспериментальных крыс, полученная различными методами Наименование метода Биуретовый метод Метод Лоури Спектрофотометрический Метод Брэдфорда Исследуемый препарат Ед. изм. Плазма крови Гомогенат печени Гомогенат мозга Плазма крови Гомогенат печени Гомогенат мозга Плазма крови Гомогенат печени Гомогенат мозга Плазма крови Гомогенат печени Гомогенат мозга г/л г/л г/л г/л г/л г/л г/л г/л г/л г/л г/л г/л Количество повторов Среднее значение Практическое задание № 2 к модулю № 2. Количественное определение альбумина в плазме крови экспериментальных крыс колориметрическим методом на основе реакции с бромкрезоловым зелѐным. Определить концентрацию альбумина в плазме крови экспериментальных крыс. При взаимодействии альбумина в слабокислой среде с бромкрезоловым зелѐным (БКЗ) образуется окрашенный комплекс, имеющий максимум поглощения при длине волны 628 нм. Использование липемичных и гемолизированных образцов недопустимо. Состав реагентов: 1. Монореагент, рН 4,2: Цитрат натрия — 100 ммоль/л, бромкрезоловый зелѐный — 100 мкмоль/л. 2. Калибратор — 45 г/л Ход определения: 1. Смешать и инкубировать 5 минут при температуре 37 С. По окончании инкубации измерить оптическую плотность пробы (E пробы) и калибратора (Е калибратора) против контроля на реактивы при длине волны 628 нм. Окраска стабильна в течение 3 часов. 2. Расчѐт: С = 45 х Е пробы / Е калибратора (г/л) 3. Если концентрация альбумина превышает 60 г/л развести образец в 2 раза физиологическим раствором, повторить исследование и результат умножить на 2. По полученным результатам заполнить таблицу 2.6 39 Таблица 2.5 Концентрация альбумина в плазме крови экспериментальных крыс Наименование метода Исследуемый препарат Ед. изм. Альбумин Плазма крови г/л Количество повторов Среднее значение Практическое задание № 3 к модулю № 2. Характеристика основных методов количественного определения белков. Таблица 2.6 Сравнительная характеристика различных методов определения белка № 1 2 3 4 5 6 Наименование метода Необходимое количество белка Принцип метода Степень деструкции белка Зависимость от аминокислотной посл-ти Достоинства метода Биуретовая реакция Метод Лоури Спектрофотометрически при 280 нм Спектрофотометрически при 205 нм Связывание кумасси синего Связывание амидочѐрного Метод Брэдфорда Вопросы рубежного контроля к модулю 2 Подготовьте развѐрнутый ответ по следующим вопросам: 1 . Что такое белки? Дайте определение. 2. Перечислите биологическую роль белков. 3. Как свойства белка зависят от его аминокислотного состава? Приведите примеры. 4. Первичная структура белков - базовая структура, определяющая пространственную укладку полипептидной цепи и индивидуальные биологические свойства белков. Ее строение. 5. Назовите методы изучения первичной структуры белка. 40 6. Какое значение для биологии и медицины имеет расшифровка аминокислотного состава и последовательности соединения аминокислотных остатков в полипептидной цепи белковой молекулы? 7. Понятие о вторичной структуре белковой молекулы, еѐ виды, связи, стабилизирующие структуру. 8. Третичная структура белков, виды. Химические связи, участвующие в ее образовании. 9. Четвертичная структура белков. Особенности строения и функционирование олигомерных белков. 10. Назовите факторы устойчивости белков в растворе. 11. Что такое изоэлектрическое состояние белков? 12. Денатурация белков, еѐ виды. Факторы, вызывающие денатурацию. Использование в медицине. 13. Гидролиз белков, его виды. Применение в медицине, экспериментальной и практической биохимии. 14. Многообразие белков. Глобулярные и фибриллярные белки. Характеристика представителей. 15. На чем основана классификация простых белков? 16. Охарактеризуйте основные классы простых белков. 17. Сопоставить чувствительность четырѐх методов количественного определения общего белка в биологических жидкостях. 18. Основные красители, используемые для определения концентрации белков. 19. Сравнительная оценка методов определения белка по чувствительности, специфичности, воспроизводимости. Тест рубежного контроля к модулю № 2 Тест содержит задания. Выберите один или несколько правильных, по вашему мнению, вариантов ответа и отметьте их любым значком в бланке ответов. 1. Присутствие любого белка в растворе можно определить с помощью реакции: 1 Нингидриновой 3 Биуретовой 2 Ксантопротеиновой 4 Реакции Фолина 1 2 1 2. Цветные реакции позволяют судить о: Присутствии белков в Присутствии некоторых 3 биологических жидкостях аминокислот в белке Количестве аминокислот в Первичной структуре белков 4 белке 3. Укажите реакцию, позволяющую обнаружить белок в растворе: Нингидриновая 3 41 Биуретовая 2 Ксантопротеиновая 4 Реакция Фолина 4. Что общего между нативной и денатурированной рибонуклеазой: 1 Первичная структура 3 Строение активного центра 2 Конформация 4 Функция 5. Белки денатурируют в результате (выберите один неправильный ответ): Действия протеолитических 1 3 Изменения рН ферментов 2 Повышения температуры 4 Действия мочевины 6. Денатурация белковой молекулы - это: Уменьшение растворимости белка Изменение конформации белка, 1 при добавлении солей щелочных 3 сопровождающееся потерей его или щелочно-земельных металлов биологической активности Конформационные изменения Потеря биологической активности белка в результате 2 4 белка в результате его гидролиза взаимодействия с природными лигандами 7. Содержание белков в сыворотке крови взрослого человека составляет: 55-60 г/л 1 20-30 г/л 3 2 45-50 г/л 4 65-85 г/л Назначение теста и критерий оценки Тест может использоваться для проведения рубежной оценки знаний студентов по модулю 3. Стоимость одного правильного ответа составляет 1 балл. При ответе на 7 баллов, тестируемому выставляется оценка 5; при ответе на 5-6 баллов, тестируемому выставляется оценка 4; при ответе на 4 балла, тестируемому выставляется оценка 3. МОДУЛЬ № 3. СОСТАВ, СТРОЕНИЕ, СВОЙСТВА И ФУНКЦИИ ПЕПТИДОВ. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГЛУТАТИОНА Комплексная цель Усвоение знаний в области структурной организации и функции пептидов, ознакомление с методами их количественной оценки содержания в биологических жидкостях. Содержание 3.1 Состав, строение и свойства пептидов Пептиды, природные или синтетические соединения, молекулы которых построены из остатковα-аминокислот, соединенных между собой пептидными (амидными) связями C(O) NH. Могут содержать в молекуле также не аминокислотную компоненту (например остаток углевода). 42 По числу аминокислотных остатков, входящих в молекулы пептидов, различают дипептиды, трипептиды, тетрапептиды и т.д. Пептиды, содержащие до 10 аминокислотных остатков, называются олигопептидами, содержащие более 10 аминокислотных остатков полипептидами. Природные полипептиды с молекулярной массой более 6000 Да называются белками. Аминокислотный остаток пептидов, несущий свободнуюα-аминогруппу, называется N-концевым, а несущий свободнуюα-карбоксильную группу – С-концевым. Название пептида образуется из названия входящих в его состав аминокислотных остатков, перечисляемых последовательно, начиная с N-концевого. При этом используют тривиальные названия аминокислот, в которых окончание "ин" заменяется на "ил"; исключение C-концевой остаток, назв. которого совпадает с названием соответствующей аминокислоты. Все аминокислотные остатки, входящие в пептиды, нумеруются, начиная с N-конца. Для записи первичной структуры пептидов (аминокислотной последовательности) широко используют трехбуквенные и однобуквенные обозначения аминокислотных остатков. Все пептиды делятся на гомомерные и гетеромерные. Гомомерные пептиды при гидролизе образуют только аминокислоты, гетеромерные наряду с аминокислотами соединения других классов. В зависимости от структуры не аминокислотной компоненты, гетеромерные пептиды делятся на глико-, липо-, нуклео-, фосфопептиды и др. Гомомерные и гетеромерные пептиды могут быть линейными и циклическими. Аминокислотные остатки в них соединены между собой только пептидными связями (гомодетные пептиды) или не только пептидными сложноэфирными, дисульфидными и др. (гетеродетные пептиды). Гетеродетные пептиды с встроенными в цепь гидроксиаминокислотами называют пептолидами. Пептиды, содержащие в молекуле остатки только одной аминокислоты, называются гомополиаминокислотами, а содержащие одинаковые повторяющиеся участки (из одной или нескольких аминокислотных остатков) регулярными пептидами В растворах пептидов наблюдается предпочтительное образование определенных конформеров. С удлинением цепи более выраженную устойчивость приобретают (аналогично белкам) упорядоченные элементы вторичной структуры (α-спираль и β-структура). Образование вторичной структуры особенно характерно для регулярных пептидов, в частности для полиаминокислот. Олигопептиды по свойствам близки к аминокислотам, полипептиды подобны белкам. Олигопептиды представляют собой, как правило, кристаллические вещества, разлагающиеся при нагревании до 200- 300 0C. Они хорошо растворимы в воде, разбавленных кислотах и щелочах, почти не растворимы в органических растворителях. Олигопептиды обладают амфотерными свойствами и, в зависимости от кислотности среды, могут существовать в форме катионов, анионов или цвиттерионов. Основные полосы поглощения в ИК-спектре для группы NH 3300 и 3080 см-1, для группы C=O 1660 см-1. В УФ спектре полоса поглощения 43 пептидной группы находится в области 180-230 нм. Изоэлектрическая точка (рI) пептидов колеблется в широких пределах и зависит от состава аминокислотных остатков в молекуле. Величины рКа пептидов составляют для α-СООН равно 3, для α-NH2 равно 8. Химические свойства олигопептидов определяются содержащимися в них функциональными группами, а также особенностями пептидной связи. Их химические превращения в значительной мере аналогичны соответствующим реакциям аминокислот. Они дают положительную биуретовую реакцию и нингидриновую реакцию. Дипептиды и их производные (особенно эфиры) легко циклизуются, превращаясь в дикетопиперазины. Под действием 5,7 н. соляной кислоты пептиды гидролизуются до аминокислот в течение 24часов при температуре 1050C. 3.2 Метод количественного определения глутатиона Общая характеристика Глутатион - это трипептидγ-глутамилцистеинилглицин. Глутатион содержит необычную пептидную связь между аминогруппой цистеина и карбокси-группой боковой цепи глутамата. Важность глутатиона в клетке определяется его антиоксидантными свойствами. Фактически глутатион не только защищает клетку от таких токсичных агентов, как свободные радикалы, но и в целом определяет редокс-статус внутриклеточной среды (рис. 3.1). Рис. 3.1 Строение глутатиона. В клетке тиоловые группы находятся в восстановленном состоянии (SH) в концентрации около 5 мМ. Фактически, такая высокая концентрация глутатиона в клетке приводит к тому, что он восстанавливает любую дисульфидную связь (S-S), образующуюся между цистеинами цитозольных белков. При этом восстановленная форма глутатиона GSH превращается в окисленную GSSG. Восстанавливается окисленный глутатион под действием фермента глутатионредуктазы, которая постоянно находится в клетке в активном состоянии и индуцируется при оксидативном стрессе. Отношение восстановленный/окисленный глутатион внутри клетки является одним из важнейших параметров, который показывает уровень внутриклеточной токсичности (уровень оксидативного стресса). Описание метода: Восстановленный глутатион GSH реагирует с 5,5-дитиобис (2-нитробензойной) кислотой (ДТНБК) (реагент Эллмана) (рис. 3.2) с образованием сложного соединения, которое обладает максимумом поглощения при 412 им. Количество GSH определяют по 44 калибровочной кривой и выражают в мкМолях на 1 мг белка [мкM/мг белка] либо на 1 мл биосубстрата [мкМ/мл биосубстрата]. Рис. 3.2 Химическая структура реактива Эллмана Реактивы 1. ТХУ 30% трихлоруксусная кислота ССl3 COOHMr = 163,5 Растворить 30 г ТХУ в дистиллированной воде и довести объѐм до 100 мл. 2. 0,3 Мтрис-HCl буфер рН 8,8 Растворить трис(гидроксиаминометан) Mr С4H11NO3= 121,14 в количестве 36,33 г в дистиллированной, довести до 1 л, рН довести путѐм добавления по каплям концентрированной НСl ( ≈ 7 мл 36% НСl). 3. 3) 10 мМ реактив Эллмана на метаноле. 3,96 мг реагента Эллмана растворить в метаноле и довести до 1 мл. Реактив стабилен 2 недели при хранении +4ºС в сосуде с плотно закрытой крышкой. 4. Стандартные растворы восстановленного глутатиона для калибровки 0,025; 0,05; 0,1; 0,25; 0,5; 1,0 ; 1,5; 2,0 мМоль/л. Ход определения: 5. К 1 мл биосубстрата добавить 0,2 мл 30% ТХУ 6. Центрифугировать смесь при 3000 об/мин в течение 10 мин. 7. К 1 мл надосадочной жидкости добавить 2,5 мл буфера и 50 мкл (0,05 мл) реактива Эллмана. Холостая проба содержит 3,5 мл буфера и 50 мкл (0,05 мл) реактива Эллмана. 8. Ожидать10 минут на развитие окраски и провести фотометрирование при λ = 412 нм относительно дистиллированной воды (бланк).Кювета с длиной оптического пути 1 см. Интерпретация результатов Средние значения глутатион в плазме 7,64 мкМ/мгHb. 45 ПРОЕКТНОЕ ЗАДАНИЕ К МОДУЛЮ № 3 Оборудование, материалы, реактивы к модулю № 3 Таблица 3.1 Список необходимых химреактивов № Наименование Фотоколориметр или спектрофотометр Центрифуга до 3000 об/мин Кювета 10 мм Трихлоруксусная кислота Трис Соляная кислота Реактив Эллмана Глутатион восстановленный Ед. изм. Кол-во шт мг г мл мг мг 1 30 40 10 4 10 Практическое задание. Определение содержания глутатиона в плазме крови и гомогенатах печени крысы Определить концентрацию глутатиона в плазме крови, гомогенате печени и мозга экспериментальных крыс. По результатам исследований заполнить таблицу 2.2 Таблица 3.2 Концентрация глутатиона в плазме крови, гомогенате печени и мозга экспериментальных крыс. Наименование метода Исследуемый препарат Плазма крови Определение глутатиона Гомогенат печени Гомогенат мозга Ед. изм. Количество повторов Среднее значение мкМоль/мг гемоглобина мкМоль/мг гемоглобина мкМоль/мг гемоглобина Вопросы рубежного контроля к модулю 3 Подготовьте развѐрнутый ответ по следующим вопросам: 1. Дать характеристику пептидов. 2. Какую роль выполняют низкомолекулярные пептиды в организме? 3. Какое строение имеют низкомолекулярные пептиды? 4. Каковы биохимические методы количественного определения пептидов? 46 Тест рубежного контроля к модулю № 3 Тест содержит задания. Выберите один или несколько правильных, по вашему мнению, вариантов ответа и отметьте их любым значком в бланке ответов. 1.Термин пептид впервые предложен: 1 Фишером 3 Меррифилдом 2 Кребсом 4 Криком 2. Пептиды не выполняют следующие функции: 1 Гормональную 3 Токсическую 2 Медиаторную 4 Строительную 3. Олигопептидом называется молекула содержащая: 1 500-1000 аминокислот 3 10-50 аминокислот 2 2-6 аминокислот 4 Свыше 1000 аминокислот 1 4. Выберите правильное утверждение: Все пептиды синтезируются на Не все пептиды имеют 2 рибосоме рибосомный синтез Назначение теста и критерий оценки Тест может использоваться для проведения рубежной оценки знаний студентов по модулю 3. Стоимость одного правильного ответа составляет 1 балл. При ответе на 6 баллов, тестируемому выставляется оценка 5; при ответе на 5 баллов, тестируемому выставляется оценка 4; при ответе на 4 балла, тестируемому выставляется оценка 3. МОДУЛЬ № 4. ТЕХНОЛОГИИ ОЧИСТКИ БЕЛКА И ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЕГО ХАРАКТЕРИСТИК Комплексная цель Усвоение знаний в области технологий очистки белков, определения их молекулярных масс и характеристик. Содержание 4.1 Электрофоретические методы разделения белков 4.1.1 Общая теория электрофореза. Многие важные в биологическом отношении молекулы, такие как аминокислоты, пептиды, белки содержат ионизирующиеся группы, поэтому в растворе они могут 47 существовать в заряженной форме, в виде катионов (+) либо анионов (-).Молекулы с близкими по величине зарядами, но различающимися молекулярными весами отличаются друг от друга отношением заряда к массе. Принцип электрофореза основан на разделении ионов при движении их в растворе под действием электрического поля. Большинство глобулярных белков собраны таким образом, что большая часть заряженных групп, а именно гидрофильных, расположена на поверхности белка, тогда как незаряженные, гидрофобные остатки погружены вовнутрь глобулы. В электрическом поле в соответствии со своим зарядом белки мигрируют по направлению к противоположно заряженному электроду. Подвижность заряженных частиц может быть представлена следующим образом: U = U0 - u = QD/kT - U' (4.1) где: U0 - подвижность в отсутствии электролитов,U' - электроосмотическая подвижность, Q общий заряд частицы, D - коэффициент диффузии, k - константа Больцмана и Т - абсолютная температура. 4.1.2 Факторы влияющие на подвижность белков Образец Электрофоретическая подвижность заряженных молекул зависит от нескольких факторов. Заряд Подвижность возрастает с увеличением суммарного заряда. Величина заряда обычно зависит от рН. Размеры Чем крупнее молекулы, тем меньше их подвижность; это связано с возрастанием сил трения и электростатических взаимодействий крупных молекул с окружающей средой по сравнению с молекулами меньших размеров. Форма Молекулы одинакового размера, но различной формы, например фибриллярные и глобулярные белки, обладают разной подвижностью; это обусловлено различиями в силе трения и электростатическом взаимодействии. Электрическое поле Согласно закону Ома, сила тока I (в амперах), напряжение V(в вольтах) и сопротивление R(в омах) связаны следующим соотношением: I= V/R. На разделение ионов в электрическом поле влияют все три фактора. Сила тока 48 Поскольку ток в растворе между электродами обусловлен исключительно переносом ионов буфера и образца, скорость их перемещения прямо пропорциональна силе тока. Длина пути, пройденного ионами, будет пропорциональна времени пропускания тока. Следовательно, для максимальной воспроизводимости результатов сила тока в процессе электролиза не должна меняться. Само собой разумеется, что ток должен быть постоянным. Напряжение Оно связано с силой тока приведенным выше соотношением; отсюда следует, что скорость миграции пропорциональна падению напряжения в поддерживающей среде, или градиенту напряжения, обычно выражаемому в В-см-1 (приложенное напряжение, деленное на длину слоя носителя). Используются как низкие (100—500 В), так и высокие (500—10 000 В) напряжения с градиентами до 20 и 200 В-см-1соответственно. По причинам, которые будут разъяснены позднее (разд. 4.1.1), высокие напряжения применяют в основном для разделения низкомолекулярных веществ. Сопротивление Скорость миграции обратно пропорциональна сопротивлению, которое в свою очередь зависит от типа и размеров, носителя и от ионной силы буфера. Сопротивление возрастает с увеличением длины слоя носителя и уменьшается при увеличении его ширины, а также с возрастанием концентрации буферных ионов. В ходе электрофореза выделяется тепло, количество которого в единицу времени равно I2RВт, при этом сопротивление уменьшается. Следовательно, при постоянном напряжении такое нагревание приведет к увеличению силы тока и усиленному испарению растворителя. Для обеспечения стабилизированные максимальной источники воспроизводимости питания, которые результатов автоматически применяют поддерживают на постоянном уровне либо напряжение, либо силу тока, несмотря на неизбежные при температурных флуктуациях изменения сопротивления. Испарение сводят до минимума, помещая аппарат под воздухонепроницаемую крышку. Для дополнительного охлаждения при работе с высоким напряжением в аппарат встраивается охлаждающая система. Буфер Буфер создает и стабилизирует рН носителя, а также самым различным образом влияет на скорость миграции веществ. Состав буфера Наиболее широко применяемые буферы — формиатный, ацетатный, цитратный, вероналовый, фосфатный, трис, ЭДТА и пиридиновый. Для разделения углеводов часто используют боратные буферы, преимущество которых заключается в том, что они образуют с углеводами заряженные комплексы. Поскольку буферы служат для образца растворителями, 49 то некоторая диффузия нанесенного образца неизбежна. Это особенно заметно для малых молекул, таких, как аминокислоты и сахара. Диффузию можно свести до минимума, если наносить образцы в виде узких полос и в умеренных количествах, использовать высокое напряжение и как можно быстрее проводить разделение, а по его завершении быстро вынимать и высушивать образцы. Концентрация буфера По мере увеличения ионной силы буфера компонент тока, обусловленный переносом ионов буфера, будет возрастать, а доля, приходящаяся на ток за счет ионов образца, уменьшаться. Таким образом, скорость миграции образца уменьшится. При высокой ионной силе буфера суммарный ток увеличивается, а следовательно, возрастает и количество выделяемого тепла. При низкой ионной силе ток, обусловленный переносом "ионов буфера, уменьшается, а доля, приходящаяся на ток за счет ионов образца, возрастает. Таким образом, миграция образца ускоряется. В буфере с низкой ионной силой общая сила тока и выделение тепла уменьшаются, но диффузия возрастает, вследствие чего разрешающая способность хуже, чем при высокой ионной силе. Таким образом, при выборе ионной силы буфера приходится идти на компромисс. Применяющиеся обычно ионные силы лежат в интервале концентраций от 0,05 до 0,10 М. Ионная сила равна 2с2 3/2, где с — молярная концентрация иона, а г—его заряд. рН Для полностью диссоциирующих веществ, таких, как неорганические соли, рН практически не играет роли, но для органических соединений рН определяет степень ионизации. С ростом рН ионизация органических кислот возрастает, а оснований, наоборот, уменьшается, и, следовательно, меняется их электрофоретическая подвиж ность. Таким образом, скорость и направление движения амфолитов зависят от рН, и для их разделения можно использовать буферы с диапазоном рН от 1 до 11. Носитель Ornstein предложил проводить электрофоретическое разделение белков в синтетический гелевой среде на основе полиакриламида (PAGE – polyacrilamide gele electrophoresis). В этом случае D является функцией размера белковой глобулы и разделение белков определяется суммарным зарядом и размером макромолекулярной глобулы белков. Однако в этих условиях белки с различными молекулярными массами могут иметь одинаковую подвижность. Поэтому не смотря на то, что PAGE может быть применен для разделения и характеристики белковых смесей, этот метод не позволяет разделять белки в соответствии с их молекулярной массой. Основной характеристикой полиакриламидного геля является размер пор, которые образуются при его полимеризации. Этот 50 показатель определяет способность биомакромолекул продвигаться внутри геля в процессе проведения электрофореза. В ходе полимеризации геля происходит винильная полимеризация, приводящая к формированию полимера с хаотически свернутой структурой, который содержит разветвленную сеть пор. Структура такого рода позволяет просеивать макромолекулы с различными размерами. Для получения полиакриламидного геля используют акриламид и N,N’- метиленбисакриламид, последний из которых отвечает за образование поперечных сшивок в геле. Размер пор в геле определяется процентным содержанием мономеров (акриламида) и количеством сшивающего агента в процентах от общего количества мономеров (рисунок 4.1). Соотношение между сшивающим агентом и акриламидом является очень важным показателем, так как оно существенно влияет на свойства геля: чем выше концентрация акриламида, тем ниже должна быть концентрация бисакриламида, и наоборот; одновременное увеличение содержания обоих компонентов приводит к образованию гелей с повышенной жесткостью и хрупкостью, а одновременное снижение – к возрастанию мягкости и эластичности. В настоящее время принято считать, что для разделения макромолекул белковой природы наиболее подходящим является гель со значением %С=2,67% и значением %Т в диапазоне от 7,5% до 20%. Рис. 4.1 Пространственная структура акриламида 4.1.3 Общие методы электрофореза и применяемое оборудование Оборудование Оборудование, необходимое для электрофореза, состоит в основном из двух частей: источника питания и собственно электрофоретического блока. Источник питания генерирует стабилизированный постоянный ток и имеет системы контроля напряжения и силы тока на выходе. Для работы с низким напряжением применяются источники питания с выходным напряжением до 500 В и силой тока до 150 мА, которые обеспечивают либо постоянное напряжение, либо постоянную силу тока. В электрофоретический блок входят электроды, буферные камеры, опора для носителя и прозрачная изолирующая крышка (рис. 51 4.1 и 4.2). Можно пользоваться электродами из нержавеющей стали, но поскольку некоторые буферы вызывают коррозию, предпочтительнее платиновые электроды (рисунок 4.2). Рис. 4.2 Набор для проведения электрофореза 1 – Источник питания, 2 – заливочный столик, 3 – камера для электрофореза, 4 – стекла, 5-6 – гребѐнки и спейсеры Насыщенный буфером носитель, на который нанесен образец, обычно располагают вертикально (вертикальный электрофорез). Пробы белков вносят в специальные лункикарманы, полученные в структуре гена. Для предотвращения вымывания пробы белка из лунки, пробу смешивают со специальным буфером, содержащим вещество с плотностью большей, чем вода (глицерин, растворы сахарозы) (рис. 4.3). 52 Рис 4.3 Проведение вертикального гель-электрофореза Нативный электрофорез Представляет собою разделение белков, находящихся в нативной неденатурированной форме. Разделение белков происходит в соответствии с их зарядом и размером. Условия разделения, включая рН буфера, подбираются в соответствии со свойствами белков, но в большинстве случаев используется рН в диапазоне 8-9, когда большинство белков имеют суммарный отрицательный заряд и двигаются в электрическом поле по направлению к аноду. В большинстве случаев используют гели с Т = 7-10%. Однако в зависимости от задачи концентрация акриламида может варьироваться в широком диапазоне в зависимости от того какова молекулярная масса белков, присутствующих в смеси. Для белков с молекулярной массой от 1000 кДа и выше, проникновение в гель которых затруднено, используют гели с Т = 3-4% и С = 0,1%; для белков с низкой молекулярной массой около 10 кДа, соответственно Т = 15% и С до 1%. Из преимуществ этого метода необходимо отметить, что разделяемые белки находятся в нативной форме и, например, многие ферменты сохраняют свою ферментативную активность. К недостаткам следует отнести несовершенство разделяющей эффективности нативного электрофореза – фракционирование белков происходит в соответствии с их размером и зарядом. Как следствие, белки с различными молекулярными массами могут иметь одинаковую подвижность. Электрофорез в денатурирующих условиях Для разделения белков в соответствии с их молекулярной массой перед началом электрофореза белковую смесь преинкубируют в присутствии додецилсульфата натрия (SDS). 53 Анионый детергент ДСН прочно связывается с большинством белков в соотношении 1.4 мг ДСН /мг белка, при этом суммарный комплекс белок-(ДСН)n приобретает отрицательный заряд (предположительно этот комплекс образуется благодаря взаимодействиям между алкильными (гидрофобными) мотивами детергента и гидрофобными участками белковой поверхности; отрицательно заряженная же часть ДСН экспонирована наружу), кроме того ДСН приводит к разрушению нековалентных связей, приводя к денатурации белков. Дополнительная обработка белков реагентами, восстанавливающих дисульфидные связи, такие как 2-меркаптоэтанолили дитиотрейтол (ДТТ), приводит к дальнейшей денатурации белков и разрушению белок - белковых комплексов. В этом случае единственным фактором, который может повлиять на подвижность белков в полиакриламидном геле является размер белка, а точнее его молекулярная масса. Подвижность белок-(ДСН)n обратно пропорционально логарифму молекулярной массы: низкомолекулярные комплексы движутся быстрее, чем высокомолекулярные. Это означает, что молекулярная масса белков может быть определена по относительной подвижности белка в геле, а наличие одной полосы в таком геле может являться хорошим критерием чистоты препарата. Детальные исследования Weber и Osborn показали, что подвижность белков в большинстве случаев находится в четкой зависимости от их молекулярной массы, что позволило применить метод электрофореза в ПААГ в присутствии SDS для достаточно точного определения молекулярной массы белков и пептидов. В зарубежной литературе этот метод был назван SDS-poliacrylamide gel electrophoresis или SDS-PAGE (рис. 4.4) Рис. 4.4 Анализ состава фракций с помощью SDS-электрофореза в ПААГ хроматографического разделения триптического гидролизата TEF-G (4) на колонке с ультрагелем AсA-4; 1-3 – триптические фрагменты с Mr = 75 кДа, Mr = 43 кДа, Mr = 26 кДа. 54 В качестве дополнительного денатурирующего агента, вызывающего полную денатурацию белка с восстановлением дисульфидных связей, является β-меркаптоэтанол. Также в качестве денатурирующего агента используют 4 М мочевину, добавляемую как в основной буфер для электрофореза, так и к исследуемому образцу. 4.1.4 Способы визуализации (окраски) белковых фракций. Обнаружение и локализацию белковых зон после их разделения электрофорезом в ПААГ в большинстве случаев осуществляют путем их прокраски в геле. Зоны проявляются как окрашенные полоски или пятна различной интенсивности, в зависимости от содержания в них белка. Для окраски гель вымачивают в растворе красителя, который диффундирует внутрь него и прочно связывается с белками. Процесс диффузии, как правило, занимает несколько часов. Во избежание размывания полос за это время белки иногда предварительно фиксируют осаждением. Для этого гель сначала вымачивают в 10%- или 50%-ной трихлоруксусной кислоте (ТХУ). Чаще фиксацию совмещают с окрашиванием, используя раствор красителя в смеси уксусной кислоты и метанола или в ТХУ. Одновременно с белками окрашенным оказывается и сам гель. Это происходит как за счет простого замещения буфера геля на раствор красителя, так и в результате некоторой сорбции его на геле. Однако связывание красителя с гелем значительно менее прочно, чем с белками, поэтому от «фона» удается без особого труда избавиться «отмывкой» геля, например вымачиванием его в относительно большом объеме растворителя с несколькими сменами. В настоящее время широко используют краситель кумасси ярко-голубой («Coomassie brilliant blue», сокращенно СВВ). Этот краситель дает лучшую чувствительность и линейную зависимость интенсивности окраски от концентрации белка в более широком ее диапазоне. Краситель выпускают в двух модификациях: R-250 и G-250 (рис. 4.5). Рис. 4.5 Строение КумассиG-250 Обилие ароматических колец в структуре красителей типа СВВ делает их плохо растворимыми не только в воде, но и в разбавленной уксусной кислоте. Для улучшения 55 растворимости к кислоте часто добавляют этанол или метанол. После окрашивания СВВ R250 можно качественно, но вполне надежно обнаружить полосу, содержащую 10 мкг белка (рис. 4.6). Рис. 4.6 Окрашенная Кумасси R-250 электрофорезная пластина Ниже в таблице 4.1 приведены основные способы окраски белковых фракций на электрофоретической пластине. Таблица 4.1 Способы окраски белковых фракций № Краситель 1. КумассиR-250 2. Окраска серебром 3. Окраска «Stain all» Характеристика Широко распространѐнный способ окраски, не трудоѐмок и быстро выполним по времени. Высокочувствительный метод окраски ПААГ геля. Из отрицательных черт необходимо указать длительность и трудоѐмкость. В результате окраски данным красителем разные по своей природе биополимеры окрашиваются поразному: гликопротеиды в синий, белки в красный, липиды в жѐлто-оранжевый, ДНК в синий, РНК в голубовато-пурпурный. 4.1.5 Элюция белков из геля Простейший прием элюции состоит в извлечении белка из полоски или кусочка геля за счет диффузии в течение длительного времени при 37—40°. Этот прием пригоден как для свободных белков, так и для их комплексов с ДДС-Na. С целью облегчения диффузии белков из геля последний измельчают, например растирают в маленьком стеклянном гомогенизаторе. Во время элюции суспензию измельченного геля встряхивают. В элюирующий буфер, как правило, вводят ДДС-Na даже в тех случаях, когда электрофорез белка проводили без него. Это делают для облегчения растворения белков. После окончания экстракции гель удаляют центрифугированием. От ДДС-Na и красителя белок можно освободить осаждением и промывкой сначала смесью ацетона с 0,1 М НС1 (6: 1), а затем чистым ацетоном. Осажденный ацетоном белок высушивают или лиофилизируют. 56 4.1.6 Изоэлектрическое фокусирование. 2D-электрофорез Полное разделение сложной смеси белков далеко не всегда удается осуществить в ходе одного опыта. Всегда достаточно высока вероятность того, что в данной системе электрофореза различные белки мигрируют в одной зоне либо в силу близости их размеров, либо ввиду совпадения значений их электрофоретических подвижностей при выбранном значении рН, либо, наконец, в результате неблагоприятной для разделения комбинации этих параметров. Поэтому в сложных случаях каждую полосу после первого электрофоретического фракционирования смеси белков следует проверить на гомогенность, используя ее как исходный препарат для электрофореза в других условиях. Это можно сделать одновременно для всех полос первого разделения, или, как его часто называют, «разделения в первом направлении». Для этого трубку или полоску, вырезанную по всей длине трека из пластины первого направления, накладывают на стартовую зону пластины «второго направления». Контакт между двумя гелями обеспечивают, заливая место их соприкосновения стартовым буфером или, для надежности, расплавленным раствором агарозы в этом же буфере (рис. 4.7). Рис. 4.7 Схема проведения двумерного электрофореза 57 Электрофорез ведут в направлении, перпендикулярном длине трубки или полоски. Каждая негомогенная белковая полоса может дать несколько пятен, если при новых условиях электрофореза подвижности первоначально образовавших ее нескольких белков окажутся неодинаковыми. В результате на пластине второго направления после прокрашивания выявляется картина распределенных по всей поверхности пятен, напоминающая «фингерпринт» в двумерной тонкослойной хроматографии. Число пятен, которое удается различить на одной пластине, в некоторых случаях приближается к двум тысячам (рис. 4.8). Рис. 4.8 Картина двумерного электрофореза Широкое применение двумерный электрофорез нашел в протеомных исследованиях, в качестве предварительной характеристики белкового состава. 4.2 Блоттинг Блоттинг (blotting) – это название методик, включающих этап переноса разделенных макромолекул из определенной среды (например, геля) на какой-либо носитель (специальная бумага, нитроцеллюлозные фильтры и т.п.). Существует два основных типа блоттинга – капиллярный (например, Саузерн-блоттинг), в основе которого – перемещение молекул благодаря капиллярному эффекту, и электроблоттинг, при котором перенос молекул обеспечивается путем электрофореза (рисунок 4.9). 58 Блоттинг (blotting) Процесс переноса разделенных макромолекул из определенной среды (например, геля) на какой-либо носитель Саузерн блоттинг (Southern-blitting) Процесс переноса специфических нуклеотидных последовательностей ДНК из геля на носитель Вестерн блоттинг (Western-blotting) Процесс переноса разделѐнных белков из геля на носитель Нозерн блоттинг (Northern-blotting) Процесс переноса специфических нуклеотидных последовательностей РНК из геля на носитель Истерн блоттинг (Eastern-blotting) Процесс детекции посттрансляционных модификаций белков Рис. 4.9 Виды блоттинга Саузерн-блоттинг (Southern-blotting) - метод обнаружения специфических нуклеотидных последовательностей, путем переноса электрофоретически разделенных фрагментов ДНК из агарозного геля на нитроцеллюлозный (бумажный) фильтр за счет капиллярного эффекта (blotting – «промокание») и гибридизации с меченым ДНК- или РНКзондом, комплементарным искомой последовательности. Образование гибридов обнаруживают методом авторадиографии. Метод разработан Э. Саузерном и Р. Дэйвисом в 1975. Нозерн-блоттинг (Northernblotting) - метод, аналогичный методу Саузерн - блоттинга и применяемый для тестирования фрагментов и молекул РНК (вместо нитроцеллюлозного используется фильтр из диазобензилоксиметил-целлюлозы, в качестве зондов используют комплементарные молекулы ДНК). Метод нозерн-блоттинга предложен Дж. Олвайном с сотрудниками в 1977. Истерн-блоттингом (англ. Eastern blotting) называется детекция посттрансляционных модификаций белков. Вестерн блоттинг (белковый иммуноблот, англ. Western blotting) — аналитический метод, используемый для определения специфичных белков в образце. Вестерн - блоттинг был разработан в лаборатории Джорджа Старка (англ. George Stark) в Стэнфорде. Название вестерн - блот было дано технике У. Нейлом Бурнеттом (англ. W. Neal Burnette) и является 59 игрой слов от названия Саузерн - блоттинг, — методики определения ДНК, разработанной ранее Эдвином Саузерном. Проведение вестерн-блоттинга. На первом этапе использует электрофорез белков в полиакриламидном геле для разделения денатурированных полипептидов по длине (как правило, в присутствии SDS) или по трехмерной структуре белка (в нативном состоянии). Далее белки переносятся на нитроцеллюлозную мембрану или PVDF, затем детектируются с использованием антител, специфичных к заданному белку (рисунок 4.10). Чтобы сделать белки доступными для антител и дальнейшей детекции, их вместе с полоской геля переносят на мембрану, изготовленную из нитроцеллюлозы или поливинилидендифлюорида (англ. PVDF). Мембрана накладывается поверх геля, а поверх неѐ кладут стопку фильтровальной бумаги. Всю стопку помещают в буфер для переноса, который продвигается верх по бумаге под действием капиллярных сил, уносит с собой белки. Другой метод переноса белков называется электроблоттингом и использует электрический ток, который переносит белки из геля на мембрану. Белки перемещаются из геля на мембрану с сохранением своего расположения. В результате этого «промакивания» (от. англ. blotting) процесса белки удерживаются на тонком поверхностном слое мембраны для детекции. Оба варианта мембран используют из-за их свойства неспецифично связывать белки. Связывание белков основано как гидрофобных взаимодействиях, так и на электростатических взаимодействиях между мембраной и белком. Нитроцеллюлозная мембрана дешевле PVDF, но гораздо более хрупкая и хуже выдерживает повторное нанесение меток. Единообразие и общая эффективность переноса белков из геля на мембрану может быть проверена окрашиванием мембраны красителями Coomassie или Ponceau S. Coomassie наиболее распространенный из двух, а краситель Ponceau S обладает большей чувствительностью и лучше растворим в воде, что упрощает последующую отмывку и нанесение меток на мембрану. Для исключения взаимодействия между мембраной и антителом, используемым для детекции целевого белка применяется помещение мембраны в разбавленный раствор белка — обычно бычьего сывороточного альбумина (BSA) или нежирного сухого молока, с небольшим процентом детергента типа Tween 20. Белок из разбавленного раствора прикрепляется к мембране во всех местах, где не прикрепился целевой белок. Поэтому, при добавлении антител, нет свободного места на мембране, куда бы они могли прикрепиться, кроме сайтов связывания на специфичных целевых белках. 60 Рис. 4.10 Схема иммуноблоттинга Детекция Во время процесса детекции мембрана «метится» исследуемым белком с модифицированным антителом, которое связано с репортѐрным ферментом, который выдерживается на соответствующей подложке, приводя к колориметрической реакции и давая 61 цвет. В силу различных причин, детекция проводится в два этапа, хотя сейчас доступен одношаговый метод детекции для определенных областей применения. После блокирования разведенный раствор первичных антител (обычно между 0,5 и 5 мкг/мл) инкубируется с мембраной и слегка встряхивается. Обычно раствор состоит из забуференного раствора соли с небольшим процентным содержанием детергента, иногда с сухим молоком или BSA. После промывки мембраны, для удаления не связавшихся первичных антител, мембрану выдерживают в других антителах, напрямую связывающихся с класс - специфическими участками первичных антител. Они известны как вторичные антитела и в соответствии с их целевыми свойствами, как правило называются по типу «anti-mouse», «anti-goat», и так далее. Антитела получают из животного источника (или животных — источников культуры гибридом); анти-мышиные вторичные антитела будут связываться с большинством первичных антител, полученных из мышей. Это создает некоторую экономию, позволяя отдельной лаборатории использовать один источник массового производства антител, и ведет к намного более воспроизводимым результатам. Вторичные антитела обычно связывают с биотином или с репортѐрным ферментом, таким как щелочная фосфатаза или пероксидаза хрена. Это значит, что несколько вторичных антител могут связываться с одним первичным и усиливать сигнал. Наиболее распространенные, связанные с пероксидазой хрена вторичные антитела используются для разрезания хемилюминесцентного агента, и продукт реакции производит люминесцентное излучение пропорционально количеству белка. Лист светочувствительной фотографической пленки помещается напротив мембраны и подвергается действию излучения реакции, создавая изображение полос антител на блоте. Более дешевый, но менее чувствительный подход с использованием 4-хлоронафтольного окрашивания в смеси с 1 % перекисью водорода; реакция пероксидного радикала с 4-хлоронафтолом дает темнокоричневое окрашивание, которое регистрируется без использования специальной фотографической пленки. Другой метод детекции вторичными антителами использует антитела со связанным флюорофором, который излучает в ближней инфракрасной области (NIR). Свет, излучаемый флюоресцентным красителем, постоянен и делает флюоресцентную детекцию более точным и чувствительным способом измерения разницы в сигнале, производимом белками, которые мечены антителами, на вестерн блоте. Белки могут быть определены количественно, так как сигнал рассчитывается как разница (излучения) по отношению ко всем белкам на мембране, измеренном в покое, к (излучению) хемилюминесценции, которая измеряется в динамике. После отмывки не связавшихся меток, вестерн блот готов к детекции зондов, связавшихся с целевым белком. На практике, не во всех вестернах обнаруживают белки лишь по одному бэнду на мембране. Приблизительный размер вычисляют сравнивая окрашенные бэнды с маркерами молекулярной массы, добавленными при электрофорезе. Процесс повторят 62 с структурными белками, такими как актин или тубулин, которые не меняют между эксперментами. Количество целевого белка зависит от количества контрольного структурного белка между группами. Этот прием обеспечивает коррекцию количества общего белка на мембране в случае ошибки или неполного переноса. 4.3 Хроматографические методы разделения белков 4.3.1 Общие принципы хроматографии Хроматография (от греч. χρώμα — цвет) — метод разделения и анализа смесей веществ, а также изучения физико-химических свойств веществ. Основан на распределении веществ между двумя фазами — неподвижной (твердая фаза или жидкость, связанная на инертном носителе) и подвижной (газовая или жидкая фаза, элюент). Метод разработан в 1903 М. Цветом, который показал, что при пропускании смеси растительных пигментов через слой бесцветного сорбента индивидуальные вещества располагаются в виде отдельных окрашенных зон. Полученный таким образом послойно окрашенный столбик сорбента Цвет назвал хроматограммой, а метод - хроматографией. Впоследствии термин "хроматограмма" стали относить к разным способам фиксации результатов многих видов хроматограмм. Однако вплоть до 40-х гг. хроматография не получила должного развития. Лишь в 1941 А. Мартин и Р. Синг открыли метод распределительной хроматографии и показали его широкие возможности для исследования белков и углеводов. В 50-е гг. Мартин и американский учѐный А. Джеймс разработали метод газо-жидкостной хроматографии. В зависимости от природы взаимодействия, обусловливающего распределение компонентов между элюентом и неподвижной фазой, различают следующие основные виды хроматографии: 1. Адсорбционную 2. Распределительную 3. Ионообменную 4. Эксклюзионную (молекулярно-ситовую) 5. Осадочную Адсорбционная хроматография основана на различии сорбируемости разделяемых веществ адсорбентом (твѐрдое тело с развитой поверхностью); распределительная хроматография - на разной растворимости компонентов смеси в неподвижной фазе (высококипящая жидкость, нанесѐнная на твѐрдый макропористый носитель) и элюенте (следует иметь в виду, что при распределительном механизме разделения на перемещение зон компонентов частичное влияние оказывает и адсорбционное взаимодействие анализируемых 63 компонентов с твѐрдым сорбентом); ионообменная хроматография - на различии констант ионообменного равновесия между неподвижной фазой (ионитом) и компонентами разделяемой смеси; эксклюзионная (молекулярно-ситовая) хроматография - на разной проницаемости молекул компонентов в неподвижную фазу (высокопористый неионогенный гель). Эксклюзионная Х. подразделяется на гель-проникающую (ГПХ), в которой элюент неводный растворитель, и гель-фильтрацию, где элюент - вода. Осадочная хроматография основана на различной способности разделяемых компонентов выпадать в осадок на твѐрдой неподвижной фазе. В соответствии с агрегатным состоянием элюента различают газовую и жидкостную хроматографию. В зависимости от агрегатного состояния неподвижной фазы газовая хроматография бывает газо-адсорбционной (неподвижная фаза - твѐрдый адсорбент) и газожидкостной (неподвижная фаза - жидкость), а жидкостная хроматография - жидкостноадсорбционной (или твѐрдо-жидкостной) и жидкостно-жидкостной. Последняя, как и газожидкостная, является распределительной хроматографией. К твѐрдо-жидкостной хроматографии относятся тонкослойная и бумажная. Различают колоночную и плоскостную хроматографию. В колоночной сорбентом заполняют специальные трубки - колонки, а подвижная фаза движется внутри колонки благодаря перепаду давления. Разновидность колоночной хроматографии - капиллярная, когда тонкий слой сорбента наносится на внутренние стенки капиллярной трубки. Плоскостная хроматография подразделяется на тонкослойную и бумажную. В тонкослойной хроматографии тонкий слой гранулированного сорбента или пористая плѐнка наносится на стеклянную или металлическую пластинки; в случае бумажной хроматографии используют специальную хроматографическую бумагу. В плоскостной хроматографии перемещение подвижной фазы происходит благодаря капиллярным силам. При хроматографировании возможно изменение по заданной программе температуры, состава элюента, скорости его протекания и др. параметров. В зависимости от способа перемещения разделяемой смеси вдоль слоя сорбента различают следующие варианты Х.: фронтальный, проявительный и вытеснительный. При фронтальном варианте в слой сорбента непрерывно вводится разделяемая смесь, состоящая из газа-носителя и разделяемых компонентов, например 1, 2, 3, 4, которая сама является подвижной фазой. Через некоторое время после начала процесса наименее сорбируемый компонент (например, 1) опережает остальные и выходит в виде зоны чистого вещества раньше всех, а за ним в порядке сорбируемости последовательно располагаются зоны смесей компонентов: 1 + 2, 1 + 2 + 3, 1 + 2 + 3 + 4. При проявительном варианте через слой сорбента непрерывно проходит поток элюента и периодически в слой сорбента вводится разделяемая смесь веществ. Через определѐнное время происходит деление 64 исходной смеси на чистые вещества, располагающиеся отдельными зонами на сорбенте, между которыми находятся зоны элюента. При вытеснительном варианте в сорбент вводится разделяемая смесь, а затем поток носителя, содержащего вытеснитель (элюент), при движении которого смесь через некоторый период времени разделится на зоны чистых веществ, между которыми окажутся зоны их смеси. В жидкостной колоночной хроматография в качестве элюента применяют легколетучие растворители (например, углеводороды, эфиры, спирты), а в качестве неподвижной фазы силикагели (в т. ч. силикагели с химически привитыми к поверхности различными функциональными группами - эфирными, спиртовыми и др.), алюмогели, пористые стекла; размер частиц всех этих сорбентов несколько мкм. Подавая элюент под давлением до 50 Мн/м2 (500 кгс/см2), удаѐтся сократить время анализа от 2-3 ч до нескольких мин. Для повышения эффективности разделения сложных смесей используют программируемое во времени изменение свойств элюента путѐм смешения растворителей разной полярности (градиентное элюирование). Жидкостная молекулярно-ситовая хроматография отличается использованием сорбентов, имеющих поры строго определѐнного размера (пористые стекла, молекулярные сита, в том числе декстрановые и др. гели). В тонкослойной и бумажной Х. исследуемую смесь в жидком виде наносят на стартовую линию (начало пластинки или полоски бумаги), а затем разделяют на компоненты восходящим или нисходящим потоком элюента. Последующее обнаружение (проявление) разделѐнных веществ на хроматограмме (так в этих случаях называют пластину с нанесѐнным на неѐ сорбентом или хроматографическую бумагу, на которых произошло разделение исследуемой смеси на компоненты) осуществляют инфракрасной (ИК) при помощи спектроскопии или ультрафиолетовой обработкой (УФ) реактивами, спектроскопии, образующими с анализируемыми веществами окрашенные соединения. Качественно состав смесей с помощью этих видов Х. характеризуют определѐнной скоростью перемещения пятен веществ относительно скорости движения растворителя в данных условиях. Количественный анализ осуществляют измерением интенсивности окраски вещества на хроматограмме. 4.3.2 Хроматография высокого давления (ВЭЖХ) Интерес к колоночной хроматографии с подвижной жидкой фазой резко возрос с появлением аппаратуры для жидкостной хроматографии при высоких давлениях. Отличительной особенностью этого метода является наличие в аппаратуре специальных насосов, позволяющих с достаточно большой скоростью продавливать жидкую фазу через колонку, чувствительных имеющей диаметр частиц от 3 до 15 мкм, а также наличие детекторов для обнаружения разделенных веществ. Хроматографы ВЭЖХ (HPLC) включают несколько кислорода из растворителей), насос, блоков: дегазатор (для для удаления растворенного термостат (где помещается колонка), детектор (УФ, 65 рефрактометр, амперометрический, кондуктометрический и другие), принтер, коллектор фракций (сбор образцов). На хроматограф могут быть установлены различные колонки: ионообменные, гельфильтрационные, гидрофобные и.т.д (рисунок 4.11). Рис. 4.11 Хроматограф 4.3.3 Ионообменная хроматография Для разделения белков используют ионообменники на основе целлюлозы, декстранов и агароз. Белки связываются ионообменником с помощью электростатических сил между заряженными поверхностями белков и кластерами заряженных групп на ионообменнике. Степень модификации КМ или ДЭАЭ-целлюлозы высока – до 0,5 ммоль/см 3 . Заряды, нейтрализованы противоионами, такими как ионы металлов, хлорид - ионы и ионы буфера. Белок должен вытеснить противоионы, отсюда происходит термин ―ионный обмен‖. Количество белка, которое может связать ионообменник в расчете на единицу объема, может быть очень большим. У ионообменников на основе целлюлозы это количество зависит в основном от размеров белковых молекул, – чем мельче молекулы белка, тем в большей степени он адсорбируется. Молекулы белков с молекулярной массой более 106 не задерживаются большинством целлюлозных ионообменников. Ниже в таблице 4.2 приведены наиболее известные ионообменники. 66 Таблица 4.2 Список ионообменников № Обменник Группа На основе целлюлозы 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. Катионообменник КМ-целлюлоза Заряженная группа О-СН 2-СОО(карбоксиметилцеллюлоза) Анионообменник ДЭАЭ-целлюлоза Заряженная группа О-С2Н4NН(С2Н5) 2 (диэтиламиноэтилцеллюлоза) КатионообменникФосфоцеллюлоза Заряженная группа -О-РО3Анионообменник ТЭАЭцеллюлоза Заряженная группа О-С2Н4N+(С2Н5)3 (триэтиламиноэтилцеллюлоза) На основе декстранов Катионообменник КМ-сефадекс Заряженная группа О-СН2-СОО(карбоксиметилсефадекс) Катионообменник СП-сефадекс Заряженная группа О-(СН2)3-SО3(сульфопропилсефадекс) На основе сефарозы (предназначены для разделения крупных молекул) Катионообменник КМ-сефароза Заряженная группа О-СН2-СОО(карбоксиметилсефароза) Анионообменник ДЭАЭсефароза Заряженная группа О-С2Н4NН(С2Н5)2 (диэтиламиноэтилсефароза) Для выбора ионообменника для очистки белка с известной изоэлектрической точкой имеют в виду, что при значениях рН буфера ниже изоэлектрической, белок имеет положительный заряд и адсорбируется на катионообменнике и наоборот. На практике условия адсорбции выбирают эмпирически, так как чаще всего изоэлектрическая точка белка неизвестна. Хотя изоэлектрическую точку фермента можно определить методом изоэлектрического фокусирования в сочетании со специфическим окрашиванием на ферментативную активность, но иногда проще провести эксперимент с применением ионообменников. Образец необходимо наносить в том же буфере, который используют для уравновешивания колонки. Для перевода в нужный буфер используют диализ или гель-фильтрацию. Например, 1 мл препарата пропускают через колонку с сефадексом G25 объемом 10 мл, уравновешенную нужным буфером, за 10 мин. Концентрация белка в образце может достигать 30 мг/мл. В ионообменной хроматографии применяют короткие и толстые колонки, длина которых в 4-5 раз превышает их диаметр. Никогда не следует наносить образец, в котором есть осадок, 67 его надо сначала отделить центрифугированием. Осадок может привести к закупорке колонки. хроматографии не следует забывать о методах адсорбции смешиваются с носителем, например, в стакане, Кроме колоночной ―в объеме‖, когда белки а элюцию (обычно ступенчатым градиентом) проводят на стеклянном фильтре. Это очень быстрый и потому полезный метод в тех случаях, когда время имеет первостепенное значение (рис. 4.12). Рис. 4.12 Схема ионообменной хроматографии 1. Принцип метода основан на притяжении между противоположно заряженными частицами. 2. В основе разделения многих биологических соединений, таких как аминокислоты и белки, лежит тот факт, что эти соединения содержат способные к ионизации групы, которые обуславливают суммарный положительный или отрицательный заряд соединения; величина заряда зависит от рН и изоионной точки. 3. Разделение проводят на колонках, заполненных специальной ионообменной смолой. Элюция адсорбированного белка. Теоретически существуют два способа элюции белков: 1) Изменение рН буфера до величины, при которой связывание белка с адсорбентом ослабевает; для анионообменников используют более низкие значения рН, а для катионообменников – более высокие. 68 2) Повышение ионной силы, что вызывает ослабление электростатического взаимодействия между белком и адсорбентом. На практике метод 1 не всегда дает хорошие результаты из-за буферных свойств самих белков, а в некоторых случаях и адсорбента. Более распространенные способы элюции – солевые градиенты (ступенчатые и линейные). Обычно используют хлориды калия или натрия, линейный градиент создают при помощи простого смесителя, работающего на принципе сообщающихся сосудов. При повышении концентрации соли белки начинают двигаться вниз, но перемещаются с меньшей скоростью, чем соль, поэтому каждая часть белковой зоны испытывает действие повышенной концентрации соли. Это приводит к тому, что зоны сужаются. 4.3.4 Аффинная хроматография Под аффинной (биоспецифической) хроматографией понимают использование иммобилизованного на адсорбенте лиганда, осуществляющего специфический отбор белков, которые связываются с этим лигандом. По своему существу аффинная хроматография - это особый тип адсорбционной хроматографии. Адсорбция здесь осуществляется за счѐт биоспецифических взаимодействий между молекулами лиганда, закреплѐнного на матрице (связанного с неподвижной фазой) и соответствующими ему молекулами. В качестве примера можно назвать взаимодействия между: Фермент - субстрат Кофактор/ингибитор – фермент Гормон – рецептор Антитело – антиген НК – ДНК-связывающие белки После адсорбции фермент может быть элюирован либо неспецифическим образом, например, повышением концентрации соли, либо специфическим в результате замещения белка лигандом из раствора. Следовательно, аффинная хроматография включает две специфические стадии – “аффинную адсорбцию” и “аффинную элюцию” (рис. 4.13). Хотя и существуют некоторые готовые нерастворимые материалы, имитирующие субстрат или настоящие субстраты (крахмал для амилаз, хитин для хитиназ и т.д.), но чаще аффинные адсорбенты необходимо синтезировать. 69 Рис. 4.13 Аффинная хроматография 1. Аффинная хроматография является методом, который позволяет очищать биомолекулы и другие полимеры на основе их индивидуальной структуры или функции. 2. Она использует высоко специфичное сродство макромолекулы к другой молекуле, которая присоединена к неподвижной фазе. 3. Принцип работы заключается в следующем: а — образец вводят (впрыскивают) в колонку; б — через колонку пропускают буферный раствор, в результате чего молекулы, у которых нет сродства в неподвижной фазе, вымываются из колонки, а молекулы с высоким сродством к неподвижной фазе удерживаются в колонке; в — удерживаемые молекулы элюируются из колонки буферным раствором с высокой концентрацией соли, или с другим значением рН, или растворителем другого состава. Лигандов может быть много (субстраты и квазисубстраты, ингибиторы и их аналоги), поэтому фирмы-производители пошли по пути изготовления носителя с реакционными группами, к которым затем присоединяют необходимый лиганд. Таким носителем является, например, сефароза, обработанная бромцианом гидроксильной группой агарозной матрицы). -ОН + BrCN = -O-C≡ N + Br- + H+ 70 (бромциан вступает в реакцию с Активированная агароза быстро взаимодействует с первичными аминами. Например, белки присоединяются по аминогруппе ε–лизина. Основные требования к аффинной адсорбции 1. Лиганд должен быть присоединен к матрице таким образом, чтобы при связывании его с белком не возникало серьезных затруднений. 2. Удлиняющий мостик между матрицей и лигандом должен облегчать доступ белка к лиганду. 3. Неспецифическое взаимодействие не должно быть слишком сильным, чтобы сопутствующие белки не могли связаться с адсорбентом. 4. Связь лиганда с матрицей должна быть стабильна в условиях хроматографии и в процессе регенерации адсорбента. Ослабление биоспецифических сил может быть достигнуто обычными приѐмами: изменением рН, ионной силы раствора, введением органических растворителей, детергентов. В случае иммуноглобулинов в качестве лиганда, разделение осуществляется за счѐт введения в элюирующий буфер β-меркаптоэтанола (рис. 4.14). Следует заметить, что аффинная адсорбционная хроматография является исключительным методом, если вся процедура уже тщательно отработана, однако создание необходимых адсорбентов может быть очень трудоемким процессом. Рис. 4.14 Хроматограмма иммуноаффинного выделения фактора элонгации EF-G из белковой фракции, полученной после хроматографии грубого экстракта клеток T. Thermophiles на колонке с ДЕАЕ-сефарозой. Колонка с анти-EP-G-IgG, иммобилизованными на агарозе. Стрелками показаны моменты добавления в уравновешивающий буфер NaCl и KCNS. 71 4.3.5 Гидрофобная хроматография В ходе создания носителей для аффинной хроматографии были проведены контрольные опыты, в которых изучалось поведение матриц, содержащих удлиняющие мостики, но без лиганда. Оказалось, что в некоторых случаях ферменты прочно связывались с гексаметиленовыми мостиками. Этот факт послужил основой для развития методов гидрофобной хроматографии, взаимодействия между основанных на алифатической цепью связывании адсорбента белка в и результате соответствующим гидрофобным участком на поверхности белковой глобулы. Соответствующие сорбенты синтезируют, включая гидрофобные группы в гидрофильную матрицу, например поперечносшитую агарозу (сефарозу). По такому принципу построены октил- и фенил- сефарозы. Гидрофобные взаимодействия Максимальное усиливаются с повышением концентрации соли. усиление вызывают соли, проявляющие наибольшую активность при высаливании, такие как 1,5 М сульфат аммония. Это объясняется тем, что в основе обоих процессов лежат агрегации одинаковые механизмы. При высаливании основной причиной является Следовательно, при усиление высоких гидрофобных концентрациях взаимодействий между соли большинство белками. белков будут адсорбироваться на гидрофобных группах, связанных с матрицей. Элюцию проводят понижающимся градиентом концентрации соли. Плавное снижение концентрации соли в элюирующем растворе приводит к поочерѐдной десорбции белков. Белки, которые прочно адсорбируются, обычно удаляют с колонки, добавляя в элюирующий раствор этиленгликоль. Сходным образом действуют сорбенты, полученные присоединением к мелкопористому кремнезѐму гидрофобных алкильных радикалов различной длины: С18 – углеводородной цепи - малопригодны для фракционирования белков из-за сильного, порой необратимого связывания с полипептидной цепью, но могут использоваться для разделения пептидов. С4 – С8 - углеводородной цепи – даѐт наилучшие результаты по фракционированию белков. Будучи жѐсткими по своим физико-химическим свойствам, эти сорбенты подходят для работы при высоком давлении в условиях ВЭЖХ (HPLC). 4.3.6 Адсорбционная хроматография В этом виде хроматографии неподвижная фаза представлена твѐрдой поверхностью снаружи и внутри гранул сорбента – в их порах. Для пористых сорбентов, как и в случае гидрофобной хроматографии, имеет место эффект гель-фильтрации, т. к. жидкость внутри пор неподвижна, но по сравнению с адсорбцией этот эффект невелик. На поверхности сорбента могут сорбироваться не только молекулы фракционируемого вещества, но и молекулы 72 элюента, которые могут даже конкурировать с веществом за одни и те же участки поверхности. Однако, обычно молекулы вещества обладают намного большим сродством к сорбенту, чем элюент, и такая конкуренция играет второстепенную роль. В процессе сорбции вещества и элюента на поверхности сорбента могут участвовать несколько типов физических взаимодействий между молекулами: 1. Дипольные 2. Ван-дер-Ваальсовы 3. Водородные связи 4. Ионные связи Характер и степень связывания молекул вещества сорбентом сильно зависит от взаимодействия вещества с элюентом. Совокупность всех взаимодействий обуславливает степень растворимости вещества в элюенте. Склонность к адсорбции и растворимость вещества выступают как конкурирующие характеристики, соотношением которых можно управлять путѐм изменения состава элюента. Особо необходимо отметить взаимодействие, как фактор стерического соответствия молекул вещества и сорбента, т. е. возможность совпадения расстояний между способными взаимодействовать атомами и химическими группами на поверхности обоих партнѐров, когда контакт между ними оказывается не одноточечным. Любая твѐрдая поверхность является в некоторой степени сорбентом. Удельная сорбционная способность (отношение к 1 г сорбента) будет тем выше, чем больше отношение поверхности к массе, т. е. чем мельче проницаемость их поры. Важными качествами сорбента, предназначенного для хроматографии, является его полная нерастворимость в широком наборе возможных жидких элюентов и химическая инертность. В адсорбционной хроматографии в качестве элюентов часто применяют органические растворители. В качестве сорбентов применяются: 1. Силикагель 2. Окись алюминия в виде 5-20% водного золя. 3. Гранулы пористого стекла 4. Кизельгур 5. Окись магния 6. Силикаты магния 7. Карбонат кальция 8. Полистиролы 9. Оксиапатит (единственный вариант, широко применяемый для очистки белков и нуклеиновых кислот) 73 Известно, что 1 г оксиапатита способен сорбировать около 10 мг белка или 1 мг нуклеиновых кислот. Коммерческий сорбент оксиапатита, известен как «Ultrogel HA». Он состоит из гранул 4% химически-инертной агарозы, в которых находятся кристаллы оксиапатита. Основную роль в адсорбционном взаимодействии играют ионы кальция, находящиеся на поверхности кристаллов. 4.3.7 Тонкослойная хроматография Тонкослойная хроматография (ТСХ) является разновидностью жидкостной хроматографии, в которой подвижная фаза (ПФ) движется в пористой среде слоя адсорбента. Самым простым вариантом планарной хроматографии является бумажная хроматография, когда разделение производят с использованием специальной бумаги. Также для разделения используются пластины на основе оксида алюминия и силикагеля (рисунок 4.15). Рис. 4.15 Хроматограмма образца Наиболее распространены пластины на основе силикагеля. Оксид алюминия и силикагель, как правило, размещается на стеклянной, металлической или пластиковой основе. В ряде случаев к сорбенту добавляется флуоресцентный индикатор синего или зелѐного цвета. Также существуют NH2-, CN-, ДИОЛ, и RP модифицированные сорбенты для анализа веществ не разделяющихся на силикагелях напрямую. Разделение, как правило, производится в специальных герметичных камерах для ТСХ (рисунок 4.16). Рис. 4.16 Схема тонкослойной хроматографии 74 4.4 Идентификация белка. Масс-спектрометрические методы анализа 4.4.1 Общие принципы масс-спектрометрического анализа До недавнего времени неизвестные («безымянные») белки и протеомы идентифицировали с использованием либо агента, специфически связывающегося с белком (как правило, антитело), либо секвенирование белка ступенчатой деградацией по Эдману. Ни один из этих методов не подходит для анализа целого протеома, когда необходимо быстро охарактеризовать тысячи белков. В начале 1990-х годов выяснилось, что быстрая идентификация белков может быть достигнута масс-спектрометрически. Масс-спектрометрия (МС) используется для определения молекулярных масс, но очень долгое время этот метод не удавалось использовать для анализа больших молекул, включая белки, поскольку процесс ионизации приводит к фрагментации молекулы. В результате разработки методов мягкой ионизации, таких как матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация (МАЛДИ, или англ. MALDI, т.е. лазерная десорбция при содействии матрицы) и электроспрей-ионизация (ЭСИ, или англ. ESI), появилась возможность определять массы больших молекул. В 1993 г. несколько независимых исследовательских групп опубликовали алгоритмы, которые могут быть использованы для поиска в базах данных белковых последовательностей, соответствующих результатам масс-спектрометрического анализа пептидов. Принципы этого метода, известного как фингерпринтинг масс пептидов, состоят в следующем: 1. Получение биологического образца; 2. Подготовка биологического образца к исследованию; 3. Аналитический 2D-SDS-PAGE с окраской гелей нитратом Ag или Coomassie Brilliant Blue; 4. Образец белка, например из двумерного геля, расщепляют протеазой, трипсином для получения набора – триптических пептидов; 5. Их анализируют методом MALDI-MS (МАЛДИ-МС), как правило, с времяпролетным детектором (TOF, time off light); 6. Определяются молекулярные массы пептидов; 7. Поисковый алгоритм, такой как MS-BLAST, использует полученные молекулярные массы пептидов для поиска в базах данных белков. Алгоритм осуществляется виртуальный гидролиз трипсином всех белков в базе данных и вычисляет массы соответствующих (из баз данных, т.е. предсказанных) триптических пептидов. Затем делаются попытки установить соответствие между этими предсказанными массами и молекулярными массами полученными экспериментально. 8. Создается список соответствий. Если несколько пептидов соответствуют одному и тому же белку в базе данных, появляется основание утверждать, что получено полное 75 соответствие. Соответствие может быть найдено не для всех пептидов из-за существования непредвиденных посттрансляционных модификаций, различных вариантов сплайсинга и полиморфизма. В тех случаях, когда соответствия не могут быть получены, можно использовать более жесткие методы тандемной масс-спектроскопии (MS/MS) для фрагментации пептидов и вычисления масс фрагментированных ионов. И тогда можно проводить поиск менее сложным базам данных белковых последовательностей, включая коллекции EST, для получения частичного соответствия. Фрагменты также могут быть собраны в «лестницы» пептидов, массы которых можно сравнивать со стандартными таблицами аминокислот, с целью определения последовательности de novo. 4.4.2 Масс-спектрометрический анализ в протеомике МС представляет собой физический метод, основанный на измерении массы заряженных частиц материи. Этот метод используется для анализа вещества около 100 лет, начиная с основополагающих опытов Д.Д. Томпсона в 1907 г. МС отличается от других аналитических физико-химических методов тем, что непосредственно детектирует сами частицы вещества, а оптические рентгеновские и некоторые другие методы детектируют излучение или поглощение энергии молекулами или атомами. МС измеряет отношение m/z. Оборудование, позволяющее получить масс-спектр, называется масс-спектрометром (рис. 4.17). А Б Рис. 4.17 Современные масс-спектрометры различного принципа детектирования (Bruker) А. Высокопроизводительный MALDI-TOF Autoflex 3 масс-спектрометр Б. Высокопроизводительный масс-спектрометр типа «ионная ловушка»HST Ultra 76 В органических веществах молекулы представляют собой определенные структуры, образованные атомами. Современные масс-спектрометры способны фрагментировать детектируемые ионы и определять массу полученных фрагментов. Таким образом, можно получать данные о структуре вещества. Результат (МС-масс-спектрограмма) служит для идентификации молекулы. Масс-спектрограмма состоит из отдельных полос, высота которых соответствует относительному содержанию определенных ионов анализируемого соединения как функции массы. Эти ионы несут информацию о Mw наиболее электронно-стабильных фрагментов исходной молекулы. По масс-спектрограмме можно, основываясь на атомной структуре, охарактеризовать молекулу анализируемого соединения (рис. 4.18). Рис. 4.18 Пример масс-спектрограммы белкового профиля МС можно рассматривать как совокупность трех процессов: ионизации, разделения ионов по массам и регистрации образующихся ионов. Многочисленные методы ионизации (электронный удар, химическая ионизация, бомбардировка быстрыми атомами, ESI, MALDI) можно сочетать с различными способами разделения ионов в зависимости от поставленных задач: в магнитном поле, электрическом, с помощью ионной ловушки, а также на основе TOF и ион-циклотронного механизма (Сидоров, 2000). Основными звеньями любого MS являются вакуумная система, система для ввода анализируемого образца, система ионизации и разделения ионов по массам, система для регистрации и компьютерной обработки полученных результатов, включая программное обеспечение. Принципиальная схема устройства масс-спектрометра включает в себя инжектор (дозатор) проб, ионизатор, анализатор масс и детектор ионов (рис. 4.19). Сначала проба впрыскивается в ионизатор, где молекулы образца ионизируются. Затем ионы образца 77 анализируются и регистрируются. Чтобы предотвратить столкновение с молекулами газа, ионизатор, анализатор масс и детектор ионов обычно работают в вакууме. Рис. 4.19 Принципиальная схема масс-спектрометра Ключевым компонентом MS является масс-анализатор, в котором под действием электрического и магнитного поля происходит процесс разделения пучка ионов на фракции с одинаковым отношением m/z. В большинстве случаев необходимо исследовать нейтральные частицы, которые должны быть переведены в ионы. Для этого служит ионный источник, в котором нейтральные частицы подвергаются ионизации. Первым методом ионизации являлся метод FAB. Обычная схема эксперимента заключалась в том, что проводилась ионизация атомов гелия электронным ударом. Положительные ионы гелия разгоняли в электрическом поле до энергии 5 – 10 кВ, затем ионы поступали в камеру перезарядки, наполненную гелием, и в результате перезарядки получали атомы гелия с энергией 5 – 10 кВ, которые и направляли на исследуемый трехфазный образец. В результате фиксировали лишь осколки того вещества, которое находилось на поверхности. При бомбардировке электронов молекул в газообразном состоянии связи в молекулах разрываются и образуются ионы. Вид и количество образующихся фрагментов характерны для данной молекулы. При наложении магнитного поля положительно заряженные частицы ускоряются и движутся по изогнутым кривым, радиус кривизны которых пропорционален корню квадратному из массы иона. При некотором постоянном магнитном поле поток ионов, содержащий ионы с идентичным отношением масса/заряд, попадает на коллектор, где при разряде ионов возникает ток, пропорциональный относительному количеству ионов с соответствующей массой. Изменением магнитного поля постепенно переводят на коллектор потоки ионов с другим отношением m/z. Ток коллектора записывается и представляется графически в виде масс-спектрограммы. Масс-спектр служит для идентификации молекулы. В настоящее время различают несколько способов ионизации: «электроспрей» (API, ESI), основанный на методе электростатического распыления, блоки химической (APCI) или фотохимической (APPI) ионизации, комбинированный способ, в котором параллельно осуществляются два типа ионизации API + APCI и метод матрично-активированной лазерной десорбционной ионизации (MALDI) (или лазерно-десорбционная ионизация в матрице). 78 Метод ионизации, получивший название «электрораспыление» (ESI) (Davis, 1998), часто называют электродинамическим. Ионизация происходит при взаимодействии сильного электростатического поля с поверхностью жидкости на конце капиллярной трубки. В исследуемой жидкости должны быть ионы. Поэтому обычно добавляют небольшие количества ионных солей или другие соединения, которые могут привести к образованию ионов (рис. 4.20). Рис. 4.20. Электрораспылительный метод ионизации Техника ионизации ESI в сочетании с наиболее мощными современными массанализаторами позволяет успешно определять Mw таких молекул, как мРНК в диапазоне масс 25 000 Da, ДНК для последовательности в 100 нуклеотидов в диапазоне масс 31 000 Da, белок альбумин – масса в районе 66 000 Da. При некотором снижении разрешающей способности достижимый диапазон масс составляет несколько сот тысяч Da. Характерной чертой APCI является ионизация вне вакуумной системы MS, а анализируемые вещества в потоке газа-носителя (азот, аргон) поступают в анализатор через специальный интерфейс. В качестве источника ионов используют коронный разряд. Масса определяемых веществ при APCI не превосходит 1 500 Da. Главным преимуществом APCI является незначительная, по сравнению с ESI, ионная супрессия. К недостаткам метода относится трудность определения термонестабильных веществ. Одновременно APCI приводит к фрагментации образца. В конце 80-х годов техника ионизации стала крайне важной для анализа пептидов и белков биологических жидкостей и тканей организма человека. Эта техника позволяет очень 79 точно определить Mw больших молекул. В результате помещения исследуемого вещества в глицериновую матрицу можно получить спектр нелетучих органических молекул, что явилось революционным открытием в технике ионизации термически нестойких соединений без их деструкции. Дальнейшее развитие привело к вытеснению этого метода технически более удобным методом, получившим название MALDI – лазерно-десорбционная ионизация в матрице. С 1970 г. в МС-анализе начали применяться лазерные устройства для получения прямой десорбции интактных молекулярных ионов из конденсированных газовых фаз. В этот период исследований тонкий слой образца наносился на металлическую поверхность и подвергался воздействию пульсирующего лазера. Однако получавшиеся масс-спектры имели малую интенсивность, так как энергия лазера была недостаточной, чтобы вызвать молекулярную фрагментацию молекул образца. Таким образом, MALDI находила применение только для биомолекул с Mw ниже 1 000 Da. Ситуация резко изменилась с тех пор, как Karas M. из университета Мюнстера обнаружил тот факт, что если поместить образец, состоящий из малых органических молекул, в определенный вид матрицы, лазерный луч сильно поглощается, что способствует увеличению интенсивности масс-спектра анализируемого образца; при этом фрагментация образца сведена к минимуму. Основной принцип MALDI-ионизации состоит в том, что, при смешивании после специфической пробоподготовки образец на планшете с соответствующей матрицей, абсорбирующей длину волны лазера, возникает кристаллизация матрицы и анализируемого материала после испарения сольвента. Включение молекул образца в структурную решетку матрицы создает условия для работы процесса лазерной десорбции/ионизации. Кристаллизованная поверхность подготовленного образца подвергается воздействию лазера в импульсном режиме в абсолютном вакууме. Этот процесс происходит в ионном источнике MS. Электрод, который располагается в нескольких миллиметрах напротив образца, применяется для формирования электростатического поля. В зависимости от полярности (положительные или отрицательные ионы) ионы достигают анализатора с поверхности образца. Образовавшиеся ионы управляются электростатическими линзами и четырехполосными (квадроупольными) или восьмиполосными (октопольными) проводниками, за исключением ионов, разогнанных (раскрученных) в циклотроне и регистрирующихся путем измерения и Фурье-преобразования сигналов напряжения, которые они индуцируют в принимающих (накопительных) электродах (рис. 4.21). 80 АБ Рис. 4.21. А. СхемаMALDI-ионизации (Laser Mass Spectrometry Group, Institut für Medizinische Physik und Biophysik, Münster). Б. Подложка для MALDI-ионизации. В соответствие с конструкцией анализатора масс существует пять основных типов МС: 1) секторные магнитные и (или) электрические МС, в которых ионы, покидающие источник ионов, ускоряются и проходят через сектор, в котором магнитное или электрическое поле прикладывается перпендикулярно к направлению их движения. Поле изгибает траекторию полета ионов и принуждает ионы с различным отношением m/z разлетаться веером. В сканирующем анализаторе масс изменяют силу электрического или магнитного поля, при этом каждый раз регистрируется только одна масса. В несканирующем анализаторе все массы регистрируются одновременно (в определенном диапазоне масс) с помощью многоканального детектора (Нолтинг, 2005); 2) квадрупольные МС, в которых пучок ионов с помощью электрического поля разгоняется до высокой скорости и проходит сквозь квадрупольный анализатор масс, состоящий из четырех металлических стержней. К этим стержням прилагается напряжение постоянного или переменного тока таким образом, что в каждый момент времени сквозь анализатор пролетают ионы только с одним соотношением массы к заряду – m/z. Чтобы просканировать различные m/z, напряжение тока варьирует (рис 4.22). 81 Рис 4.22. Квадрупольный масс-спектрометр Масс детекторы с тройным квадруполем (QQQ) нашли своѐ применение в лабораториях, занимающихся массовыми анализами объектов окружающей среды, пищевых и сельскохозяйственных продуктов, в лабораториях метаболомики (для определения следовых количеств метаболитов), биоэквивалентности лекарственных средств, допинг- и наркологического контроля, а также для мониторинга следовых количеств известных соединений в сложных матрицах (почва, вода, пищевые продукты, биологические объекты). 3) МС и ионной ловушкой включает ионный источник, входной капилляр, зону диссоциации ионов, активируемая столкновениями (CID), где ионы могут быть подвергнуты дополнительной фрагментации, конус скиммера, через отверстие которого они попадают в фокусирующий октаполь и затем в ионную ловушку – анализатор масс. Принцип и режимы работы ионных ловушек коренным образом отличаются от таковых для квадрупольных МС. Ионные ловушки могут работать только в периодическом режиме: накопление ионов, затем их анализ. Анализ может быть проведен либо путѐм сканирования масс, либо путѐм изоляции определенного иона, с последующим изучением его фрагментации, а также масс-фрагментографии нескольких поколений его дочерних ионов с целью получения информации. Другим режимом работы ловушки является процесс резонансного захвата выбранного. При этом при помощи радиочастотных полей из всей массы ионов, находящихся в ловушке выделяется и удерживается ион с определенным отношением m/z. Этот процесс занимает десятки микросекунд. Следующий этап начинается с повышения напряжения на одном из электродов, из-за чего захваченному иону сообщается дополнительная энергия. Ион испытывает соударения с атомами гелия, приводящие к его фрагментации. 82 В результате в ловушке вновь оказывается смесь ионов. Важно отметить, что эта новая группа ионов, но уже дочерних ионов, образовывалась в результате распада родительского иона, масса которого известна и состав которого изучается в данный момент. Далее группа дочерних ионов может быть либо проанализирована путѐм сканирования масс, либо из полученной смеси может быть вновь изолирован выбранный дочерний ион, который может быть подвергнут дальнейшей фрагментации и процесс может быть повторѐн многократно (МС)n(рис. 7). Алгоритм автоматического (МС)n анализа основан на поиске наиболее интенсивного пика в масс-спектре соединения, изоляции этого иона, его фрагментации, поиске и изоляции наиболее интенсивного иона среди полученных фрагментов, дальнейшей фрагментации и т.д. Количество ионов каждого следующего поколения неуклонно уменьшается, поэтому количество циклов в реальных анализах редко превышает 5. Благодаря высокой чувствительности и возможности многократного (МС) n анализа МС в сочетании с системой жидкостного хроматографа чип-ВЖЭХ нашли широкое применение в протеомике для установления ПТМ белковых молекул (мест гликозилирования или фосфорилирования). МС с ионной ловушкой позволяет быстро идентифицировать пептиды, полученные после гидролиза модифицированных белков и установить количество и места модифицирования, с целью воссоздания структуры белков, встроенных в клеточные мембраны (рис. 4.23). Рис. 4.23. Масс-спектрометр с ионной ловушкой 4) Время-пролѐтные МС. Времяпролѐтный масс-детектор используется для идентификации неизвестных соединений, а также для количественного анализа. В отличие от квадраупольных детекторов и ионных ловушек этот прибор, основанный на других физических принципах, обеспечивает гораздо более точное измерение масс ионов и демонстрирует существенно более высокую скорость сбора данных, являясь самым 83 перспективным детектором для быстрой ВЭЖХ. Большой диапазон масс (12 000 m/z и выше) и высокое разрешение (более 13 000) делают этот детектор незаменимым для изучения состава макромолекул, прежде всего белков и пептидов, олигонуклеотидов и других полимеров природного или искусственного происхождения. Этот прибор нашел своѐ применение в исследовательских лабораториях, работающих в области протеомики, метаболомики, криминалистических, наркологических и лабораториях судебно-медицинской экспертизы, лабораториях, выполняющих анализы пищевых продуктов и объектов окружающей среды (рис. 4.24). Рис. 4.24. Линейный времяпролѐтный масс-спектрометр с лазерной десорбционной ионизацией на матрице Несмотря на то, что времяпролѐтные МС появились ещѐ в 50-х годах ХХ века, они долгое время относились к МС низкого разрешения. Принцип действия этих приборов основан на измерении времени свободного дрейфа ионов разной массы от ионного источника до детектора и вычисления их m/z на основе этих данных. Среди трудностей, которые пришлось преодолевать на протяжении десятилетий, наиболее значительными были 2: Проблема быстрого и точного измерения времени дрейфа; Разброс энергий и направлений движения ионов на старте. Первая проблема решалась развитием вычислительной техники и быстродействующей электроники (Сысоев, 1990; Сѐмкин, 2002). Решение второй проблемы связано с изобретением российского профессора Б.А. Мамурина, предложившего в 70-х годах ХХ столетия, для 84 улучшения разрешения времяпролѐтных МС использовать относительно простое устройство, которое он назвал «рефлектон». Ионный луч имеет горизонтальное направление, импульсы высокого напряжения периодически «выстреливают» ионы с места «старта» по баллистическим траекториям вверх к рефлектону, который служит ионным зеркалом и отражает дуги ионов вниз к детектору. Реализация идеи ортогонального ускорения в месте старта послужила ещѐ одним принципиальным изобретением, которое соединило непрерывный процесс поступления ионов в масс-детектор с периодической работой времяпролѐтного МС. Такая схема резко увеличивает разрешение, которое превышает 10 000 времяпролѐтных детекторов. Дальнейшее увеличение разрешения ограничено физическими размерами (толщиной) ионного пучка, выходящего из фокусирующего октополя, и другими факторами. Время за которое ионы долетают от места старта до детектора, обратно пропорционально m/z каждого типа ионов и измеряется десятками микросекунд. За это время происходит регистрация всего масс-спектра. Запись масс-спектров может производиться сотни и тысячи раз, данные усредняются прежде чем каждой точке на хроматограмме будет «присвоен» свой масс-спектр. Времяпролѐтный масс-детектор является самым быстрым среди всех типов МС. 5) МС с преобразованием Фурье (ПФ) («ион-циклотрон-резонансный МС»). Принцип работы МС основан на том, что ионы, инжектированные в ячейку анализатора, раскручиваются и вращаются на низких орбитах. При приложении высокочастотного сигнала ионы резонансно ускоряются и вращаются на более высоких орбитах. Высокочастотный сигнал, порождаемый раскрученными ионами, измеряется и подвергается преобразованию Фурье. Замечательной особенностью МС-ПФ является высокое разрешение, которое обычно превышает 100 000. Начиная с середины 90-х годов прошлого века наибольшее распространение в практической работе исследователей получил хромато-МС. Хромато-масс-спектрометрия является гибридным методом анализа и рассматривается как сочетание хроматографии (газовой или жидкостной) и МС. Процессы разделения и анализа здесь протекают независимо друг от друга. МS рассматривают как отличный детектор для газовой и жидкостной хроматографии. Когда эти два прибора напрямую соединяют в единую хромато-массспектрометрическую систему, аналитические возможности, в частности, в биомедицине и фармакологии, увеличиваются экспоненциально. Реализация всего потенциала, заключенного в большом количестве данных, генерируемых хромато-масс-спектрометром, происходит с помощью специализированного компьютера (рис. 4.25). 85 А Б Рис. 4.25.А. Масс-спектрометр FTMS (Bruker) Б. Принцип работы масс-спектрометра с преобразованием Фурье 86 Возможности МС и хромато-масс-спектрометрии для фундаментальных и прикладных исследований в биомедицине, фармакологии и биофармации безграничны. С помощью MS проводится поиск и регистрация биомаркеров развития социально-значимых заболеваний (сердечно-сосудистые заболевания, онкологические заболевания, инфекционные заболевания), а также поиск и регистрация биомаркеров эффектов лекарственных средств, механизма действия лекарства и его метаболизма в организме пациентов, исследование новых биомишеней для перспективных лекарственных средств. На основе МС выполняется разработка новых методов превентивной и клинической диагностики заболеваний, а также высокопроизводительный скрининг, разработка и клинические испытания новых лекарств. Как отмечено выше, протеомные исследования имеют ограничения, прежде всего связанные с абсолютным измерением концентраций пептидов и белков. Сила МС-технологий состоит в скорости и точности определения пептидных масс и возможностях секвенирования пептидов и белков. Предел определения пептидов и протеинов с помощью МС-технологий зависит от размера и сложности анализируемого образца. К сожалению, одинаковые пептиды в одинаковых концентрациях в двух разных образцах могут давать различную интенсивность ионных сигналов, что требует предварительного детального разделения пептидов для идентификации. МС обладает высоким разрешением и чувствительностью определения пептидов и их анализа. МС-системы могут определять отдельные пептиды на уровне 1 фмоль (различные виды МС), 10 аттомоль при определенных условиях (ионная ловушка), 1 аттомоль (FT-ICR, или ионная ловушка с капиллярным электрофорезом), 30 цептомоль (FT-ICR с дополнительной ионной оптикой). 4.4.3 Международные банки данных белков Глобальная белковая база данных была базирована в 1971 году. Тогда она содержала всего семь структур белков, расшифрованных в Брукхейвенской государственной лаборатории. Ученые из разных государств мира присылали в базу расшифрованные ними трехмерные структуры белков, пополняя архивы базы. На данный момент Глобальная белковая база данных каждодневно пополняется примерно 25 новейшими структурами. Организация белковых структур в соответствии с их паттернами укладки логически очень удобна для представления данных в Protein Data Bank (PDB). На этом основан принцип поиска информации. Несколько баз данных - производных от PDB — построены на классификации белковых структур. В них предлагаются удобные инструменты для изучения структур белков, такие как поиск по ключевому слову и последовательности, навигация среди сходных структур на разных уровнях систематической иерархии, сканирование базы данных 87 на предмет поиска структур, сходных с заданной структурой, и ссылки на другие сайты. Примерами таких баз данных могут служить SCOP (классификация структур белков), САТН (класс, архитектура, топология, гомология в суперсемействах), FSSP/DDD (классификация укладок, основанная на выравнивании структур/словарь DALI доменов) и СЕ (расширенный комбинаторный метод). Protein Data Bank, PDB (http://www.pdb.org/pdb/home) — банк данных 3-D структур белков и нуклеиновых кислот. Информация, полученная методами рентгеновской кристаллографии или ЯМР-спектроскопии, вносится в базу данных биологами и биохимиками со всего мира, и доступна бесплатно через интернет. PDB является один из важнейших ресурсов для ученых, работающих в области структурной биологии. Большинство научных журналов и некоторые фонды финансирования исследований, например, NIH в США требуют от авторов статей и получателей грантов, чтобы все структурные данные были размещены в PDB. Protein Data Bank содержит, в основном, первичные данные о структуре биологических молекул, в то время как существуют сотни других банков данных, категоризирующих первичные данные или выявляющие закономерности между строением молекул и эволюционным родством. Преобладающая часть структур получена при помощи метода диффракции рентгеновских лучей, около 15 % — при помощи ЯМР белков, и лишь малая часть — при помощи крио-электронной микроскопии. Некоторое время количество структур в PDB росло экспоненциально. В 2007 году было добавлено 7263 структур, однако, в 2008 году было добавлено лишь 7073 структур. Каждая структура, опубликованная в PDB, получает четырехзначный идентификатор (комбинация цифр и букв латинского алфавита). Данный шифр не может служить идентификатором биомолекул, так как часто разные структуры одной и той же молекулы, например, в различной среде, могут иметь различные PDB ID. Структуры могут быть просмотрены при помощи нескольких компьютерных программ (как бесплатных и распространяющихся по лицензии «open source», так и платных, распространяющихся не с открытым кодом) и плагинов к веб-браузерам. Примером свободнораспространяемой программой для чтения PDB-файлов является Ras-Top программа (рис. 4.26). 88 Рис. 4.26. Пример рабочего стола программы RasTop ПРОЕКТНОЕ ЗАДАНИЕ К МОДУЛЮ № 4 Оборудование, материалы, реактивы к модулю № 4 Таблица 4.3 Список необходимых химреактивов № 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. 24. Наименование Электрофоретический набор(камера, источник тока, стѐкла, гребѐнки, срейсеры) Сканер Акриламид Бис-акриламид Трис-НСl Соляная кислота Додецилсульфатнатрия (SDS) Аммоний персульфат ТЕМЕД Глицерин Бромфеноловый синий Дитиотрейтол (DTT ) Глицин Этанол КумассиR-250 Уксусная кислота 89 Ед. изм. Количество шт 1 шт г г г мл г мг мл мл г мг г мл г мл 1 30 1 40 20 20 100 5 10 0,5 100 50 200 0,5 100 Практическое задание№ 1 к модулю № 4.Электрофоретический анализ смеси белков с помощью градиентного гель-электрофореза в денатурирующих условиях. Провести электрофорез смеси белков, полученных из плазмы крови путѐм высаливания. Полученную электрофоретическую пластину отсканировать, прикрепить к результатам электрофореза. Оценить приблизительное количество полученных фракций и молекулярную массу белка фракции. Приготовление реактивов. Ход работы. 1. Приготовить раствор акриламид/ бис-акриламида (30,8%Т 2,7%С). Подготовить навеску содержащую 30 г. акриламида и 0,8 г. бисакриламида. Растворить в 100 мл деионизованной воды. Раствор нагреть до 40 - 60 0 С, периодически перемешивая. Полученный раствор хранить не более 3-х месяцев при 40С в темноте. 2. Приготовить 4Х буфер для разделяющего геля (1,5 М Tris-HCl, pH 8.8) Подготовить навеску 18,5 г. Tris и растворить ее в 75 мл деионизованной воды. Довести pH полученного раствора с помощью концентрированной соляной кислоты до значения 8,8. После этого довести объем полученного раствора до 100мл. Полученный раствор хранить не более 3-х месяцев при 40С в темноте. 3. Приготовить4Х буфер для концентрирующего геля (0,5 М Tris-HCl, pH 6,8). Подготовить навеску 1,5 г. Tris и растворить ее в 20 мл деионизованной воды. Довести pH полученного раствора с помощью концентрированной соляной кислоты до значения 6,8. После этого довести объем полученного раствора до 25 мл. Полученный раствор хранить не более 3-х месяцев при 40С в темноте. 4. Приготовить 10% SDS (додецилсульфа натрия, ДСН).Приготовить навеску 5 г. SDS и растворить ее в 100 мл деионизованной воды. Полученный раствор хранить не более 6хмесяцев при комнатной температуре. 5. Приготовить 10% раствор PSA (персульфата аммония). Подготовить навеску 0,1г. персульфата аммония и растворить ее в 1 мл деионизованной воды. Полученный раствор использовать немедленно сразу после приготовления. 6. Приготовить 2Х буфер для образцов (0,125М Tris-HClpH 6,8, 4% SDS, 20% глицерин, 0,2М ДТТ, 0,02% бромфеноловый синий, pH 6,8). Подготовить растворы содержащие а) 2,5мл 4Х кратного буфера для концентрирующего геля Tris-HCl, pH 6.8. б) 4 мл 10% SDS в) 2 мл глицерина г) 2 мг бромфенолового голубого д) 0,31г. ДТТ 90 Довести объем полученной смеси деионизованной водой до 10мл. Буфер хранить при -200С не более 6 месяцев. 7. Приготовить электродный буфер (0,025М Tris-HCl, 0,192М Глицин, 0,1% SDS, pH 8,3) Приготовить навеску содержащую 7,7 г. Tris, 36,03 г. глицина и 2,5 г. SDS и растворить ее в 2 л деионизованной воды. Довести pH полученного раствора с помощью концентрированной соляной кислоты до значения 8,3. После этого довести объем полученного раствора до 2,5л. Полученный раствор хранить не более 1-го месяца при комнатной температуре. Ход работы: I. Подготовка стеклянных пластин для заливки электрофорезного геля. 1. Для приготовления электрофорезного геля выберите две стеклянные пластинки - с вырезом и без выреза. Поместите стеклянную пластинку с вырезом на ровную горизонтальную поверхность и поместите по ее краям два спейсера. Сверху положите на спейсеры стеклянную пластинку без выреза. Осторожно переместите стеклянные пластинке в вертикальное положение и поставьте на горизонтальную поверхность. Обратите внимание, чтобы отсутствовал зазор между спейсерами и горизонтальной поверхностью. С помощью зажимов зафиксируйте стеклянные пластинки с находящимися между ними спейсерами. 2. Поместите зафиксированные стеклянные пластинки с находящимися между ними спейсерами на заливочный столик таким образом, чтобы расплавленный агар находился между стеклянными пластинами. Выждите 10-15 минут пока агар застынет. II. Приготовление геля 1.Для приготовления разделяющего геля смешать компоненты (за исключением ТЕМЕД и PSA) в соответствии с данными приведенными в таблице 4.2 (толщина геля и концентрация геля). Полученную смесь тщательно перемешать. 2. Добавить последовательно ТЕМЕД и PSA и тщательно перемешать полученный раствор важно, чтобы в процессе перемешивания не образовались пузырьки с газом. 3. Полученным раствором разделяющего геля залить пространство между пластинами таким образом, чтобы уровень не превышал 3 см от верхнего края пластин. 4. Осторожно наслоить на раствор разделяющего геля тонкий слой этанола и оставить гель застывать (до 30 минут). 5. 6. Приготовить Удалить раствор слой концентрирующего этанола с геля поверхности как указано застывшего в таблице разделяющего 4.3. геля. 7. Наслоить на поверхность застывшего разделяющего геля раствор концентрирующего геля и немедленно после этого вставить гребенку между стеклянными пластинами. 8. Оставить гель застывать в течение 30 минут. III. Подготовка электрофорезной камеры. 91 1. Поставить электрофорезную камеру на ровную горизонтальную поверхность. 2. Удалить пластины с гелем с заливочного столика и закрепить их в электрофорезной камере. 3. Добавить электродный буфер в нижнюю и верхнюю часть электрофорезной камеры так, чтобы уровень электродного буфера на 0,5 см был выше уровня геля. 4. Осторожно удалить гребенку и промойте лунки электродным буфером с помощью шприца. IV. Нанесение образцов и проведение электрофореза. 1. Подготовить образцы растворов белков и смешать их с 2Х буфером для образцов в соотношении 1:1. 2.Прокипятить полученные образцы в водяной бане 2-5 мин. 3. Охладить образцы до комнатной температуры, после чего слегка крутаните на центрифуге (чтобы снять конденсат с крышки и стенок). 4. С помощью дозатора нанести полученные образцы в лунки, образованные с помощью гребенки. 5. Подключить электрофорезную камеру к источнику тока. 6. Электрофорез проводить при постоянном токе - 20 мА для одного геля и 40мА для двух гелей. В этих условиях электрофорез длится 40-50 минут. 7. По достижению маркера нижнего края геля выключить прибор. 8. Удалить пластинки с гелем из электрофорезной камеры. 9. Осторожно вынуть спейсеры, находящиеся между стеклянными пластинками. 10. Отделить гель от стеклянных пластин. V. Окрашивание электрофорезного геля с помощью Кумасси ярко голубого (чуствительность 0,3-1,0 мкг белка). 1.Приготовить раствор для окрашивания (0,025% Кумасси ярко голубой R 250, 40% этанол, 7% уксусная кислота).Растворите в 80 мл этанола 0,05 г кумасси ярко голубого R 250. После этого добавить к полученному раствору 140 мл уксусной кислоты и доведите объем смеси до 0,2 литров с помощью деионизованной воды. Раствор хранится при комнатной температуре не более 6 месяцев. 2.Раствор для проявления 1. (40% этанол, 7% уксусная кислота). Смешать 40 мл этанола с 7 мл уксусной кислоты и доведите объем смеси до 0,1 литра с помощью деионизованной воды. Раствор хранится при комнатной температуре. 3. Раствор для проявления 2. (5% этанол, 7% уксусная кислота). Смешать 50 мл метанола с 70 мл уксусной кислоты и довести объем смеси до 1 литра с помощью деионизованной воды. Раствор хранится при комнатной температуре. V1. Последовательность окрашивания геля с помощью Кумасси ярко голубого R 250. 92 1. Поместить гель в раствор для окрашивания. Окрашивание проводить в течение 2 - 4 часов при медленном перемешивании на шейкере. 2. Удалить раствор для окрашивания и поместить гель в раствор для проявления 1 на 30 мин при медленном перемешивании. 3. Удалить раствор для проявления 1. Поместите гель в раствор для проявления 2 и оставьте гель при медленном перемешивании, пока с геля не исчезнет фон. В процессе проявления геля рекомендуется 2-3 раза менять раствор для проявления 2 для достижения более высокого качества проявки. VII. Проведение сканирования геля Поместить проявленный гель в сканер и отсканировать при разрешении не менее 1200dpi. Вопросы рубежного контроля к модулю 4 1. Что такое хроматография? Охарактеризуйте ее основные виды. 2. В чем принцип метода "молекулярных сит"? 3. На чем основано разделение белков методом электрофореза? 4. Основные красители, используемые для определения концентрации белков? 5. В чѐм особенности хроматографии высокого давления? 6. Опишите основные составные части хроматографа? 7. Что такое коллектор фракций? 8. Что такое ионообменная хроматография? 9. Опишите основные ионообменники? 10. В чѐм заключаются особенности аффинной хроматографии? 11. Что такое активированная агароза, применяемая в аффинной хроматографии? 12. Опишите гидрофобную хроматографию и основные носители? 13. Опишите тонкослойную хроматографию и еѐ применение? 14. В чѐм заключается суть метода фингерпринтинга масс пептидов? 15. Что изучает протеомика? 16. В чѐм заключается масс-спектрометрический метод анализа? 17. Что такое масс-спектрограмма? 18. Опишите принципиальную схему устройства масс-спектрометра? 19. Опишите метод FAB? 20. Какие способы ионизации молекул Вы знаете? 21. Что такое MALDI-ионизация? 22. Какие виды масс-спектрометров существуют? 23. В чѐм особенности применения каждого из вида масс-спектрометра? 93 24. Современные базы данных белков? 25. База данных PDBи SCOP? Тест рубежного контроля к модулю № 4 Выберите один или несколько правильных, по вашему мнению, вариантов ответа и отметьте их любым значком в бланке ответов. 1. При ПААГ-электрофорезе с использованием SDS-Na деление белков происходит: по заряду 3 по молекулярной массе в зависимости от радиуса белковой 2 4 по заряду и молекулярной массе глобулы 2. какие вещества можно фракционировать с помощью изоэлектрического фокусирования: 1 амфотерные 3 гидрофобные 1 2 1 2 высокомолекулярные 4 низкомолекулярные 3. Амфолиты-носители являются: гетерогенной смесью полиакриламидным гелем 3 полиаминокарбоновых кислот поперечно сшитой агарозой 4 4. Для проявления белка после электрофореза гель последовательно обрабатывают раствором красителя, смесью водой, смесью кислоты и 1 3 кислоты и спирта, водой спирта, раствором красителя смесью кислоты и спирта, 2 4 спиртом, кислотой и водой раствором красителя, водой 5. Установите соответствие: А биогели 1 агароза Б сефадексы 2 полиакриламид В сефарозы 3 декстран 6. Установите соответствие: А Катионообменник Б Анионообменник 1 КМ-целлюлоза 2 ДЭАЭ-сефадекс 3 СП-сефадекс 4 ТЭАЭ-целлюлоза Назначение теста и критерий оценки Тест может использоваться для проведения рубежной оценки знаний студентов по модулю 4. Стоимость одного правильного ответа составляет 1 балл. При ответе на 6 баллов, тестируемому выставляется оценка 5; при ответе на 5 баллов, тестируемому выставляется оценка 4; при ответе на 4 балла, тестируемому выставляется оценка 3. 94 Литература 1. Арчаков А.И. Биоинформатика, геномика и протеомика – науки о жизни XXI столетия//Вопр. мед. химии. 2000. № 1. С. 13 – 18. 2. Алейникова Т. Л. Руководство к практическим занятиям по биологической химии / Под. Ред. Северина. М.: МГУ.-2000.- 516 с. 3. Дарбре А. Практическая химия белка. Пер. с англ. - М.: Наука, 1989, 623 с. 4. Дати Ф., Метцманн Э. Белки. Лабораторные тесты и клиническое применение. М.: Лабора, 2007 – 560с. 5. Камышников В. С. Справочник по клинико-биохимической лабораторной диагностике: в.2, т.1. – Мн.: Беларусь, 2000, с. 171-243. 6. Нолтинг Б. Новейшие методы исследования биосистем. – М.: Техносфера, 2005. С. 52 – 75; 184 – 195. 7. Остерман Л. А. Исследование биологических макромолекул. М.: Мир, 1985. – 358с. 8. Остерман Л. А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование (практическое пособие). М.: Наука, 1981, 288 с. 9. Остерман Л. А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. М.: Наука, 1985, 536 с. 10. Примроуз С., Твеймен Р. Геномика: роль в медицине. – М.: БИНОМ, 2008. С. 10 – 84. 11. Сарвилина И.В., Каркищенко В.Н., Горшкова Ю.В. Междисциплинарные исследования в медицине. – М.: Техносфера, 2007. – С. 15 – 56. 12. Семкин Н.Д., Пияков И.В., Воронов К.Е. и др. Перспективы развития времяпролѐтных масс-спектрометров для анализа газовых и пылевых частиц//Прик. физ. 2002. № 2. C. 18 – 25. 13. Сидоров Л.Н. Масс-спектрометрия и определение массы больших молекул//Сорос. обр. журнал. 2000. Т. 6. № 11. С. 41 – 45. 14. Скоупс Р. Методы очистки белков.- М.: МИР. – 1985.- 357 с. 15. Современные методы в биохимии /под ред. Ореховича В.Н. М: Медицина, 1968. С.5-59. 16. Степанов В. М. Молекулярная биология структур и функций белков. М.: МГУ: Наука. – 2005. – 325 с. 17. Сысоев А.А., Артаев В.Б. Времяпролѐтные масс-спектрометры. Учебное пособие. – М.: МИФИ, 1990. С. 82 – 90. 18. Чиркин А. А. Практикум по биохимии. / Минск.: Нов. знания.-2002. - 216 с. 19. Уильямс Б. Уилсон К. Методы практической биохимии. М.: Мир, 1978. – 360с. 95
