Федеральное казенное учреждение здравоохранения
реклама
Федеральное казенное учреждение здравоохранения «Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека На правах рукописи Головинская Татьяна Михайловна БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ СОВЕРШЕНСТВОВАНИЯ ФАГОДИАГНОСТИКИ СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ 03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии) 03.02.03 – микробиология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научные руководители: Куличенко А.Н. доктор медицинских наук, профессор Цыганкова О.И. доктор медицинских наук Ставрополь – 2014 2 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ………………………………………………………. ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ…………………………………………. 1.1 Биологические особенности возбудителя сибирской язвы…… 1.2 Сибиреязвенные бактериофаги и их биологические свойства…………………………………………………………... 1.3 Практическое применение сибиреязвенных бактериофагов…. 1.3.1 Возможность использования бактериофагов для дезинфекции почвенных очагов и лечения сибирской язвы…………………. 1.3.2 Использование бактериофагов в тестах индикации Bacillus anthracis………………………………………………………....... 1.3.3 Идентификационные тесты с применением сибиреязвенных бактериофагов…………………………………………………… 1.4 Способы производства препаратов бактериофага…………….. 1.5 Механизмы фагочувствительности и фагорезистентности штаммов Bacillus anthracis……………………………………… ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Стр. 5 12 12 13 19 19 20 22 25 29 ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ…………………………………… 34 2.1 2.1.1 Материалы……………………………………………………...... Бактериофаги…………………………………………………...... 34 34 2.1.2 Штаммы возбудителя сибирской язвы и близкородственных представителей рода Bacillus…………………………………… Питательные среды……………………………………………… Химические реактивы…………………………………………… Аппаратура……………………………………………………….. Методы исследования…………………………………………… 34 38 38 39 39 2.1.3 2.1.4 2.1.5 2.2 2.2.1 2.2.1.1 2.2.1.2 2.2.1.3 2.2.1.4 2.2.2 2.2.2.1 Методы изучения фенотипических свойств сибирской язвы… Тест на обнаружение капсулы in vitro………………………….. Метод выращивания спор B. anthracis на среде ГладстонаФилдса……………………………………………………………. Приготовление взвесей B. anthracis……………………………. Определение концентрации жизнеспособных спор сибиреязвенного микроба…………………………………………………. Методы размножения и изучения свойств сибиреязвенных бактериофагов…………………………………………………… Метод получения (размножения) бактериофага сибиреязвен- 39 39 40 40 41 41 3 ного Гамма А-26…………………………………………………. 42 2.2.2.2 Метод определения концентрации фаговых частиц…………... 42 2.2.2.3 2.2.2.4 Определение чувствительности культур к специфическим бактериофагам…………………………………………………… Методы оценки специфической активности бактериофагов…. 43 44 2.2.2.5 Метод определения нарастания титра бактериофага (РНФ)…. 45 2.2.3 Методы статистической обработки результатов……………… 46 ГЛАВА 3. РАЗРАБОТКА БИОТЕХНОЛОГИИ ПРОИЗВОДСТВА ПРЕПАРАТА БАКТЕРИОФАГА ДИАГНОСТИЧЕСКОГО СИБИРЕЯЗВЕННОГО ГАММА А-26 ЖИДКОГО……………………….. 3.1 Подбор штамма B. anthracis для размножения сибиреязвенного бактериофага……………………………………………...... 3.2 Разработка оптимальных параметров репродукции бактериофага сибиреязвенного Гамма А-26…………………………. 3.3 Сравнительная характеристика экспериментальнопроизводственных серий бактериофага диагностического сибиреязвенного Гамма А-26 жидкого…………………………… ГЛАВА 4. СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ СИБИРЕЯЗВЕННЫХ БАКТЕРИОФАГОВ………………………………………………………… 4.1 Сравнительная оценка свойств сибиреязвенных бактериофагов, определяющих их пригодность для промышленного производства………………………………………………… 4.2 Определение спектра специфической литической активности сибиреязвенных бактериофагов………………………………… 4.3 Изучение специфичности диагностических бактериофагов Bacillus anthracis…………………………………………………. ГЛАВА 5. ОПТИМИЗАЦИЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ РАЗЛИЧНЫХ СИБИРЕЯЗВЕННЫХ БАКТЕРИОФАГОВ ДЛЯ СОВЕРШЕНСТВОВАНИЯ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ………………………………………………………... 5.1 Изучение возможности использования видоспецифического сибиреязвенного бактериофага R/D-Ph-6 для индикации возбудителя B. anthracis в РНФ……………………………………. 5.1.1 Изучение динамики изменения концентрации B. anthracis и сибиреязвенного бактериофага R/D-Ph-6 при культивировании 47 48 54 64 68 68 75 86 91 91 4 в бульонной культуре…………………………………………….. 92 5.1.2 5.1.3 5.1.4 5.1.5 5.1.6 5.2 5.2.1 5.2.2 Подбор оптимальных условий для получения высоких концентраций бактериофага R/D-Ph-6 при размножении на чистых культурах B. anthracis……………………………………... Испытание специфической активности бактериофага R/D-Ph-6 в РНФ на различных штаммах сибиреязвенного микроба…………………………………………………………... Изучение специфичности бактериофага R/D-Ph-6 в РНФ на различных штаммах сапрофитных представителей рода Bacillus……………………………………………………………. Изучение специфической активности бактериофага R/D-Ph-6 в РНФ в смешанных культурах……………………… Изучение специфической активности бактериофага R/D-Ph-6 в РНФ на пробах из объектов окружающей среды… Изучение возможности повышения эффективности фагодиагностики сибирской язвы при комплексном использовании бактериофагов с различным литическим спектром…………… Выделение фагорезистентных сибиреязвенных культур и определение их чувствительности к различным бактериофагам…………………………………………………….. Разработка оптимальной схемы комплексного применения сибиреязвенных бактериофагов с различным спектром специфической активности для идентификации и фаготипирования штаммов B. anthracis………………………………………... ЗАКЛЮЧЕНИЕ………………………………………………….. 95 97 99 100 102 103 103 108 115 СПИСОК сокращений и условных обозначений……………… 129 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ………………………………………. 130 5 ВВЕДЕНИЕ Актуальность темы исследования. В Российской Федерации практически ежегодно регистрируется заболеваемость людей и животных сибирской язвой, которая так же как во всем мире не имеет тенденции к снижению [Бургасов П.Н. с соавт., 1970; Бургасов П.Н., Рожков Г.И., 1984; Маринин Л.И. с соавт., 1999; Рязанова А.Г. с соавт., 2011; 2012; Онищенко Г.Г. с соавт. 1999, 2012; Куличенко А.Н. с соавт., 2012; Антюганов С.Н. с соавт., 2012, 2012а; Еременко Е.И. с соавт., 2010, 2013]. Опасность сибирской язвы в первую очередь связана с тяжестью течения заболевания людей и животных, высокой летальностью, значительностью экономических затрат на лечение больных и проведение противоэпидемических и противоэпизоотических мероприятий. Другим аспектом этой проблемы является длительная выживаемость B. anthracis в споровой форме в окружающей среде, что приводит к формированию стойких почвенных очагов. Составленный «Кадастр стационарно неблагополучных по сибирской язве пунктов Российской Федерации» содержит сведения о местонахождении 36091 стационарно неблагополучных пунктов с почвенными очагами сибирской язвы [Кадастр…М., 2005, Маринин Л.И., 2008], значительная часть которых находится на юге РФ [Хотько Н.И., 1994; Киреев Ю.Г. с соавт., 1996, Еременко Е.И. с соавт., 1996; Агапов В.А. с соавт., 1997; Петров С.П. с соавт., 1997; Петрюк В.А. с соавт., 1997; Куличенко А.Н. с соавт., 2010; Буравцева Н.П. с соавт., 2011, 2011а, 2012; Мезенцев В.М. с соавт., 2012; Антюганов С.Н. с соавт., 2012]. Степень разработанности темы исследования. В настоящее время для проведения теста на фагочувствительность при идентификации культур B. anthracis, в Российской Федерации производится бактериофаг сибиреязвенный R/D-Ph-6 в виде фаг-тест-набора «Оболенск R1» для медицинского применения (ФБУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии», г. Оболенск) и бактериофаг сибиреязвенный Fah-ВНИИВВиМ – для ветеринарно- 6 го применения (ГНУ Всероссийский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии Российской академии сельскохозяйственных наук, г. Покров). Бактериофаги, применяющиеся для идентификации культур B. anthracis, обладают различным спектром специфической литической активности и неодинаковой специфичностью [Левина Е.Н., Архипова В.Р., 1967; Ипатенко с соавт., 1989; Васильев П.Г. с соавт., 1999; Цыганкова О.И., 2007; Саяпина Л.В., с соавт., 2011]. В связи с этим идет постоянный поиск новых бактериофагов, оптимальных по указанным свойствам. Производство бактериофагов требует максимальной оптимизации технологического процесса с учетом их индивидуальных биологических особенностей, как для обеспечения эффективной репродукции бактериофага, так и для контроля специфической активности и специфичности. Кроме этого, усовершенствование технологии производства преследует цели повышения качества готовой продукции и срока годности препарата, а также уменьшения количества манипуляций в биотехнологической производственной схеме, снижение затрат времени и средств. Ранее был предложен препарат бактериофага сибиреязвенного Гамма А-26 [Солодовников Б.В. с соавт., 1997, 1997а], однако, техническая документация на его производство не была разработана и утверждена. Отсутствие регистрационного удостоверения Федеральной службы по надзору в сфере здравоохранения не позволяло регламентировать его применение для диагностики сибирской язвы. Фаготипирование широко используется как метод изучения индивидуальных особенностей штаммов микроорганизмов [Гремякова Т.А. с соавт., 1999; Сидоренко С.В. с соавт., 2003; Митрохина Е.Н., 2006; Скородумова Д.И., 2007 и др.], но до сих пор этот подход не был разработан для изучения штаммов B. anthracis. Таким образом, очевидна необходимость разработки биотехнологии получения и внедрения в производство сибиреязвенного бактериофага, оптимизации схем анализа для совершенствования фагодиагностики сибирской язвы. Цель исследования – совершенствование фагодиагностики сибирской язвы путем разработки биотехнологии производства препарата «Бактериофаг диагно- 7 стический сибиреязвенный Гамма А-26 жидкий» и схемы комплексного применения сибиреязвенных бактериофагов, обеспечивающей максимальную чувствительность и специфичность анализа. Задачи исследования: 1. Разработать производственную биотехнологию препарата «Бакте- риофаг диагностический сибиреязвенный Гамма А-26 жидкий» с широким спектром специфической активности. 2. Осуществить подбор штаммов B. anthracis с различной чувствитель- ностью к литическому действию сибиреязвенных бактериофагов для производственного контроля специфической активности и штаммов сапрофитов рода Bacillus для подтверждения специфичности препарата «Бактериофаг диагностический сибиреязвенный Гамма А-26 жидкий». 3. Разработать техническую документацию на препарат «Бактериофаг диагностический сибиреязвенный Гамма А-26 жидкий» и внедрить его в практику. 4. Провести сравнительную оценку специфической активности и специ- фичности сибиреязвенных бактериофагов Гамма А-26, ВА-9, К ВИЭВ, R/D-RH-6, Fah-ВНИИВВиМ, Саратов, 186. 5. Экспериментально обосновать выбор сибиреязвенных бактериофагов для идентификации штаммов возбудителя сибирской язвы, для индикации в материале из объектов окружающей среды, а также для комплексного проведения идентификации и фаготипирования штаммов B. anthracis. 6. Оптимизировать параметры проведения теста реакции нарастания титра фага (РНФ) с использованием бактериофага R/D-Ph-6. Оценить специфичность теста при использовании смешанных культур B. anthracis и близкородственных сапрофитов и материала, имитирующего пробы окружающей среды. 7. Разработать схему комплексного применения сибиреязвенных бакте- риофагов с различным спектром специфической активности для совершенствования лабораторной диагностики B. anthracis. 8 8. Разработать схему фаготипирования штаммов сибиреязвенного мик- роба и оценить ее эффективность. Научная новизна исследования. На представительной выборке штаммов B. anthracis (114) и близкородственных представителях рода Bacillus (75) получены новые данные о специфической активности и специфичности сибиреязвенных бактериофагов Fah-ВНИИВВиМ, R/D-Ph-6, Гамма А-26, ВА-9, К ВИЭВ, Саратов и 186. Впервые изучены биологические и диагностические свойства бактериофага 186, не применявшегося ранее для дифференциации B. anthracis от близкородственных сапрофитов, что позволило рекомендовать его использование для комплексного фаготипирования штаммов возбудителя сибирской язвы. Научно обоснован выбор бактериофагов для наиболее достоверной идентификации (100 %) штаммов B. anthracis, в тесте РНФ с целью индикации возбудителя сибирской язвы и для комплексного проведения идентификации и фаготипирования. Определен комплекс бактериофагов, обеспечивающих 100 % чувствительность и специфичность фагодиагностики сибирской язвы. На основе анализа чувствительности к отдельным бактериофагам штаммов B. anthracis и выделенных из их популяции фагорезистентных вариантов впервые разработана схема фаготипирования с применением бактериофагов Гамма А-26 и 186, позволяющая определять фаготип. Теоретическая и практическая значимость работы. Результаты проведенных исследований отражены в следующих технических и методических документах, нашедших применение в научно-исследовательской и практической деятельности учреждения. 1. Нормативная документация на препарат «Бактериофаг диагностический сибиреязвенный Гамма А-26 жидкий»: технические условия (ТУ) 9386-01301897080-2009, пусковой регламент (ПУР) № 01897080-03-09, инструкция по применению. Получено регистрационное удостоверение от Федеральной службы по надзору в сфере здравоохранения № ФСР 2011/10451. 9 2. Методические рекомендации «Комплексное применение сибиреязвенных бактериофагов Гамма А-26 и 186 для идентификации и фаготипирования штаммов Bacillus anthracis», утвержденные директором ФКУЗ Ставропольский противочумный институт Роспотребнадзора, 3 сентября 2013 г., протокол заседания Ученого совета № 8. Налажено производство препарата «Бактериофаг диагностический сибиреязвенный Гамма А-26 жидкий» Результаты исследований используются для чтения лекций и проведения семинарских занятий на курсах повышения квалификации в ФКУЗ Ставропольский противочумный институт Роспотребнадзора. Методология и методы исследования. При подготовке и реализации программы исследования использована методология, базирующаяся на традиционных, адаптированных к специфике поставленных задач, методах. В исследованиях использовали методы: биотехнологические и микробиологические, с последующей современной компьютерной статистической обработкой и научным анализом полученных данных. Положения, выносимые на защиту. 1. Разработанная биотехнология производства бактериофага сибиреяз- венного Гамма А-26 позволяет получать препарат, отвечающий регламентированным требованиям, обеспечивающий идентификацию штаммов сибиреязвенного микроба, различающихся по фенотипическим и генетическим свойствам, и стабильно сохраняющий диагностические свойства в течение гарантийного срока годности. 2. Штаммы возбудителя сибирской язвы различаются по чувствительно- сти к специфическим бактериофагам: 99,1 % исследованных штаммов чувствительны к бактериофагам Гамма А-26, ВА-9, R/D-Ph-6, и только 58,7-65,7 % чувствительны к бактериофагам Fah-ВНИИВВиМ, 186, Саратов, К ВИЭВ. 3. Применение бактериофага R/D-Ph-6 с широким спектром специфиче- ской активности в тесте РНФ с оптимизированными параметрами обеспечивает 10 точность анализа при тестировании смешанных культур и материала, имитирующего пробы окружающей среды в тесте индикации B. anthracis. 4. Разработанная схема комплексного применения бактериофагов Гамма А-26 и R/D-Ph-6 или бактериофага 186, в совокупности лизирующих весь спектр изученных сибиреязвенных штаммов, различающихся по фенотипическим и генетическим свойствам, обеспечивает 100 % чувствительности и 100 % специфичности фагодиагностики сибирской язвы. 5. По чувствительности к бактериофагам Гамма А-26 и 186 штаммы си- биреязвенного микроба разделяются на 3 фаготипа. Степень достоверности и апробация результатов. Результаты исследований получены с использованием современного поверенного оборудования с привлечением статистических методов обработки данных. Материалы диссертации доложены на итоговых научно-практических конференциях ФКУЗ «Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора (Ставрополь, 2012, 2013 гг.). Материалы диссертации были представлены на Всероссийской научной конференции «Проблемы современной эпидемиологии. Перспективные средства и методы лабораторной диагностики и профилактики актуальных инфекций» (Санкт-Петербург, 2009); научно-практической конференции молодых ученых и специалистов научно-исследовательских организаций Роспотребнадзора «Современные технологии обеспечения биологической безопасности» (Оболенск, 2010); Х Межгосударственной научно-практической конференции государств – участников СНГ «Актуальные проблемы предупреждения и ликвидации последствий чрезвычайных ситуаций в области санитарно-эпидемиологического благополучия населения государств-участников СНГ в современных условиях», (Ставрополь, 2010); Юбилейной Всероссийской научной конференции, посвященной 75-летию кафедры общей и военной эпидемиологии и 90-летию со дня рождения академика В.Д. Белякова «Отечественная эпидемиология в XXI веке: приоритетные направления развития и новые технологии в диагностике и профилактике болезней человека» (Санкт-Петербург, 2012); Всероссийской научно-практической конферен- 11 ции с международным участием «Актуальные проблемы болезней общих для человека и животных» (Ставрополь, 2012); XI Межгосударственной научнопрактической конференции «Современные технологии в совершенствовании мер предупреждения и ответных действий на чрезвычайные ситуации в области санитарно-эпидемиологического благополучия населения» (Саратов, 2012); Региональной научно-практической конференции с международным участием «Актуальные вопросы обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия в Причерноморском регионе» (Ставрополь, 2013). Публикации. Основное содержание диссертации отражено в 13 опубликованных работах. Из них: в ведущих рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК – 3 статьи, депонировано – 1 работа, в сборниках научных трудов, материалах научных и научно-практических конференций – 9 статей. Структура и объем работы. Диссертация изложена на 146 страницах компьютерного текста, содержит 33 таблицы и 9 рисунков, состоит из введения, обзора литературы, 4 глав собственных исследований, включающих описание материалов и методов исследований и экспериментальную часть; заключения; выводов. Список литературы включает 147 источников, из них: 98 – отечественных и 49 – зарубежных. 12 ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1 Биологические особенности возбудителя сибирской язвы Сибирская язва – острое инфекционное заболевание животных и человека, вызываемое Bacillus anthracis. Потенциал инфекции поддерживается существованием множества почвенных очагов, которые проявляют себя в течение многих лет периодическими вспышками сибирской язвы у сельскохозяйственных животных и сопутствующими им заболеваниями людей. Ежегодно в мире регистрируется более 20000 случаев сибирской язвы [Caksen Н. et al., 2000]. Применение спор B.anthracis в качестве бактериологического оружия обусловлено легкостью получения, возможностью скрытного применения, высокой эффективностью [Седов А.В. с соавт., 2002]. Возбудитель сибирской язвы B. anthracis, или сибиреязвенный микроб, по данным определителя бактерий Берги [Holt J.G., 1980], относится к классу Schizomycetes, порядку Eubacteriales, семейству Bacillaceae, роду и подроду Bacillus. В связи с тем, что B. anthracis, B. cereus, B. thuringiensis, B. mycoides, B. pseudomycoides, В. weichenstephanensis имеют ряд сходных морфологических и культуральных свойств, а также генетическое родство, их относят к группе Bacillus cereus [Priest F.G.et al., 1988; Turnbull P.C.B., Kramer J.M., 1991; Nakamura L.K., 1998; Lechner S. еt al., 1998]. Все представители группы B. cereus являются почвенными спорообразующими микроорганизмами, но вызывать острую инфекцию у человека и животных способен только B. anthracis. Наиболее близкий к бацилле сибирской язвы вид B. cereus синтезирует энтеротоксин и способен вызывать у людей и животных пищевые токсикоинфекции, кроме того, описаны поражения тканей целого ряда 13 органов, вызванные этим микроорганизмом [Руководство по мед. микроб., 2010; Helgason E.et al., 2000; Willey T.L., Ellar D.J., 2003; O,Donoqhue K., Ellar D.J., 2003]. Принятая у нас в стране схема исследования материала на наличие возбудителя сибирской язвы предусматривает выделение культуры и её идентификацию на основании результатов целого комплекса тестов, в число которых входит и чувствительность к сибиреязвенным бактериофагам. Однако иногда выделяют штаммы B. anthracis, которые по одному или нескольким тестам отличаются от типичных описаний свойств этого микроорганизма. Некоторые штаммы сибиреязвенного микроба отличаются от типичных по морфологии, характеру роста на питательных средах, способности формировать капсулу в специальных условиях, степени вирулентности и некоторым биохимическим свойствам (резистентные к действию сибиреязвенных бактериофагов, устойчивые к антибиотикам, изменена способность продукции протеаз, гемолитических продуктов, щелочной фосфатазы и образование спор). Все это делает идентификацию B. anthracis затруднительной даже при использовании современных бактериологических, биохимических и молекулярно-генетических методов исследования [Обносова Н.В., Шуляк В.П., 1978; Гулый А.А., 1982; Буравцева Н.П. с соавт., 1997; Неляпин Н.М. с соавт., 1986; Еременко Е.И. с соавт., 1992; Цыганкова О.И., 1998; Васильев П.Г. с соавт., 1998; Рязанова А.Г., 2006; Doganay M., Aydin N.,1991; Bradaris N., Punda-Polis V., 1992; Turnbull P.C.B. et al., 2004; Papaparaskevas J. et al., 2004; Okinaka R. еt al., 2006]. Поэтому исследование выделенных штаммов B. anthracis может быть только комплексным, что значительно повышает эффективность идентификации. 1.2 Сибиреязвенные бактериофаги и их биологические свойства Бактериофаги – относящиеся к различным таксономическим группам вирусы, являются внутриклеточными паразитами бактерий, проявляющими значи- 14 тельную видоспецифичность к бактериям-репродуцентам, что и лежит в основе практического интереса к ним со стороны медицинской микробиологии. При исследовании более 160 штаммов B. anthracis из окружающей среды и от больных животных со всего мира более 20 % штаммов оказались устойчиво инфицированными множеством различных индуцибельных профагов [Buck С.A. et al., 1963; Vera T. еt al., 1968; Inal J.H., Karunakaran K.V., 1996; Redmond C. еt al., 1996]. Свободные фаги, способные заражать B. anthracis, также обнаруживали во многих видах окружающей среды, включая сточные воды, шерсть животных, почву и воду вокруг сибиреязвенных трупов или неподалеку от них, а также – почву из неэндемичных районов [Колесов С.Г., 1976; Ипатенко Н.Г. с соавт., 1987; Маринин Л.И. с соавт., 2009; Buck C.A. et al., 1963; Vera T. еt al., 1968; Nagy E. et al., 1976; Odendaal M. еt al., 1991; Inal J.H., Karunakaran K.V., 1996; Redmond C. еt al., 1996; Walter M.N., Baker D.D., 2003]. Сибиреязвенные бактериофаги изучались многими исследователями. E.W. McCloy [1951] выделила фаг W из штамма B. cereus W (ATCC 11950) и установила, что он довольно специфичен для B. anthracis, хотя и инфицирует несколько штаммов B. cereus. Фаг Гамма () был выделен E.R.Brown и W.B. Cherry [1955] как вариант фага W, образовавшийся после повторного инфицирования штамма B. cereus W лизатом фага W. Он обладал уникальной способностью лизировать как капсульные, так и бескапсульные штаммы, а также лизогенные по фагу W штаммы B. anthracis, но не лизировал культуры B. cereus. Другой фаг B. anthracis, названный фагом Cherry использовался для идентификации сибиреязвенного микроба, хотя и реже, однако его родство с фагом Гамма оставалось неизвестным. Определение нуклеотидных последовательностей этих фагов позволило установить их общее происхождение. Геномы фагов оказались идентичными, за исключением трех вариабельных локусов, которые были гетерогенными у фагов Cherry, W, Fah, а так же у индивидуальных препаратов фагов [Fouts D.E. et al., 2006]. 15 В 1961 году Е.В. Груз выделила из почвы г. Кишинева высокоспецифичный бактериофаг ВА-9. Сравнительные испытания сибиреязвенных бактериофагов Е, L7, W и ВА-9 в отношении 52 штаммов возбудителя сибирской язвы и 43 близкородственных спорообразующих сапрофитов, показали их полную идентичность, что позволило автору рекомендовать их для лабораторной диагностики сибирской язвы. В 1962 году А.Я. Мещеряковым был выделен сибиреязвенный фаг К ВИЭВ [Маринин Л.И. с соавт., 2009]. Н.Г. Ипатенко с соавт. [1989] исследовали литическую активность сибиреязвенных бактериофагов К ВИЭВ и Гамма МВА на 244 штаммах B. anthracis и 23 штаммах спорообразующих сапрофитов. Специфическая активность бактериофагов составила 95 %, специфичность – 100 %. Исследования показали, что сибиреязвенные бактериофаги К ВИЭВ и Гамма МВА являются высокоспецифичными препаратами. В.С. Ларина и Л.С. Петрова в 1964 сообщили о выделении специфического фага «Саратов». Изучению биологических свойств бактериофага «Саратов» посвящено исследование И.Н. Земцовой [1965, 1965а]. Диапазон литического действия и специфичность сибиреязвенного бактериофага «Саратов» были проверены на 58 штаммах сибиреязвенного микроба и 94 штаммах почвенных аэробных спорообразующих сапрофитов. Бактериофаг вызывал лизис всех испытанных сибиреязвенных культур, а из 94 штаммов сапрофитов оказался чувствительным к фагу только один штамм B. cereus, лизис которого проявлялся слабо и непостоянно. При анализе клеточного состава популяции данного штамма выявлено, что отдельные клетки его обладали резистентностью к действию фага. Препарат сибиреязвенного бактериофага «Саратов» был выпущен только в экспериментальных сериях. В 1967 г. при изучении музейных сибиреязвенных культур, на Туркменской противочумной станции, был изолирован сибиреязвенный бактериофаг, обозначенный 186, что соответствовало порядковому номеру культуры. Штамм 186, выделенный Марыйским противочумным отделением из пыли на шерстомойной 16 фабрике в 1963 г., обладал свойствами антракоида. Диагностические характеристики этого бактериофага были изучены недостаточно полно. В результате опытов установлено, что фаг оказывал литическое действие на преобладающее большинство (91,5 %) испытанных 46 музейных штаммов возбудителя сибирской язвы и вакцинный штамм B. anthracis СТИ. Антракоиды не лизировал [Жеглова Д.В., 1972]. Наиболее детально сибиреязвенные фаги исследовали Е.Н. Левина и В.Р. Архипова [1967]. С целью испытания литических свойств бактериофагов ВА-9, Саратов, , С, и L7 были использованы 50 сибиреязвенных штаммов различной вирулентности, выделенных из разных источников, а также 83 штамма спорообразующих аэробов. Наиболее широким спектром литического действия обладали фаги и ВА-9. Остальные бактериофаги не лизировали от 14 до 22 % сибиреязвенных штаммов. Вместе с тем эти фаги не обусловливали неспецифического лизиса штаммов из группы спорообразующих аэробов, в то время как под влиянием фагов и ВА-9 наблюдалось неспецифических реакций 5 % и 3-8 % соответственно. По результатам изучения специфической активности шести сибиреязвенных бактериофагов (, С, ВА-9, L7, Саратов, К ВИЭВ) И.И. Павлова [1971] пришла к выводу о наиболее широком спектре литической активности бактериофага К ВИЭВ. Более широкое применение для идентификации штаммов B. anthracis нашли сибиреязвенные бактериофаги К ВИЭВ, Гамма МВА, ВА-9, Fah-ВНИИВВиМ, ВА-104, 3-БК2, Саратов, W и другие [Земцова И.Н., 1965; Преснов И.Н., 1966; Коротич А., Погребняк Л.И., 1976; Brown E.R., Cherry W.B., 1955]. В 1996 г. был выделен новый бактериофаг из культуры B. thuringiensis var. Kurstaki (ВТ Н3). Предварительные исследования показали, что он лизирует вирулентные и вакцинные штаммы B. anthracis, а также штаммы большинства серотипов B. thuringiensis [Исангалин Ф.Ш. с соавт., 2000]. Вследствие того, что данный 17 бактериофаг лизирует штаммы близкородственных сапрофитов, он является непригодным для идентификации штаммов возбудителя сибирской язвы. Предложенный бактериофаг Fah-ВНИИВВиМ, разработанный во Всесоюзном научно-исследовательском институте ветеринарной вирусологии и микробиологии, по данным авторов, лизировал не менее 98 % исследованных сибиреязвенных штаммов и не взаимодействовал с другими видами бацилл [Бакулов И.Ф. с соавт., 2001]. В настоящее время, бактериофаг Fah-ВНИИВВиМ производится во ГНУ «Всероссийский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии» Российской академии сельскохозяйственных наук для индикации и идентификации возбудителя сибирской язвы. Специфичный для сибиреязвенного микроба бактериофаг AP50 был выделен из почвы с использованием штамма репродуцента B. anthracis Sterne [Nagy Е., 1974; Nagy E., Pragai B., Ivanovics G., 1976; Ackermann H.-W. еt al., 1978]. Изучение литических свойств бактериофага AP50с выявило, что из 115 штаммов сибиреязвенного микроба бактериофаг AP50с лизировал 111штаммов B .anthracis (97 %) и ни одного из 100 штаммов B. cereus. Сравнительное исследование литических свойств бактериофагов AP50с и показало, что только 4 из 115 были устойчивы к AP50с, когда 10 из 115 устойчивы к . Девять из 10 штаммов резистентных к инфекции фагом , были чувствительны к лизирующему действию бактериофага AP50с, а три из 4 штаммов устойчивые к AP50с, были чувствительны к и только один штамм оказался устойчив к обоим фагам [Priest F.G.et al., 2004]. Был выделен вариант бактериофага Гамма А-26, обладающий специфической активностью к более широкому набору штаммов и культуральноморфологических вариантов штаммов B. anthracis – 100 % [Цыганкова О.И. с соавт., 1995; Солодовников Б.В., Пат. РФ № 2171842, опубл. 10.08.2001, Бюл. № 22). Позднее к ним добавились и другие бактериофаги – ФПГ, ФЮИ, ВЛАЗ [Васильев П.Г. с соавт., 1999] . 18 Сравнительные испытания сибиреязвенных бактериофагов продемонстрировали, что фаги ФПГ, ФЮИ и ВЛАЗ обладали более широким спектром литической активности по сравнению с коммерческими диагностическими фагами Гамма МВА и К ВИЭВ. Бактериофаги ФПГ и ВЛАЗ лизировали более 90 % из 632 изученных штаммов B. anthracis, выделенных от больных сибирской язвой людей и их трупов, крупного и мелкого рогатого скота, лошадей и свиней, тогда как Гамма МВА, К ВИЭВ, ВА-9, ФЮИ – менее 88 %. При этом фаги ФПГ и ВЛАЗ не лизировали 62 штамма близкородственных бацилл, в то время как другие фаги были способны лизировать культуры отдельных штаммов близкородственных бацилл. На основании проведенных исследований фаги ФПГ и ВЛАЗ были рекомендованы для широкого использования в практике идентификации B. anthracis [Маринин Л.И. с соавт., 2009] Однако, надо отметить, что их производство не налажено, вследствие чего они не находят применения в практике лабораторной диагностики сибирской язвы. В ГНЦ МПБ, Поповой В.М. получен новый сибиреязвенный бактериофаг R/D-Ph-6, отличающийся высокой специфической литической активностью и видоспецифичностью, лизирующий культуры только сибиреязвенных штаммов [Маринин с соавт., 2009; Дятлов И.А., Пат. РФ № 2351650, опубл. 10.04.2009. Бюл. № 10 (III ч.)]. Спектр литического действия: лизирует 99 % изученных сибиреязвенных штаммов и не проявляет литической активности к 160 штаммам близкородственных бацилл. Бактериофаг не инактивируется при температуре 55 ºС в течение 45 мин. Литическая активность фага не изменяется в пределах рН 5,7-8,0. Таким образом, к настоящему времени выделены в достаточном количестве и изучены различные сибиреязвенные бактериофаги. Детально изучена морфология фаговых частиц, чувствительность к различным агентам физической и химической природы, антигенные свойства различных бактериофагов, кинетика их взаимодействия с микробной клеткой. Существующие бактериофаги различаются по широте спектра лизируемых ими штаммов возбудителя сибирской язвы, а также по специфичности их действия. Следует отметить, что литературные данные о полноте спектра лизируемых культур B. anthracis и специфичности наиболее из- 19 вестных бактериофагов несколько противоречивы, что может быть объяснено использованием различных вариантов бактериофагов, неодинаковой концентрацией фаговых корпускул в препаратах, представительностью выборок культур B. anthracis и близкородственных сапрофитов, а также различиями оценки результатов теста на фагочувствительность. 1.3 Практическое применение сибиреязвенных бактериофагов 1.3.1 Возможность использования бактериофагов для дезинфекции почвенных очагов и лечения сибирской язвы Наличие сибиреязвенных почвенных очагов обусловливает постоянную угрозу возникновения данной болезни среди животных и людей. Обеззараживание почвы – сложный, трудоемкий и экономически затратный процесс. До настоящего времени нет доступного и надежного метода её санации. Исходя из этого, актуальными остаются исследования с целью изыскания таких средств, которые надежно и возможно в более короткие сроки могли бы привести к очистке почвы от возбудителя сибирской язвы. Известна гипотеза об альтернативном размножении возбудителя сибирской язвы в почве в естественных очагах, скотомогильниках, особенно на богатых черноземных почвах. Поэтому в дополнение к вакцинации может быть предложен способ профилактики подавления численности вегетативной формы возбудителя сибирской язвы путем внесения сибиреязвенного бактериофага в очаги [Исангалин Ф.Ш. с соавт., 2000; Дятлов И.А. с соавт., 2012]. В настоящее время сибиреязвенные бактериофаги рассматриваются в качестве основы биологического дезинфицирующего препарата по отношению к возбудителю сибирской язвы [Озеров М.Ю. с соавт., 2011; Попов В.Г., Пат. РФ № 2412769, опубл. 27.02.2011, Бюл. № 6 (II ч); Попов В.Г., Пат. РФ № 2413539, опубл. 10.03.2011, Бюл. № 7 (II ч)]. 20 Наличие штаммов B. anthracis в различной степени резистентных в опытах in vitro к ряду антибиотиков, применяющихся для лечения и профилактики сибирской язвы [Odendaal М.et al., 1991; Cieslak T.J., Eitzen E.M., 1999], а также наличие риска развития реакций на антибактериальные препараты, особенно при длительном приеме, позволяет считать перспективным направлением в поиске эффективных средств лечения сибирской язвы применение вирулентных сибиреязвенных бактериофагов [Попов В.Г. с соавт., 2006]. По мнению авторов в лечебных целях могут использоваться лишь бактериофаги, обладающие широким спектром литической активности, высокой степенью репродуктивности и стабильности. При этом предпочтительным является использование комбинаций нескольких бактериофагов, имеющих различия в механизмах взаимодействия с бактериальной клеткой, что должно существенно снизить возможность отбора и накопления фагорезистентных вариантов в популяции возбудителя. В свете указанных перспектив весьма важным и недостаточно изученным представляется вопрос чувствительности к литическому действию бактериофагов культур возбудителя сибирской язвы в капсульной форме в условиях in vivo или при культивировании in vitro в специальных условиях, обеспечивающих образование капсулы. Литературные данные по этому вопросу противоречивы. 1.3.2 Использование бактериофагов в тестах индикации Bacillus anthracis Сибиреязвенный бактериофаг нашел широкое применение в качестве индикатора культур B. anthracis. Для индикации возбудителя сибирской язвы используют следующие методы: реакция нарастания титра фага (РНФ), реакция адсорбции фага (РАФ), фаготетразоловый метод (ФТМ) и люминесцентно-серологический метод (ЛЮМ). 21 Реакция нарастания титра фага [Тимаков В.Д. Гольдфарб Д.М, 1956] – метод позволяет выявлять возбудителя непосредственно в исследуемом материале без выделения чистой культуры. Сущность метода заключается в том, что если в исследуемом материале присутствует искомый возбудитель, то добавленный к такому материалу гомологичный бактериофаг с коротким циклом внутриклеточного развития, вступив во взаимодействие с ним, размножится и последующее увеличение концентрации (повышение титра) свободного внеклеточного фага укажет на присутствие в исследуемом материале гомологичного возбудителя. Реакция адсорбции фага [Ломов Ю.М., 1967] – метод позволяет выявлять споры и вегетативные формы возбудителя сибирской язвы в смывах с объектов внешней среды и почвы, без выделения чистой культуры. В основу предложенной реакции положен специфический процесс адсорбции фага на бактериальных клетках, который легко регистрируется с помощью антифаговой сыворотки или раствора новэмбихина в дистиллированной воде. Реакция обладает сравнительно высокой чувствительностью и дает возможность исследования смывов, загрязненных посторонними бактериями или не бактериальными примесями. Фаготетразоловый метод [Королев Н.И., 1970] – метод может быть использован для исследования проб воздуха, воды, почвы, смывов с поверхностей различных предметов; для идентификации выделенных культур. ФТМ основан на использовании выраженной избирательности литического действия бактериофагов в отношении гомологичных культур микробов, которое регистрируется по изменению активности дегидраз с помощью солей тетразолия. Реакцию учитывают косвенным путем по изменению цвета индикатора метилтиазолилтетразолия, указывающего на наличие окислительно-восстановительных ферментов типа дегидрогеназ, образующихся в процессе роста клеток бактерий, и отсутствие их в результате лизиса клеток специфическим бактериофагом. Метод предусматривает использование фага с коротким циклом развития. 22 Люминесцентно-серологический метод с использованием системы фаг – флуоресцентный антифаг(непрямой метод) – основан на использовании явления специфической адсорбции частиц сибиреязвенного фага на клетках чувствительного гомологичного микроба, специфической реакции их антифаговой флуоресцирующей сывороткой и последующим выявлением возбудителя путем люминесцентной микроскопии. Специфическое свечение бактериальных клеток в препаратах, обработанных системой фаг – люминесцирующий антифаг, указывает на наличие в исследуемом материале возбудителя сибирской язвы [Колесов С.Г., 1976]. Этот тест обладает высокой чувствительностью и специфичностью. 1.3.3 Идентификационные тесты с применением сибиреязвенных бактериофагов Ведущее место в определении заболеваемости животных и человека принадлежит своевременной и точной диагностике болезни, основным звеном которого является правильная идентификация возбудителя. Фагодиагностика основана на специфической способности фагов взаимодействовать с определенными видами бактерий в результате чего происходит их лизис. Особенно важным является тот факт, что фаг лизировал пенициллиноустойчивые варианты, которые не давали феномена «жемчужного ожерелья» [Земцова И.Н., 1965]. Для идентификации возбудителя сибирской язвы используют следующие методы: чашечный (спот-тест), «стекающей капли», пробирочный, микрометод. Наиболее простыми и часто употребляемыми методами являются: чашечный и метод «стекающей капли», которые применяются в работе с чистыми микробными культурами. Чашечный метод: На чашку Петри с питательным агаром высевают 5-6часовую бульонную культуру (концентрация должна быть достаточной для фор- 23 мирования бактериального газона). Затем их подсушивают в термостате (36±1) ºС, после чего пипеткой наносят фильтрат фага. Результаты учитывают через 5-6 ч инкубации при (36±1) ºС просмотром под малым увеличением (х8). Лучше производить учет в более поздние сроки – через 16-24 ч невооруженным глазом. Результат, согласно методическим указаниям [МУК 4.2.2413-08], оценивают визуально по четырехкрестовой системе. Метод «стекающей капли»: На поверхность скошенного агара, в пробирках, наносят по одной капле исследуемой культуры. Каплю равномерно распределяют по всей поверхности агара и пробирки ставят в термостат. При температуре (36±1) ºС на 15 мин. Затем в пробирки вносят по одной капле неразведенного бактериофага и пробирки вновь ставят в термостат на 6-18 ч. Предварительный учет результатов проводят через 6-8 ч, окончательный – через 18 ч. Если испытуемая культура сибиреязвенная, то по ходу стекающей капли не будет роста исследуемой культуры. Если «дорожки» нет, то испытуемая культура не сибиреязвенная. Пробирочный метод: Дрожжевой бульон разливают в пробирки. В первую и четвертую пробирки вносят бактериофаг, который титруют, перенося его из первой во вторую. Затем в три первые пробирки вносят взвесь испытуемой культуры. Третья пробирка служит контролем культуры, а четвертая – контролем бактериофага. Результаты определяют через 4-6 ч инкубирования в термостате. Если в культуре содержится возбудитель сибирской язвы, то в третьей пробирке обнаруживается ее рост, тогда как в первых двух он отсутствует – среда остается прозрачной. Четвертая пробирка всегда должна быть прозрачной. Микрометодом исследуют чистые микробные культуры различного возраста, в том числе и споровые, а также свежий патологический материал. Исследование проводят в чашках Петри с дрожжевым или мясо-пептонным агаром, с добавлением 0,4 % раствора генцианвиолета. Чашки подсушивают в термостате 2-3 ч. Подсушенную поверхность агара разделяют горизонтальными и вертикальными линиями на три участка в каждом ряду. Каждый ряд участков по вертикали нумеруют и используют для исследования одной микробной культуры. 24 На три участка одного вертикального ряда по одной бактериологической петле наносят подготовленный к исследованию материал и подсушивают 5 мин. Затем на два первых участка наносят по одной капле бактериофага и, покачиванием распределяют его по всей поверхности в пределах границ участка. Третий горизонтальный ряд служит контролем исследуемой культуры или пробы. Чашки подсушивают 10-15 мин при комнатной температуре, затем заворачивают в бумагу и крышками вниз помещают в термостат при (36±1) ºС. Оценка результатов: если на участках с фагом отмечается лизис, то исследуемая культура содержит возбудителя сибирской язвы. В одном из недавних исследований была показана возможность использовать литический цикл репликации высокоспецифичного фага Гамма для непрямого обнаружения B. anthracis. Потомство фага Гамма воспроизводится только при наличии подходящего хозяина, поэтому выявление возросших концентраций, или размножения потомства фага Гамма предполагает присутствие жизнеспособных клеток B. anthracis. Были разработаны и экспериментально проверены на способность обнаруживать жизнеспособные клетки B. anthracis четыре уникальных, основанных на использовании фага Гамма, непрямых метода исследования для детекции сибиреязвенного микроба при помощи ПЦР в режиме реального времени, MALDI-TOF масс-спектрометрии и двух разных компактных иммунохроматографических устройств. ПЦР в реальном времени регистрировала нарастание количества ДНК фага Гамма вследствие размножения фага и тем самым непрямым образом позволяла определить начальную концентрацию, начиная с 4 клеток B. anthracis, менее чем за пять часов [Reiman R.W., 2007]. В последние годы появился ряд исследований, посвященных использованию для идентификации B. anthracis вместо бактериофагов фаговых белков – лизинов, которые также способны специфически лизировать сибиреязвенный микроб [Schuch R., 2002; Yoong P., 2006; Kikkawa M.S., 2008]. Разработан и запатентован метод количественного определения резистентности популяционного состава штаммов B. anthracis к сибиреязвенным 25 бактериофагам [Цыганкова О.И., Пат. РФ № 266963, опубл. 27.12.2007, Бюл. № 36; Цыганкова О.И. с соавт., 2008]. Суть метода заключается в обработке препаратом одного из сибиреязвенных бактериофагов посевов спор на питательных средах перед инкубацией, где контролем служат аналогичные посевы, не обработанные бактериофагами. Этот чувствительный метод позволяет определить непосредственно в споровой взвеси процентное содержание микробных особей резистентных к действию любого из сибиреязвенных бактериофагов и выделить их для дальнейших исследований их фенотипических и генетических свойств. При исследовании могут встречаться существующие в природе лизогенные штаммы возбудителя сибирской язвы, устойчивые к диагностическому бактериофагу. Окончательную идентификацию таких фагорезистентных штаммов проводят путем испытания их на лизогенность и на основании результатов полной схемы идентификации. Таким образом, благодаря своему специфическому литическому действию на B. anthracis сибиреязвенные бактериофаги являются необходимым средством для проведения одного из регламентированных тестов идентификации культур при проведении лабораторной диагностики сибирской язвы и обнаружении ее возбудителя в объектах окружающей среды. В перспективе высоковирулентные сибиреязвенные бактериофаги могут быть использованы для деконтаминации объектов окружающей среды от возбудителя сибирской язвы, включая споры, а возможно, и в лечебных целях. 1.4 Способы производства препаратов бактериофага Производство сертифицированных коммерческих препаратов, в том числе и диагностических бактериофагов, для диагностики инфекционных заболеваний и обнаружения их возбудителей в объектах окружающей среды подчиняется строго регламентированной в технической документации биотехнологической схеме, 26 включающей все стадии процесса от подготовительных этапов до сдачи готовой продукции на склад. Основной этап получения препарата предусматривает ряд последовательно осуществляемых процессов, включая получение бактериальной культуры размножения, ее инокуляцию производственным бактериофагом, получение фаголизата, его очистку от бактериального детрита, стабилизацию и проверку диагностических свойств – специфической активности и специфичности. Наиболее значимыми в разработке биотехнологии производства препаратов конкретных бактериофагов являются параметры, зависящие от их индивидуальных биологических особенностей. Все описанные в литературе схемы получения сибиреязвенных бактериофагов содержат разработки авторов по подбору оптимальных штаммов размножения, что влияет на параметры получения культуры для репродукции. Практически во всех литературных источниках описание процесса получения бактериофагов не только, приводятся конкретные штаммы B. anthracis, но и указывается, что были отобраны наиболее чувствительные клоны или были использованы хорошо известные авирулентные штаммы [Земцова И.Н., 1965; Кузьмин Н.А., Комаров Б.А., 1967; Ипатенко Н.Г., 1987; Цыганкова О.И., Пат. РФ № 2133273, опубл. 27.07.1999, Бюл. № 20; Солодовников Б.В., Пат. РФ № 2171842, опубл. 10.07.2001, Бюл. № 22; Дятлов И.А., Пат. РФ № 2351650, опубл. 10.04.2009, Бюл. 10 (III ч.)]. Практически во всех схемах получения препаратов бактериофагов используются среды на основе ферментативных переваров мяса – мясопептонный бульон и агар, бульон и агар Хоттингера, обеспечивающие интенсивный рост штамма размножения B. anthracis, и как следствие эффективную репродукцию бактериофага [Земцова И.Н., 1965; Кузьмин Н.А., Комаров Б.А., 1967; Ипатенко Н.Г., 1987; Цыганкова О.И., 1999; Солодовников Б.В., 2001; Дятлов И.А., 2009]. В качестве добавок улучшающих ростовые качества питательной среды для размножения культуры-репродуцента чаще всего используется дрожжевой экстракт, глюкоза, триптофан [Кузьмин Н.А., Комаров Б.А., 1967; Ипатенко Н.Г., 1987; Цыганкова О.И., 1999; Солодовников Б.В., 2001; Дятлов И.А., 2009] и мине- 27 ральные соли (хлористый кальций, хлористый магний, сульфат магния), катионы которых повышают эффективность адсорбции фаговых частиц на поверхности бактериальных клеток [Кузьмин Н.А., Комаров Б.А., 1967; Цыганкова О.И., 1999; Солодовников Б.В., 2001; Дятлов И.А., 2009]. Количество стадий в подготовке культуры штамма-репродуцента может быть различным. Некоторые авторы предлагают предварительно получать вегетативную культуру на плотной питательной среде, которая смывается питательным бульоном [Кузьмин Н.А., Комаров Б.А., 1967], физиологическим раствором [Ипатенко Н.Г., 1987;] или синтетической питательной средой [Солодовников Б.В., 2001] и используется для получения фаголизата. Другая группа способов предусматривает получение жидких культур штамма размножения B. anthracis, контаминируя жидкие питательные среды непосредственно спорами с последующим получением 3-6-часовых культур, после чего вносится препарат бактериофага [Цыганкова О.И., 1999; Солодовников Б.В., 2001; Дятлов И.А., 2009]. Следует отметить, что концентрация фаговых частиц в фаголизате во всех случаях составляла 1×109-1×1010 БОЕ/мл и применение длительного многоступенчатого процесса фаголизата не оказывало существенного влияния на этот показатель, в то время, как большое количество манипуляций с культурой размножения при переносе из жидкой питательной среды на дрожжевой агар, приготовление взвеси под стандарт мутности с последующим засевом в мясопептонный бульон [Ипатенко Н.Г., 1987] повышает потенциальную возможность контаминации продукта производства посторонней микрофлорой. На этапе получения культуры размножения часто используется аэрация культуры [Земцова И.Н., 1965; Цыганкова О.И., 1999; Солодовников Б.В., 2001; Дятлов И.А., 2009], что значительно в конечном итоге повышает выход фаговых частиц [Земцова И.Н., 1965]. Учитывая, что описанные биотехнологические схемы разработаны для получения различных сибиреязвенных бактериофагов – «Саратов», «К»-ВИЭВ, «Гамма» МВА, «Гамма А-26», «Bacillus anthracis R/D-Рh-6». Следует отметить, что биологические особенности самих бактериофагов и штаммов-репродуцентов 28 обусловливают вариацию таких параметров, как инокулирующая доза штамма размножения и время предварительного подращивания, заражающая доза производственного бактериофага и продолжительность этапа получения фаголизата. Дозировка штамма размножения колеблется от относительных показателей – «три бактериологические петли на 100 мл питательной среды» [Солодовников Б.В., 2001] или «смытую 5 мл перевара Хоттингера с агарового косяка вносят в 35 мл питательной среды» [Кузьмин Н.А., Комаров Б.А., 1967] до конкретных концентраций 6×106-1×107 спор в 1 мл питательной среды [Цыганкова О.И., 1999; Дятлов И.А., 2009]. Использование вегетативной культуры при посеве в жидкую питательную среду позволяет одновременно вносить бактериофаг [Кузьмин Н.А., Комаров Б.А., 1967; Солодовников Б.В., 2001], в то время как при использовании штамма B. anthracis размножения в виде спор, производственный бактериофаг вносится после 4-6 ч предварительной инкубации в условиях аэрации [Цыганкова О.И., 1999; Дятлов И.А., 2009], что позволяет получить «молодую» культуру с высокой концентрацией бактериальных клеток. Заключительный этап непосредственного получения препарата – очистка фаголизата от бактериального детрита и живых бактерий включает последовательно центифугирование, а затем стерилизующую фильтрацию супернатанта через фильтры Зейтца или мембранные фильтры [Земцова И.Н., 1965; Кузьмин Н.А., Комаров Б.А., 1967; Дятлов И.А., 2009], или ограничивается фильтрацией [Ипатенко Н.Г., 1987; Цыганкова О.И., 1999; Солодовников Б.В., 2001]. После определения нормативных показателей полученного препарата, производят розлив в ампулы и их опай [Солодовников Б.В., 2001; Дятлов И.А., 2009]. Некоторые биотехнологические схемы предусматривают лиофильное высушивание препарата [Солодовников Б.В., 2001], что по данным авторов увеличивает срок годности готового препарата. Важным разделом схемы биотехнологии препаратов бактериофагов является выбор оптимального набора тест-штаммов B. anthracis близкородственных сапрофитов, достаточного для объективной оценки таких ключевых показателей 29 каждой получаемой серии препарата, как специфическая активность и специфичность. 1.5 Механизмы фагочувствительности и фагорезистентности штаммов B. anthracis Результат воздействия на бактериальные клетки специфических бактериофагов может проявляться в виде феномена фагочувствительности или фагорезистентности в зависимости от сочетания индивидуальных особенностей взаимодействующих бактерий и бактериофагов. Неодинаковая чувствительность отдельных штаммов бактерий одного вида к специфическим бактериофагам представляет интерес не только с точки зрения надежности теста фаголизабельности в схеме идентификации сибиреязвенных культур, но и как основа метода выделения вариантов с разной чувствительностью к действию бактериофагов, которые могут быть использованы для детального изучения механизмов фагорезистентности. Фаги, как правило, проявляют специфичность в отношении хозяина. По специфичности взаимодействия с клетками различают следующие бактериофаги: поливалентные, взаимодействующие с родственными видами бактерий; моновалентные, взаимодействующие с бактериями одного вида; типовые, взаимодействующие с отдельными вариантами одного вида [Взаимодействие фага с бактериальной клеткой. www.biofile.ru/bio/761.html]. Строгая специфичность позволяет использовать моновалентные бактериофаги для дифференцирования видов; типовые – для фаготипирования. Метод фаготипирования бактерий позволяет не только определить видовую принадлежность исследуемой культуры, но и ее фаготип (фаговар). Фаготипирование имеет большое эпидемиологическое значение т.к. позволяет установить источник и пути распространения инфекции [Медицинская микробиология…, 1994]. Поливалентные бактериофаги не применяют для индикации и дифференциации бактерий ввиду их низкой специфичности. 30 Бактериальные клетки обладают целым рядом функциональных механизмов, направленных на обеспечение защиты от действия бактериофагов. По данным A. Coffey аnd R.P. Ross [2002] можно выделить четыре группы механизмов антифаговой защиты: 1 – ингибирование адсорбции бактериофагов; 2 – блокирование проникновения фаговой ДНК в бактериальную клетку; 3 – системы рестрикции/модификации, обеспечивающие при помощи сайт-специфической эндонуклеазы и метилазы разрушение геномов фагов; 4 – механизмы абортирования фаговой инфекции, которые влияют на репликацию фагового генома, транскрипцию, трансляцию, упаковку фаговой частицы. Системы антифаговой защиты бактерий могут эффективно действовать против нескольких групп фагов [Moineay S., 1999]. Некоторые авторы связывают чувствительность культур к бактериофагам с определенными биологическими свойствами этих штаммов. Механизм резистентности к действию бактериофагов может быть различным. Бактерии обычно развивают устойчивость к определенным фагам, теряя при мутации фаговые рецепторы или изменяя их. Однако потеря некоторых рецепторов не дает защиты от множества других фагов, которые используют иные поверхностные молекулы. Более того, в большинстве случаев фаг может приобретать компенсаторную адаптацию через мутацию в генах белков адсорбции, которая изменяет хвостовые фибриллы так, что они могут узнавать измененные поверхностные клеточные белки или связываться с другим рецептором. Этот путь в целом менее эффективен, чем приобретение устойчивости бактериями, так как при адаптации фагов к новым рецепторам нужно создание нового функционального взаимодействия, тогда как для выработки устойчивости хозяина требуется лишь потеря функции [Lenski R.E., 1984]. Отсутствие S-слоя вегетативной клетки, который служит местом фиксации бактериофагов, и инфицирование бактерий умеренным фагом – все это делает клетку неспособной к адсорбции фага [Буланцев А.Л. с соавт., 1992; Fouet A., 1998]. Умеренные бактериофаги после проникновения в бактерию не разрушают её, так как ДНК фага встраивается в хромосому бактерий и передается по наслед- 31 ству. Такое существование бактерии и умеренного бактериофага называется лизогенией. Лизогенизация бактерий лежит в основе феномена лизогенной или фаговой конверсии, который заключается в приобретении лизогенными бактериями дополнительных свойств. Под действием ультрафиолетового и ионизирующего излучения, химических и других факторов, профаг может превращаться в вирулентную форму, что сопровождается репликацией бактериофагов и лизисом бактерий. А.Л. Буланцев с соавт. [1992] получали фагорезистентные клоны трех штаммов B. anthracis, путем селекции жизнеспособных бактериальных клеток на плотных питательных средах или в бульонных культурах после обработки бактериофагами К ВИЭВ и БФ. Из всех трех штаммов в результате обработки фагом К ВИЭВ получены фагорезистентные к нему клоны, которые сохраняли чувствительность к фагу БФ. После обработки фагом БФ клоны, приобретшие резистентность к нему, оставались чувствительными к фагу К ВИЭВ. Лишь один клон оказался резистентным к обоим фагам. С появлением и совершенствованием новых биохимических и молекулярногенетических методов исследования стало доступно изучение тонких механизмов чувствительности и резистентности бактерий к литическому действию бактериофагов на бактериальные клетки. В настоящее время идентифицирован лизин сибиреязвенного бактериофага Гамма, обладающий ферментативной активностью и специфичностью [Watanabe T. et al., 1975; Schuch R. et al., 2002]. По данным V.А. Fischetti [1971] очищенный с применением двустадийной хроматографии Гамма-лизин в течение трех секунд вызывал резкое (в 5000 раз) уменьшение количества жизнеспособных клеток B. anthracis в жидкой питательной среде и фосфатном буфере. Как отмечает автор, бактерицидная активность по отношению к клеткам B. anthracis, находившимся в крови человека, была значительно ниже. К сожалению, из текста не понятно, была ли вегетативная культура культивирована в крови и могла быть в капсульной форме, или акапсульная вегетативная культура с обычных питательных сред была суспендирована в крови пе- 32 ред постановкой эксперимента. Гамма-лизин был активен по отношению к десяти типичным и пяти моноплазмидным штаммам сибиреязвенного микроба из различных географических регионов. Автором была предпринята попытка изучить литическое действие Гаммализина in vivo, для чего мышей интраперитонеально заражали чувствительным к действию бактериофага Гамма штаммом B. cereus летальным для этих животных. Мыши, которым через 15 минут после инфицирования вводили 100 мг Гаммализина, выжили в 72 %, в отличие от 10 % в контрольной группе. К сожалению, результаты этого исследования нельзя экстраполировать на воздействие Гаммализина на типичные диплазмидные штаммы B. anthracis, которые in vivo, в отличие от B. cereus, образуют капсулу. Исследования S. Davison et al. [2005] посвящены изучению структуре рецепторов и их функциональной роли в адсорбции бактериофага Гамма на поверхности клеток сибиреязвенных бацилл. Рецепторную функцию, по данным авторов, выполняет белок, названный ими GamR. Штамм B. anthracis с мутацией структурного гена, детерминирующего синтез рецепторного белка, был резистентен к литическому действию бактериофага Гамма. Важную роль в функционировании указанных фагорецепторных структур играет сортаза А, обеспечивающая прикрепление белковых рецепторов к поверхности бактериальной клетки. Мутации, возникающие в генетических детерминантах сортазы А, значительно снижают чувствительность клеток сибиреязвенного микроба к бактериофагу Гамма. Спонтанные мутанты B. anthracis, устойчивые к инфицированию фагом AP50c (AP50R), проявляли фенотип слизистых колоний [Bishop-Lilly K.A. et al., 2012]. Использовали полногеномное секвенирование (ПГС) с целью определить кандидатные мутации, придающие устойчивость к фагу AP50c, с последующим исследованием генетических делеций и их комплементацией для подтверждения данных ПГС и демонстрации необходимости вовлеченных генов для инфицирования AP50c. На основе данных ПГС картировали значимые мутации гена csaB у 6 AP50 R штаммов. Дополнительно, 11 спонтанных мутантов, выделенных в двух разных 33 генетических условиях, были исследованы в ПЦР с последующим сиквенсом по Сэнгеру гена csaB. У каждого из спонтанных мутантов обнаружили либо несинонимическую замену, нонсенс-мутацию или мутацию со сдвигом рамки считывания, вызываемые единичными нуклеотидными полиморфизмами или инсерцией размером 5 п.н.в гене csaB. Из этих 17 спонтанных мутаций, 5 предсказывали изменения полноразмерных белков, а 12 – укорочение белков CsaB. Как и ожидалось из этих результатов, целевая мутация или мутации со сдвигом рамки считывания, внедренные в ген csaB в разных генетических условиях у штамма, не подвергшегося воздействию фага AP50c, приводили к возникновению фагоустойчивого фенотипа. Заключая обзор научной литературы, посвященной биологическим свойствам сибиреязвенных бактериофагов, биотехнологии их производства и пригодности использования для индикации возбудителя сибирской язвы в патологическом материале от больных людей и животных и в объектах окружающей среды и идентификации выделенных культур, следует отметить неполноту изучения некоторых вопросов и противоречивость данных отдельных исследователей. Появление новых бактериофагов побуждает к сравнительному изучению биологических и диагностических свойств сибиреязвенных бактериофагов, научному обоснованию их применения в тех или иных индикационных или идентификационных тестах, а также к разработке биотехнологии производства соответствующих препаратов. 34 ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1 Материалы 2.1.1 Бактериофаги В работе были использованы 7 cибиреязвенных бактериофагов. Экспериментальные серии бактериофагов ВА-9, 186, Саратов, К ВИЭВ и Гамма А-26 были получены в 2011 г. в лаборатории сибирской язвы ФКУЗ Ставропольский противочумный институт Роспотребнадзора. Все препараты бактериофагов использовались в установленные сроки годности. Характеристика препаратов бактериофагов, использованных в исследованиях представлена в таблице 1. 2.1.2 Штаммы возбудителя сибирской язвы и близкородственных представителей рода Bacillus Все штаммы микроорганизмов были получены из лаборатории «Коллекция патогенных микроорганизмов» ФКУЗ Ставропольский противочумный институт Роспотребнадзора. В ходе научных экспериментов были использованы 122 штамма B. anthracis, выделенные на 20 территориях Российской Федерации и в 4 странах ближнего зарубежья. Сведения о группах штаммов B. anthracis, использованных в работе представлены в таблице 2. 35 Таблица 1 – Характеристика препаратов бактериофагов, использованных в исследованиях № п/п Наименование бактериофага 1 1 2 Fah-ВНИИВВиМ 2 R/D-Ph-6, является основой фаг-тест-набора «Оболенск R1» 3 Гамма А-26 4 ВА-9 5 К ВИЭВ 6 Саратов 7 186 Источник поступления Квалификация препарата 3 ГНУ ВНИИ ветеринарной вирусологии и микробиологии, г. Покров, 2008 ФГУН Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии Роспотребнадзора, г. Оболенск, 2010 ФКУЗ Ставропольский противочумный институт, 2011 ФКУЗ Ставропольский противочумный институт, 2011 ФКУЗ Ставропольский противочумный институт, 2011 ФКУЗ Ставропольский противочумный институт, 2011 ФКУЗ Ставропольский противочумный институт, 2011 4 коммерческий препарат Концентрация фаговых частиц 5 8 1×10 БОЕ/см3 коммерческий препарат 1×108 БОЕ/см3 коммерческий препарат экспериментальная серия экспериментальная серия экспериментальная серия экспериментальная серия 2,2×109 БОЕ/см3 2,8×109 БОЕ/см3 1,9×109 БОЕ/см3 1.5×1010 БОЕ/см3 2,5×1010 БОЕ/см3 36 Таблица 2 – Характеристика групп штаммов B. anthracis, использованных в работе Группы штаммов B. anthracis, использованные в исследовании 1 Типичные по капсулообразованию Кол-во 2 88 Наименования штаммов B. anthracis 3 Атипичные по морфологии (ОSS-варианты по классификации Л.И. Маринина, 2009) Штаммы, не имеющие плазмиду рХО1- 4 1; 1 (СО); 5/1; 12/16; 14/41; 15/47; 18/54; 32/89; 63/112; 68/12; 73/42; 81/1; 228; 272/103-Д; 388/1; 401/109; 427/618; 473/634; 476/539; 477/616; 484/551; 489/559; 490/563; 492/497; 499/556; 500/561; 505/628; 513/1; 517/133; 519/644; 531/17; 537/308; 542/151; 546/714; 555/288; 566/762; 596/9; 603/33; 658/543; 664/313; 860/25;885/65; 888/73; 914/213; 1020/11; 1021/23; 1027/207; 1030/213; 1056/1; 1168; 1169/8; 1170; 1173; 1179; 1184; 1190; 1191; 1192; 1194; 1198; 1199; 1204; 1210; 1215; 1217; 1257; 1264; 1265; 1266; 1269; 1271;1274; И-362; И-363; И-364; И-365; И-366; И-368; 1283; 1284; 1285; 1286; 1298; 14/41-I; 14/41 Trp+, 14/41-1; 2-я вакцина Пастера; 71/12 СТИ-1; СТИ-ПР; 55; 228/8; 228/9; Ихтиман; 34 F 2Sterne; 140 П сар-; Ames ANR; 140 П; 300/31; 303/137-1; 304/137-2; 592/10; 594/37; 595/40; 643/267; 644/268; 645/291; 646/294; 880/372; 940/16; 941/21; 1177; 1(СО) S; 12/16 S; CТИ-II; 228/8-II; 14/41-II; WAUm 44 1 ∆ Ames Бесплазмидные штаммы 3 228/4, ∆ CТИ, Sterne tox- Атипичные по капсулообразованию Всего акапсульные 9 образующие капсулу в атмосфере воздуха 17 122 37 Специфичность литического действия препаратов бактериофагов проверяли на 75 штаммах близкородственных спорообразующих сапрофитах, видовая принадлежность которых представлена в таблице 3. Таблица 3 – Видовой состав сапрофитных представителей рода Bacillus, использованных в работе № Вид п/п микроорганизма 1 Bacillus cereus 2 3 4 5 6 Количество штаммов 18 Bacillus thuringiensis 14 Bacillus subtilis 16 Bacillus megaterium 7 Bacillus mesentericus Bacillus species Всего Наименование штаммов 4/43; GР-7; 8; 16; 45; 96; 104; 111; 183; 2527; 8035; 569 RM – 1 (23); 569 R-K 36 (24); АТТСС 6464 (25); АТТСС 6464 (26); NRRL 569 (27); NRRL 569 (28); 569 RM – 20 S (29) Ser.1; Ser. 2; Ser. 3; Ser. 4; Ser. 5; Ser. 6; Ser. 7; Ser. 8; Ser. 9; Ser. 10; Ser. 11; Ser. 12; var. Pasteur; var. Finitimus Л-2; 3; 35; 36; 37; 38; 83; 168; 168 Um 21; 168 pBc 16; PY-313; 336; 6346; 6633; 8236;11774 1; 2; 3; 5; 6; 89; 654 В1 - 1024 1 19 75 27; 80; 96; 146; 197; 242 R; 242 SM; 250; 360; 374; 430; 449; 565; 583; 689; 1312; Т1; Т2; Т3 38 2.1.3 Питательные среды Для культивирования B. anthracis и близкородственных сапрофитов рода Bacillus были использованы: гидролизат Хоттингера рН (7,3±0,1); 0,7 % и 2 % агар Хоттингера рН (7,3±0,1); казеиновый агар Гладстона-Филдса (7,3±0,1), с проверенными свойствами, приготовленные в лаборатории питательных сред для культивирования микроорганизмов I-IV групп патогенности ФКУЗ Ставропольский противочумный институт Роспотребнадзора. Агар 1 % бикарбонатносывороточный для выявления капсулообразования готовили в лаборатории сибирской язвы непосредственно перед проведением исследований на основе агара Хоттингера (100 мл), добавляя 10 мл 10 %-ного раствора соды и 10 мл лошадиной сыворотки, инактивированной при 56 0С в течение 30 мин. Бактериофаги размножали в гидролизате Хоттингера с добавлением дрожжевого экстракта (2,0 г/л), 10 % хлорида кальция (3 мл/л) и установкой рН в пределах 7,3±0,1. Среда подвергалась автоклавированию (20 мин при 1 атм = 121 0С). 2.1.4 Химические реактивы В работе использовали различные реактивы для микробиологических исследований: натрия гидроокись (ГОСТ 4328-77)-чда, кислота соляная (ГОСТ 3118-77)-чда, натрий хлористый (ГОСТ 4233-77), хлороформ (ГОСТ 20015-88), этиловый спирт (ГОСТ Р51652-2000)-экстра, вода дистиллированная (ГОСТ 670972), водорода перекись (ГОСТ 177-88), твин-80 (фирма «Fluka» Швейцария), 10 % кальция хлорид (ТУ 10.19.006-88), дрожжевой экстракт Yeast Extract («Fluka BioChemika», Швейцария), сухая среда LB по Миллеру (фирма AppliChem, USA; состав: дрожжевой экстракт биохимический 5 г/л, натрий хлорид 10 г/л, триптон 10 г/л). 39 2.1.5 Аппаратура Все исследования проводили с помощью следующего оборудования: микроскоп биологический «Биолам Р1» (ЛОМО, Ленинград), весы электронные «Acculab 210d4» (США), рН-метр «Sartorius Basic Meter РВ-11» (Германия), фильтрующий аппарат фирмы «Millipore», насос вакуумный мембранный «Millivac» фирмы «Millipore» (США), мембранные фильтры «Владипор МФЦ № 2» ПО «Тасма» (Россия), шейкер орбитальный OS-20 фирмы «BioSan» (Латвия), термостатирующая баня GFL-1003 (Беларусь), термостат электрический суховоздушный «ТСО 200 СПУ» ОАО «Смоленское СКТБ СПУ» (Россия), стерилизатор паровой «ГПД-400-2» ТЗМОИ (Россия), анаэростат (Германия), газозарядные пакеты (BDGasPakTMEZ Campy Container System, USA), индикаторы СО2 (BBLCO2 Indicators, USA), твердотельный термостат ТТ1 «Гном» (АО ДНК-Технология, Россия). 2.2 Методы исследования 2.2.1 Методы изучения фенотипических свойств возбудителя сибирской язвы Культурально-морфологические свойства изучали в соответствии с методическими указаниями «Лабораторная диагностика и обнаружение возбудителя сибирской язвы» [МУК 4.2.2413-08]. 2.2.1.1 Тест на обнаружение капсулы in vitro Обнаружение капсулы in vitro проводили посевом культур на 1 % бикарбонатно-сывороточный агар. После внесения чашек Петри с посевами в анаэростат, устанавливали концентрацию в пределах 5-50 % СО2 при помощи газозарядных пакетов «BDGasPakTMEZ Campy Container System, USA». Анаэростат помещали в 40 термостат и инкубировали посевы при температуре (36±1) 0С. Просматривали посевы через 18-24 ч. Капсулообразующие культуры вырастали в виде крупных гладких блестящих слизистых колоний. В мазках из культур капсулообразующих штаммов, окрашенных по Ребигеру, выявляли цепочки палочек, окруженные хорошо выраженной капсулой розового цвета. 2.2.1.2 Метод выращивания спор B. anthracis на среде Гладстона-Филдса В подготовленные матрацы со средой Гладстона-Филдса по два на каждый штамм засевали суточную бульонную культуру (5 мл) и распределяли по поверхности среды. Из остатка культур в пробирках петлей засевали чашки Петри с агаром Хоттингера рН (7,2±0,1) для контроля чистоты посевного материала. Засеянные матрацы выдерживали 1 ч при температуре (20±2) 0С в горизонтальном положении для впитывания культуры, затем инкубировали средой вверх в термостате при температуре (36±1) 0С в течение (7±1) суток. Через (19±1) ч инкубирования матрацы просматривали в проходящем свете на типичность роста и его специфическую чистоту. Начиная с 5 суток, из одного матраца (контрольного) петлей делали мазки, которые окрашивали по Ребигеру. Мазки просматривали с помощью микроскопа. Споры в мазках видны в виде отчетливых неокрашенных овальных образований, расположенных в вегетативной клетке, окрашенной в синий цвет или лежащих вне клеток. Смыв культуры проводили при наличии в мазках спор (95±5) %. Выращенные споры дважды отмывали и хранили в растворе глицерина. 2.2.1.3 Приготовление взвесей B. anthracis Все работы с возбудителем сибирской язвы проводили в соответствии с требованиями СП 1.3.1285-03. Приготовление микробных взвесей проводили по стандартному образцу 41 мутности ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России (ОСО 42-28-85 соответствующего года выпуска) 10 единиц. 2.2.1.4 Определение концентрации жизнеспособных спор сибиреязвенного микроба Количественная оценка концентрации живых спор B. anthracis во взвесях. В качестве разводящей жидкости использовали стерильный 0,05 % раствор Твина-80 [Буравцева Н. П., Чернявская Е.Г., 1986]. Испытуемую взвесь спор титровали с десятикратным шагом до разведения 10-7 с обязательной сменой пипеток. После тщательного перемешивания путем пипетирования из разведений 10 -5, 10-6 и 10-7, производили контрольные высевы строго по 0,1 мл каждой полученной взвеси на поверхность агара Хоттингера в чашках Петри (не менее 3 чашек на одно разведение). Путем плавного вращения чашек распределяли жидкость по поверхности питательной среды. После полного впитывания жидкости чашки переворачивали и помещали при температуре 37 0С. Через 20-24 ч подсчитывали число колоний на 3 чашках с высевом из одного разведения, где формировались изолированные типичные по морфологии колонии B. anthracis и вычисляли их среднее число. Концентрацию жизнеспособных спор рассчитывали с применением следующей формулы (1) К=ах 10n, где К – концентрация спор в исследуемой взвеси, а – среднее количество колоний, сформировавшихся на 1 чашке с плотной питательной средой из разведения, выбранного для проведения расчета, n – порядковый номер десятикратного разведения, результаты высева из которого используются для расчета концентрации спор. 2.2.2 Методы размножения и изучения свойств бактериофагов 42 2.2.2.1 Метод получения (размножения) бактериофага сибиреязвенного Гамма А-26 Питательную среду засевали спорами вакцинного штамма B. anthracis 228/8 из расчета 3×109 спор на 100 мл питательной среды. Инкубировали в термостате при температуре (36±1) 0С в течение (4±1) ч на орбитальном шейкере (65±5) об/мин. Затем добавляли в колбу маточную культуру бактериофага Гамма А-26 в количестве 10 мл. Колбу с засеянным бактериофагом вновь ставили на орбитальный шейкер и инкубировали в термостате при температуре (36±1) 0С в течение (14±2) ч. Фаголизат переносили в приемный стакан системы для фильтрации «Мillipor» и проводили фильтрацию. Использовали мембранные фильтры «Мillipor» с размером пор 0,45мкм. Перепад давления – не более 70 мПа. По окончании фильтрации фаголизат переносили в стерильных условиях из колбы «Мillipore» в стерильную мерную колбу и добавляли консервант – химически чистый хлороформ в количестве 0,5 % от объема фаголизата. Содержимое колбы осторожно перемешивали и выдерживали с хлороформом при температуре (20±2) 0С в течение 30 мин, затем переносили в холодильник при температуре (4±2) 0С на 24-72 ч. По окончании инкубации с хлороформом препарат контролировали на специфическую стерильность и отсутствие контаминации посторонней микрофлорой. Изменение параметров процесса при подборе условий размножения бактериофагов Fah-ВНИИВВиМ, R/D-Ph-6, ВА-9, К ВИЭВ, Саратов и186 описаны в соответствующих разделах. 2.2.2.2 Метод определения концентрации фаговых частиц Концентрацию фаговых частиц определяли методом агаровых слоев, предложенным A. Gratia в 1936 г., который является наиболее простым и точным для количественной характеристики испытуемого бактериофага. 43 Сущность метода и техника работы заключается в следующем: готовили взвесь спор B. anthracis СТИ согласно стандарту мутности (ОСО 42-28-85, 10 единиц) и засевали 0,1 мл взвеси в 3 мл бульона Хоттингера. Инкубировали 5 ч при температуре (36±1) 0С . Препараты бактериофага титровали с десятикратным шагом до разведения 10-10 с обязательной сменой пипеток. Предварительно разлитый в пробирки 0,7 % агар Хоттингера в количестве 3 мл расплавляли и остужали до 47 0С и заражали 0,1 мл 5-часовой бульонной культурой штамма B. anthracis СТИ. Затем добавляли точно по 0,5 мл одного из разведений препарата бактериофага, делая не менее трех высевов из каждого разведения. Смесь быстро перемешивали, вращая пробирку, и выливали на поверхность агара Хоттингера. После того, как верхний слой застывал, чашки переворачивали и помещали в термостат на 24 ч при (36±1) 0С . Бактерии размножались внутри верхнего слоя агара в виде негативных колоний (прозрачные пятна) на фоне роста B. anthracis. Расчет концентрации бактериофага проводили исходя из количества его негативных колоний на фоне сплошного роста индикаторной культуры и степени наибольшего разведения, в котором еще наблюдались такие колонии. Концентрацию рассчитывали по формуле (2) К = 2а×10n, где: К – количество корпускул исследуемого бактериофага в мл препарата, 2 – постоянный коэффициент, позволяющий корректировать показатель на 1 мл препарата (по методике вносят 0,5 мл), а – количество негативных колоний на чашке с учитываемым разведением бактериофага, n – порядковый номер разведения препарата, по которому проводится расчет. 2.2.2.3 Определение чувствительности культур к специфическим бактериофагам Чувствительность культур к специфическим бактериофагам определяли чашечным методом. Свежеприготовленные чашки с агаром Хоттингера перед по- 44 становкой пробы подсушивали в термостате. Расчерчивали дно чашки снаружи на сектора. В 4,5 мл бульона Хоттингера засевали бактериологической петлей 18часовую вегетативную культуру исследуемого штамма и культивировали в течение 5 ч, после чего в объеме 0,5 мл наносили на подсушенную поверхность агара Хоттингера. После полного впитывания жидкости, в центр каждого сектора наносили автоматической пипеткой каплю (6,5 мкм) цельного препарата одного из бактериофагов, после полного впитывания бактериофагов чашки переворачивали и инкубировали при (36±1) 0С в течение 20 ч. Результат оценивали визуально. Посевы просматривали невооруженным глазом. Лизис оценивали по четырехкрестовой системе. Полный лизис культуры на месте нанесения бактериофага оценивали на (++++); наличие единичных колоний культуры на фоне зоны её лизиса в месте нанесения - на (+++), резкое ослабление роста – на (++), наличие единичных негативных колоний бактериофага на фоне сплошного роста культуры – на (+), отсутствие лизиса – (-). Положительной считали пробу при оценке не менее чем на (+++). 2.2.2.4 Методы оценки специфической активности бактериофагов Активность бактериофага выражают степенью его разведения, при котором происходит полный лизис чувствительной тестовой культуры. Так, например, титр 10-6 означает, что фаг проявляет свое литическое действие при разведении в 1 000 000 раз. Титр бактериофага определяли на плотных питательных средах: 1) число активных единиц бактериофага, содержащихся в 1 мл фаголизата; 2) по Грациа – количество негативных колоний, образовавшихся из определенного объема (обычно 1 мл) взвеси бактериофага (исследуемого материала) при ее культивировании совместно с чувствительными бактериями на плотной питательной среде. 45 Диагностический рабочий титр (ДРТ) – наибольшее разведение бактериофага, дающее сливной лизис культур индикаторных штаммов. Кроме того, специфическую активность препаратов сибиреязвенных бактериофагов характеризует их способность лизировать штаммы B. anthracis с различными фенотипическими свойствами. Для этого определяли чувствительность к изучаемым бактериофагам 114 штаммов B. anthracis с различными характеристиками и выражали в виде % чувствительных от общего числа штаммов. 2.2.2.5 Метод определения нарастания титра бактериофага (РНФ) Реакция нарастания титра фага (РНФ) основана на свойстве индикаторного бактериофага строго специфично размножаться только в клетках гомологичного микроба. Размножение бактериофага сопровождается увеличением количества его частиц и повышением титра. В опыте был использован сибиреязвенный бактериофаг R/D-RH-6. Готовили взвесь 20-часовой агаровой культуры испытуемого штамма B. anthracis по стандарту мутности (ОСО 42-28-85 соответствующего года выпуска) 10 единиц в физиологическом растворе с 0,1 % Твина-80 и ее десятикратное разведение до расчетной концентрации 1×108 КОЕ/мл. Из последнего 5 мл взвеси вносили в колбу с 50 мл бульона Хоттингера с добавлением дрожжевого экстракта и хлорида кальция. Колбы с посевами помещали в термостат при температуре (36±1) 0С на орбитальном шейкере при 150 об/мин. Через 3 ч добавляли 1 мл препарата бактериофага R/D-RH-6 с концентрацией 1×106 БОЕ/мл, после чего продолжали инкубацию в этих же условиях в течение 8 ч. При внесении 1 мл препарата бактериофага с концентрацией 1×106 БОЕ/мл в 50 мл бульонной культуры B. anthracis его начальная концентрация в бульоне составляла 2×104 БОЕ/мл. В качестве индикаторных штаммов для определения концентрации размноженного в данных условиях бактериофага использовали 31 штамм B. anthracis. 46 2.2.3 Методы статистической обработки результатов Статистический анализ данных осуществляли с использованием пакета прикладных программ «Statistika 6,0», системы электронных таблиц Excel 7,0. Достоверность различий оценивалась по критерию Стьюдента. Текстовый и графический материал оформлен на персональном компьютере под управлением операционной системы MS Microsoft XP Professional и офисного пакета MS Office 2007. 47 ГЛАВА 3. РАЗРАБОТКА БИОТЕХНОЛОГИИ ПРОИЗВОДСТВА ПРЕПАРАТА БАКТЕРИОФАГА ДИАГНОСТИЧЕСКОГО СИБИРЕЯЗВЕННОГО ГАММА А-26 ЖИДКОГО В СтавНИПЧИ в период 1998-2002 гг. О.И. Цыганковой и Б.В. Солодовниковым была разработана биотехнология производства препарата бактериофага Гамма А-26 сибиреязвенного диагностического жидкого (сухого) и получены 2 патента [Пат. РФ № 2133273 «Способ выращивания сибиреязвенного бактериофага Гамма», опубл. 20.07.1999, Бюл. № 20; Пат. РФ № 2171842 «Способ получения сибиреязвенного бактериофага Гамма А-26», опубл. 10.08.2001, Бюл. № 22]. После выпуска экспериментальных серий в 2002 г. производство бактериофага было приостановлено. Все экспериментальные серии хранились в ампулах при температуре (4±2) 0С в лиофилизированном или жидком состоянии. Для возобновления производства необходимо было восстановить жизнеспособность длительно хранившегося бактериофага сибиреязвенного Гамма А-26, оценить его литические свойства, отобрать наиболее продуктивные производственные штаммы (бактериофаг, штамм размножения) и штаммы для контроля специфической активности. Для характеристики свойств бактериофагов применяется ряд показателей, которые можно условно разделить на 2 группы: количественные показатели – это концентрация бактериофага или количество фаговых корпускул (БОЕ) в 1 мл препарата и диагностический рабочий титр (ДРТ – это максимальное разведение, в котором испытуемый бактериофаг проявил свое литическое действие); качественные показатели – это специфичность (специфичность бактериофага сводится к избирательному действию на отдельные виды и даже типы микробов) и специфическая активность, которая оценивается по спектру литической активности бактериофага в отношении штаммов определенных видов бактерий [Адамс М., 1961; Ляпустина Л.В., 2004]. В связи с вышеизложенным характеристика свойств сибиреязвенного бак- 48 териофага и последующая оценка качества получаемых серий препаратов сибиреязвенного бактериофага в процессе отработки технологических схем его производства, стабилизации и хранения проводилась по данным двум группам показателей. Традиционные стадии процесса производства диагностических бактериофагов включают: 1) получение вегетативной культуры штамма B. anthracis для размножения; 2) заражение культуры B. anthracis производственным сибиреязвенным бактериофагом; 3) размножение производственного бактериофага в оптимальных условиях; 4) стерилизация, проверка препарата на стерильность и консервация; 5) контроль специфической литической активности и специфичности сибиреязвенного бактериофага; 6) розлив препарата в ампулы и их опай; 7) контроль качества готового препарата в ЛБТК. 3.1 Подбор штамма B. anthracis для размножения сибиреязвенного бактериофага Важным фактором, влияющим на воспроизводство бактериофагов, являются индивидуальные свойства штамма микроба, используемого для их репродукции. Для репродукции сибиреязвенного бактериофага необходим штамм B. anthracis, обеспечивающий высокие количественные показатели и стабильность качественных (специфичность, специфическая активность) показателей. Необходимость соблюдения мер биологической безопасности технологического цикла заставляет отдавать предпочтение штаммам B. anthracis с низкой вирулентностью (желательно, авирулентных), если они обеспечивают получение препаратов, удовлетворяющих выше перечисленным требованиям. 49 Для изучения возможности экспериментально-производственного получения сибиреязвенного бактериофага Гамма А-26, были использованы вакцинные штаммы B. anthracis, авирулентность которых обусловлена отсутствием плазмиды pХO2. В качестве штаммов размножения были апробированы 6 вакцинных штаммов B. anthracis: СТИ, СТИ-ПР, 55, 228/8, Sterne 34F2, Ichtiman. Процесс культивирования бактериофагов предполагает создание, с помощью питательных сред, благоприятных условий для размножения фаговых частиц. Поскольку наиболее простой является методика репродукции сибиреязвенных бактериофагов в жидких питательных средах, то дальнейший подбор производственной пары «штамм размножения – бактериофаг» проводили путем пассирования бактериофага Гамма А-26 в бульонных культурах вакцинных штаммов сибиреязвенного микроба. Питательную среду засевали 1,0 мл взвеси вегетативной культуры (1×108 КОЕ/мл), с оптической плотностью 10 единиц стандарта ОСО ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России в 50 мл бульона Хоттингера, содержащего дополнительно 0,2 г дрожжевого экстракта и 0,15 мл 10 % раствора СаCl2. После инкубации в течение 5 ч при температуре (36±1) 0С на орбитальном шейкере (70 об/мин), вносили 2,0 мл бактериофага Гамма А-26 с концентрацией 4×107 БОЕ/мл. После инкубации в течение 24 ч в термостате в прежних условиях, фаголизаты фильтровали. Фильтраты использовали в качестве препаратов бактериофагов. В качестве доступного критерия оценки эффективности отобранных штаммов применялось определение ДРТ и концентрации конечного продукта производства – бактериофага (таблица 4). Концентрацию фаговых частиц определяли методом агаровых слоев по Грациа [Gratia A., 1936]. Индикаторной культурой служил вакцинный штамм B. anthracis СТИ. Как видно из таблицы 4, бактериофаг Гамма А-26 успешно размножался на всех используемых вакцинных штаммах, наилучшие результаты были получены при использовании штамма B. anthracis 228/8. 50 Таблица 4 – Эффективность репродукции бактериофага сибиреязвенного Гамма А-26 на различных вакцинных штаммах B. anthracis № п/п Штаммы размножения 1 B. anthracis 228/8 Концентрация бактериофага Гамма А-26 (БОЕ/мл), (M±m) (1,6±0,1)×1010 ДРТ 2 B. anthracis СТИ (2,0±0,12)×109* 10-5 3 B. anthracis Ichtiman (3,0±0,24)×108* 10-5 4 B. anthracis 55 (1,0±0,11)×108* 10-4 5 B. anthracis СТИ-ПР (3,5±0,21)×108* 10-3 6 B. anthracis Sterne 34F2 (2,2±0,14)×108* 10-4 10-5 Примечание: *р<0,001 Специфическую активность и специфичность экспериментальных серий бактериофага, полученных на различных штаммах размножения, проверяли на 6 вакцинных штаммах B. anthracis, а специфичность на 10 спорообразующих сапрофитах рода Bacillus (таблица 5). На чашке с агаром Хоттингера равномерно распределяли бульонную культуру одного из 16 штаммов, делили её на 5 секторов и закапывали один из 6 вариантов фага в различных разведениях: неразведенный и в разведениях от 10-1 до 10-7. Как видно из таблицы 5, лизировались все штаммы B. anthracis, но значения ДРТ были различными. Наиболее чувствительными к специфическому действию серий бактериофага, полученных на различных штаммах репродуцентах, были штаммы B. anthracis 228/8, СТИ, Ichtiman. 51 Таблица 5 – Литический спектр и специфичность экспериментальных серий бактериофага сибиреязвенного Гамма А-26 Индикаторные штаммы Показатель ДРТ бактериофага Гамма А-26, выращенного на различных штаммах размножения: B. anthracis CТИ -5 10 B. anthracis CТИ-ПР -3 10 B. anthracis 228/8 -5 10 B. anthracis 55 -4 10 B. anthracis Ichtiman -5 10 B. anthracis Sterne 34F2 -4 10 10-4 10-4 10-4 10-3 10-4 10-4 10-5 10-4 10-5 10-3 10-5 10-3 B. anthracis 55 10-4 10-4 10-4 10-4 10-4 10-3 B. anthracis 10-5 10-4 10-5 103 10-5 10-4 10-4 10-4 10-4 10-4 10-4 10-3 B. cereus 8 – – – – – – B. cereus 16 – – – – – – B. cereus 104 – – – – – – 10-2 10-3 10-3 10-4 10-2 B. anthracis CТИ B. anthracis СТИ-ПР B. anthracis 228/8 Ichtiman B. anthracis Sterne 34F2 B. megaterium 1 10-3 52 Продолжение таблицы 5. B. megaterium 2 10-3 10-2 10-3 10-3 10-3 10-2 B. megaterium 3 10-3 10-2 10-3 10-3 10-3 – – – – – – – B. subtilis 36 – – – – – – B. subtilis 37 10-4 10-2 10-3 10-3 10-3 10-1 B. subtilis 83 – – – – – – B. megaterium 654 Примечание: (-) – зона лизиса отсутствует 53 Мало отличались серии бактериофага Гамма А-26 и в отношении близкородственных сапрофитов. Все варианты бактериофага не лизировали B. cereus 8, 16, 104; B. megaterium 654 и B. subtilis 36, 83. Чувствительными к действию бактериофага были культуры B. megaterium 1, 2, 3 и B. subtilis 37. Следует отметить, что значения ДРТ для них были ниже, как минимум, на один порядок по сравнению со штаммом B. anthracis СТИ. Наибольшие зоны лизиса давал штамм B. anthracis Ichtiman. В качестве индикаторных штаммов можно было рекомендовать все вакцинные штаммы, за исключением B. anthracis Sterne 34F2, который давал значительный рост фагорезистентных колоний. Предложенные вакцинные штаммы для репродукции сибиреязвенного бактериофага позволяли получать препараты бактериофага с достаточно высокой концентрацией (108-10 БОЕ/мл) и значением ДРТ (10-5), стабильные по показателям специфичности и специфической активности. Использование вакцинных штаммов в качестве штаммов размножения обеспечивало производство диагностического препарата в условиях с более высоким уровнем (по сравнению с вирулентными штаммами) биологической безопасности лиц, занятых в производстве. Для возобновления производства, в качестве штамма размножения, предпочтение было отдано штамму B. anthracis 228/8 по следующим показателям: концентрация фаговых частиц при выращивании на этом штамме достигала высоких показателей – 1010 БОЕ/мл; проявление стабильных литических свойств в отношении сибиреязвенных культур. Что же касается специфичности в отношении спорообразующих сапрофитов, то бактериофаг, выращенный на штамме B. anthracis 228/8, не отличался от бактериофагов, полученных с использованием других штаммов. К этому следует добавить, что вакцинный штамм B. anthracis 228/8 был селекционирован в лаборатории сибирской язвы и его биологические свойства (морфологические, культуральные, биохимические, патогенные, иммуногенные и генетические) всесторонне изучены в лаборатории [Буравцева Н.П. с соавт, 1987]. 54 3.2 Разработка оптимальных параметров репродукции бактериофага сибиреязвенного Гамма А-26 Для успешной репродукции бактериофагов, являющихся внутриклеточными паразитами бактерий, в первую очередь, необходимы специфические бактериальные клетки, обладающие индивидуальными потребностями в питательных веществах и строго определенных параметрах физических факторов при культивировании (температура, значения pH среды, наличие аэрации и т.д.). [Гольдфарб Д.М., 1961; Адамс М., 1961; Бактериофаги…, 2012]. При подборе питательных сред для культивирования штамма размножения сибиреязвенных бактериофагов не возникает затруднений т.к. B. anthracis не предъявляет особых требований к питательным средам и достаточно эффективно размножается на таких универсальных питательных средах, как МПА, АХ, МПБ, БХ. Оптимальными являются следующие условия культивирования: температура 34-37 ºС, значения pH в пределах 7,2-7,6, свободный доступ кислорода [Еременко Е.И., 1997; МУК 4.2.2413-08; Лабораторная диагностика…, 2009; Курилова А.А., 2009; Gladston G.P.,1939]. Обогащение сред культивирования питательными добавками, стимулирующими размножение бактериальных клеток в течение логарифмической фазы, в конечном счете, способствует более эффективному размножению бактериофагов. Одним из таких стимуляторов является доступный и хорошо известный препарат – дрожжевой экстракт [Бендас Л.Г., 1971; Anderson T., 1945; Fowler С., Cohen S, 1948]. Вторая группа условий необходимых для успешного размножения бактериофагов обусловлена их индивидуальными особенностями для обеспечения всех стадий размножения в бактериальных клетках. Адсорбция на поверхности бактериальной клетки является первым этапом взаимодействия бактериофага с клеткой специфического хозяина. Нарушение этого этапа делает невозможным дальнейшее внедрение в клетку бактерии, репродукцию фаговых корпускул с последующим выходом фагового потомства по- 55 сле лизиса клетки хозяина. Исходя из этого, среда, в которой осуществляют получение фаголизата, должна содержать вещества способствующие эффективности этого процесса. Необратимость ферментативной фазы закрепления фага на клетке зависит от температуры, концентрации ионов в среде и других факторов. Добавление в среду катионов Са2+ усиливает адсорбцию фага на поверхности бактериальной клетки и завершает процесс проникновения структур фага в бактерию. При отсутствии этого катиона комплекс фаг- бактерия неустойчив [Beumer-Jochmans M.-P. et al., 1959; Lanni J., 1960]. Условия культивирования клеток хозяина до инфицирования их фагом, отражаясь на физиологическом состоянии бактерий, влияют на интенсивность формирования фага внутри бактерий. С целью повышения продуктивности, производили выращивание вегетативной культуры в режиме перемешивания на орбитальном шейкере. Зависимость размножения бактериофага от свойств среды и физиологического состояния бактериальной клетки обусловлена, главным образом тем, в какой мере они обеспечивают синтез основных структур фага, т. е. его белков и ДНК. При подборе питательной среды руководствовались перечисленными требованиями. С целью увеличения концентрации фаговых частиц в конечном продукте необходимо было обогатить среду питательными добавками, стимулирующими размножение бактериальных клеток в течение логарифмической фазы, способствующими активной адсорбции фаговых частиц на специфических рецепторах бактерий и продуктивному его размножению в них. Для приготовления питательной среды на 100 мл бульона Хоттингера добавляли (0,23±0,02) г дрожжевого экстракта. Устанавливали с помощью ионометра рН (7,3±0,1) и переносили 100 мл приготовленной среды в колбу объемом 500 мл, стерилизовали в автоклаве при давлении пара 1 атм 30 мин. В связи с тем, что хлористый кальций, добавленный в питательную среду, при автоклавировании вызывает выпадение осадка, его добавляли в стерильных условиях непосред- 56 ственно перед засевом из расчета 0,3 мл стерильного 10% раствора на 100 мл среды. Наиболее кратковременный латентный период и наибольший выход фага при лизисе бактерий наблюдаются в том случае, когда бактерии находятся в логарифмической фазе роста в благоприятной питательной среде. Если бактериальная популяция перешла из логарифмической фазы в стационарную, клетки становятся «плохим» хозяином для размножения фага и лизис происходит очень медленно или не наступает вовсе [Delbruck M., 1940]. Исходя из этого, для репродукции бактериофага выбрали использование бульонной культуры штамма размножения, в которой высокая концентрация бактериальных клеток обеспечивалась соответствующей посевной дозой спор, а инкубация в течение 4 ч гарантировала наличие «молодой» культуры в одинаковой фазе роста. Для определения оптимальных условий получения препарата бактериофага сибиреязвенного Гамма А-26 необходимо было определить оптимальную посевную дозу штамма размножения и заражающую дозу бактериофага. Размножение бактериофага сибиреязвенного Гамма А-26 осуществляли следующим способом. Бульон Хоттингера засевали взвесью спор сибиреязвенного вакцинного штамма B. anthracis 228/8 в концентрациях 1×108 и 3×108 спор/100 мл среды. Культивирование проводили на орбитальном шейкере при (36±1) 0С и (65±5) об/мин в течение (4±1) ч. Затем вносили препарат производственного бактериофага Гамма А-26 (концентрация 4×107 БОЕ/мл) в дозе 2,0 и 10,0 мл на 100 мл бульонной вегетативной культуры и продолжали инкубировать 24 ч при (36±1) 0С на орбитальном шейкере в режиме (60±5) об/мин. Концентрацию фаговых частиц в экспериментальных сериях определяли методом агаровых слоев по Грациа. В качестве индикаторной культуры для определения концентрации и ДРТ был выбран штамм B. anthracis СТИ. Полученные результаты опыта представлены в таблице 6. 57 Таблица 6 – Влияние посевной дозы культуры размножения и заражающей дозы бактериофага сибиреязвенного Гамма А-26 на его концентрацию в фаголизате № Доза спор штамма серии размножения на100 мл среды 1 2 3 4 1×108 1×108 3×108 3×108 Концентрация фаговых частиц (БОЕ/мл3), (M±m): после внесения в среду в полученном фаголизате размножения 8,0×105 4,0×106 8,0×105 4,0×106 (4,0±0,24)×108 (2,0±0,21)×108 (4,0±0,22)×109 (1,3±0,18)×1010 Достоверно установлено, наиболее высокой концентрацией (1,3×1010 БОЕ/мл) обладал препарат бактериофага серии 4. Посевная доза сибиреязвенного штамма, при получении этой серии, составляла 3×108 спор/100 мл среды, а заражающая доза бактериофага составляла 10 мл с концентрацией 4×107 БОЕ/мл. Следующим этапом получения препарата бактериофага являлась стерилизация фаголизата. Стерилизацию проводили методом фильтрации, используя стерильные мембранные фильтры фирмы «Millipore» (США) с размером пор 0,45 мкм. По окончании фильтрации бактериофаг контролировали на специфическую стерильность и отсутствие контаминации посторонней микрофлорой согласно МУК 4.1/4.2.588-96. Контроль микробиологической чистоты допускает рост не более 20 любых колоний микробов на 1 чашке Петри. Перед постановкой контроля 3 чашки Петри с агаром Хоттингера рН (7,2±0,1) подсушивали в термостате при температуре (36±1) 0С. После чего, пипеткой наносили 0,1 мл бактериофага. Затем методом «обкатки» распределяли по поверхности среды. Инкубировали посевы при температуре (36±1) 0С в течение 24 ч. Посевы просматривали через 24 ч. При контроле специфической стерильности должен отсутствовать рост сибиреязвенного микроба. Для контроля по 1 мл бактериофага засевали в один флакон со 100 мл бульона Хоттингера рН (7,2±0,1), по 0,1 мл в 2 пробирки со ско- 58 шенным агаром Хоттингера рН (7,2±0,1) и по 0,1 мл на 2 чашки Петри с агаром Хоттингера рН (7,2±0,1). Посевы инкубировали при температуре (36±1) 0С во флаконах в течение (20±1) сут, в пробирках со скошенным агаром – (10±1) сут, на чашках – (5±1) сут. Посевы образцов ежедневно оценивали визуально на наличие роста, характерного для сибиреязвенного микроба. Производство жидких препаратов бактериофагов не исключает возможности контаминации конечного продукта производства посторонней микрофлорой, так как приходится работать с достаточно большими объемами жидких питательных сред [Ляпустина Л.В., 2004]. В связи с этим нужно применять химические вещества, которые бы не оказывали влияния на жизнеспособность и другие биологические свойства фагов в процессе их приготовления и длительного хранения. В качестве консерванта применяли хлороформ, который уже широко использовался для консервации различных фаговых препаратов [Ляпустина Л.В., 2004]. Хлороформ вносили в колбы в количестве 0,5 % от объема фаголизата. Содержимое колбы осторожно перемешивали и выдерживали с хлороформом при температуре (20±2) 0С в течение 30 мин, после чего хранили при температуре (4±2) 0С. Таким образом, представленные выше условия получения бактериофага сибиреязвенного Гамма А-26 были признаны оптимальными и были использованы для получения 3-х экспериментально-производственных серий. Репродукцию их осуществляли на штамме B. anthtracis 228/8 в жидкой питательной среде по предложенной методике. Показатели различных серий бактериофага представлены в таблице 7. Важным разделом разработки контроля стабильности свойств отдельных серий препарата бактериофага является подбор штаммов B. anthtracis для определения специфической активности и подбор штаммов близкородственных сапрофитов – для подтверждения специфичности препарата. 59 Таблица 7 – Показатели бактериофага диагностического сибиреязвенного Гамма А-26 жидкого Серия препарата рН Стерильность Специфическая стерильность С. 01-09 Концентрация бактериофага (БОЕ/мл) 4,0×1010 6,6 стерильность сохранена С. 02-09 С. 03-09 4,0×109 1,3×1010 6,6 6,6 – // – – // – рост сибиреязвенного микроба отсутствует – // – – //– С этой целью использовали: 10 вирулентных штаммов сибиреязвенного микроба, 6 вакцинных штаммов, 6 штаммов B.cereus, 8 штаммов B. thuringiensis, 4 штамма B. megaterium, 10 штаммов B. subtilis, 10 штаммов B.species. Результаты исследований представлены в таблице 8. Результаты испытания показали, что три экспериментальные серии бактериофага Гамма А-26 лизировали все (100 %) 10 вирулентных и 6 вакцинных штаммов сибиреязвенного микроба. При просмотре чашек на поверхности газонов сибиреязвенных штаммов в месте нанесения капель бактериофагов наблюдались четкие, округлые зоны лизиса, при отсутствии в них фагорезистентных колоний. Среди штаммов сапрофитных аэробных спорообразующих бацилл выявлено 4 штамма (B. subtilis 35; 37; 336; B. megaterium 1), которые лизировались тремя сериями бактериофага. Индикаторными штаммами, для контроля специфической активности бактериофага сибиреязвенного Гамма А-26, были определены 5 вакцинных штаммов B. anthracis, дающих четкий фаголизис (положительный контроль) с бактериофагом. В число контрольных штаммов не вошли вирулентные сибиреязвенные культуры, так как это создаёт определенные трудности при производстве, а различий в характере зоны лизиса вирулентных и авирулентных штаммов в процессе выполнения работы выявлено не было. 60 Таблица 8 – Результаты изучения специфической активности и специфичности трех экспериментально-производственных серий бактериофага диагностического сибиреязвенного Гамма А-26 жидкого Название штамма Серии Название препарата штамма 01-09 02-09 03-09 B. anthracis B. subtilis ++++ ++++ ++++ Л 2 1 ++++ ++++ ++++ 3 1(СО) ++++ ++++ ++++ 35 5/1 ++++ ++++ ++++ 36 15/47 ++++ ++++ ++++ 37 81/1 ++++ ++++ ++++ 38 228 ++++ ++++ ++++ 83 1056/1 ++++ ++++ ++++ 336 1183 ++++ ++++ ++++ 168 pBc 16; 1184 ++++ ++++ ++++ 168 Um 21 1185 ++++ ++++ ++++ B. species СТИ ++++ ++++ ++++ 27 228/8 ++++ ++++ ++++ 80 55 ++++ ++++ ++++ 96 СТИ-ПР ++++ ++++ ++++ 146 Ichtiman ++++ ++++ ++++ 197 Sterne 34 F2 B. cereus 242 SM GP-7 – – – 242 R 8 – – – 250 16 – – – 360 45 – – – 374 104 – – – B. megaterium 8035 – – – 1 B. thuringiensis 5 Ser. 1 – – – 6 Ser. 2 – – – 89 Ser. 3 – – – Ser. 5 – – – Ser. 7 – – – Ser. 9 – – – Ser. 11 – – – Ser. 12 – – – Примечание: (+) – наличие лизиса, (-) – отсутствие лизиса Серии препарата 01-09 02-09 03-09 – – – – – – ++++ ++++ ++++ – – – ++++ ++++ ++++ – – – – – – ++++ ++++ ++++ – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – ++++ ++++ ++++ – – – – – – – – – 61 В качестве отрицательного контроля были отобраны следующие штаммы близкородственных сапрофитов: B. cereus 16, 104; B. megaterium 5, 89; B. subtilis 36, 83, не лизирующихся бактериофагом Гамма А-26. Проведенные лабораторные испытания литического спектра бактериофага сибиреязвенного Гамма А-26 выявили полное совпадение результатов воздействия всех серий бактериофага на тестируемые культуры. Экспериментальнопроизводственные серии препарата бактериофага диагностического сибиреязвенного Гамма А-26 жидкого имели характеристики, представленные в таблице 9. Таким образом, оптимальными условиями культивирования бактериофага сибиреязвенного Гамма А-26 были признаны: 1) применение жидкой питательной среды на основе Хоттингера с добавлением в него дрожжевого экстракта (0,23±0,02) г/л, хлористого кальция 0,3 г/л на 100 мл среды и значением рН (7,2±7,4); 2) посевная доза производственного штамма размножения B. anthracis 228/8 – 3×108 спор на 100 мл среды с последующим культивированием на орбитальном шейкере в режиме непрерывного перемешивания (65±5) об/мин при (36±1) 0С в течение (4±1) ч; 3) заражающая доза производственного бактериофага сибиреязвенного Гамма А-26 составила 10 мл с концентрацией 4,0×107 БОЕ/мл на 100 мл культуры; 4) время получения фаголизата бактериофага Гамма А-26 составляет (16±2) ч от момента заражения. Основные стадии производства препарата «Бактериофаг диагностический сибиреязвенный Гамма А-26 жидкий» представлены на рисунке 1. 62 Таблица 9 – Характеристика свойств бактериофага диагностического сибиреязвенного Гамма А-26 жидкого Наименование показателя Внешний вид рН Герметизация Микробиологическая чистота Специфическая стерильность Специфическая активность Подлинность и специфичность Характеристика нормы Прозрачная жидкость светложелтого цвета От 6,5 до 7,5 Ампулы с препаратом должны быть герметичны Допускается рост не более 20 колоний Не допускается рост сибиреязвенного микроба Бактериофаг сибиреязвенный Гамма А-26 должен содержать не менее 107 БОЕ/мл Препарат лизирует штаммы сибиреязвенного микроба при концентрации не ниже 107 и не лизирует контрольные гетерологичные штаммы спорообразующих сапрофитов. В виду генетического родства сибиреязвенного микроба с другими представителями рода Bacillus допускается лизис не более, чем у 5 % от числа исследуемых гетерологичных штаммов Результаты исследования С. 01-09 С. 02-09 С. 03-09 Прозрачная жидкость Прозрачная жидкость Прозрачная жидкость светло-желтого цвета светло-желтого цвета светло-желтого цвета 6,6±0,1 Ампулы с препаратом герметичны Рост посторонней микрофлоры отсутствует Рост сибиреязвенного микроба отсутствует 4,0×1010 БОЕ/мл 6,5±0,1 Ампулы с препаратом герметичны Рост посторонней микрофлоры отсутствует Рост сибиреязвенного микроба отсутствует 4,0×109 БОЕ/мл 6,7±0,1 Ампулы с препаратом герметичны Рост посторонней микрофлоры отсутствует Рост сибиреязвенного микроба отсутствует 1,3×1010 БОЕ/мл Лизирует B. anthracis 228/8, СТИ, 55, Sterne 34F2, Ichtiman. не лизирует B. cereus16, 104; B. megaterium 5, 89; B. subtilis 36, 83. Лизирует B. anthracis 228/8, СТИ, 55, Sterne 34F2, Ichtiman. не лизирует B. cereus16, 104; B. megaterium 5, 89; B. subtilis 36, 83. Лизирует B. anthracis 228/8, СТИ, 55, Sterne 34F2, Ichtiman. не лизирует B. cereus16, 104; B. megaterium 5, 89; B. subtilis 36, 83. 63 I. I. Подготовительная стадия 1. Подготовка помещения и оборудования 2. Получение спор производственной культуры штамма размножения B. anthracis 228/8 3. Приготовление обогащенной жидкой питательной среды II. Стадия основного технологического процесса 1. Получение 6-часовой бульонной культуры штамма размножения 2. Заражение производственным препаратом бактериофага сибиреязвенного Гамма А-26 штамма размножения B. anthracis 228/8 3. Очистка и стерилизация фаголизата 4. Контроль стерильности препарата бактериофага сибиреязвенного Гамма А-26 5. Определение концентрации бактериофага сибиреязвенного Гамма А-26 6. Контроль специфичности литического действия бактериофага сибиреязвенного Гамма А-26 7. Розлив по ампулам препарата бактериофага сибиреязвенного Гамма А-26 и опай 8. Этикетировка и упаковка препарата Контроль готовой продукции в ЛБТК Передача препарата на склад готовой продукции Рисунок 1 – Основные этапы производства бактериофага диагностического сибиреязвенного Гамма А-26 жидкого 64 3.3 Сравнительная характеристика экспериментально-производственных серий бактериофага диагностического сибиреязвенного Гамма А-26 жидкого Оценку диагностической ценности трех экспериментально- производственных серий по основным показателям – специфической активности и специфичности проводили по результатам литического действия указанных препаратов на 55 штаммов возбудителя сибирской язвы (33 – типичных вирулентных, 16 – атипичных по капсулообразованию, 6 – вакцинных) и 72 штамма близкородственных спорообразующих бацилл (18 – B. cereus, 14 – B. thuringiensis, 14 – B. subtilis, 7 – B. megaterium, 1 – B. mesentericus, 18 – B. species (spp.)). Определение чувствительности культур к специфическому бактериофагу осуществляли в соответствии с МУК 4.2.2413-08. Положительной считали пробу при оценке не менее, чем на +++. Данные изучения специфического литического спектра трех экспериментально-производственных серий препарата бактериофага сибиреязвенного Гамма А-26 приведены в таблице 10. Таблица 10 – Результаты испытания специфической активности бактериофага сибиреязвенного Гамма А-26 Штаммы B. anthracis Типичные вирулентные Атипичные по капсулообразованию Вакцинные Всего Количество штаммов, чувствительных к литическому действию экспериментальных серий бактериофага сибиреязвенного Гамма А-26 С. 01-09 С. 02-09 С. 03-09 33 33 33 16 16 16 6 55 6 55 6 55 65 Полученные результаты продемонстрировали высокую специфическую активность препарата, совпадающую у всех трех серий – все 55 (100 %) штаммов B. anthracis лизировались бактериофагом Гамма А-26. У всех тестируемых штаммов сибиреязвенного микроба в месте нанесения бактериофага на фоне газонного роста агаровой культуры образовывались четкие, абсолютно прозрачные округлые зоны лизиса при отсутствии в них фагорезистентных колоний. Чувствительными к действию бактериофага Гамма А-26 (С. 01-09, С. 02-09, С. 03-09), среди сапрофитных аэробных спорообразующих бацилл, оказались штаммы: B. megaterium 1, 2, 3 и B. subtilis 35, 37, 336. На основании полученных данных, определили специфичность бактериофага диагностического сибиреязвенного Гамма А-26 жидкого, которая составила – 91,7 %. Показатель специфичности выражали процентным отношением количества не лизировавшихся штаммов к общему количеству спорообразующих сапрофитов (таблица 11). Таким образом, показатели специфической активности и специфичности трех экспериментально-производственных серий бактериофага сибиреязвенного Гамма А-26 совпадали. Важным параметром процесса производства биологических диагностических препаратов является определение сроков их годности и условий хранения. Была определена динамика концентрации экспериментальных серий бактериофага диагностического сибиреязвенного Гамма А-26 жидкого при длительном хранении в оптимальных условиях (таблица 12). Для этого 3 серии препарата были разлиты в ампулы по 1 мл и в запаянном виде хранились в холодильнике при температуре (4±2) 0С, после чего с интервалами в 1 г. проводилось определение концентрации бактериофага в препаратах всех серий. 66 Таблица 11 – Оценка специфичности бактериофага сибиреязвенного Гамма А-26 Бактериофаг сибиреязвенный Гамма А-26, серия Количество штаммов отдельных видов, Всего лизирующихся бактериофагом Bacillus Специфичность % Bacillus Bacillus Bacillus Bacillus cereus thuringiensis subtilis С. 01-09 0/18 0/14 3/14 3/7 0/1 0/18 6/72 91,7 С. 02-09 0/18 0/14 3/14 3/7 0/1 0/18 6/72 91,7 С. 03-09 0/18 0/14 3/14 3/7 0/1 0/18 6/72 91,7 megaterium mesentericus Bacillus species Примечание: числитель – количество лизирующихся штаммов, знаменатель - общее количество штаммов 67 Таблица 12 – Динамика изменения концентрации в препаратах различных серий бактериофага диагностического сибиреязвенного Гамма А-26 жидкого в процессе хранения в оптимальных условиях Серии бактериофага ГаммаА-26 исходная Концентрация бактериофага Гамма А-26 (БОЕ/мл) через 1 г. через 2 г. через 3 г. через 4 г. (С. 01-09) 4,0×1010 4,0×109 3,0×108 2,8×107 1,2×107 (С. 02-09) 4,0×109 3,8×109 3,1×108 2,6×107 1,4×107 (С. 03-09) 1,5×1010 1,4×109 1,2×108 1,0×107 1,0×106 При исследовании изменений концентрации фаговых частиц бактериофага сибиреязвенного Гамма А-26 при длительном хранении в оптимальных условиях установлено, что в препаратах всех трех серий концентрация бактериофага Гамма А-26 на протяжении 3 лет не снижалась ниже регламентированного уровня (10 7), ДРТ всех серий для контрольного индикаторного штамма B. anthracis СТИ после трех лет хранения составил 10-4, что свидетельствует об определенном резерве показателей активности т. к. предполагается применение препарата в неразведенном виде. На основании анализа полученных результатов определили гарантированный срок хранения препарата бактериофага диагностического сибиреязвенного Гамма А-26 жидкого, составившего 2 года. Таким образом, в результате проведенных исследований была предложена технологическая схема, которая легла в основу разработанной нормативной документации: пусковой регламент (ПУР) № 01897080-03-09, технические условия (ТУ) 9386-013-01897080-2009, инструкция по применению на бактериофаг диагностический сибиреязвенный Гамма А-26 жидкий. 68 ГЛАВА 4. СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ СИБИРЕЯЗВЕННЫХ БАКТЕРИОФАГОВ Известные в настоящее время сибиреязвенные бактериофаги различаются по широте спектра лизируемых ими штаммов возбудителя сибирской язвы, а также специфичности их действия [Левина Е.Н., Архипова В.Р., 1967; Павлова И.П., 1973; Солодовников Б.В., 2002, Цыганкова О.И., 2007; Саяпина Л.Б., 2011]. Некоторую противоречивость литературных данных отдельных авторов по этому вопросу можно объяснить использованием ими различных вариантов бактериофагов, неодинаковой концентрацией бактериофагов в препаратах, недостаточной представительностью использованных выборок культур B. anthracis и близкородственных сапрофитов, а также различиями в оценке результатов теста на фагочувствительность. Все вышеизложенное, а также появление новых сибиреязвенных бактериофагов определило необходимость сравнительного комплексного изучения производственных и диагностических свойств доступных сибиреязвенных бактериофагов в условиях одного исследования. 4.1 Сравнительная оценка свойств сибиреязвенных бактериофагов, определяющих их пригодность для промышленного производства Были изучены свойства доступных сибиреязвенных бактериофагов (FahВНИИВВиМ, R/D-Ph-6, Гамма А-26, 186, ВА-9, Саратов и К ВИЭВ), определяющие пригодность их для применения. Одним из требований, предъявляемых к диагностическим бактериофагам, является эффективность их репродукции для получения препаратов с достаточно высокой концентрацией фаговых частиц. Независимо от регламентированных условий получения коммерческих препаратов, была апробирована репродукция всех бактериофагов в одинаковых усло- 69 виях. В качестве питательной среды использовали бульон Хоттингера (pH=7,4) с добавлением 0,2 % дрожжевого экстракта. В 50 мл питательной среды перед засевом добавляли 0,15 мл 10 % стерильного раствора хлористого кальция. Репродукцию бактериофагов проводили на авирулентном штамме В. anthracis СТИ. Используя отраслевой стандарт мутности ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России (ОСО 42-28-85, 10 единиц), из 20-часовой вегетативной культуры В. anthracis СТИ, готовили взвесь, 0,5 мл которой вносили в 50 мл жидкой питательной среды. После инкубирования при (36±1) 0С в течение 3 ч на орбитальном шейкере – 150 об/мин вносили 1 мл препарата бактериофагов (концентрация показана в таблице 13). Инкубировали ещё 24 ч в тех же условиях. Стерилизацию фаголизата производили фильтрованием через мембранные фильтры «Millipore» с диаметром пор 0,22 mM. Таблица 13 – Эффективность репродукции различных сибиреязвенных бактериофагов Исследуемые бактериофаги 186 Саратов Гамма А-26 ВА-9 К ВИЭВ FahВНИИВВиМ R/D-Ph-6 Концентрация фаговых частиц (БОЕ/мл3): в исходных пре- после внесения в в полученном фагопаратах бактесреду размножелизате риофагов до внения сения в среду 4,0×107 8×105 2,5×1010 2,0×107 4×105 1,5×1010 4,0×107 8×105 1,3×109 4,0×108 8×106 2,8×109 2,0×108 4×106 1,9×109 1,0×108 2×106 3,0×1010 1,0×108 2×106 1,9×1010 Согласно данным, приведенным в таблице 13, наиболее эффективная репродукция в стандартных условиях на авирулентном штамме размножения В. anthracis СТИ, была у бактериофагов186 и Саратов, концентрация которых повыси- 70 лась на пять порядков по сравнению с концентрацией фаговых частиц непосредственно после внесения их в среду размножения. Бактериофаги Fah-ВНИИВВиМ, Гамма А-26, R/D-Ph-6 повысили концентрацию на четыре порядка. Концентрация фагов ВА-9 и К ВИЭВ в этих условиях возросла на три порядка. Таким образом, более высокую репродуктивную активность показали бактериофаги 186 и Саратов, незначительно меньше была у фагов Fah-ВНИИВВиМ, R/D-Ph-6 и Гамма А-26. Тем не менее, в фаголизатах всех бактериофагов концентрация достигала уровня, необходимого для использования их в неразведенном виде в качественной пробе. Важной для производственного выпуска диагностических препаратов является стабильность специфической активности, обеспечивающаяся в конкретном случае сохранением достаточной концентрации бактериофагов на протяжении регламентированного срока годности. Были проведены опыты по определению динамики концентрации при длительном хранении в оптимальных условиях экспериментальных серий бактериофагов (186, ВА-9, К ВИЭВ, Саратов) и 3-х коммерческих препаратов бактериофагов (Гамма А-26, R/D-Ph-6, Fah-ВНИИВВиМ). С этой целью экспериментальные серии сибиреязвенных бактериофагов 186, ВА-9, К ВИЭВ, Саратов были разлиты в ампулы по 1 мл и в запаянном виде хранились вместе с коммерческими бактериофагами в условиях холодильника (4±2) 0С. Определение количественных показателей проводили по методу Грациа [Гольдфарб Д.М., 1961]. Качественные показатели бактериофагов проверяли на 10 штаммах сибиреязвенного микроба в стабильной R-форме. Анализ полученных данных достоверно показал, что хранение бактериофагов К ВИЭВ и ВА-9 в оптимальных условиях(4±2) 0С в течение двух лет практически не изменило их концентрации, в отличие от фагов 186, Саратов и коммерческих препаратов бактериофагов Fah-ВНИИВВиМ, R/D-Ph-6, у которых концентрация снизилась на порядок, а у бактериофага Гамма А-26 – на два порядка (таблица 14). При этом все сибиреязвенные бактериофаги сохраняли специфи- 71 ческую литическую активность при применении в виде неразведенного препарата по отношению к десяти использованным штаммам В. anthracis. Таблица 14 – Изменение концентрации сибиреязвенных бактериофагов в зависимости от срока хранения, БОЕ/мл Исследуемые бактериофаги 186 Начальная концентрация, (M±m) (2,5±0,1)×1010 Концентрация через 1 год, (M±m) (2,3±0,2)×109 Концентрация через 2 года, (M±m) (2,0±0,1)×109 Саратов (1,7±0,3)×1010 (1,6±0,1)×109 (1,3±0,3)×109 ВА-9 (2,8±0,2)×109 (2,2±0,3)×109 (1,6±0,2)×109 К ВИЭВ (1,9±0,13)×109 (1,6±0,1)×109 (1,4±0,1)×109 Гамма А-26 (1,3±0,4)×109 (1,2±0,1)×108 (1,0±0,4)×107 (4,6±0,2)×108 (3,0±0,3)×107 (2,6±0,07)×107 (1,8±0,4)×108 (1,7±0,1)×107 (1,4±0,2)×107 (коммерческий препарат) Fah-ВНИИВВиМ (коммерческий препарат) R/D-Ph-6 (коммерческий препарат) Изучение динамики концентрации бактериофагов и изменения их литической активности важно для определения сроков годности диагностических препаратов бактериофагов. По параметру сохранения исходной концентрации, все бактериофаги можно разделить на две группы. Бактериофаги первой группы (К ВИЭВ, ВА-9) сохранили концентрации на исходном уровне в течение срока наблюдения. Вторая группа была представлена фагами 186, Саратов, Fah-ВНИИВВиМ, R/D-Ph-6, Гамма А-26. Для второй группы было отмечено снижение концентрации, по мере увеличения времени хранения препаратов в данных условиях. Концентрация бактериофагов 186, Саратов, Fah-ВНИИВВиМ, R/D-Ph-6 снизилась на один порядок, а бактериофага Гамма А-26 – на два порядка. Несмотря на зафиксированные различия в 72 концентрации бактериофагов в зависимости от сроков хранения, спектр их литической активности в отношении штаммов B. anthracis, оставался стабильным на протяжении всего срока наблюдения. Нами была предпринята попытка моделирования температурно-временных режимов, которые могут возникнуть при транспортировке препаратов. С этой целью сибиреязвенные бактериофаги хранили при (25±1) 0С в течение 5 и 30 суток (предполагаемые сроки транспортировки). После этого определяли диагностический рабочий титр (ДРТ) бактериофагов и концентрацию фаговых частиц методом агаровых слоев по Грациа. Индикаторной культурой служил вакцинный штамм B. anthracis СТИ. Изучение стабильности показателей специфической активности диагностических сибиреязвенных бактериофагов, при кратковременном хранении в условиях температур, превышающих регламентированные (4±2) 0С, показало, что хранение бактериофагов Fah-ВНИИВВиМ, R/D-Ph-6, 186, Саратов, К ВИЭВ при температуре (25±1) 0С в течение 5 суток не изменило их начальную концентрацию и ДРТ (таблица 15). Таблица 15 – Изменения концентрации сибиреязвенных бактериофагов при кратковременном хранении в условиях температур, превышающих регламентированные, БОЕ/мл Исследуемые бактериофаги Концентрация вначале опыта, (M±m) (2,3±0,2)×109 Концентрация через 5 суток, (M±m) (2,0±0,1)×109 Концентрация через 30 суток, (M±m) (1,2±0,4)×109 К ВИЭВ (1,2±0,4)×109 (1,2±0,3)×109 (1,0±0,2)×108 Саратов (8,6±0,1)×109 (7,0±0,1)×109 (6,7±0,1)×108 ВА-9 (6,8±0,2)×109 (6,0±0,2)×108 (5,7±0,1)×107 Гамма А-26 (3,2±0,1)×109 (2,0±0,3)×108 (1,1±0,3)×107 R/D-Ph-6 (8,0±0,1)×108 (7,5±0,1)×108 (3,2±0,2)×108 Fah– ВНИИВВиМ (4,6±0,2)×107 (4,0±0,05)×107 (3,0±0,1)×107 186 73 Бактериофаги ВА-9 и Гамма А-26 оказались более чувствительными и через 5 суток их концентрация понизилась до 1×108 БОЕ/мл, при неизмененном ДРТ (10-5). Через 30 суток при указанном температурном режиме хранения у фагов Fah-ВНИИВВиМ, R/D-Ph-6 и 186 концентрация осталась прежней. Бактериофаги Саратов, К ВИЭВ и ВА-9, Гамма А-26 снизили концентрацию до 1×108 БОЕ/мл и 1×107 БОЕ/мл соответственно. ДРТ снизился у всех бактериофагов на порядок, что не влияло на эффективность применения указанных препаратов в качественном тесте с использованием неразведенного препарата. Сведения о подобного рода исследованиях в доступной нам литературе найти не удалось. Отношение сибиреязвенных бактериофагов Гамма А-26, 186 и R/D-Ph-6 к действию повышенных температур проверяли, прогревая их фаголизаты при температурах 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100º С в течение 15 мин. После прогревания сразу помещали при (4±2) 0С. Из, подвергнутых воздействию повышенных температур, фаголизатов готовили ряд последовательных десятикратных разведений и определяли концентрацию бактериофага в каждом разведении. Полученные данные сравнивали с контрольными показателями, вычисленными для тех же фагов, не подвергавшихся действию тепла. Изучение устойчивости сибиреязвенных бактериофагов Гамма А-26, 186 и R/D-Ph-6, к действию температур в диапазоне 30-100 0С, с интервалами 10 0С показало, что прогревание препаратов бактериофагов 186 и R/D-Ph-6 при температурах 30-50 0С в течение 15 минут не уменьшало концентрацию в них (таблица 16). Оба бактериофага после обработки при 60 0С снижали концентрацию на два порядка, при повышении температуры до 70 0С концентрация бактериофага 186 оставалась на том же уровне, а концентрация бактериофага R/D-Ph-6 уменьшалась еще на порядок. Оба бактериофага полностью инактивировались после воздействия температуры 90 0С. 74 Таблица 16 – Устойчивость сибиреязвенных бактериофагов к действию высоких температур Исследуемые бактериофаги Начальная концентрация 186 R/D-Ph-6 Концентрация бактериофагов (БОЕ/мл3) через 15 мин прогревания, (M±m) 30 0С 40 0С 50 0С 60 0С 70 0С 80 0С (5,2±0,3)×109 (3,8±0,3)×109 (3,4±0,2)×109 (3,3±0,1)×109 (2,6±0,05)×107 (2,1±0,1)×107 (5,8±0,1)×107 (4,7±0,1)×107 (4,3±0,3)×107 (3,9±0,4)×107 (3,2±0,3)×105 9 8 8 Гамма А-26 (4,8±0,2)×10 (4,2±0,1)×10 (4,1±01)×10 (4,0±0,2)×108 (2,0±0,1)×103 (2,0±0,5)×104 90 100 0 С 0С – – (1,6±0,2)×102 – – – – (1,2±0,4)×102 (1,3±0,15)×101 – 75 При прогревании препарата бактериофага Гамма А-26 при температурах 3050 0С его концентрация снижалась на порядок, после воздействия температуры 60 0С резко падала еще на 5 порядков, а в препарате прогретом при 70 0С определялись единичные негативные колонии фага. Таким образом, бактериофаги 186 и R/D-Ph-6 обладают более выраженной устойчивостью к воздействию высоких температур по сравнению с бактериофагом Гамма А-26. Е. Н. Левина и В.Р. Архипова изучали чувствительность к температуре бактериофагов ВА-9, Саратов, Гамма, β, άС, L7, нагревая фаги 15 мин при температуре 56 0С. Установили, что все бактериофаги оказались высокочувствительными к 56 0С, за исключением фага άС. В.М. Попова, исследуя бактериофаг R/D-Ph-6, показала, что он не инактивируется при температуре 55 0С в течение 45 минут. В целом, наши исследования подтвердили более высокую терморезистентность бактериофага R/D-Ph-6 по сравнению с бактериофагом Гамма А-26. В результате проведенных исследований показано, что диагностические сибиреязвенные бактериофаги Fah-ВНИИВВиМ, R/D-Ph-6, Гамма А-26, 186, ВА-9, Саратов, К ВИЭВ обладают свойствами, необходимыми для производства их в виде препаратов, эффективно размножаются на жидких культурах авирулентного штамма В. anthracis СТИ, в достаточной степени сохраняют специфическую активность при хранении при оптимальных температурах (4±2) 0С в течение двух лет и при кратковременных отклонениях условий хранения и транспортирования от регламентированных, если находятся при температуре до 25 0С продолжительностью до 30 суток. 4.2 Определение спектра специфической литической активности сибиреязвенных бактериофагов Пригодность специфических бактериофагов для применения в целях идентификации и фаготипирования соответствующих микроорганизмов определяется 76 в первом случае способностью лизировать широкий спектр микробов данного вида независимо от индивидуальных фенотипических особенностей, а во втором случае способностью лизировать или не лизировать часть штаммов, имеющих сходные особенности, более детально характеризующие их свойства. Исходя из этого, набор штаммов для сравнительного изучения диагностических свойств бактериофагов должен включать как типичные вирулентные штаммы, выделенные в различное время на отдаленных и сопредельных территориях из различного материала, так и штаммы с атипичным проявлением отдельных свойств. Для определения спектра специфической литической активности были использованы 114 штаммов B. anthracis, 91 из которых были выделены в природных условиях в период с 1956 по 2010 гг. (рисунок 2). Штаммы были изолированы из различных объектов: из материала от больных людей – 40; из почвы – 23; из материала от животных – 19; смывы с объектов – 3; из сточных вод – 3; прочие – 3. Данные об источниках выделения культур приведены на рисунке 3. Из оставшихся 23 штаммов, 16 являлись производными от вирулентных штаммов, селекционированными в разных лабораториях и 7 вакцинных штаммов. Результаты определения чувствительности 114 штаммов B. anthracis к лизирующему действию бактериофагов Гамма А-26, ВА-9, R/D-Ph-6, Fah- ВНИИВВиМ, К ВИЭВ, Саратов, 186 представлены в таблице 17. Лизабельность штаммов сибиреязвенного микроба бактериофагами Гамма А-26, ВА-9, R/D-Ph-6 была одинаковой в целом – 99,1 % и лишь незначительно различалась по группам штаммов. Бактериофаги Гамма А-26, ВА-9 не лизировали по одному типичному вирулентному капсульному штамму, а бактериофаг R/D-Ph-6 – один акапсульный штамм. Во всех положительных случаях лизис тестируемой культуры происходил на ++++. 77 Рисунок 2 – Сроки выделения штаммов B. anthracis в природных условиях 4% 3% 3% 44% 25% 21% материал от людей почва сточные воды материал от животных смывы с объектов прочие Рисунок 3 – Состав штаммов по источникам выделения 78 Таблица 17 – Чувствительность штаммов B. anthracis к сибиреязвенным бактериофагам Штаммы B. anthracis Саратов 186 79/80 (98,8 %) Сибиреязвенные бактериофаги R/D-Ph-6 FahК ВИЭВ ВНИИВВиМ 80/80 54/80 55/80 (100 %) (67,5 %) (68,7 %) Гамма А-26 ВА-9 Типичные по капсулообразованию 79/80 (98,8 %) 60/80 (75,0 %) 61/80 (76,3 %) Атипичные по капсулообразованию (включая SM) 26/26 (100 %) 26/26 (100 %) 25/26 (96,2 %) 10/26 (38,5 %) 10/26 (38,5 %) 10/26 (38,5 %) 10/26 (38,5 %) Атипичные по морфологии (OSS - варианты) Штаммы, не имеющие плазмиду pXO1- 4/4 (100 %) 4/4 (100 %) 4/4 (100 %) 0/4 (0 %) 0/4 (0 %) 0/4 (0 %) 0/4 (0 %) 1/1 (100 %) 1/1 (100 %) 1/1 (100 %) 1/1 (100 %) 1/1 (100 %) 1/1 (100 %) 1/1 (100 %) Бесплазмидные штаммы Всего % 3/3 (100 %) 113/114 99,1 3/3 (100 %) 113/114 99,1 3/3 (100 %) 113/114 99,1 3/3 (100 %) 68/114 59,6 3/3 (100 %) 69/114 60,5 3/3 (100 %) 74/114 64,9 3/3 (100 %) 75/114 65,8 Примечание: числитель - количество лизирующихся штаммов, знаменатель - общее количество штаммов 79 Бактериофаги Fah-ВНИИВВиМ, 186, Саратов, К ВИЭВ в большей степени различались по широте спектра лизируемых культур. При этом различия наблюдались только в группе вирулентных диплазмидных штаммов – наименьшее количество штаммов этой группы лизировали бактериофаги Fah-ВНИИВВиМ и К ВИЭВ (соответственно 67,5 % и 68,7 %), бактериофаги Саратов и 186 обладали несколько большей специфической активностью (соответственно 75,0 % и 76,3 %). Следует отметить, что и по интенсивности фаголизиса между этими бактериофагами отмечались различия. Так в группе штаммов B. anthracis с типичным капсулообразованием результат теста оценивался на 4+ (наличие абсолютной зоны лизиса без резистентных колоний) у бактериофагов Fah-ВНИИВВиМ – 68,7 %; К ВИЭВ – 75,0 %, Саратов – 80,0 %, 186 – 81,2 % штаммов. Таким образом, более высокими показателями специфической активности обладает бактериофаг 186 и незначительно меньшими – бактериофаг Саратов (рисунок 4). положительные результаты % 100 80 60 186 40 Бактериофаги: Саратов К 20 Fah 0 А Б Рисунок 4 – Сравнительная характеристика специфической активности бактериофагов 186, Саратов, К и Fah по отношению к типичным по капсулообразованию штаммам B. anthracis: А – процент положительных тестов от общего количества исследованных штаммов; Б – процент проб положительных на 4+ от количества положительных тестов. 80 Анализ количества различных вариаций отрицательных результатов теста (++,+,–) выявил в большем количестве четкие отрицательные результаты теста (-) с бактериофагами 186 и Саратов (рисунок 5). Абсолютно отрицательными считали результаты теста, в которых зона нанесения фага не содержит резистентных колоний. 90% абсолютно отрицательные результаты % 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 186 Бактериофаги: Саратов К Fah 0% Рисунок 5 – Процент абсолютно отрицательных (–) результатов тестов с бактериофагами 186, Саратов, К и Fah от общего числа отрицательных тестов по четырехкрестовой системе оценки с типичными по касулообразованию штаммами B. anthracis. Учитывая интерес, проявляемый в настоящее время, к бактериофагам в плане возможности применения их или синтезируемых ими лизинов в качестве антибактериального средства для лечения сибирской язвы, исследовали влияние капсулы на чувствительность бактериальных клеток к литическому действию сибиреязвенных бактериофагов. При определении способности к капсулообразованию in vitro и влияния капсулы на фагочувствительность, была отобрана группа штаммов B. anthracis различающихся по ряду фенотипических свойств: 1) типичные штаммы образующие капсулу in vivo и на сывороточно- бикарбонатном агаре в условиях повышенного содержания углекислого газа (B. anthracis 81/1, 1284); 2) штаммы, спо- 81 собные к капсулообразованию на питательных средах в атмосфере воздуха (B. anthracis 12/16 S, 140 П); 3) штаммы, не образующие капсулу ни при каких условиях, т. к. отсутствует плазмида рХО2 (B. anthracis СТИ, СТИ-II, 228/8, 55). В качестве питательных сред применялись: среда Хоттингера, среда, приготовленная на основе LB по Миллеру и бикарбонатно-сывороточная среда. При постановке пробы с бактериофагами классическим методом все штаммы, включая B. anthracis 12/16 S и 140 П, лизировались бактериофагами Гамма А26, ВА-9, R/D-Ph-6 (таблица 18). Бактериофаги Fah-ВНИИВВиМ, 186, ВА-9, Саратов, К ВИЭВ не лизировали штаммы СТИ-II и 55, обладающих признаками OSS-типа колоний. Таблица 18 – Способность штаммов к капсулообразованию и чувствительность к бактериофагам на среде Хоттингера Лизабельность сибиреязвенными бактериофагами на агаре Хоттингера Bacillus anthracis 81/1 1284 12/16 S 140 П СТИ-1 СТИ-II 228/8 55 Гамма А-26 ВА-9 R/D-Ph-6 FahВНИИВВиМ К ВИЭВ Саратов 186 ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++ ++ ++++ – ++++ – ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ – +++ – ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ – ++++ – ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ – +++ – Следует отметить, что штаммы B. anthracis 12/16 S и 140 П на различных питательных средах и отдельных сериях агара Хоттингера (не содержащих инактивированную сыворотку крови животных и бикарбонат натрия) не одинаково интенсивно синтезируют капсулу. Исходя из этого для сравнительной оценки чувствительности к бактериофагам штаммов с различным типом капсулообразования использовали более стандартную среду, приготовленную на основе LB по 82 Миллеру (фирма AppliChem, USA; состав: дрожжевой экстракт биохимический 5 г/л, натрий хлорид 10 г/л, триптон 10 г/л) Постановка теста была стандартной, инкубация осуществлялась в атмосфере воздуха. Результаты представлены в таблице 19. В этих условиях штамм B. anthracis 140 П рос в выраженной в SM-форме и не лизировался ни одним из бактериофагов. Штамм B. anthracis 12/16 S формировал блестящие колонии с менее выраженным слизистым слоем (в мазках, окрашенных по Ребигеру – палочки, окруженные капсулой менее выраженной, чем у штамма B. anthracis 140 П) лизировался бактериофагами Гамма А-26, ВА-9, R/D-Ph-6 и был устойчив к действию бактериофагов Fah-ВНИИВВиМ, 186, ВА-9, Саратов, К ВИЭВ. Остальные штаммы росли в акапсульной форме и все лизировались фагами Гамма А-26, ВА-9, R/D-Ph-6, в то время как бактериофаги Fah-ВНИИВВиМ, 186, ВА-9, Саратов, К ВИЭВ, как и на агаре Хоттингера, не лизировали штаммы СТИ-II и 55. Таблица 19 – Способность штаммов к капсулообразованию и чувствительность к бактериофагам на среде, приготовленной на основе LB Лизабельность сибиреязвенными бактериофагами на агаре LB Bacillus anthracis 81/1 1284 12/16 S 140 П СТИ-1 СТИ-II 228/8 55 Гамма А-26 ВА-9 R/D-Ph-6 FahК ВИЭВ ВНИИВВиМ Саратов 186 ++++ ++++ ++++ – ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ – ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ – ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ +++ – – ++++ – +++ – ++++ ++++ – – ++++ – +++ – ++++ ++++ – – ++++ – ++++ – ++++ +++ – – ++++ – +++ – При проведении теста на чувствительность к бактериофагам в условиях выращивания на сывороточно-содовой среде в атмосфере повышенного содержания углекислого газа в классическом варианте постановки пробы на месте нанесения 83 бактериофагов отмечалось некоторое разрежение газонного роста культуры, что могло возникнуть вследствие действия бактериофагов на акапсульную культуру, которая подращивалась в бульоне Хоттингера в обычных условиях (рисунок 6Б) (капсула еще не успела сформироваться после пересева на сывороточно-содовый агар и помещения в анаэростат). Для исключения такой возможности подращивание в бульоне было заменено приготовлением взвеси вегетативной культуры в капсульной форме (20-часовая культура, выращенная на сывороточно-содовом агаре в анаэростате), которую засевали на сывороточно-содовый агар и помещали в анаэростат. В этих условиях на фоне ровного газонного роста капсульной культуры не отмечалось никаких изменений (рисунок 6В). Контрольный тест в классической постановке был положителен со всеми бактериофагами (рисунок 6А). В следующем опыте для сравнительной оценки литического влияния бактериофагов на штаммы сибиреязвенного микроба с различным типом капсулообразования использовался указанный выше способ получения вегетативной культуры капсульных штаммов. Результаты, представленные в таблице 20, свидетельствуют, что в условиях культивирования оптимальных для капсулообразования, штаммы, формирующие капсулу, не чувствительны к действию всех испытанных бактериофагов. Штаммы, не имеющие генетических детерминант, ответственных за синтез капсульного вещества и формирование капсулы, сохраняли различия в чувствительности к бактериофагам Fah-ВНИИВВиМ, 186, ВА-9, Саратов, К ВИЭВ, ранее выявленные на обычных питательных средах (таблица 20). 84 Б А В Рисунок 6 – Чувствительность типичного по фенотипическим и генетическим свойствам штамма B. anthracis 81/1 к бактериофагам Гамма А-26, ВА-9, R/D-Ph-6, Fah-ВНИИВВиМ, 186, Саратов, К ВИЭВ при различных условиях проведения теста: А – классический тест, Б – посев бульонной культуры на сывороточно-содовый агар с инкубацией в атмосфере повышенного содержания углекислого газа, В – посев взвеси капсульной культуры на сывороточно-содовый агар с инкубацией в атмосфере повышенного содержания углекислого газа. В надписях на чашках обозначены бактериофаги: 1 – Гамма А-26; 2 – К ВИЭВ; 3 – FahВНИИВВиМ; 4 – Саратов; 5 – R/D-Ph-6; 6 – 186; 7 – ВА-9; 8 – R/D-Ph-6 в концентрации 106. 85 Таблица 20 – Способность к капсулообразованию и чувствительность к бактериофагам на бикарбонатно-сывороточной среде штаммов B. anthracis Лизабельность сибиреязвенными бактериофагами на бикарбонатно-сывороточном агаре в атмосфере повышенного содержания СО2 Bacillus anthracis 81/1 1284 12/16 S 140 П СТИ-1 СТИ-II 228/8 55 Гамма А-26 ВА-9 R/D-Ph-6 FahВНИИВВиМ К ВИЭВ Саратов 186 – – – – ++++ ++++ ++++ ++++ – – – – ++++ ++++ ++++ ++++ – – – – ++++ ++++ ++++ ++++ – – – – +++ – +++ – – – – – +++ – +++ – – – – – +++ – +++ – – – – – +++ – +++ – Результаты приведенных исследований свидетельствуют о том, что одним из решающих факторов чувствительности B. anthracis к литическому действию специфических бактериофагов является состояние (особенности) поверхностных структур бактериальных клеток, что на начальном этапе взаимодействия между бактериальной клеткой и бактериофагом нарушает процесс адсорбции. Бактериальные клетки B. anthracis в капсульной форме были не чувствительны к специфическому литическому действию всех использованных в работе сибиреязвенных бактериофагов, что делает проблематичным их применение для лечения больных людей и животных. Было четко выявлено, что штаммы в акапсульной форме, формирующие колонии OSS-тип, не лизируются бактериофагами Fah- ВНИИВВиМ, К ВИЭВ, Саратов и 186, что также связано с некоторыми изменениями строения поверхностных структур бактериальных клеток и биологическими особенностями указанных бактериофагов. 86 4.3 Изучение специфичности диагностических бактериофагов Bacillus anthracis Другим важным свойством бактериофагов, характеризующим их диагностическую пригодность, является их специфичность. Серьезной проблемой при использовании диагностических бактериофагов является отсутствие 100 % - ной специфичности. Поэтому на практике часто применяют комбинации бактериофагов. Для изучения специфичности сибиреязвенных бактериофагов использовали 75 штаммов представителей рода Bacillus, не относящихся к виду B. anthracis: B. сereus – 18 штаммов; B. thuringiensis – 14 штаммов, B. subtilis – 16 штаммов, В. megaterium– 7 штаммов, B. mesentericus – 1 штамм, B. species (spp.) – 19 штаммов. Контролем служил вакцинный штамм B. anthracis СТИ. Для исследования использовали классический чашечный метод. Оценка результатов проводилась по четырехкрестовой системе. Результаты исследования показали, что сибиреязвенные бактериофаги 186, К ВИЭВ и Саратов из экспериментальных серий, а также коммерческие препараты бактериофагов Fah-ВНИИВВиМ и R/D-Ph-6 не вызывали лизиса штаммов спорообразующих сапрофитов рода Bacillus и обладали 100 % специфичностью. Проявления неспецифического лизиса наблюдались при действии как коммерческого бактериофага Гамма А-26, так и экспериментальной серии бактериофага ВА-9, которые лизировали одни и те же штаммы близкородственных сапрофитов рода Bacillus (B. subtilis 35, 37, 336; B. megaterium 1, 2, 3). Лизис газонов культур исследуемых бацилл в зоне нанесения бактериофагов был выражен в разной степени. Спектры неспецифического литического действия бактериофагов Гамма А-26 и ВА-9 совпадали. Специфичность выражали процентным отношением количества не лизировавшихся штаммов спорообразующих сапрофитов рода Bacillus, к общему количеству штаммов (таблице 21). близкородственных бацилл, использованных в опыте 87 Таблица 21 – Сравнительная характеристика специфичности сибиреязвенных бактериофагов Бактериофаг Количество штаммов бацилл отдельных видов, лизирующихся бактериофагом Bacillus Bacillus megaterium mesentericus Всего Специфичность, % Bacillus cereus Bacillus thuringiensis Bacillus subtilis Bacillus species 186 0/18 0/14 0/16 0/7 0/1 0/19 0/75 100 R/D-Ph-6 0/18 0/14 0/16 0/7 0/1 0/19 0/75 100 Fah- 0/18 0/14 0/16 0/7 0/1 0/19 0/75 100 К ВИЭВ 0/18 0/14 0/16 0/7 0/1 0/19 0/75 100 Саратов 0/18 0/14 0/16 0/7 0/1 0/19 0/75 100 Гамма А-26 0/18 0/14 3/16 3/7 0/1 0/19 6/75 92 ВА-9 0/18 0/14 3/16 3/7 0/1 0/19 6/75 92 ВНИИВВиМ Примечание: числитель – количество лизирующихся штаммов, знаменатель - общее количество штаммов 88 С целью сопоставления чувствительности культур сапрофитов и B. anthracis к литическому действию бактериофагов Гамма А-26 и ВА-9 были определены значения их ДРТ по отношению к шести штаммам сапрофитов, которые лизировались неразведенными препаратами указанных бактериофагов (таблица 22). Таблица 22 – Сравнительная литическая активность бактериофагов Гамма А-26 и ВА-9 по отношению к B. anthracis CТИ и близкородственным сапрофитам Вид, штамм микроорганизма B. anthracis CТИ-1 B. subtilis 35 B. subtilis 37 B. subtilis 336 B. megaterium 1 B. megaterium 2 B. megaterium 3 Диагностический рабочий титр бактериофагов Гамма А-26 ВА-9 10-5 10-1 10-1 10-3 10-2 10-1 10-3 10-5 10-1 10-1 10-3 10-2 10-1 10-3 Из шести штаммов сапрофитов наибольшей чувствительностью обладали культуры B. subtilis 336 и B. megaterium 3, которые лизировались обоими бактериофагами в разведениях 1×10-3 (рисунок 7), однако разница в значениях ДРТ для этих культур и контрольного штамма B. anthracis СТИ составляла не менее двух порядков. Остальные четыре культуры лизировались в разведениях 1×10-1 – 1×10-2. ДРТ обоих бактериофагов для штамма B. anthracis СТИ составил 1×10-5. Исходя из концентрации бактериофагов в неразведенных препаратах бактериофагов Гамма А-26 и ВА-9 (1×109 БОЕ/мл), применение препаратов с концентрацией 1×105 БОЕ/мл должно обеспечить специфичность лизиса. 89 Б А Рисунок 7 – Различия литической активности бактериофага ВА-9 по отношению к культурам B. subtilis 336 и B. anthracis CТИ. В надписях на чашках обозначен бактериофаг ВА-9 в разведениях: 1 – 10-1; 2 – 10-2; 3 – 10-3; 4 – 10-4; 5 – 10-5; 6 – 10-6; 7 – 10-7; 8 – неразведенный препарат фага ВА-9. Таким образом, результаты исследований, проведенных в этом разделе работы, свидетельствуют о следующем. В большей степени были выражены различия в диагностических свойствах изученных бактериофагов – специфической активности и специфичности, анализ которых позволил прийти к следующим выводам. На наш взгляд, наиболее предпочтительным для идентификации культур B. anthracis является применение бактериофагов Гамма А-26, ВА-9 и R/D-Ph-6, которые в нашем исследовании лизировали 99,1 % штаммов B. anthracis с различными фенотипическими и генетическими свойствами. Для повышения специфичности теста на фаголизабельность бактериофагами Гамма А-26 и ВА-9 представляется перспективной возможность их применения в пределах значений ДРТ достаточных для лизиса культур B. anthracis, но исключающих неспецифический лизис близкородственных сапрофитов. 90 Бактериофаги К ВИЭВ, Fah-ВНИИВВиМ, Саратов и 186, обладая высокой специфичностью, не лизировали от 19 (23,7 %) до 26 (32,5 %) диплазмидных вирулентных и еще больший процент атипичных по капсулообразованию и морфологии колоний штаммов сибиреязвенного микроба, что может приводить к значительному проценту ошибок при идентификации штаммов возбудителя сибирской язвы. Эти бактериофаги представляют интерес для фаготипирования штаммов сибиреязвенного микроба, так как не лизируют значительное количество штаммов B. anthracis или выявляют в их популяциях фагорезистентные варианты, многие из которых обладают сходными культурально-морфологическими свойствами. Штаммы возбудителя сибирской язвы различаются по чувствительности к специфическим бактериофагам: 99,1 % исследованных штаммов чувствительны к бактериофагам Гамма А-26, ВА-9, R/D-Ph-6, и только 58,7-65,7 % чувствительны к бактериофагам Fah-ВНИИВВиМ, 186, Саратов, К ВИЭВ. Вероятно, такие различия в чувствительности штаммов сибиреязвенного микроба к отдельным бактериофагам обусловлены особенностями биологических свойств, как, поверхностных структур бактериальных клеток, так и бактериофагов. 91 ГЛАВА 5. ОПТИМИЗАЦИЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ РАЗЛИЧНЫХ СИБИРЕЯЗВЕННЫХ БАКТЕРИОФАГОВ ДЛЯ СОВЕРШЕНСТВОВАНИЯ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ 5.1 Изучение возможности использования видоспецифического сибиреязвенного бактериофага R/D-RH-6 для индикации возбудителя B. anthracis в РНФ Несмотря на наличие значительного количества описанных в литературе методов индикации возбудителя сибирской язвы, основанных на применении специфических сибиреязвенных бактериофагов, они не находят широкого применения в лабораторной практике. Часть методов требует разработки и сертификации препаратов и соответствующего оборудования для выполнения методических приемов [Тимаков В.Д., Гольдфарб Д.М., 1956; Ломов Ю.М., 1967; Королев Н.И., 1970; Колесов С.Г., 1976; Цыганкова О.И., 2007; Reiman R.W., 2007; Schuch R., 2002; Yoong P., 2006; Kikkawa M.S., 2008]. Простейшим методом, предложенным для этой цели, является метод нарастания титра фага (РТФ). В настоящее время выпускается коммерческий диагностический фаг-тест-набор «Оболенск R1», предназначенный для индикации и идентификации B. anthracis. Очевидно, что для использования в целях индикации B. anthracis в объектах окружающей среды, содержащих в большом количестве близкородственные сапрофиты рода Bacillus, бактериофаг должен обладать сочетанием широкого спектра литического действия на штаммы сибиреязвенного микроба с высокой специфичностью. По результатам проведенного нами сравнительного анализа указанных свойств семи сибиреязвенных бактериофагов: FahВНИИВВиМ, R/D-Ph-6, Гамма А-26, ВА-9, К ВИЭВ, Саратов и 186 (глава 4), этим требованиям в наибольшей степени отвечает бактериофаг R/D-RH-6. В тоже вре- 92 мя применение этого бактериофага в тесте РНФ требует более детального изучения количественных параметров динамики концентраций культуры B. anthracis и бактериофага, определения показателей специфической активности и специфичности в условиях их проявления в жидкой питательной среде. Важным является изучение возможного влияния присутствия сапрофитных представителей рода Bacillus на концентрацию фаговых частиц в фильтрате среды инкубирования. 5.1.1 Изучение динамики изменения концентрации сибиреязвенного микроба и бактериофага R/D-RH-6 при культивировании в бульонной культуре B. anthracis Для использования бактериофага в РНФ необходимо определить такие ключевые параметры как посевная доза идентифицируемого микроорганизма, время предварительного подращивания до внесения бактериофага, длительность совместной инкубации от внесения бактериофага до получения фильтрата. Учитывая тот факт, что индикации возбудителя сибирской язвы в пробах из объектов окружающей среды, где его концентрация редко достигает высоких значений, и для идентификации во взвесях чистых или смешанных культур нами были выбраны контаминирующие дозы 100 и 1000 спор B. anthracis СТИ на 1 мл питательной среды. В колбы с питательным бульоном вносили соответствующие дозы B. anthracis СТИ, помещали их в термостат при температуре 37 0С на орбитальном шейкере при 150 об/мин. Начиная с 2 ч инкубации в указанных условиях, осуществляли ежечасно отбор бульонной культуры и определяли в ней концентрацию колониеобразующих единиц (КОЕ). Результаты представлены в таблице 23. Определение концентрации культуры размножения методом высева на плотные питательные среды для микроорганизмов, образующих длинные цепочки в процессе размножения, дает только ориентировочные величины КОЕ. Ввиду этого, медленное нарастание концентрации КОЕ в течение 6 ч можно объяснить 93 увеличением количества микробных клеток в пределах цепочек без образования новых КОЕ. Тем не менее, вновь образующиеся микробные клетки доступны для адсорбции бактериофага с последующим его проникновением в клетку и размножением. Таблица 23 – Динамика нарастания концентрации бактериофага в жидкой культуре B. anthracis СТИ при различных посевных дозах Время инкубации, ч 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Концентрация бактериофага (БОЕ/мл) при посевных дозах, (M±m): 100 КОЕ/мл 1000 КОЕ/мл 2 (1,6 ± 0,12)×10 (1,4 ± 0,21)×103 (3,7 ± 0,24)×102 (2,5 ± 0,18)×103 (3,7 ± 0,21)×102 (5,3 ± 0,32)×103 (3,9 ± 0,12)×102 (9,0 ± 0,13)×103 (4,3 ± 0,21)×102 (2,1 ± 0,18)×104 (1,7 ± 0,14)×105 (1,0 ± 0,08)×106 (5,9 ± 0,32)×105 (2,2 ± 0,14)×106 (9,0 ± 0,14)×105 (9,8 ± 0,18)×106 (1,1 ± 0,24)×106 (1,1 ± 0,24)×107 (1,6 ± 0,30)×106 (4,9± 0,16)×107 (1,8 ± 0,30)×106 (9,0 ± 0,24)×107 Бурное нарастание на 2-3 порядка концентрации КОЕ при указанных условиях культивирования происходило на седьмом часу инкубации, а также еще на порядок на десятом часу, после чего до 12 ч (срок наблюдения) происходило незначительное медленное увеличение. Учитывая, что «Инструкцией по применению диагностического фаг-тестнабора («Оболенск R1») для идентификации сибиреязвенного возбудителя» при исследовании смешанной культуры используется взвесь вегетативной культуры, попытались определить концентрацию КОЕ во взвесях вегетативных культур трех штаммов B. anthracis СТИ, 55, 228/8, приготовленных по стандарту мутности ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России (ОСО 42-28-85 соответствующего года выпуска) 10 единиц. Полученные данные представлены в таблице 24. 94 Таблица 24 – Концентрация КОЕ во взвесях вегетативных культур B. anthracis, приготовленных по стандарту мутности (ОСО 42-28-85) Наименование штамма B. anthracis СТИ 55 228/8 Концентрация (КОЕ/мл) 1,2×107 4,9×107 1,1×107 Данные, представленные в таблице 24, свидетельствуют о том, что вне зависимости от индивидуальных особенностей штаммов B. anthracis, концентрация КОЕ во взвесях вегетативных культур B. anthracis, приготовленных по стандарту мутности (ОСО 42-28-85 соответствующего года выпуска) составляла в среднем (3,4±0,18)×107 КОЕ/мл. Одновременное определение динамики концентрации сибиреязвенного штамма-размножения и бактериофага в жидкой питательной среде оказалось невозможным, так как при высеве и последующей инкубации на плотных питательных средах происходил полный или частичный лизис культуры B. anthracis, находившейся в момент отбора пробы. Полученные данные не были достоверны, так как концентрации КОЕ рассчитанные по различным разведениям одной культуры, существенно различались, возрастая с увеличением степени разведения. Причиной этого явления следует считать уменьшение влияния бактериофага на данный показатель в связи со снижением его концентрации в более разбавленных пробах. В качестве примера в таблице 25 приведены результаты определения концентрации КОЕ в жидкой культуре B. anthracis СТИ при совместной инкубации с бактериофагом R/D-RH-6 в течение 8 ч, когда концентрация бактериофага достигла 3,8×108 БОЕ/мл. Полученные количественные характеристики бульонных культур и взвесей вегетативных культур B. anthracis использовались для стандартизации последующих экспериментов. 95 Таблица 25 – Концентрация B. anthracis СТИ по расчету из разных разведений при совместной инкубации с бактериофагом R/D-RH-6 Время инкубации Культура размножения B. anthracis СТИ разведение -1 -2 -3 8ч количество колоний (из 0,1мл) 2+3+2 37+33+42 208+190+203 концентрация, КОЕ/мл 4,7×102 3,73×103 2,00×106 5.1.2 Подбор оптимальных условий для получения высоких концентраций бактериофага R/D-RH-6 при размножении на чистых культурах B. anthracis Для определения зависимости конечной концентрации бактериофага от посевной дозы культуры размножения в 50 мл бульона Хоттингера с добавлением дрожжевого экстракта и хлорида кальция вносили взвесь спор B. anthracis СТИ в объеме 5 мл физиологического раствора с 0,1 % Твина-80 из расчета 10, 100, и 1000 КОЕ на 1 мл питательной среды. Колбы с посевами помещали в термостат при температуре (36±1) 0С на орбитальном шейкере при 150 об/мин. Через 3 ч добавляли по 1 мл препарата бактериофага R/D-RH-6 с концентрацией 1×106 БОЕ/мл, после чего продолжали инкубацию при тех же условиях в течение 12 ч. Полученный фаголизат фильтровали и определяли концентрацию бактериофага. Результаты представлены в таблице 26. Таблица 26 – Концентрация бактериофага R/D-RH-6 при размножении в бульонных культурах B. anthracis СТИ при инокуляции различными дозами спор Посевная доза культуры размножения B. anthracis СТИ 10 КОЕ/мл 100 КОЕ/мл 1000 КОЕ/мл Концентрация бактериофага R/D-RH-6, БОЕ/мл (M±m) (9,3±0,22)×105 (2,7±0,12)×108 (8,7±0,18)×107 96 В условиях данного опыта оптимальной для репродукции бактериофага оказалась доза 100 КОЕ штамма-размножения в 1 мл питательной среды. Следующим этапом явились опыты по подбору оптимальных доз вегетативной культуры размножения и срока размножения бактериофага R/D-RH-6, для получения фильтратов, с концентрацией 108-109 БОЕ/мл. Готовили взвесь 20часовой агаровой культуры B. anthracis СТИ по стандарту мутности (ОСО 42-2885 соответствующего года выпуска) 10 единиц в физиологическом растворе с 0,1 % Твина-80 и ее десятикратное разведение. В две колбы с 50 мл бульона Хоттингера с добавлением дрожжевого экстракта и хлорида кальция вносили исходную взвесь B. anthracis СТИ и ее десятикратное разведение в объеме 5мл. Колбы с посевами помещали в термостат при температуре (36±1) 0С на орбитальном шейкере при 150 об/мин. Через 3 ч добавляли по 1 мл препарата бактериофага R/D-RH-6 с концентрацией 106 БОЕ/мл, после чего продолжали инкубацию в указанных условиях, отбирая пробы через 3, 6, 8 и 10 ч, в которых после фильтрации определяли концентрацию бактериофага. Поскольку требовалось установить длительность инкубации, необходимую для получения фильтратов с концентрацией фаговых частиц не менее 108 БОЕ/мл, определение начинали с разведения получаемого фаголизата 10 -7 и более. Наибольшее нарастание концентрации бактериофага в более ранние сроки было зарегистрировано при инокуляции 50 мл питательной среды 5 мл взвеси вегетативной культуры B. anthracis СТИ из расчетной концентрации 1×108 КОЕ/мл (таблица 27). Таким образом, в качестве оптимальной посевной дозы для репродукции бактериофага R/D-RH-6 была определена посевная доза взвеси сибиреязвенного микроба из расчетной концентрации 1×108 КОЕ/мл, которая в объеме 5 мл вносилась в 50 мл питательного бульона. 97 Таблица 27 – Динамика концентрации бактериофага R/D-RH-6 при размножении в бульонных культурах B. anthracis СТИ при инокуляции различными дозами вегетативной культуры Длительность инкубации после внесения бактериофага, ч 3 6 8 10 Концентрация бактериофага R/D-RH-6 БОЕ/мл (M±m) при посевных дозах: 5 мл взвеси по стандарту 5 мл взвеси из расчетной мутности (ОСО 42-28-85) концентрации 1×108 10 единиц (M±m) КОЕ/мл (M±m) не определяется не определяется не определяется (1,3±0,10)×109 (1,6±0,12)×108 (9,0±0,24)×109 (1,0±0,18)×109 (9,0±0,32)×1010 5.1.3 Испытание специфической активности бактериофага R/D-RH-6 в РНФ на различных штаммах сибиреязвенного микроба Готовили взвесь 20-часовой агаровой культуры испытуемого штамма B. anthracis по стандарту мутности (ОСО 42-28-85 соответствующего года выпуска) 10 единиц в физиологическом растворе с 0,1 % Твина-80 и ее десятикратное разведение до расчетной концентрации 1×108 КОЕ/мл. Из последнего 5 мл взвеси вносили в колбу с 50 мл бульона Хоттингера с добавлением дрожжевого экстракта и хлорида кальция. Колбы с посевами помещали в термостат при температуре (36±1) 0С на орбитальном шейкере при 150 об/мин. Через 3 ч добавляли 1 мл препарата бактериофага R/D-RH-6 с концентрацией 1×106 БОЕ/мл, после чего продолжали инкубацию в этих же условиях в течение 8 ч. При внесении 1 мл препарата бактериофага с концентрацией 1×106 БОЕ/мл в 50 мл бульонной культуры B. anthracis его начальная концентрация в бульоне составляла 2×104 БОЕ/мл. В качестве индикаторного штамма для определения концентрации, размноженного в данных условиях бактериофага, использовали штамм B. anthracis СТИ. Полученные результаты представлены в таблице 28. 98 Таблица 28 – Конечная концентрация бактериофага R/D-RH-6 при использовании различных штаммов B. anthracis в РНФ Наименование штамма B. anthracis СТИ 55 228/8 Sterne 34 F2 Ихтиман СТИ-ПР 71/12 2-я вакцина Пастера 81/1 1(СО) 1(СО)-S 1177 1283 1284 12/16 12/16-S 140 П 401/109 1190 1269 228 555/288 885/65 272/103-Д 18/54 15/47 1020/11 73/42 388/1 517/133 63/112 Концентрация бактериофага, БОЕ/мл3 (M±m) (9,0±0,24)×109 (2,3±0,18)×1010 (1,2±0,12)×1010 (1,4±0,21)×1010 (1,6±0,18)×109 (4,4±0,25)×1010 (7,1±0,32)×108 (2,0±0,16)×109 (2,9±0,24)×109 (2,5±0,14)×109 (2,9±0,23)×108 (7,1±0,28)×109 (1,1±0,12)×1011 (8,8±0,30)×108 (3,6±0,18)×108 (2,3±0,22)×108 (1,3±0,14)×108 (3,5±0,21)×109 (1,4±0,18)×109 (4,0±0,14)×109 (2,6±0,22)×108 (6,4±0,27)×109 (4,5±0,16)×109 (2,2±0,24)×109 (8,3±0,34)×109 (7,0±0,28)×109 (5,5±0,24)×109 (8,7±0,32)×109 (1,2±0,19)×109 (1,0±0,12)×109 (1,2±0,23)×1010 Было показано, что при использовании в качестве культуры размножения 31 штамма B. anthracis наблюдалось эффективное размножение бактериофага: на 18 из них (58,1 %) концентрация последнего достигала 1×109БОЕ/мл, на 7 (22,6 %) – 99 108 БОЕ/мл, на 5 (16,1 %) – 1010 БОЕ/мл и только на одном штамме (3,0 %) – 1011 БОЕ/мл, при этом минимальное увеличение концентрации бактериофага составляло четыре порядка. Следует отметить, что из 7 штаммов B. anthracis, обеспечивших наименьшее нарастание концентрации бактериофага, 5 – были атипичными по тем или иным признакам (питательные потребности, токсино- и капсулообразование, гемолитическая и протеолитическая активность (Цыганкова О.И., 2008)), а 2 штамма B. anthracis не были нами изучены по указанным свойствам. Таким образом, в экспериментально подобранных условиях при работе с чистыми культурами B. anthracis бактериофаг R/D-RH-6 способен успешно идентифицировать в РНФ штаммы сибиреязвенного микроба. 5.1.4 Изучение специфичности бактериофага R/D-RH-6 в РНФ на различных штаммах сапрофитных представителей рода Bacillus Широко известно, что практически все сибиреязвенные бактериофаги, использующиеся для идентификации B. anthracis, в большей или меньшей степени проявляют литическую активность и к близкородственным бациллам. Задачей данного этапа работы была проверка возможности нарастания концентрации бактериофага R/D-RH-6 при культивировании в бульонных культурах близкородственных бацилл. Все условия опыта были аналогичны условиям, описанным в разделе 5.3. Результаты представлены в таблице 29. При совместной инкубации бактериофага R/D-RH-6 с половиной (50 %) из 10 использованных культур отмечалось уменьшение концентрации бактериофага, а еще у 30 % – присутствие бактериофага не определялось. Возможно, это является следствием адсорбции фаговых частиц на клетках бацилл без последующего эффективного размножения, сопровождающегося лизисом клетки и выходом бактериофага в жидкую среду. В таком случае при фильтрации через мембранные фильтры вместе с бактериальной массой бактериофаг извлекается из жидкой сре- 100 ды. Таблица 29 – Конечная концентрация бактериофага R/D-RH-6 при использовании различных штаммов представителей рода Bacillus в РНФ Концентрация бактериофага (БОЕ/мл3), (M±m) (2,2±0,22)×102 Культура B. thuringiensis 5 B. thuringiensis var. Finitimus B. megaterium 1 B. megaterium 2 B. cereus 8 B. cereus 104 B. cereus 16 B. cereus 569 (23) B. subtilis 36 B. subtilis 37 (6,3±0,18)×101 не определяется (3,8±0,16)×104 не определяется не определяется (1,2±0,24)×103 (1,7±0,26)×103 (1,2±0,12)×103 (2,4±0,22)×106 При использовании B. megaterium 2 концентрация бактериофага оставалась того же порядка, как и при внесении в среду культивирования. Способной обеспечивать размножение бактериофага R/D-RH-6 оказалась одна культура (10 %) – B. subtilis 37. При совместном с B. subtilis 37 культивировании бактериофага R/DRH-6, концентрация последнего возрастала на 2 порядка. 5.1.5 Изучение специфической активности бактериофага R/D-RH-6 в РНФ в смешанных культурах Поскольку при испытании специфичности бактериофага R/D-RH-6 в РНФ было выявлено уменьшение его концентрации после совместной инкубации с некоторыми сапрофитными представителями рода Bacillus, представляло интерес оценить возможность нарастания концентрации бактериофага при размножении на смешанных культурах. 101 Условия опыта были аналогичны предыдущим за исключением того, что при посеве в жидкую питательную среду помимо обычной дозы B. anthracis СТИ вносилась такая же доза или 0,1 дозы одного из сапрофитов. Результаты представлены в таблице 30. Таблица 30 – Конечная концентрация бактериофага R/D-RH-6 при его репродукции на B. anthracis СТИ совместно с различными представителями рода Bacillus в РНФ Видовой состав и соотношение (объем/объем) культур во взвеси, использовавшейся для инокуляции питательной среды B. anthracis СТИ/B. cereus 8 (1/1) Концентрация бактериофага, БОЕ/мл3 (M±m) (3,7±0,12)×107 B. anthracis СТИ/B. cereus 8 (1/0,1) (6,7±0,18)×107 B. anthracis СТИ/B. thuringiensis var. Finitimus (1/1) B. anthracis СТИ/B. thuringiensis var. Finitimus (1/0,1) B. anthracis СТИ/B. megaterium 1(1/1) B. anthracis СТИ/B. megaterium 1(1/0,1) (4,6±0,22)×105 (1,1±0,18)×107 (5,7±0,24)×105 (1,8±0,26)×106 Полученные результаты свидетельствуют о том, что присутствие, по крайней мере, некоторых близкородственных представителей рода Bacillus в среде размножения снижает на 2-3 порядка конечную концентрацию бактериофага R/DRH-6 по сравнению с репродукцией на чистых культурах B. anthracis. Увеличение инокулирующей дозы указанных сапрофитов в большей мере снижало конечную концентрацию бактериофага. Тем не менее, во всех вариантах проб наблюдалось возрастание концентрации бактериофага как минимум на 1 порядок и более. 102 5.1.6 Изучение специфической активности бактериофага R/D-RH-6 в РНФ на пробах из объектов окружающей среды Одной из задач данной работы было испытание бактериофага R/D-RH-6 в РНФ на материале, имитирующем пробы окружающей среды, контаминированные B. anthracis. Пробы из сена, зерна (фуражный ячмень) и почвы готовили в соответствии с МУК 4.2.2413-08, затем контаминировали спорами B.anthracis СТИ из расчета, чтобы при посеве 5 мл такой пробы в 50 мл питательной среды концентрация КОЕ составила 100 КОЕ/мл. Все остальные условия опыта были аналогичны предыдущим. В качестве контроля в бульон засевали те же пробы, неконтаминированные B. anthracis, и исследовали по общей схеме. Результаты представлены в таблице 31. Таблица 31– Конечная концентрация бактериофага R/D-RH-6 в РНФ при использовании проб объектов окружающей среды Вид пробы почва + B. anthracis СТИ почва сено + B. anthracis СТИ сено зерно + B. anthracis СТИ зерно Концентрация бактериофага, БОЕ/мл3 (M±m) (6,6±0,28)×106 (3,1±0,18)×103 (2,0±0,14)×106 (2,6±0,16)×103 (1,5±0,24)×107 (2,7±0,22)×103 В пробах, контаминированных спорами B.anthracis СТИ, наблюдалось увеличение концентрации бактериофага на 1-2 порядка, что дает основание считать результат РНФ положительным. В контрольных пробах отмечалось снижение концентрации бактериофага на 1 порядок. 103 5.2 Изучение возможности повышения эффективности фагодиагностики сибирской язвы при комплексном использовании бактериофагов с различным литическим спектром 5.2.1 Выделение фагорезистентных сибиреязвенных культур и определение их чувствительности к различным бактериофагам В соответствии с МУК 4.2.2413-08, лизабельность сибиреязвенными бактериофагами является одним из трех опорных тестов, позволяющих идентифицировать штаммы сибиреязвенного микроба. Оценка результатов теста на лизабельность специфическими бактериофагами проводится визуально по характеру изменений газонного роста тестируемой культуры в месте нанесения бактериофага от полного лизиса культуры («++++» – положительный результат) до абсолютного отсутствия следов нанесения бактериофага («–» – отрицательный результат). Однако кроме таких результатов встречаются промежуточные варианты: наличие единичных или множественных изолированных колоний в зоне лизиса, четко очерченная зона лизиса с покрывающей ее едва заметной пленкой культуры. Такие варианты зоны лизиса затрудняют четкую объективную оценку результатов теста. Их причиной является наличие в популяции исследуемых штаммов в различном соотношении чувствительных и резистентных к конкретному бактериофагу бактериальных клеток. Работу по изучению особенностей взаимодействия бактериофагов с различными штаммами сибиреязвенного микроба начали, отбирая колонии из зон лизиса различными бактериофагами при постановке качественной классической пробы согласно МУК 4.2.2413-08. Резистентные колонии отсевали на агар Хоттингера и при получении хорошего роста ставили пробу на чувствительность ко всем бактериофагам. Всего было отобрано 102 варианта штаммов B. anthracis по признаку устойчивости к тому или иному бактериофагу (таблица 32). 104 Таблица 32 – Количество выделенных фагорезистентных вариантов B. anthracis по отношению к бактериофагам Гамма А-26, ВА-9, R/D-Ph-6, К ВИЭВ, Fah-ВНИИВВиМ, Саратов, 186 и характеристика их чувствительности к указанным бактериофагам Варианты культур выделенные по признаку резистентности к бактериофагам: Количество Из общего числа чувствительны к лизирующему действию бактериофагов: фагорезистентных R/D-Ph-6 FahК ВИЭВ Саратов 186 вариантов Гамма А-26 ВА-9 Гамма А-26 3 0/0* 0/0 2/67 2/67 2/67 3/100 2/67 ВА-9 5 0/0 0/0 4/80 3/60 4/80 4/80 4/80 FahВНИИВВиМ К ВИЭВ 32 31/97 31/97 31/97 1/3 0/0 0/0 0/0 23 23/100 23/100 23/100 0/0 0/0 0/0 0/0 Саратов 20 20/100 20/100 20/100 0/0 0/0 0/0 2/10 186 17 17/100 17/100 17/100 0/0 0/0 0/0 0/0 R/D-Ph-6 2 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 Всего 102 ВНИИВВиМ Примечание: *числитель – количество лизирующихся штаммов/знаменатель – процент от общего числа лизированных штаммов 105 Чаще всего выделялись культуры, резистентные к бактериофагам FahВНИИВВиМ (32), К ВИЭВ (23), Саратов (20), 186 (17) – всего 92 культуры. Из них 88 (95,7 %) культур были резистентны к литическому действию всех бактериофагов этой группы, но лизировались бактериофагами Гамма А-26, R/D-Ph-6, ВА-9. Только 4 из отобранных культур отличались от них по спектру фагорезистентности. Две из них были дополнительно чувствительны к бактериофагу186, 1 культура была чувствительна к бактериофагу Fah-ВНИИВВиМ и 1 оказалась резистентной к действию всех бактериофагов. Значительно реже выделялись культуры по признаку резистентности к лизирующему действию бактериофагов ВА-9 (5), Гамма А-26 (3) и R/D-Ph-6 (2). Все 10 культур были нечувствительны к бактериофагам Гамма А-26 и ВА-9, но 4 из них были чувствительны к бактериофагам R/D-Ph-6, Fah-ВНИИВВиМ, К ВИЭВ, Саратов, 186 и 1 была аналогична им, за исключением резистентности к бактериофагу Fah-ВНИИВВиМ. Остальные 5 культур отличались полирезистентностью к действию специфических сибиреязвенных бактериофагов – 4 были нечувствительны ко всем бактериофагам, 1 лизировалась только бактериофагом Саратов. На основе анализа данных, представленных в таблице 32, можно выделить 3 группы фагорезистентных культур B. anthracis, имеющие общие закономерности внутри каждой группы в чувствительности к изученным бактериофагам: 1. Культуры, выделенные по признаку резистентности к бактериофагам Гамма А-26 и ВА-9; 2. Культуры, выделенные по признаку резистентности к бактериофагам К ВИЭВ, Fah-ВНИИВВиМ, Саратов, 186; 3. Культуры, выделенные по признаку резистентности к бактериофагу R/D-Ph-6. На рисунке 8 представлена характеристика фагорезистентности культур- первой и второй группы по отношению к действию всех изученных бактериофагов. Культуры первой группы, выделенные по признаку резистентности к бактериофагам Гамма А-26 и ВА-9 сохраняли фагорезистентность к обоим бакте- 106 риофагам, при этом резистентность к литическому действию остальных бактериофагов проявлялась лишь в 18-38 %. Фагорезистентные культуры второй группы еще более четко демонстрировали различия в чувствительности к различным бактериофагам. Резистентным к действию бактериофагов Гамма А-26, ВА-9, R/D-Ph-6 оказался только 1 % культур (1 вариант был резистентен к действию всех бактериофагов), тогда как 98-100 % из них были устойчивы к специфическому действию бактериофагов К ВИЭВ, Fah-ВНИИВВиМ, Саратов, 186. Немногочисленные культуры B. anthracis третьей группы (2) были резистентны к действию всех использованных в работе бактериофагов. 100% 90% Бактериофаги: 80% 70% Гамма А-26 60% ВА9 50% R\D-Fh-6 40% Fah 30% К 20% Саратов 10% 186 0% культуры 1 группы культуры 2 группы Рисунок 8 – резистентность двух групп фагорезистентных культур B. anthracis к различным сибиреязвенным бактериофагам На основе полученных данных использованные нами в работе сибиреязвенные бактериофаги можно разделить на три группы: 1. Гамма А-26, ВА-9; 2. К ВИЭВ, Fah-ВНИИВВиМ, Саратов, 186; 3. R/D-Ph-6 Бактериофаги первой группы по воздействию на все 102 фагорезистентные культуры давали 100%-ное совпадение (92 положительных, 10 отрицательных) результатов. Бактериофаги второй группы наиболее часто выявляют резистентные по отношению к ним колонии штаммов B. anthracis, которые в зоне лизиса нередко находятся, в большом количестве и затрудняют учет результатов теста. Совпадение результатов определения чувствительности к бактериофагам этой группы культур, выделенных по признаку резистентности к отдельным из них, составляло 96,8 %. Бактериофаг R/D-Ph-6 несколько отличается по своему спектру литической активности от бактериофагов первой и второй группы. Он, также как и бактериофаги Гамма А-26 и ВА-9, лизировал все культуры, выделенные по признаку резистентности к бактериофагам второй группы, но, кроме того, лизировал и 62,5 % культур, выделенных по признаку резистентности к бактериофагам первой группы. Применение данного бактериофага позволило выделить наименьшее количество резистентных культур (2), которые оказались нечувствительны к действию всех бактериофагов. Из общего числа фагорезистентных культур (102) бактериофагом R/D-Ph-6 не лизировалось наименьшее количество культур (5). Все они были резистентны ко всем испытанным бактериофагам. Для идентификации культур B. anthracis предпочтительно применение наиболее вирулентных бактериофагов, резистентность к которым выявляется в минимальном количестве случаев при равных показателях специфичности. 108 5.2.2 Разработка оптимальной схемы комплексного применения сибиреязвенных бактериофагов с различным спектром специфической активности для идентификации и фаготипирования штаммов B. anthracis При оценке результатов классической пробы на чувствительность штаммов B. anthracis к бактериофагам в положительных случаях выявлялась зона лизиса культуры в пределах которой полностью отсутствовал рост культуры. При отрицательном результате газонный рост культуры оставался абсолютно неизмененным или внутри круга, отмечающего контуры зоны нанесения препарата бактериофага, наблюдался несколько угнетенный, но равномерно покрывающий всю зону рост культур, так называемая «пленка». Это позволило предположить неоднородность состава популяции культуры по чувствительности в отношение различных сибиреязвенных бактериофагов. Чтобы проверить это предположение, были отобраны 10 штаммов B. anthracis: 5/1, 505/628, 542/151, 592/10, 646/294, 1194, 1198, 1204, 1257, WAUm 44, где в зонах лизиса наблюдали рост культуры виде «пленки». Споры этих штаммов отсевали на чашки Петри с агаром Хоттингера (рН 7,4). После инкубации через 24 ч при температуре (36±1) 0С, определяли морфологию колоний невооруженным глазом и под малым увеличением в микроскопе. При изучении морфологии колоний отмечали две разновидности: 1 – колонии шероховатые, неровные, с отростками, переходящие в завитки в виде локонов волос; 2 – колонии шероховатые, круглые, по краю колоний очень мелкий завиток. В литературе представлены данные, что по морфологии колоний на агаре Хоттингера (независимо от способности образовывать капсулу) штаммы культур сибиреязвенного микроба можно разделить на два типа – I и II. Варианты I типа образуют крупные плоские шероховатые колонии с пологими краями в выраженной R-форме. Морфологический вариант II характеризовался выпуклой гладкой блестящей поверхностью, малыми размерами колоний в S-форме, в диаметре в 1,5-2 раза меньшими по сравнению с вариантом I. Культуры двух типов различа- 109 лись также по ферментативной активности и чувствительности к некоторым бактериофагам [Цыганкова О.И.,1993, 2007; Маринин Л.И. с соавт., 2009]. Отобранные формы колоний обоих типов проверили на чувствительность к бактериофагам. В результате, колонии, находящие в R-форме (I тип), лизировались всеми бактериофагами: Гамма А-26, ВА-9; R/D-Ph-6, а колонии, находящие в S-форме (II тип) только фагами первой и третьей групп: Гамма А-26, ВА-9; R/DPh-6 (рисунок 9 – А и Б). Результаты на чувствительность к бактериофагам исходного штамма 646/294 и смеси выделенных его вариантов I и II типов (рисунок 9 – В и Г) выглядели однотипно: лизис культуры происходил только под действием бактериофагов Гамма А-26, ВА-9 и R/D-Ph-6. Таким образом, в результате проведенных исследований были выявлены различия в чувствительности к литическому действию сибиреязвенных бактериофагов штаммов B. anthracis и их вариантов, имеющих различия по культурально-морфологическим свойствам. Учитывая значительную частоту встречаемости штаммов B. anthracis и их культуральных вариантов нечувствительных к специфическому действию бактериофагов К ВИЭВ, Fah-ВНИИВВиМ, Саратов, 186, а также общность культурально-морфологических свойств этих культур, нами была поставлена задача разработать схему комплексного применения сибиреязвенных бактериофагов с различным спектром специфической активности с целью идентификации и фаготипирования штаммов сибиреязвенного микроба. Способность сибиреязвенных культур лизироваться под действием тех или иных специфических бактериофагов зависит как от биологических свойств фагов, так и от индивидуальных особенностей штаммов B. anthracis. Исходя из этого, оптимальным представляется подбор и одновременное применение бактериофагов с различной широтой литического спектра, один из которых лизирует все культуры B. anthracis и обеспечивает надежность теста идентификации сибиреязвенных штаммов, а второй проявляя избирательность в литическом действии по отношению к части культур имеющих сходные свойства, способен эффективно выявлять эти различия. Различия в широте спектра специфического литического действия сибиреязвенных бактериофагов описаны во многих публикациях посвя- 110 щенных этой теме [Цыганкова О.И.. 1998; Васильев П.Г. с соавт., 1998, 1999; Методы изучения биологических свойств…, 2009; Саяпина Л.В. с соавт., 2011; Головинская Т.М. с соавт, 2011, 2013;]. А Б В Г Рисунок 9 – Различная чувствительность культуральных вариантов двух ти- пов B. anthracis к бактериофагам различных групп: А – вариант I типа R-форме, Б – вариант II типа в OSS-форме, В – вариант II типа, Г – варианты I и II типа. В надписях на чашках обозначены бактериофаги: 1 – Гамма А-26; 2 – К ВИЭВ; 3 – Fah-ВНИИВВиМ; 4 – Саратов; 5 – R/D-Ph-6; 6 – 186; 7 – ВА-9; 8 – R/D-Ph-6 в разведении 106. 111 Согласно литературным данным нередко выделяются B. anthracis в целом или отдельные культуральные варианты в их популяции, резистентные к специфическому литическому действию тех или иных бактериофагов [Березкина Г.П., 1978; Васильев П.Г. с соавт, 1998; Цыганкова О.И., 1998; Саяпина Л.В., 2011]. Рядом авторов отмечается корреляция фагорезистентности с такими свойствами, как культурально-морфологические особенности, наличие специфических рецепторов, нарушения S-слоя клеточной стенки, состояние лизогении [Буланцев А.А.,1992; Ипатенко Н.Г., 2000; Fouet A. еt al., 1998; Davison S. еt al., 2005; BishopLilly K.A. et al., 2012]. Фаготипирование используется как метод изучения индивидуальных особенностей штаммов некоторых микроорганизмов. В настоящее время наиболее полно и тщательно разработаны методы фагодиагностики и фаготипирования стафилококков, бактерий брюшного тифа и паратифов, синегнойной палочки и др. [Крылова М.Д., 1963; Македонова Л.Д. с соавт., 2001; Сидоренко С.В. с соавт., 2003; Кересилидзе М., 2006; Митрохина Е.Н., 2006; Габисония Т., 2010]. Методы фаготипирования штаммов B. anthracis разработаны не были. Исходя из этого, первым этапом в подборе бактериофагов для комплексного применения с целью проведения идентификационного теста и фаготипирования изучаемых культур, было намечено выделение из популяций штаммов вариантов резистентных к литическому действию отдельных бактериофагов и последующее изучение их чувствительности ко всем семи изученным в работе бактериофагам. При изучении специфической литической активности бактериофагов Гамма А-26, ВА-9, R/D-Ph-6, 186, Fah-ВНИИВВиМ, К ВИЭВ, Саратов было выявлено, что по широте спектра литического действия их можно разделить на две группы. К первой группе относятся бактериофаги Гамма А-26, ВА-9, R/D-Ph-6, лизирующие 99,1 % штаммов B. anthracis, ко второй группе – бактериофаги 186, FahВНИИВВиМ, К ВИЭВ, Саратов лизирующие 59,6-65,8 % этих же штаммов. Исходя из этого, с целью идентификации и фаготипирования штаммов сибиреязвенного микроба оптимально одновременное применение бактериофагов с различной широтой литического спектра, один из которых лизирует все культуры 112 B. anthracis и обеспечивает надежность теста идентификации сибиреязвенных штаммов, а второй, проявляя избирательность в литическом действии по отношению к части культур, имеющих сходные свойства, способен эффективно выявлять эти различия. Оптимальным для идентификации является схема комплексного применения бактериофагов Гамма А-26 и R/D-Ph-6. Для фаготипирования была разработана следующая схема проведения комплексного теста. Из первой группы нами был выбран бактериофаг Гамма А-26, из второй группы предпочтение в применении для фаготипирования штаммов сибиреязвенного микроба было отдано бактериофагу 186, т. к. он лизировал большее (в данной группе бактериофагов) количество штаммов и в положительных случаях давал более четкие результаты. Чувствительность культур к специфическим бактериофагам определяли чашечным методом. Свежеприготовленные чашки с агаром Хоттингера перед постановкой пробы подсушивали в термостате. Расчерчивали дно чашки снаружи на 2 сектора. Вегетативную 5-часовую культуру исследуемого штамма в объеме 0,5 мл наносили на подсушенную поверхность агара Хоттингера, осторожными движениями распределяли по поверхности. Чашки с приоткрытыми крышками подсушивали в термостате до полного впитывания жидкости. Затем в центр каждого сектора, засеянного культурой, наносили дозатором (6,5 мкм) или пипеткой каплю цельного препарата одного из бактериофагов. После впитывания капли фага, чашки переворачивали и инкубировали при (36±1) 0С в течение (19±1) ч. Результат оценивали визуально. Посевы просматривали невооруженным глазом. Лизис оценивали по четырехкрестовой системе. Полный лизис культуры на месте нанесения бактериофага оценивали на (++++); наличие единичных колоний культуры на фоне зоны её лизиса в месте нанесения – на (+++), резкое ослабление роста – на (++), наличие единичных негативных колоний бактериофага на фоне сплошного роста культуры – на (+), отсутствие лизиса – (–). Положительной считают пробу при оценке не менее чем на (+++). Тест сопровождали двумя контролями: 113 Положительный контроль. Чашку Петри с АХ засевали индикаторным 1. штаммом B.anthracis CТИ. Чувствительность к бактериофагам определяют по стандартной методике. Отрицательный контроль. Чашку Петри с АХ засевали близкород- 2. ственным сапрофитом рода Bacillus, резистентным к действию сибиреязвенных бактериофагов. Чувствительность к бактериофагам определяли по стандартной методике. Все манипуляции с исследуемым материалом и контролями проводили одновременно. Результаты теста учитывали только при соответствующих результатах положительном и отрицательном контролях. Результаты интерпретировали следующим образом. При наличии у изучаемого штамма чувствительности к литическому действию хотя бы к одному из двух бактериофагов идентификационный тест можно считать положительным. В зависимости от наличия чувствительности к литическому действию обоих бактериофагов или одного из них определяется один из 3 фаготипов (таблица 33). Первый фаготип – культура лизируется бактериофагами Гамма А-26 и 186; второй фаготип – культура лизируется бактериофагом Гамма А-26; третий фаготип культура лизируется бактериофагом 186. Таблица 33 – Критерии оценки комплексного теста Лизис бактериофагом Гамма А-26 + Лизис бактериофагом 186 + Идентификационный тест Фаготип положительный 1 + – положительный 2 – + положительный 3 – – отрицательный не является B. аnthracis* Примечание: (*) – теоретически возможен очень редкий штамм B. anthracis, отсутствующий в выборке изученных штаммов. 114 При изучении предложенным методом 114 штаммов B. anthracis идентификационный тест был положителен у всех, к фаготипу 1 принадлежали 74,6 %, к фаготипу 2 – 24,5 % и к фаготипу 3 – 0,9 % исследованных штаммов. Наиболее типичными являются штаммы, относящиеся к фаготипу 1. Штаммы 2 и 3 фаготипов представляют интерес для всестороннего изучения, так как фагорезистентные штаммы и культуральные варианты нередко обладают целым комплексом атипичных фенотипических свойств [Цыганкова О.И. с соавт., 2008]. Таким образом, при выполнении данного раздела работы было апробировано применение бактериофага R/D-Ph-6 в тесте РНФ с целью индикации возбудителя сибирской язвы в объектах окружающей среды. Оптимизированы параметры проведения РНФ с использованием бактериофага R/D-RH-6 при учете результатов количественным методом по нарастанию концентрации бактериофага. Выявлено что бактериофаг R/D-RH-6 обладает достаточной специфической активностью – все 30 штаммов B. anthracis, различающиеся по комплексу фенотипических свойств в тесте давали положительный результат. Специфичность теста составила 90 %. Удовлетворительные результаты были получены и при тестировании смешанных культур и материала, имитирующего пробы окружающей среды. Изучение спектра фагорезистентности культур B. anthracis к различным сибиреязвенным бактериофагам, позволило разделить изученные бактериофаги на 3 группы в соответствии с их литическим спектром по отношению к фагорезистентным культурам, выявить некоторые культурально-морфологические особенности групп фагорезистентных культур и разработать методические рекомендации «Комплексное применение сибиреязвенных бактериофагов Гамма А-26 и 186 для идентификации и фаготипирования штаммов B. anthracis», одобренные ученым советом ФКУЗ Ставропольский противочумный институт Роспотребнадзора 03.09.2013 г., протокол № 8 и утвержденные директором ФКУЗ Ставропольский противочумный институт Роспотребнадзора. 115 ЗАКЛЮЧЕНИЕ Вопросы обеспечения лабораторной диагностики сибирской язвы сертифицированными биологическими препаратами остаются актуальными до настоящего времени. Это обусловлено наличием большого количества сибиреязвенных почвенных очагов, поддерживающих потенциал возникновения заболеваний людей и животных. Другим аспектом этой проблемы является не ликвидированная до сих пор угроза применения спор возбудителя сибирской язвы в качестве агента биотерроризма [Imperial M.J., Casadevall A., 2011]. В настоящее время для проведения теста на фагочувствительность при идентификации культур B. anthracis, в Российской Федерации производится бактериофаг сибиреязвенный R/D-Ph-6 в виде фаг-тест-набора «Оболенск R1» для медицинского применения (ФБУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии», г. Оболенск) и бактериофаг сибиреязвенный Fah-ВНИИВВиМ – для ветеринарного применения (ГНУ Всероссийский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии Российской академии сельскохозяйственных наук, г. Покров). В СтавНИПЧИ в период 1998-2002 гг. О.И. Цыганковой и Б.В. Солодовниковым была разработана биотехнология производства препарата бактериофага Гамма А-26 сибиреязвенного диагностического жидкого (сухого) и получены 2 патента [Пат. РФ № 2133273 «Способ выращивания сибиреязвенного бактериофага Гамма», опубл. 20.07.1999, Бюл. № 20; Пат. РФ № 2171842 «Способ получения сибиреязвенного бактериофага Гамма А-26», опубл. 10.08.2001, Бюл. № 22]. После выпуска экспериментальных серий в 2002 г. производство бактериофага было приостановлено. Все экспериментальные серии хранились в ампулах при температуре (4±2) 0С в лиофилизированном или жидком состоянии. Для возобновления производства необходимо было восстановить жизнеспособность длительно хранившегося бактериофага Гамма А-26, определить оптимальные условия культивирования, отобрать наиболее продуктивные производ- 116 ственные штаммы (бактериофаг, штамм В.anthracis для репродукции бактериофага) и штаммы для контроля литических свойств, установить срок хранения готового продукта производства. При выборе питательных сред, используемых для размножения сибиреязвенных бактериофагов, было показано, что для их репродукции наиболее оптимальной является среда на основе бульона Хоттингера, обогащенная питательными добавками (дрожжевой экстракт, хлористый кальций), которая обеспечивала получение бактериофага Гамма А-26 в концентрации, удовлетворяющей нормативным требованиям. Репродукцию бактериофага сибиреязвенного Гамма А-26 осуществляли на вакцинных штаммах, обеспечивая этим биологическую безопасность отдельных этапов процесса производства. Результаты исследований показали, что эффективность размножения бактериофага зависит от типа штамма В.anthracis, который использовался для этой цели. Из 6 апробированных вакцинных штаммов B. anthracis: СТИ, СТИ-ПР, 55, 228/8, Sterne 34F2, Ichtiman. Оптимальным в качестве штамма размножения оказался штамм B. anthracis 228/8, использование которого позволило обеспечить воспроизводство фага с лучшими показателями концентрации бактериофага и ДРТ, удовлетворяющими нормативные требования. Были усовершенствованы биотехнологические параметры репродукции бактериофага Гамма А-26: 1) подобрана питательная среда (бульон Хоттингера с добавлением в него дрожжевого экстракта – (0,23±0,02) г/л, хлористого кальция – 0,3 г/л и уровнем рН (7,2±7,4); 2) посевная доза штамма размножения B. anthracis 228/8 (3×108 спор на 100 мл среды с последующим выращиванием на орбитальном шейкере в режиме непрерывного перемешивания (65±5) об/мин при (36±1) 0С в течение (4±1) ч; 3) заражающая доза бактериофага Гамма А-26 (10 мл с концентрацией 4,0×107 БОЕ/мл на 100 мл культуры); 4) время получения бактериофага Гамма А-26 ((16±2) ч от момента заражения при температуре (36±1) 0С). 117 Данная технология позволяет получать бактериофаг с высокой концентрацией фаговых частиц, срок годности которого на основе экспериментальных данных, полученных в процессе выполнения исследования, был увеличен до двух лет. В качестве усовершенствования процесса контроля качества готовой продукции экспериментально обосновали использование в числе культур B. anthracis для контроля специфической активности авирулентного штамма B. anthracis 55 для подтверждения широкого спектра специфической литической активности данного препарата, так как бактериофаги с более узким спектром литической активности (186, Fah-ВНИИВВиМ, К ВИЭВ, Саратов) не лизируют указанный штамм. Индикаторными штаммами, для контроля специфической активности бактериофага сибиреязвенного Гамма А-26, были определены 5 вакцинных штаммов B. anthracis, дающих четкий фаголизис (положительный контроль) с бактериофагом. Для контроля специфичности были отобраны следующие штаммы близкородственных сапрофитов: B. cereus 16, 104; B. megaterium 5, 89; B. subtilis 36, 83, не лизирующихся бактериофагом Гамма А-26. С использованием подобранных оптимальных условий репродукции, были получены три экспериментальные серии бактериофага сибиреязвенного Гамма А-26. Литическая активность этих серий была определена на 33 типичных по капсулообразованию штаммах сибиреязвенного микроба, 16 – атипичных по капсулообразованию, 6 вакцинных штаммах и 72 штаммах близкородственных спорообразующих бацилл рода Bacillus. У всех тестируемых штаммов B. anthracis в месте нанесения бактериофага образовывались четкие, округлые зоны лизиса, при отсутствии в них фагорезистентных колоний. Полученные результаты показали, что все 55 (100 %) штаммов B. anthracis лизировались бактериофагом Гамма А-26. Чувствительными к действию бактериофага Гамма А-26 (С. 01-09, С. 02-09, С. 03-09), среди сапрофитных аэробных спорообразующих бацилл, оказались штаммы: B. megaterium 1, 2, 3 и B. subtilis 35, 37, 336. На основании полученных данных, определили специфичность бактериофага диагностического сибиреязвенного Гамма А-26 жидкого, которая составила – 91,7 %. 118 Таким образом, показатели специфической активности и специфичности трех экспериментально-производственных серий бактериофага сибиреязвенного Гамма А-26 совпадали. Важным этапом разработки биотехнологической схемы производства диагностических препаратов и соответствующей технической документации является определение условий и сроков их годности. Проведенные опыты по определению динамики концентрации экспериментальных серий бактериофага Гамма А-26 при длительном хранении в оптимальных условиях показали, что в препаратах всех трех серий бактериофага Гамма А-26 концентрация фаговых частиц на протяжении 3 лет не снижалась ниже регламентированного уровня. ДРТ всех серий для контрольного индикаторного штамма B. anthracis СТИ после четырех лет хранения составил 10-4, что свидетельствует об определенном резерве т. к. предполагается применение препарата в неразведенном виде. На основании результатов исследований был определен гарантированный срок хранения препарата «Бактериофаг диагностический сибиреязвенный Гамма А26 жидкий» и составил 2 года. Три экспериментально-производственные серии бактериофага диагностического сибиреязвенного Гамма А-26 жидкого прошли испытания на базе ФКУЗ ИркутскНИПЧИ Сибири и Дальнего Востока Роспотребнадзора, ФГУН Государственного научного центра прикладной микробиологии и биотехнологии Роспотребнадзора (г. Оболенск). Успешно проведены государственные медицинские испытания бактериофага сибиреязвенного Гамма А-26 в ФГБУ «ГИСК им. Л.А. Тарасевича» Минздрав России и утверждена нормативная документация. Получено регистрационное удостоверение от Федеральной службы по надзору в сфере здравоохранения № ФСР 2011/10451 от 20 декабря 2011 г. В настоящее время осуществляется коммерческое производство данного препарата. Появление на рынке медико-биологических препаратов относительно новых коммерческих препаратов бактериофагов R/D-Ph-6 производства ФБУН «Государственный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» (г. Оболенск) и FahВНИИВВиМ производства ГНУ Всероссийского научно-исследовательского инсти- 119 тута ветеринарной вирусологии и микробиологии Российской академии сельскохозяйственных наук (г. Покров), наличие в коллекции лаборатории известных бактериофагов ВА-9, Саратов и К ВИЭВ, малоизученного бактериофага 186, а также противоречивость литературных данных об их биологических и диагностических свойствах – все это обусловило необходимость проведения сравнительного изучения и анализа биологических свойств указанных бактериофагов. Нами были изучены свойства доступных сибиреязвенных бактериофагов, определяющих их пригодность для применения в производственных целях. В опытах, в условиях одного исследования, применялись 7 сибиреязвенных бактериофагов, находящихся в коллекции лаборатории сибирской язвы: Fah- ВНИИВВиМ, R/D-Ph-6, Гамма А-26, 186, ВА-9, Саратов и К ВИЭВ. Одним из требований, предъявляемых к диагностическим бактериофагам, является эффективность их репродукции для получения препаратов с достаточно высокой концентрацией фаговых частиц. Репродукцию бактериофагов осуществляли на вакцинном штамме В. anthracis СТИ. Проведенные исследования показали, что у всех бактериофагов процесс размножения проходил с увеличением выхода фагового потомства. Важным для производственного выпуска диагностических препаратов является стабильность специфической активности, обеспечивающаяся в конкретном случае сохранением достаточной концентрации бактериофагов на протяжении регламентированного срока годности. Проведено определение динамики концентрации бактериофагов при длительном хранении в оптимальных условиях. Анализ полученных данных показал, что хранение бактериофагов К ВИЭВ и ВА-9 в оптимальных условиях (4±2) 0С в течение двух лет практически не изменило их концентрации, в отличие от фагов 186, Саратов, Fah-НИИВВиМ, R/D-Ph-6, у которых концентрация снизилась на порядок, а у фага Гамма А-26 – на два порядка. При этом все сибиреязвенные бактериофаги сохраняли специфическую литическую активность при применении неразведенного препарата. 120 При изучении стабильности показателей специфической активности диагностических сибиреязвенных бактериофагов, при кратковременном хранении в условиях температур, превышающих регламентированные (4±2) 0С, установлено, что препараты диагностических сибиреязвенных бактериофагов Fah-ВНИИВВиМ, R/DPh-6, Гамма А-26, 186, ВА-9, Саратов, К ВИЭВ в достаточной степени сохраняют специфическую активность при кратковременных отклонениях условий хранения и транспортирования от регламентированных, если находятся (транспортируются) при температуре до 25 0С продолжительностью до 30 суток и могут быть использованы в диагностических целях. Изучая действие температур (от 30 0С до 100 0С с интервалом в 10 0С) на бактериофаги Гамма А-26, R/D-Ph-6 и 186, определили, что они имеют разную степень чувствительности к температуре. При этом бактериофаг Гамма А-26 обладает относительно низкой устойчивостью к действию повышенных температур (70 0С), а R/DPh-6 и 186 наибольшей термоустойчивостью. Результаты проведенных исследований продемонстрировали, что диагностические сибиреязвенные бактериофаги Fah-ВНИИВВиМ, R/D-Ph-6, Гамма А-26, 186, ВА-9, Саратов, К ВИЭВ обладают свойствами необходимыми для производства их в виде препаратов: эффективно размножаются в жидких культурах авирулентного штамма В. anthracis СТИ, в достаточной степени сохраняют специфическую активность при хранении (4±2) 0С в течение двух лет а также в условиях транспортирования, если находятся при температуре до 25 0С продолжительностью до 30 суток. Известные сибиреязвенные бактериофаги различаются по широте спектра лизируемых ими штаммов возбудителя сибирской язвы, а также по специфичности их действия [Головинская Т.М., 2011; Саяпина Л.В., 2011]. Учитывая наличие штаммов сибиреязвенного микроба различающихся по фенотипическим свойствам, для определения спектра литической активности сибиреязвенных бактериофагов были использованы штаммы B. anthracis с разными характеристиками: 1) типичные по капсулообразованию – 80 штаммов; 2) атипичные по капсулообразованию – 26 штаммов; 3) атипичные по морфологии (ОSS-варианты по 121 классификации Л.И. Маринина, 2009) – 4 штамма; 4) штаммы не имеющие плазмиду рХО1 – 1 штамм; 5) штаммы не имеющие плазмид рХО1 и рХО2 – 3 штамма. Анализ результатов показал, что лизабельность штаммов сибиреязвенного микроба бактериофагами Гамма А-26, ВА-9, R/D-Ph-6 была одинаковой в целом – 99,1 % и лишь незначительно различалась по группам. Бактериофаги FahВНИИВВиМ (67,5 %), К ВИЭВ (68,7 %), Саратов (75,0 %) и 186 (76,3 %) в большей степени различались по широте спектра лизируемых культур. При этом различия наблюдались только в группе вирулентных диплазмидных штаммов. Учитывая интерес, проявляемый в настоящее время, к бактериофагам в плане возможности применения их или синтезируемых ими лизинов в качестве антибактериального средства для лечения сибирской язвы, исследовали влияние капсулы на чувствительность бактериальных клеток к литическому действию сибиреязвенных бактериофагов. При определении способности к капсулообразованию in vitro и влияния капсулы на фагочувствительность, была отобрана группа штаммов B. anthracis, различающихся по ряду фенотипических свойств: 1) типичные штаммы, образующие капсулу in vivo и на сывороточно-бикарбонатном агаре в условиях повышенного содержания углекислого газа; 2) штаммы, способные к капсулообразованию на питательных средах в атмосфере воздуха; 3) штаммы, не образующие капсулу ни при каких условиях (отсутствует плазмида рХО2). В качестве питательных сред применялись среда, приготовленная на основе LB по Миллеру, среда Хоттингера и бикарбонатно-сывороточная среда. Результаты исследований свидетельствуют, что капсульные клетки не чувствительны к действию всех бактериофагов, так как капсула предохраняет клетку от адсорбции бактериофагов. Было четко выявлено, что штаммы в акапсульной форме формирующие колонии OSS-типа не лизируются бактериофагами Fah-ВНИИВВиМ, К ВИЭВ, Саратов и 186, что, вероятно, связано с отсутствием рецепторов специфичных для данных бактериофагов. Определение специфичности действия сибиреязвенных бактериофагов на 75 штаммах близкородственных спорообразующих сапрофитах (B. cereus, В. thurin- 122 giensis, В. subtilis, В. megaterium, В. mesentericus, В. species) показало, что сибиреязвенные бактериофаги Fah-ВНИИВВиМ, R/D-Ph-6, К ВИЭВ, Саратов и 186 не вызывали лизиса штаммов спорообразующих сапрофитов рода Bacillus и обладали 100 % специфичностью. Проявления неспецифического лизиса наблюдались при действии бактериофагов Гамма А-26 и ВА-9, которые лизировали одни и те же штаммы близкородственных сапрофитов рода Bacillus (B. subtilis 35, 37, 336; B. megaterium 1, 2, 3). Однако, значения ДРТ бактериофагов, даже для наиболее чувствительных культур B. subtilis 336 и B. megaterium 3, были ниже на два порядка по сравнению с контрольным штаммом B. anthracis СТИ. По результатам проведенного нами сравнительного анализа свойств семи сибиреязвенных бактериофагов, бактериофаг R/D-RH-6 в наибольшей степени обладает сочетанием широкого спектра литического действия на штаммы сибиреязвенного микроба с высокой специфичностью, поэтому может быть использован в методах индикации возбудителя сибирской язвы, основанных на применении специфических сибиреязвенных бактериофагов. Простейшим методом индикации возбудителя сибирской язвы с применением бактериофагов является метод нарастания титра фага (РНФ). Для применения этого бактериофага в тесте РНФ необходимо было более детального изучить количественные параметры динамики концентраций культуры B. anthracis и бактериофага, определить показатели специфической активности и специфичности в условиях их проявления в жидкой питательной среде. Также важным являлось изучение возможного влияния присутствия сапрофитных представителей рода Bacillus на концентрацию фаговых частиц в фильтрате среды инкубирования. При изучении динамики изменения концентрации сибиреязвенного микроба и бактериофага R/D-RH-6 при культивировании в бульонной культуре были определены такие ключевые параметры как посевная доза идентифицируемого микроорганизма, время предварительного подращивания до внесения бактериофага, длительность совместной инкубации от внесения бактериофага до получения фильтрата. При использовании в качестве культуры репродукции 31 штамма B. anthracis наблюдалось эффективное размножение бактериофага: на 18 из них (58,1 %), кон- 123 центрация последнего достигала 1×109 БОЕ/мл, на 7 (22,6 %) – 108 БОЕ/мл, на 5 (16,1 %) – 1010 БОЕ/мл и только на одном штамме (3,0 %) – 1011 БОЕ/мл, при этом минимальное увеличение концентрации бактериофага составляло четыре порядка. Для изучения возможности нарастания концентрации бактериофага R/D-RH-6 при культивировании в бульонных культурах близкородственных бацилл, проводили совместную инкубацию бактериофага R/D-RH-6 с 10 культурами сапрофитных представителей рода Bacillus. Уменьшение концентрации бактериофага отмечалось с половиной (50 %) из 10 использованных культур, а еще у 30 % – присутствие бактериофага не определялось. Можно предположить, что это является следствием адсорбции фаговых частиц на клетках бацилл без последующего эффективного размножения, сопровождающегося лизисом клетки и выходом бактериофага в жидкую среду. В таком случае при фильтрации через мембранные фильтры вместе с бактериальной массой бактериофаг извлекается из жидкой среды. Способной обеспечивать размножение бактериофага R/D-RH-6 оказалась одна культура (10 %) – B. subtilis 37. При совместном с B. subtilis 37 культивировании бактериофага R/D-RH-6, концентрация последнего возрастала на 2 порядка. Полученные данные о характере изменения концентрации бактериофага при размножении на смешанных культурах свидетельствуют о том, что присутствие, по крайней мере, некоторых близкородственных представителей рода Bacillus в среде размножения снижает на 2-3 порядка конечную концентрацию бактериофага R/D-RH-6 по сравнению с репродукцией на чистых культурах B. anthracis. При испытании бактериофага R/D-RH-6 в РНФ на материале, имитирующем пробы окружающей среды (пробы из сена, зерна и почвы), контаминированные B. anthracis наблюдали увеличение концентрации бактериофага на 1-2 порядка по сравнению с контрольными пробами, что дает основание считать результат РНФ положительным. Вызывает интерес феномен фагорезистентности штаммов возбудителя сибирской язвы, так как влияет на эффективность фагодиагностики сибирской язвы. В этой связи были выделены фагорезистентные культуры и определена их чувствительность к различным бактериофагам. Всего было отобрано 102 варианта штаммов 124 B. anthracis по признаку устойчивости к тому или иному бактериофагу. На основе полученных данных, можно выделить 3 группы фагорезистентных культур B. anthracis, имеющие общие закономерности внутри каждой группы в чувствительности к изученным бактериофагам. Культуры первой группы, выделенные по признаку резистентности к бактериофагам Гамма А-26 и ВА-9 сохраняли резистентность к обоим бактериофагам, при этом резистентность к литическому действию остальных бактериофагов проявлялась лишь в 18-38 %. Культуры, выделенные по признаку резистентности к бактериофагам К ВИЭВ, Fah-ВНИИВВиМ, Саратов, 186 и представляющие вторую группу, ещё более четко демонстрировали различия в чувствительности к различным бактериофагам. Немногочисленные культуры B. anthracis третьей группы (выделенные по признаку резистентности к бактериофагу R/D-Ph-6) были резистентны к действию всех использованных в работе бактериофагов. Для идентификации культур B. anthracis предпочтительно применение наиболее вирулентных бактериофагов, резистентность к которым выявляется в минимальном количестве случаев при равных показателях специфичности. Результаты проведенных исследований стали основой для разработки эффективной схемы комплексного применения сибиреязвенных бактериофагов с различным спектром специфической активности для идентификации и фаготипирования штаммов B. anthracis. Наблюдая в зонах лизиса, при отрицательном результате несколько угнетенный рост культуры, но равномерно покрывающий всю зону, так называемую «пленку», предположили, что существует неоднородность состава популяции штаммов B. anthracis по чувствительности к литическому действию различных сибиреязвенных бактериофагов. Для проверки правильности этого предположения, были отобраны 10 штаммов B. anthracis, в зонах лизиса которых наблюдалась «пленка», и посеяны на питательную среду. При просмотре под микроскопом, через 20 ч инкубации, были определены 2 типа колоний: R- и ОSS-формы. Отобранные формы колоний 125 проверили на чувствительность к бактериофагам. В результате, колонии, находящие в R-форме (I тип), лизировались всеми бактериофагами, а культуры, находящиеся в ОSS-форме (II тип) только фагами Гамма А-26, ВА-9; R/D-Ph-6. При изучении специфической литической активности бактериофагов Гамма А-26, ВА-9, R/D-Ph-6, 186, Fah-ВНИИВВиМ, К ВИЭВ, Саратов было выявлено, что по широте спектра литического действия их можно разделить на две группы. К первой группе относятся бактериофаги Гамма А-26, ВА-9, R/D-Ph-6, лизирующие 99,1 % штаммов B. anthracis, ко второй группе – бактериофаги 186, FahВНИИВВиМ, К ВИЭВ, Саратов лизирующие 59,6-65,8 % этих же штаммов. Исходя из этого, с целью идентификации и фаготипирования штаммов сибиреязвенного микроба оптимальным посчитали подбор и одновременное применение бактериофагов с различной широтой литического спектра, один из которых лизирует все культуры B. anthracis и обеспечивает надежность теста идентификации сибиреязвенных штаммов, а второй, проявляя избирательность в литическом действии по отношению к части культур имеющих сходные свойства, способен эффективно выявлять эти различия. Из первой группы нами был выбран бактериофаг Гамма А-26, из второй группы предпочтение в применении для фаготипирования штаммов сибиреязвенного микроба было отдано бактериофагу 186 т. к. он лизировал большее (в данной группе бактериофагов) количество штаммов и в положительных случаях давал более четкие результаты. Была разработана схема комплексной оценки фагочувствительности штаммов B. anthracis к бактериофагам Гамма А-26 и 186 с различной широтой спектра специфической активности, которые в совокупности позволяют идентифицировать 100 % штаммов сибиреязвенного микроба. В зависимости от наличия чувствительности к литическому действию обоих бактериофагов или одного из них определяется один из 3 фаготипов: 1 фаготип – культура лизируется бактериофагами Гамма А-26 и 186; 2 фаготип – культура лизируется бактериофагом Гамма А-26; 3 фаготип – культура лизируется бактериофагом 186. При изучении чашечным методом 114 штаммов B. anthracis идентификационный тест был положителен у всех, к фаготипу 1 принадлежали 74,6 %, 126 к фаготипу 2 – 24,5 % и к фаготипу 3 – 0,9 % исследованных штаммов. Наиболее типичными являются штаммы, относящиеся к фаготипу 1. Штаммы 2 и 3 фаготипов представляют интерес для всестороннего изучения, так как фагорезистентные штаммы и культуральные варианты нередко обладают целым комплексом атипичных фенотипических свойств [Цыганкова О.И. с соавт., 2008]. Таким образом, на основании проведенных исследований и анализа полученных результатов разработана биотехнология производства, оформлена техническая документация и налажен выпуск препарата «Бактериофаг диагностический сибиреязвенный Гамма А-26 жидкий». Получены новые сведения о биологических и диагностических свойствах семи сибиреязвенных бактериофагах, оценены возможности их использования в различных тестах с применением бактериофагов. Обосновано комплексное применение бактериофагов Гамма А-26 и R/D-Ph-6 с широким спектром специфической активности для повышения достоверности фагодиагностики сибирской язвы. Разработана схема фаготипирования штаммов B. anthracis, применение которой позволяет получать дополнительную характеристику культур и отобрать из их числа представляющие интерес для изучения механизмов фагорезистентности. Выводы: 1. Разработана биотехнология производства препарата «Бактериофаг диагностический сибиреязвенный Гамма А-26 жидкий»: предложен новый авирулентный штамм размножения (продуцент) B. anthracis 228/8, подобраны условия репродукции бактериофага сибиреязвенного Гамма А-26 – дозы внесения культуры размножения в виде спор и производственного бактериофага, длительность инкубирования (получения фаголизата), экспериментально обоснован срок годности готового препарата. 2. Определены штаммы B. anthracis с различной чувствительностью к литическому действию бактериофагов для проверки специфической активности и сапрофитов рода Bacillus для подтверждения специфичности препарата «Бактериофаг диагностический сибиреязвенный Гамма А-26 жидкий». 127 3. Составлена и утверждена нормативная документация на бактериофаг сибиреязвенный Гамма А-26: технические условия (ТУ) 9386-013-01897080-2009, пусковой регламент (ПУР) № 01897080-03-09, инструкция по применению. Получено регистрационное удостоверение от Федеральной службы по надзору в сфере здравоохранения № ФСР 2011/10451. Налажено производство препарата «Бактериофаг диагностический сибиреязвенный Гамма А-26 жидкий». 4. Сибиреязвенные бактериофаги Гамма А-26, ВА-9, R/D-Ph-6, 186, FahВНИИВВиМ, К ВИЭВ, Саратов обладают различной специфической активностью и специфичностью. Бактериофаги Гамма А-26, ВА-9, R/D-Ph-6 лизировали 99,1 % штаммов с разными фенотипическими свойствами, бактериофаги Fah- ВНИИВВиМ, К ВИЭВ, Саратов, 186 – 58,7-65,7 %. Бактериофаги R/D-Ph-6, 186, Fah-ВНИИВВиМ, К ВИЭВ, Саратов обладают 100 % специфичностью, соответствующий показатель для бактериофагов Гамма А-26, ВА-9 составил 92 %. 5. На основании сравнительного анализа специфической активности и специфичности 7 сибиреязвенных бактериофагов установлено, что повышение достоверности фагодиагностики сибирской язвы может быть достигнуто за счет: комплексного применения бактериофагов Гамма А-26 и R/D-Ph-6 или 186 для идентификации штаммов сибиреязвенного микроба; бактериофага R/D-Ph-6 – для индикации B. anthracis в объектах окружающей среды методом РНФ; сочетанное применение сибиреязвенных бактериофагов Гамма А-26 и 186 для определения фаготипов штаммов возбудителя сибирской язвы. 6. Оптимизированы параметры теста РНФ с применением бактериофага R/D-RH-6 (предварительное подращивание пробы в течение 3 ч, посевная доза бактериофага – 2×104 БОЕ/мл, последующая инкубация 8 ч). Доказана возможность применения бактериофага R/D-RH-6 в тесте РНФ в целях индикации B. anthracis в объектах окружающей среды. 7. В зависимости от наличия чувствительности к литическому действию бактериофагов Гамма А-26 и 186 или одного из них, штаммы B. anthracis разделяются на 3 фаготипа. При изучении фаготипов предложенным методом, из 114 штаммов B. anthracis к фаготипу 1 принадлежали 74,6 %, к фаготипу 2 – 24,5 % и к фа- 128 готипу 3 – 0,9 % исследованных штаммов. По основным культуральноморфологическим и биохимическим свойствам наиболее типичными являются штаммы, относящиеся к фаготипу 1. Практические рекомендации: 1. При производстве препарата «Бактериофаг диагностический сибиреязвенный Гамма А-26 жидкий» использовать экспериментально обоснованную биотехнологическую схему, позволяющую получать препарат с высокой специфической активностью при сокращении времени производства, количества манипуляций и увеличении гарантированного срока годности. 2. Для контроля качества препарата «Бактериофаг диагностический сибиреязвенный Гамма А-26 жидкий» в числе контрольных штаммов B. anthracis использовать вакцинный штамм 55, положительная проба с которым подтверждает широкий спектр специфической литической активности данного препарата, так как бактериофаги с более узким спектром литической активности (186, FahВНИИВВиМ, К ВИЭВ, Саратов) не лизируют указанный штамм. 3. В целях повышения достоверности идентификации штаммов B. anthracis использовать препараты диагностических бактериофагов «Бактериофаг диагностический сибиреязвенный Гамма А-26 жидкий» и фаг-тест-набор «Оболенск R1», лизирующие 99,1 % штаммов сибиреязвенного микроба с разными фенотипическими свойствами. 4. Для индикации возбудителя сибирской язвы использовать в тесте РНФ – бактериофаг R/D-Ph-6 (фаг-тест-набора «Оболенск R1») с широким спектром специфической активности. 5. В практике работы «Референс-центра по мониторингу за возбудителем сибирской язвы» для идентификации штаммов возбудителя сибирской язвы и изучения их биологических свойств использовать комплексное применение бактериофагов «Бактериофаг диагностический сибиреязвенный Гамма А-26 жидкий» экспериментальные серии бактериофага 186, что обеспечит идентификацию 100% штаммов и позволит определить их фаготип, ассоциирующийся с определенными фенотипическими особенностями. 129 СПИСОК сокращений и условных обозначений атм АХ БОЕ ВИЭВ – – – – ВНИИВВиМ – г/л ДРТ КОЕ МУК мл мм мкм ОСО ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России об/мин ПР РНФ рН – – – – – рХО1 – рХО2 – СарТУ – – атмосфера агар Хоттингера бляшкообразующая единица Всесоюзный институт экспериментальной ветеринарии Всесоюзный научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии грамм/литр диагностический рабочий титр колониеобразующая единица методические указания миллилитр миллиметр микрометр отраслевой стандарт оптической мутности ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздрава России оборотов в минуту пусковой регламент реакция нарастания титра фага отрицательный логарифм концентрации водородных ионов плазмида сибиреязвенного микроба, несущая гены экзотоксинов плазмида сибиреязвенного микроба, несущая гены капсулы штамм, не продуцирующий капсулу технические условия Тох- – штамм, не продуцирующий токсин Trp+ – независимость от триптофана ч R-форма S-форма – – – час шероховатые колонии гладкие колонии SM-форма – гладкие слизистые колонии – – – – – – 130 Список литературы 1. Агапов В.А. Современная ситуация по зооантропонозным инфекциям в Читинской области / В.А. Агапов, З.П. Вахрушева, Л.А. Мизитова, В.Н. Парфенов, Н.Т. Лесников, Н.М. Вершинин // Мат. науч.-практ. Конф., посвящ. 100-летию образования противочумной службы России. – Саратов, 1997. – т. 1. – С. 7. 2. Антюганов С.Н. Сибирская язва в Российской Федерации и за рубежом / С.Н. Антюганов, А.Г. Рязанова, Е.И. Еременко, А.Н. Куличенко // Эпидемиология и инфекционные болезни. Актуальные вопросы, 2012. – № 5. – С 10-11. 3. Антюганов С.Н. Сибирская язва в Ставропольском крае / С.Н. Антюганов, Н.П. Буравцева, А.Г. Рязанова, Е.И. Еременко, Е.А. Цыганкова, О.И. Цыганкова, В.М. Мезенцев, Л.Ю. Аксенова, Е.В. Лысогора, Г.А. Джаилиди // Медицинский вестник Северного Кавказа. – Старополь, 2012а. - № 4 (28). – С. 67-70. 4. Буланцев А.А. Получение и характеристика фагорезистентных клонов возбудителя сибирской язвы / А.А. Буланцев, А.М. Барков, А.В. Липницкий // Генетика и биохимия вирулентности возбудителей особо опасных инфекций: Тез. докл. Российской науч. конф. – Волгоград, 1992. – С. 12. 5. Бакулов И.А., ГавриловВ.А. Селиверстов В.В. Сибирская язва (Антракс): Новые страницы в изучении «старой» болезни. – Владимир, 2001. – 284 с. 6. Буравцева Н.П. Выделение из почвы атипичных штаммов сибиреязвенного микроба / Н.П. Буравцева, Н.М. Неляпин, Е.И. Ерёменко, А.М. Ищерякова, Е.Л Ракитина // Профилактика природно-очаговых инфекций: тез. докл. Всесоюз. науч. конф. – Ставрополь, 1983. – С. 16-17. 7. Буравцева Н.П., Ерёменко Е.И., Цыганкова О.И. Роль атипичных штаммов сибиреязвенного микроба в эпизотологии и эпидемиологии сибирской язвы / Н.П. Буравцева, Е.И. Ерёменко, О.И. Цыганкова // Матер. межрегион. рабочего совещ. ВОЗ/ФАО по сибирской язве. – Алма-Ата, 1997. – С. 38-39. 8. Буравцева Н.П., Эпизоотолого-эпидемиологическая обстановкка по сибир- ской язве в Ставропольском крае / Н.П. Буравцева, С.Н. Антюганов, А.Г. Рязано- 131 ва, Е.А. Цыганкова, Л.Ю. Аксенова // Мат. науч.-практич. конф. «Здоровье населения и среда обитания» 15-я ежегодная Неделя медицины Ставрополья. – Ставрополь, 2011. – С. 96-101. 9. Буравцева Н.П. Эпизотологическая и эпидемиологическая обстановка по сибирской язве в Чеченской республике и республике Ингушетия / Н.П. Буравцева, Ш.Ш. Мицаев, А.Г. Рязанова, Е.И. Еременко, А.Н. Куличенко // Эпидемиология и инфекционные болезни. – М., 2011а. - № 3. – С. 10-15. 10. Буравцева Н.П. Ретроспективный анализ заболеваемости сибирской язвой людей и животных на административных территориях Северо-Кавказского Федерального Округа / Н.П. Буравцева, А.Г. Рязанова, С.Н. Антюганов, Л.Ю. Аксенова, Г.К. Газиева, К.Х. Хацуков, К.Х. Болатчиев, Б.А. Хапаев, С.В. Бескакотов // Современные аспекты природной очаговости болезней: мат. Всероссийской науч.практич. конф. с междун. участием, повящ. 90-летию ФГУН «Омский научноисследовательский институт природно-очаговых инфекций» Роспотребнадзора (г. Омск, 1-2 ноября 2011). – ООО Издательский центр «Омский научный вестник», 2011. – С. 49-51. 11. Буравцева Н.П. Эпизоотолого-эпидемическая обстановка по сибирской язве в Республике Адыгея / Н.П. Буравцева, В.М. Мезенцев, Е.И. Еременко, А.Г. Рязанова, А.Х. Агиров, Л.А. Долева, Н.В. Маслова // Современные технологии в совершенствовании мер предупреждения и ответных действий на чрезвычайные ситуации в области общественного здравоохранения сан.-эпид. характера: матер. ХI межгосуд. науч.-практич. конф. (Саратов, 16-17 октября 2012 г.). – Саратов, 2012. – С. 46-47. 12. Буравцева Н.П. Использование 0,05-0,1 % раствора твина-80, как разводя- щей жидкости, для определения концентрации спор сибиреязвенного микроба / Н.П. Буравцева, Е.Г. Чернявская // Методические рекомендации. – М., 1986. – 8 с. 13. Бактериофаги: биология и практическое применение / Под. ред. Э. Картер, А. Сулаквелидзе // Пер. с англ. коллектив переводчиков; науч. ред. А.В. Летаров. – М.: Научный мир, 2012. – 640 с. 132 14. Бургасов П.Н. Сибирская язва / П.Н. Бургасов, Б.Л. Черкасский, Л.М. Мар- чук, Ю.Ф. Щербак // – М.: Медицина,1970. – 128 с. 15. Бургасов П.Н., Рожков Г.И. Сибиреязвенная инфекция. – М., 1984. – 212 с. 16. Бендас Л.Г. Ферментативные гидролизаты кормовых дрожжей – основа бак- териологических питательных сред : автореф. дис. … канд. биол. наук / Л.Г. Бендас. – М., 1971. –16 с. 17. Березкина Г.П. К характеристике культур Bacillus anthracis, выделенных из почвы // Достижения и перспективы борьбы с сибирской язвой в СССР: тез. докл. Х пленарн. заседания межвед. науч.-метод. комис. по борьбе с сибирской язвой. – М., 1978. – С. 122-123. 18. Васильев П.Г. Чувствительность штаммов Bacillus anthracis выделенных из разных источников внешней среды, к видоспецифическим сибиреязвенным бактериофагам / П.Г. Васильев, Ю.И. Иванов, Н.С. Садыков, В.В. Кожухов, Р.Ш. Зиганшин, Л.М. Дербина, А.В. Сенькин // Диагн., лечение и проф. опасных инф. заболеваний. Биотехнология. Ветеринария: мат. юбилейной науч. конф. посвящ. 70летию НИИ Микробиологии МО РФ. – Киров, 1998. – С. 64. 19. Васильев П.Г.Спектр литической активности видоспецифического сибире- язвенного бактериофага ФПГ / П.Г. Васильев, Л.И. Маринин, Р.Ш. Зиганшин, И.В Литусов, А.В. Стенькин, А.В. Степанов, А.Н. Шевцов, А.В. Маслов // Проблемы медицинской и экологической биотехнологии: сб. тезисов докл. юбилейной науч. конф., посвящ. 25-летию ГНЦ прикладной микробиологии 14-15 декабря 1999 г., г. Оболенск. – Оболенск, 1999. – С. 33. 20. Взаимодействие фага с бактериальной клеткой / Биофайл, науч.-информ. журнал. – Режим доступа: http://www.biofile.ru/bio/761.html. – Заглавие с экрана. 21. Гулый А.А. К характеристике авирулентных штаммов, выделенных из почв скотомогильников / А.А. Гулый // Эпидемиология, диагностика и профилактика инфекционных и инвазионных болезней. – Кишинев,1982. – С. 106-107. 22. Груз Е.В. Испытание специфического бактериофага «ВА-9» для идентифи- кации бацилл антракса / Е.В. Груз // Антракс. Вопросы иммунологии, клиники и лабораторной диагностики. – Кишинев: Картя Молдовеняске, 1964. – С.152-156. 133 23. Головинская Т.М. Изучение спектра литической активности и специфично- сти сибиреязвенных бактериофагов / Т.М. Головинская, Н.П. Буравцева, О.И. Цыганкова, Е.И. Еременко // Проблемы особо опасных инфекций. – Саратов, 2011. – № 3 (109). – С. 28-30. 24. Головинская Т.М. Совершенствование фагодиагностики сибирской язвы: оценка специфичности бактериофага «186» / Т.М. Головинская, О.И. Цыганкова, А.Г. Рязанова, А.Н. Куличенко // Медицинский вестник Северного Кавказа. – Ставрополь, 2013. – Том 8. – № 1. – С. 68-69. 25. Габисония Т. Фаготипирование штаммов синегнойной палочки / Т. Габисо- ния // Птицеводство. – 2010. – № 8. – С. 45. 26. Гремякова Т.А. Изучение взаимодействия фагов и микроорганизмов с ис- пользованием методов флюориметрии и электроориентационной спектроскопии / Т.А. Гремякова, Е.А. Жиленков, И.А. Новиков, М.В. Оборотов, В.Э. Сазонов, В.М. Фомченков // Вестник Российской Академии наук. – М., 1999. – № 2. – С. 24-25. 27. Гольдфарб Д.М. Бактериофагия / Д.М. Гольдфарб // – М.: МЕДГИЗ, 1961. – 298 с. 28. Дятлов И.А. Средства обеззараживания сибиреязвенных почвенных очагов / И.А. Дятлов, Л.И. Маринин, Н.А. Шишкова и др. // Актуальные проблемы болезней общих для человека и животных: Всероссийская науч.-практич. конф. с международным участием, 23-24 мая 2012 г., г. Ставрополь. – Ставрополь, 2012. – С. 35-36. 29. Еременко Е.И., Цыганкова О.И., Буравцева Н.П. Изменение фенотипа и плазмидного спектра сибиреязвенного микроба с атипичным капсулообразованием / Е.И. Еременко, О.И. Цыганкова, Н.П. Буравцева // Генетика и биохимия вирулентности возбудителей ООИ. Матер. Российской науч. конф. – Волгоград, 1992. – С. 38. 30. Еременко Е.И Потребности сибиреязвенного микроба в факторах роста и новые питательные среды для его культивирования.: дис. … канд. мед. наук / Е. И. Еременко. – Ставрополь, 1986. – 181 с. 134 31. Еременко Е.И. Эпизоотологическая и эпидемиологическая характеристика сибирской язвы в Чеченской республике / Е.И. Еременко. В.А. Ярощук, В.А. Банных, Н.М. Неляпин и др. // ЖМЭИ, – 1996. – № 3. – С. 48-52. 32. Еременко Е.И. Сибирская язва в Российской Федерации в 2009 году: анализ и прогноз / Е.И. Еременко, А.Г. Рязанова, Н.П. Буравцева, А.Н. Куличенко // Информационный Бюллетень «Здоровье населения и среда обитания» (ЗНиСО). – № 5 (206). – Май, 2010. – С. 38-40. 33. Еременко Е.И. Анализ эпидемиологической ситуации по сибирской язве в РФ в 2012 г., прогноз на 2013 г. / Е.И. Еременко, А.Г. Рязанова, Н.П. Буравцева, О.И. Цыганкова, Л.Ю. Аксенова, С.Н. Антюганов, Е.А. Цыганкова, Т.М. Головинская, В.В. Воропаев, А.Н. Куличенко // Проблемы особо опасных инфекций. – Саратов, 2013. – Вып. 1. – С. 18-20. 34. Жеглова Д.В. Характеристика бактериофагов, выделенных из музейных штаммов возбудителя сибирской язвы / Д.В. Жеглова // Проблемы особо опасных инфекций. – Саратов, 1972. – Вып. 1 (23). – С. 200-202. 35. Земцова И.Н. Характеристика сибиреязвенного бактериофага и его приме- нение для лабораторной диагностики сибирской язвы / И.Н. Земцова // Авт. дис. … канд. мед. наук. – Саратов, 1965. – 14 с. 36. Земцова И.Н. Отношение сибиреязвенного фага к действию некоторых фи- зических и химических факторов / И.Н. Земцова // Вопросы микробиологиии лаб. диагностики ООИ. – Саратов, 1965а. – С 124-128. 37. Ипатенко Н.Г. Испытание сибиреязвенных бактериофагов К ВИЭВ и Гамма МВА / Н.Г. Ипатенко, А.А. Маничев, В.А. Седов, В.Н. Гущин // Ветеринария. – М., 1989. Вып. 10. – С. 58-59. 38. Ипатенко Н.Г. Сибирская язва сельскохозяйственных животных / Н.Г. Ипа- тенко, В.А. Седов, В.С. Зелепукин, В.Н. Гущин // – М.: Агропромиздат,1987. – 256 с. 39. Ипатенко Н.Г. Лабораторные исследования при разных формах течения сибирской язвы / Н.Г. Ипатенко // Ветеринария. – 2000. – № 8. – С. 28-30. 135 40. Исангалин Ф.Ш. Изучение нового бактериофага Bacillus thuringiensis с ши- роким спектром действия, с целью разработки профилактического препарата для очагов сибирской язвы / Ф.Ш. Исангалин, Е.В. Жиленков, Л.И. Маринин, В.С. Перечко // Проблемы биологической и экологической безопасности: сб. матер. междун. науч конф. 22-25 мая 2000 г., г. Оболенск. – Оболенск, 2000. – С. 43-45. 41. Куличенко А.Н. Сибирская язва в XXI веке: эпидемиология и диагностика / А.Н. Куличенко, А.Г. Рязанова, О.И. Цыганкова, Е.А. Цыганкова, Н.П. Буравцева, Л.Ю. Аксенова, Т.М. Головинская, В.В. Воропаев, И.С. Тюменцева, Е.В. Жданова, В.М. Мезенцев, Е.И. Еременко // Мат. Х съезда Всероссийской науч.-практич. общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов «Итоги и перспективы обеспечения зпидемиологического благополучия населения Российской Федерации», 12-13 апреля 2012 // Инфекция и иммунитет. – 2012. – Т. 2. – № 1-2. – С. 161-162. 42. Куличенко А.Н. Диагностика сибирской язвы в Российской федерации // А.Н. Куличенко, Е.И. Еременко, Н.П. Буравцева, А.Г. Рязанова // ЖМЭИ. – М., 2010. – № 5. – С. 62-66. 43. Колесов С.Г. Сибирская язва / С.Г. Колесов // – М., 1976. – 287 с. 44. Королев Н.И. Инструкция по применению фаготетразолового метода (ФТМ) индикации возбудителя сибирской язвы / Н.И. Королев // – М.,1970. – 5 с. 45. Коротич А., Погребняк Л.И. Сибирская язва / А. Коротич, Л.И. Погребняк // – Киев: Изд-во Урожай, 1976. – 159 с. 46. Киреев Ю.Г. Совершенствование методологии прогнозирования активно- сти почвенных очагов сибирской язвы / Ю.Г. Киреев, Б.Л. Черкасский, В.И. Прометной // Эпидемиол. и клинико-иммунол. аспекты профилактики важнейших инф. заболеваний. Матер. конф. – Астрахань, 1996. – С.22-23. 47. Крылова М.Д. Фаготипирование бактерий / М.Д. Крылова // М., 1963. – 199 с. 48. Кересилидзе М. Чувствительность к антибиотикам и фаготипирование ста- филококков / М. Кересилидзе // Птицеводство. – 2006. – № 3. – С. 32-33. 136 49. Кадастр стационарно неблагополучных по сибирской язве пунктов Россий- ской Федерации: справочник / под ред. Б.Л. Черкасского. – М.: Интер-СЭН, 2005. – 829 с. 50. Курилова А.А. Разработка питательных сред на основе сырья растительного происхождения для культивирования возбудителей чумы, холеры, сибирской язвы : автореф. дис. … канд. биол. наук / А.А. Курилова. – Ставрополь, 2009. – 19 с. 51. Ляпустина Л.В. Бруцеллезные бактериофаги. Оптимизация технологии про- изводства и способов применения в лабораторной диагностике бруцеллеза : автореф. дис. … д-ра. мед. наук / Л.В. Ляпустина. – Ставрополь, 2004. – 41 с. 52. Ларина В.С., Петрова Л.С. Выделение активного бактериофага из бацилл сибирской язвы, обнаруженных в почве / В.С. Ларина, Л.С. Петрова // Микробиология и иммунология ООИ: сб. науч. работ противочумных учрежд. страны. – Саратов, 1964. – С. 94-95. 53. Левина Е.Н., Архипова В.Р. Сравнительное изучение сибиреязвенных бак- териофагов / Е.Н. Левина, В.Р. Архипова // ЖМЭИ. – М., 1967. – Вып.9. – С. 24-28. 54. Ломов Ю.М. Методические рекомендации по применению реакции адсорб- ции фага (РАФ) для индикации возбудителя сибирской язвы / Ю.М. Ломов // – Ростов-на-Дону,1972. – 6 с. 55. Лабораторная диагностика опасных инфекционных заболеваний. Практиче- ское руководство / под ред. Г.Г. Онищенко, В.В. Кутырева // – М.: ОАО Изд-во «Медицина», изд-во «Шико», 2009. – 472 с. 56. Методические указания МУК 4.2.2413-08 «Лабораторная диагностика и об- наружение возбудителя сибирской язвы». – М., 2008. – 65 с. 57. Методические указания МУК 4.1/4.2.588-96 «Методы контроля медицин- ских иммунобиологических препаратов, вводимых людям». – М., 1996. – 87 с. 58. Маринин Л.И Сибирская язва человека: эпидемиология, профилактика, ди- агностика, лечение / Л.И. Маринин, Г.Г. Онищенко, Т.Б. Кравченко, И.А. Дятлов, Е.А. Тюрин, А.В. Степанов, В.В. Никифоров// – М.: ЗАО МП «Гигиена», 2008. – 416 с. 137 59. Методы изучения биологических свойств возбудителя сибирской язвы (Учебно-методическое пособие) / Л.И. Маринин, И.А. Дятлов, А.Н. Мокриевич, И.В. Бахтеева, Е.В. Белова, А.И. Борзилов [и др.] // – М.: ЗАО МП «Гигиена», 2009. – 304 с. 60. Маринин Л.И. Микробиологическая диагностика сибирской язвы / Л.И. Маринин, Г.Г. Онищенко, А.В. Степанов [и др.] // М.: ВУНМЦ МЗ РФ. – 1999. – 224 с. 61. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология: Учебник / Л.Б. Борисов, А.М. Смирнова, И.С. Фрейдлин и др. / под ред. Л.Б. Борисова и проф. А.М. Смирновой. – М.: Медицина, 1994. – 528 с. 62. Македонова Л.Д. Создание набора типирующих фагов и схемы фаготипи- рования чумного микроба / Л.Д. Македонова, Т.А. Кудрякова, Г.В. Качкина // Карантинные и зоонозные инфекции в Казахстане: матер. междун. науч.-практич. конф., посвящ. 10-летию суверенитета Республики Казахстан и 50-летию Талдыкорганской противочум. станции, (г. Талдыкорган, 1-2 августа, 2001 г.). – Алматы, 2001. – С. 165-167. 63. Митрохина Е.Н. Выделение и идентификация бактерий рода Enterobacter / Е.Н. Митрохина // Ветеринария сельскохозяйственных животных. – М., 2006. – № 9. – С. 32-33. 64. Мезенцев В.М. Обстановка по сибирской язве в Краснодарском крае / В.М. Мезенцев, Н.П. Буравцева, А.Г. Рязанова, Е.И. Еременко, С.Н. Антюганов // Современные технологии в совершенствовании мер предупреждения и ответных действий на чрезвычайные ситуации в области общественного здравоохранения сан.-эпид. характера: матер. ХI межгосуд науч.-практич. конф. (Саратов, 16-17 октября 2012 г.). – Саратов, 2012. – С. 156-158. 65. Неляпин Н.М. Характеристика сибиреязвенных штаммов, выделенных в Европейской части СССР / Н.М. Неляпин, В.А. Ярощук, В.А. Проскурина [и др.] // Актуальные вопросы профилактики сибирской язвы: тез. докл. XII пленар. засед. межведомственной научно-методической комиссии по борьбе с сибирской язвой (20-21 октября 1986 г., г. Воронеж). – М., 1986. – С. 27. 138 66. Обносова Н.В., Шуляк В.П. О патогенных свойствах возбудителя сибир- ской язвы в разных очагах / Н.В. Обносова, В.П. Шуляк // Достижения и перспективы борьбы с сибирской язвой в СССР: тез. докл. X пленар. засед. межведомственной научно-методической комиссии по борьбе с сибирской язвой (28-29 сентября 1978 г., г. Баку). – М., 1978. – С. 123. 67. Озеров М.Ю. Активация рецепторов прорастания спор B. anthracis / М.Ю. Озеров, В.Г. Попов, Н.Н. Каркищенко, Д.В. Попов, С.Ю. Пчелинцев, В.Н. Каркищенко // Биомедицина. – М., 2011. – Вып. 2. – C. 18-23. 68. Онищенко Г.Г. Сибирская язва: актуальные аспекты микробиологии, эпи- демиологии, клиники, диагностики, лечения и профилактики / Г.Г. Онищенко, Н.Т. Васильев, Н.В. Литусов, А.Т. Харечко, П.Г. Васильев, Н.В. Садовой, В.В. Кожухов // М.: ВУНМЦ МЗ РФ. – 1999. – 447 с. 69. Онищенко Г.Г. Анализ вспышки сибирской язвы в Омской области в 2010 г. / Г.Г. Онищенко, А.Н. Куличенко, А.Г. Рязанова, Ю.Д. Демина, А.С. Крига, Е.И. Еременко, О.И. Цыганкова, Е.А. Цыганкова, Н.П. Буравцева, Л.Ю. Аксенова, Т.М. Головинская // ЖМЭИ. – М., 2012. – № 5. – С. 33-36. 70. Павлова И.И. Изучение морфологических и биологических свойств фагов Bac. аnthracis и Bac.сereus / И.И. Павлова // ЖМЭИ. – М.,1971. – Вып. 7. – С. 147. 71. Патент РФ № 2266963 Способ количественного определения резистентно- сти популяционного состава штаммов Bacillus аnthracis к сибиреязвенному бактериофагу / О.И. Цыганкова, Е.И Еременко, А.Г Рязанова, Е.А. Цыганкова. – Опубл. 27.12.2007. – Бюл. № 36. . – С. 24. 72. Патент РФ № 2133273 Способ выращивания сибиреязвенного бактериофага Гамма / О.И. Цыганкова, Б.В Солодовников. – Опубл. 20.07.1999. Бюл. № 20. 73. Патент РФ № 2171842 Способ получения сибиреязвенного бактериофага Гамма А-26 / Б.В Солодовников, И.С. Тюменцева, Е.Н. Афанасьев. – Опубл. 10.08.2001. – Бюл. № 22. – С. 3. 74. Патент РФ № 2351650 Штамм бактериофага Bacillus аnthracis R/D, исполь- зуемый для получения препарата для диагностики сибиреязвенной инфекции, жидкий препарат для диагностики сибиреязвенной инфекции и препарат для диа- 139 гностики сибиреязвенной инфекции / И.А Дятлов, В.М Попова, А.М Баранов. – Опубл. 10.04.2009. – Бюл. № 10 (III ч.) – С. 735. 75. Патент РФ № 2412769 Способ нейтрализации спор и вегетативных клеток Bacillus аnthracis / В.Г Попов, С.Ю. Пчелинцев, М.Ю Озеров, Д.В Попов. – Опубл. 27.02.2011. – Бюл. № 6 (II ч) – С. 425-426. 76. Патент РФ № 2413539 Биопрепарат для нейтрализации спор и вегетатив- ных клеток Bacillus аnthracis / В.Г. Попов, С.Ю Пчелинцев, М.Ю Озеров, Д.В. Попов. – Опубл. 10.03.2011. – Бюл. № .7 (II ч) – С. 475. 77. Преснов И.Н. Изменчивость Bас. аnthracis в природных условиях/ И.Н. Преснов // Ветеринария. – М., 1966. – Вып. 7. – С. 25-29. 78. Попов В.Г. Роль бактериофагов B. аnthracisв противодействии биотерро- ризму / В.Г. Попов, В.Н. Каркищенко, С.Ю. Пчелинцев, Д.В. Попов, А.А. Старшов // Биомедицина. – М., 2006. – Вып. 2. – С. 24-32. 79. Петров С.П. Заболеваемость людей сибирской язвой в Апанасенковском районе Ставропольского края в 1996 году / С.П. Петров, Е.П. Забудская, М.М. Кохов // Матер. науч.-практич. конф. , посвящ. 75-летию санэпидслужбы России «Здоровье населения и среда обитания». – Ставрополь. 1997. – Сб. III. – С. 188-189. 80. Петров С.П. Об эпиднадзоре за сибирской язвой в Ставропольском крае / С.П. Петров, П.П. Постовой, И.К. Михненко, Л.Л. Гурьев // Матер. науч.-практич. конф. , посвящ. 75-летию санэпидслужбы России «Здоровье населения и среда обитания». – Ставрополь. 1997. – Сб. III. – С. 191-193. 81. Петрюк В.А. О вспышке сибирской язвы в Карачаево-Черкесской респуб- лике / В.А. Петрюк, В.А. Проскурина, В.И. Ефременко, Т.Н. Фунтикова, Д.С. Агапитов, А.Е. Суворова // Ставрополь, 1997. – 9 с. 82. Рязанова А.Г. Характеристика биологических свойств атипичных штаммов сибиреязвенного микроба, усовершенствование методов их идентификации и дифференцирования от близкородственных бацилл : автореф. дис. … канд. мед. наук / А.Г. Рязанова. – Ростов-на-Дону, 2006. – 23 с. 140 83. Рязанова А.Г. Эпидемиологическая ситуация по сибирской язве в Россий- ской Федерации: анализ заболеваемости в 2010 г., прогноз на 2011 г. / А.Г. Рязанова, Е.И. Еременко, Н.П. Буравцева, О.И. Цыганкова, Е.А. Цыганкова, Л.Ю. Аксенова, Т.М. Головинская, А.Н. Куличенко // Проблемы особо опасных инфекций. – Саратов, 2011. – Вып.1 (107). – С. 42-45. 84. Рязанова А.Г. Анализ заболеваемости сибирской язвой в 2011 г., прогноз на 2012 г. / А.Г. Рязанова, Е.И. Еременко, Е.А. Цыганкова, Л.Ю. Аксенова, О.И. Цыганкова, Н.П. Буравцева, Т.М. Головинская, А.Н.Куличенко // Проблемы особо опасных инфекций. – Саратов, 2012. – Вып.1 (111). – С. 37-38. 85. Руководство по медицинской микробиологии. Частная медицинская мик- робиология и этиологическая диагностика инфекций. Книга II / Колл. авторов / под ред. А.С. Лабинской, Н.Н. Костюковой, С.М. Ивановой. – М.: Изд-во БИНОМ, 2010. – 1152 с. 86. Седов А.В. Защита человека в чрезвычайных ситуациях / А.В. Седов, С.Ф. Гончаров, Г.Г. Онищенко [и др.]. – М., 2002. – 502 с. 87. Солодовников Б.В. Совершенствование биотехнологии производства сиби- реязвенного диагностического бактериофага : автореф. дис. … канд. биол. наук / Б.В. Солодовников. – Ставрополь, 2002. – 21 с. 88. Солодовников Б.В. Оптимизация условий культивирования сибиреязвенно- го бактериофага / Б.В. Солодовников, О.И. Цыганкова, И.С. Тюменцева, В.И. Ефременко // Мат. науч.-практич. конф., посвящ. Образованию противочумной службы России. – Саратов, 1997. – Т.2. – С. 237. 89. Солодовников Б.В.О технологии получения сибиреязвенного бактериофага / Б.В. Солодовников, О.И. Цыганкова, И.С. Тюменцева, В.И. Ефременко // Мат. науч.-практич. конф., посвящ. Образованию противочумной службы России. – Саратов, 1997а. – Т.2. – С. 237. 90. Саяпина Л.В. Характеристика нового бактериофага диагностического си- биреязвенного Гамма А-26 жидкого / Л.В. Саяпина, А.С. Абдрашитова, И.В. Касина, А.Н. Малахаева, Л.И. Ращепкин, А.В. Осин, О.Ю. Ляшова, Т.В. Валова, 141 Ю.А. Попов, Н.И. Микшин, Н.П. Буравцева, Н.П. Миронова, О.А. Лобовикова, А.Н. Мокриевич, Н.Г. Гефан // Биопрепараты. – М., 2011 г. – № 1 (41). – С. 36-39. 91. Сидоренко С.В. Сравнительная эффективность типирования тремя коллек- циями бактериофагов штаммов метициллинрезистентных staphylococcusaureus, выделенных в стационарах г. Москва / С.В. Сидоренко, В.Я. Прохоров, В.И. Карабак, В.Г. Жуховицкий, Е.И. Васильева, О.А. Дмитренко. Н.Н. Тарасович, Р.В. Терехова // ЖМЭИ. 2003. – № 1. – С. 3-9. 92. Скородумова Д.И. Лабораторная диагностика стафилококкозов / Д.И. Ско- родумова // Ветеринария сельскохозяйственных животных. – М., 2007. – № 6. – С. 27-32. 93. Тимаков В.Д., Гольдфарб Д.М. Реакция нарастания титра фага как метод диагностики инфекционных заболеваний и индикации / В.Д. Тимаков, Д.М. Гольдфарб // ЖМЭИ. – М., 1960. – Вып 1. – С. 5. 94. Хотько Н.И. К характеристике эпидемического процесса при сибирской яз- ве в Среднем Поволжье / Н.И. Хотько // Актуал.пробл. профилактики особо опасных и природно-очаговых инф. болезней: тез. докл. науч. конф.. посвящ. 60-летию Иркутского противочум. Института. – Иркутск, 1994. – С. 168. 95. Цыганкова О.И. Фенотипические и генетические особенности культураль- но-морфологических вариантов B. anthracis / О.И. Цыганкова, Е.И. Еременко, Е.А. Цыганкова, Н.П. Буравцева, А.Г. Рязанова // ЖМЭИ. – М., 2008. – № 4. – С. 6-11. 96. Цыганкова О.И. Фенотипическая и генетическая вариабельность штаммов сибиреязвенного микроба (теоретические и практические аспекты) : автореф. дис. … д-ра. мед. наук / О.И. Цыганкова. – Ростов-на-Дону, 2007. – 38 с. 97. Цыганкова О.И. Изучение популяционного состава сибиреязвенного штам- ма 1(СО) по чувствительности к сибиреязвенным фагам / О.И. Цыганкова // Диагн., лечение и проф. опасных инф. заболеваний. Биотехнология. Ветеринария: мат. юбилейной науч. конф. посвящ. 70-летию НИИ Микробиологии МО РФ. – Киров, 1998. – С. 258-259. 142 98. Цыганкова О.И., Ярощук В.А., Буравцева Н.П. Выбор бактериофагов для идентификации сибиреязвенного микроба / О.И. Цыганкова, В.А. Ярощук, Н.П. Буравцева // Актуальные вопросы профилактики особо опасных и других инфекционных заболеваний: матер. науч. практ. конф. «60 лет противочумной службы Кавказа». – Ставрополь, 1995. – С.245-246. 99. Адамс М.Н. Бактериофаги / Пер. с англ. – М.: Иностранная литература, 1961. – 528 с. 100. Anderson T. Role of tryptophane in the adsorption of two bacterial viruses on their host E. coli. // J. cell. Comp. Physiol. – 1945. – 25, 1, 17. 101. Ackermann H.-W., Roy R., Martin M., Murthy M. R., and Smirnoff W. A. Partial characterization of a cubic Bacillus phage // Can. J. Microbiol. – 1978. – 24: 986-993. 102. Buck C.A., Anacker R.L., Newman F.S., and Eisenstark A. Phage isolated from lysogenic Bacillus anthracis // J. Bacteriol. – 1963. – Vol. 85. – P.1423-1430. 103. Bradaris N., Punda-Polis V. Cutaneous anthrax due to penicillinresistant Bacillus anthracis, transmitted by an insect bite // Lancet. – 1992. – Vol. 340. – P. 306-307. 104. Brown E.R., Cherry W.B. Specific identification of Bacillus anthracis by mens of a variant bacteriophage // J. Infect. Dis. – 1955. – Vol. 96. – P. 34-39. 105. Bishop-Lilly K.A. Whole genome sequencing of phage resistant Bacillus anthracis mutants reveals an essential role for cell surface anchoring protein CsaB in phage AP50c adsorption Sozhamannan / K.A. Bishop-Lilly, R.D. Plaut, P.E. Chen, A. Akmal, K.M. Willner, A. Butani, S. Dorse, V. Mokashi, A.J. Mateczun, C. Chapman, M. George, T. Luu, T.D. Read, R. Calendar, S. Stibitz, S. Sozhamannan // Virology Journal. – 2012. – 9:246. 106. Beumer-Jochmans M.-P., Dizkx J., Oleffe-Koopmansch S. Effect du calcium sur la penetration d,un phage dans certains bacteries sensible // Ann.Inst.Past. – 1959. – T. 96. – № 6. – Р. 771-780. 107. Caksen H., Arabaci F., Abuhandan M., Tuncer O., Cesur Y. Cutaneous anthrax in eastern Turkey // Cutis. – 2001. – 67:488; 92. 108. Cieslak T.J., Eitzen E.M. Gr. Clinical and Epidemiologic Principles of Anthrax // Emerg. Infect. Dis. – 1999. – 5:552; 5. 143 109. Coffey A. and Ross R.P. Bacteriophage-resistance systems in dairy starter strains: Molecular analysis to application // Antonie Van Leeuwenhoek. – 2002. – 82: 303-32. 110. , Сohen S. Molecular bases of parasitism of some bacterial viruses // Science. – 1956. – 123, 3199, 653. 111. Doganay M., Aydin N. Antimicrobal susceptibility of Bacillus anthracis // Scand. J. Infect. Dis. – 1991. – Vol. 23. – P.333-335. 112. Delbruck M. The growth of bacteriophage and lysis of the host // J. Gen. Physiol. – 1940. – No. 23 – P. 643-647. 113. Davison S. Identification of the Bacillus anthracis (gamma) phage receptor / S. Davison, E. Coutoure-Tosi, T. Candela et al. // J. Bacteriol. – 2005. – V. 187 – No. 10. – P. 6742-6749. 114. Fouet A. Bacillus anthracis S-layer / A. Fouet, S. Mesnage, E. Tosi-Counon et al. // 3-rd International Conference on Anthrax, 7-10-th Sept. 1998, Plymouth, England. – 1998. – P. 16. 115. Fouts D.E., Rasko D.A., Cer R.Z., Jiang Lingxia et al. Sequencing Bacillus anthracis Typing Phages Gamma and Cherry Reveals a Common Ancestry // J. Bacteriol. – 2006. – Vol. 188. – No. 9 – P. 3402-3408. 116. Fischetti V.A., Gotschlich E.C., Bernheimer A.W. Purification and physical properties of group C streptococcal phage-associated lysine // J. Exp. Med. – 1971. – 133: 1105-1117. 117. Fowler C., Cohen S. Chemical studies in host-virus interactions. A method of determining nutritional requirements for bacterial virus multiplications // J. Exp. Med. – 1948. – Vol. 87. – No. 4. – P. 259. 118. Gratia A. Des relations numeriques entre bacteries lysogenes et particulers de bacteriophage // Ann. Inst. Pasteu. – 1936. – V. 57. – P. 652. 119. Holt J.G. The Shorter Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology // Baltimore. – 1980. – 495 p. 120. Helgason E., Okstad O.A., Caugant D.A. et al. Bacillus anthracis, Bacillus cereus and Bacillus thuringiensis – one species on the basis of genetic avidence // Appl. Environ. Microbiol. – 2000. – V. 66 – No. 6. – P. 2627-2630. 144 121. Inal J.M., Karunakaran K.V. phi 20, a temperate bacteriophage isolated from Bacillus anthracis exists as a plasmidial prophage // Curr Microbiol. – 1996. – 32: 171175. 122. Imperial M.J., Casadevall A. 2011. Bioterrorism: lessons learned since the anthrax mailings. mBio 2 (6):e00232-11. Doi: 10. 1128/mBio. 00232-11. 123. Kikkawa H.S., Ueda T., Suzuki S., Yasuda J. Characterization of the catalytic activity of the gamma-phage lysin, PlyG, specific for Bacillus anthracis // FEMS Microbiol Lett. – 2008 . – 286 (2). – P236-40. 124. Lechner S., Mayr R., Francis K.P. et al. Bacillus weihenstephanensis sp. nov. is species of the Bacillus cereus group // Int. J. Syst. Bacteriol. – 1998. – Vol. 48. – P. 1373-1382. 125. Lenski R.E. Coevolution of bacteria and phage: Are there endless cycles of bacteria defenses and phage counterdefenses? // J. Theor. Biol. 108: 319-325, 1984. 126. Lanny Y. Invasion by bacteriophage T5. Dissociation of calcium dependent processes // Virology. – 1960. – Vol. 10 – No. 4 – P. 514. 127. McCloy E.W. Studies on a lysogenic Bacillus strain. A bacteriophage specific for Bacillus anthracis // J. Hyg. Camb. – 1951. – Vol. 49. – P. 114-125. 128. Moineau S. Applications of phage resistance in lactic acid bacteria // Antonie Van Leeuwenhoek. – 1999. – 76: 377-382. 129. Nagy E. A highly specific phage attacking Bacillus anthracis strain Sterne //Acta Microbiol. Acad. Sci. Hung. – 1974. – 21:257–263. 130. Nagy, E., Pragai B., Ivanovics G. Characteriation of phage AP50, an RNA phage containing phospholipids // J. Gen. Virol. – 1976. – V. 32. – P. 129-132. 131. Nakamura L.K. Bacillus pseudomycoides sp. nov. // Int. J. Syst. Bacteriol. – 1998. – Vol. 48. – P. 1031-1035. 132. O,Donoqhe K., Ellar D.J. STM analysis of Bacillus cereus // 5th International Conference on Anthrax: Program and Abstract Book. Nice, France. – 2003. 133. Okinaka R., Pearson T, Keim P. Antrax, bat not Bacillus anthracis ? // PLoS Pathog. – 2006. – 2(11): e112. 145 134. Odendaal M., Pieterson P.M., de Vos V., Botha A.D. The biochemical, morphological and virulence profiles of Bacillus anthracis isolated in the Kruger National Park. Onderstepoort // J. Vet. Res. – 1991. – 58: 21-26. 135. Priest F.G., Goodfellow M., Todd C. A numerical classification of the genus Bacillus // J. Gen. Microbiol. – 1988. – Vol. 134. – P. 1847-1882. 136. Priest F.G., Barker M., Baillie L.W., Holmes E.C., Maiden M.C. Population structure and evolution of the Bacillus cereus group // J. Bacteriol. – 2004. – 186: 79597970. 137. Papaparaskevas J., Houhoula D.P., Papadimitriou M. et al. Ruling out Bacillus anthracis // Emerg. Infect. Dis. – 2004. – Vol. 10. – № 4. – P. 732-735. 138. Redmond C., Henderson I., Turnbull P.C.B., Bowen J. Phage from different strains of Bacillus anthracis // Proceedings of the International Workshop on Anthrax – Winchester, England, September 19-21, 1995. Salisbury Medical Bulletin, Number 87, Special Supplement, June 1996. – P.60-63. 139. Reiman R.W. Indirect Detection Of Bacillus Anthracis (Anthrax) Using Amplified Gamma Phage-Based Assays // PhD Thesis, Colorado School of Mines, USA. – 2007. – 151 p. 140. Schuch R., Nelson D. and Fischetti V.A. A bacteriolytic agent that detects and kills Bacillus anthracis // Nature. – 2002. – 418:884–889. 141. Turnbull P.C.B., Kramer J.M. Bacillus // In: Balows A. et al. (ed.), Manual of Clinical Microbiology, 5th ed. – 1991. – P. 296-303. 142. Turnbull P.C.B., Sirianni N.M., LeBron C.L. et al. MICs of selected antibiotics for Bacillus anthracis, Bacillus cereus, Bacillus thuringiensis and Bacillus mycoides from a range of clinical and environmental sources as determined by the Etest // J. Clin. Microbiol. – Aug. 2004 – Vol. 42. – No 8. – P. 3626-3634. 143. Vera T., Grumbles L.C., Franklin T.E., Jungerman P.F. Effect of lysogenicity on the virulence of Bacillus anthracis // Am. J. Vet. Res. – 1968. – 29: 1059-1066. 144. Willey T.L., Ellar D.J. Comparative analyses of Bacillus cereus clinical isolates // 5th International Conference on Anthrax: Program and Abstract Book. Nice, France. – 2003. – P. 24. 146 145. Walter M.H., Baker D.D. Three Bacillus anthracis Bacteriophages from Topsoil // Current microbiology. – 2003. – Vol. 47. – P. 55-58. 146. Watanabe T., Morimoto A. and Shiomi T. The fine structure and the protein composition of gamma phage of Bacillus anthracis.// Can. J. Microbiol. – 1975. – 21: 1889-1892. 147. Yoong P., Schuch R., Nelson D. and Fischetti V.A. PlyPH, a Bacteriolytic Enzyme with a Broad pH Range of Activity and Lytic Action against Bacillus anthracis // J. Bacteriol. – 2006. – Vol. 188. – No. 7. – P. 2711-2714.
