МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Федеральное государственное бюджетное учреждение Министерства здравоохранения Российской Федерации
реклама
МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Министерства здравоохранения Российской Федерации На правах рукописи ЛОБАЧ РОМАН НИКОЛАЕВИЧ ДИАГНОСТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ СИБИРЕЯЗВЕННЫХ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ И БАКТЕРИОФАГА ГАММА А-26 ПРИ ВЫЯВЛЕНИИ И ИДЕНТИФИКАЦИИ ВОЗБУДИТЕЛЯ СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ 03.02.03 – микробиология ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научный руководитель – доктор медицинских наук Саяпина Л.В. Москва – 2013 2 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ВНИИВВиМ РАСН – Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии Российской академии сельскохозяйственных наук ГНЦ ПМБ – Государственный научный центр прикладной микробиологии и бактериологии, п. Оболенск ГосКПБ «М» – Государственная коллекция патогенных бактерий ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб» ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота ИФА – иммуноферментный анализ ИИХЭ – иммунохроматографический индикаторный элемент КРС – крупный рогатый скот ЛФ – летальный фактор МИБП – медицинские иммунобиологические препараты МКА – моноклональные антитела МРС – мелкий рогатый скот МУК – методические указания МФА – метод флуоресцирующих антител МЧС РФ – Министерство Российской Федерации по делам гражданской обороны, чрезвычайным ситуациям и ликвидации последствий стихийных бедствий ООИ – особо опасные инфекции ОСО – отраслевой стандартный образец ОФ – отечный фактор ПА – протективный антиген ПЦР – полимеразная цепная реакция РА – реакция агглютинации РНГА – реакция непрямой гемагглютинации РИФ – реакция иммунофлуоресценции 3 ТИФА – твердофазный иммуноферментный анализ ФКУЗ Иркутский НИПЧИ – научно-исследовательский противочумный институт ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб» Роспотребнадзора – Федеральное казенное учреждение здравоохранения Российский научно-исследовательский противочумный институт «МИКРОБ» ФКУЗ Став НИПЧИ – Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт ФСБ – фосфатно-солевой буфер MLVA – многолокусный анализ вариабельных областей генома микроорганизма «294 ЦСООР» – ФГКУ «294 Центр спасательных операций особого риска» МЧС РФ 4 ОГЛАВЛЕНИЕ СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 2 ВВЕДЕНИЕ 6 Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 15 1.1. Эпидемиологическая ситуация по сибирской язве в мире и на территории Российской Федерации 15 1.2. Современное представление о патогенности возбудителя сибирской язвы… 26 1.3. Современные диагностические препараты, используемые для индикации и идентификации возбудителя сибирской язвы…. 31 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 44 Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 44 Глава 3. ИЗУЧЕНИЕ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ И СПЕЦИФИЧНОСТИ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ ФЛУОРЕСЦИРУЮЩИХ СИБИРЕЯЗВЕННЫХ ВЕГЕТАТИВНЫХ АДСОРБИРОВАННЫХ 55 3.1. Оценка специфической активности иммуноглобулинов диагностических флуоресцирующих сибиреязвенных вегетативных адсорбированных 56 3.2. Определение специфичности иммуноглобулинов диагностических флуоресцирующих сибиреязвенных вегетативных 63 Глава 4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ДИАГНОСТИЧЕСКОЙ ЦЕННОСТИ (СПЕЦИФИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ, СПЕЦИФИЧНОСТЬ) ИММУНОГЛОБУЛИНОВ ФЛУОРЕСЦИРУЮЩИХ СИБИРЕЯЗВЕННЫХ СПОРОВЫХ АДСОРБИРОВАННЫХ 4.1. Определение специфической 72 активности иммуноглобулинов диагностических флуоресцирующих сибиреязвенных споровых 4.2. Изучение специфичности иммуноглобулинов 73 диагностических флуоресцирующих сибиреязвенных споровых адсорбированных сухих Глава 5. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ДИАГНОСТИЧЕСКОЙ СИБИРЕЯЗВЕННОГО БАКТЕРИОФАГА ГАММА А-26 80 ЦЕННОСТИ 88 5 5.1. Изучение диапазона литической активности бактериофага Гамма А-26 сибиреязвенного 89 5.2. Оценка специфичности сибиреязвенного бактериофага Гамма А-26 95 ЗАКЛЮЧЕНИЕ 103 ВЫВОДЫ 110 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 112 6 ВВЕДЕНИЕ Актуальность исследования Сибирская язва относится к особо опасным инфекциям (ООИ) со своеобразным инфекционным циклом, который предполагает обязательный внеорганизменный этап споруляции возбудителя. Согласно сведениям Dixon T. (1999 г.), на протяжении многих веков, болезнь регистрировалась не менее, чем в 200 странах мира, а заболеваемость людей оценивалась от 20 до 100 тысяч случаев в год [126]. По данным ВОЗ, ежегодно в мире от сибирской язвы гибнут около 1 млн. животных и заболевают около 1 тыс людей, в том числе с нередким летальным исходом. Заболеваемость животных и людей регистрируется на уровне 900-1000 случаев в год не только в слаборазвитых странах афроазиатского региона, но и на территориях Америки и Европы, в том числе в США, Канаде, Франции и Финляндии, а также - в Австралии [4, 118, 120, 131]. В России за период с 1900 по 2012 год зарегистрировано более 35 тыс. стационарно неблагополучных по сибирской язве пунктов и более 70 тыс. вспышек инфекции [52, 88]. Заболевание сибирской язвой, вызываемое возбудителем Bacillus anthracis, характеризуется острым началом и тяжелым течением. При несвоевременной диагностике и отсутствии этиотропной терапии летальность при сибиреязвенной инфекции может достигать 90 % [39, 90]. За последние 5 лет заболеваемость сибирской язвой в России несколько стабилизировалась, однако все еще остается на высоком уровне [52, 91]. По данным МЧС в стране сохраняется негативная динамика роста количества чрезвычайных ситуаций различного характера (землетрясения, цунами, извержения вулканов, засуха, наводнение и т.п.) [60, 94, 95]. Высокой остается угроза завоза животных, сырья и продуктов животноводства, контаминированных спорами возбудителя сибирской язвы на территорию Российской Федерации из стран ближнего зарубежья [78, 91, 7 109]. Перечисленные факторы способствует осложнению эпидемической ситуации по сибирской язве [12, 36, 54]. В связи с вышеизложенным, совершенствование лабораторной диагностики сибирской язвы на этапах индикации и идентификации B. anthracis, является актуальной [37, 58, 113]. С целью своевременного выявления возбудителя сибирской язвы в различных объектах окружающей среды и биологическом материале возникает необходимость в использовании стандартных диагностических препаратов [83]. Несмотря на разработку новых сибиреязвенных препаратов, эта проблема до сих пор не решена [28, 79]. Недостаточное обеспечение лабораторных служб зарегистрированными препаратами ставит эту проблему для практического здравоохранения в число приоритетных. В России до 2010 г. для индикации возбудителя сибирской язвы применялись только 2 зарегистрированных в установленном порядке препарата: тестсистема ГенСИБ и набор реагентов «АмплиСенс B. anthracis-FRT». В соответствии с требованиями МУК 4.2.2413-08 «Лабораторная диагностика для обнаружения сибирской язвы» основными методами индикации возбудителя сибирской язвы, являются экспресс-методы (МФА, ПЦР, ИФА, РНГА). При этом лабораторными критериями установления диагноза сибирской язвы являются положительные результаты в МФА, ПЦР, иммуносерологических реакциях, с обязательным выделением и идентификацией культуры сибиреязвенного микроба бактериологическим методом [30, 67, 79, 150]. Из современных методов серологической диагностики сибирской язвы наиболее доступным, быстрым и информативным является метод флуоресцирующих антител, обеспечивающий обнаружение возбудителя сибирской язвы на ранних этапах диагностики [10]. Положительные результаты, полученные в РИФ методом флуоресцирующих антител, позволяют сделать предварительный вывод о наличии возбудителя 8 сибирской язвы или его антигенов в исследуемом биологическом материале или объектах окружающей среды и своевременно начать проведение противоэпидемических, профилактических и терапевтических мероприятий. Одним из важных тестов, позволяющих идентифицировать штаммы B. аnthracis, является лизабельность бактериофагом. Определение лизабельности выделенных культур специфическим бактериофагом многие исследователи считают одним из наиболее надежных, быстрых и простых методов идентификации штаммов B. anthracis [1, 21, 32]. В связи с этим тест с сибиреязвенным бактериофагом является одним из опорных, по которым сибиреязвенный микроб можно отличить от близкородственных бацилл. Особую ценность этот метод приобретает при идентификации атипичных по капсулообразованию, вирулентности и биохимическим свойствам штаммов сибиреязвенного микроба [26, 27]. Специалистами противочумного Ставропольского института иммуноглобулины научно-исследовательского (Ставропольский диагностические НИПЧИ) флуоресцирующие предложены сибиреязвенные вегетативные и споровые адсорбированные, а также сибиреязвенный бактериофаг Гамма А-26, своевременная регистрация которых в установленном порядке в Российской Федерации позволит улучшить лабораторную диагностику на этапах индикации и идентификации возбудителя сибирской язвы. В связи с этим возникла необходимость проведения исследований по изучению качества и диагностической ценности иммуноглобулинов сибиреязвенных вегетативных и споровых адсорбированных, и бактериофага Гамма А-26, с использованием разработанных Программ, включающих выбор препаратов или метода сравнения, подбор штаммов B. anthracis с различным плазмидным профилем и близкородственных микроорганизмов, проб объектов окружающей среды и биологического материала, контаминированных B. anthracis и близкородственными микроорганизмами. 9 Цель исследования Изучить диагностическую иммуноглобулинов ценность флуоресцирующих сибиреязвенных (вегетативные и споровые) адсорбированных и бактериофага Гамма А-26 на этапах индикации и идентификации возбудителя сибирской язвы. Задачи исследования 1. Оценить специфическую иммуноглобулинов активность флуоресцирующих и специфичность сибиреязвенных вегетативных адсорбированных в РИФ по сравнению с бактериологическим методом (тест на гемолиз). 2. Охарактеризовать активность и диагностическую специфичность) ценность иммуноглобулинов (специфическая флуоресцирующих сибиреязвенных споровых адсорбированных на чистых культурах, в пробах из объектов окружающей среды и биологического материала. 3. В сравнительных испытаниях определить широту диапазона литической активности и специфичности бактериофагов диагностических сибиреязвенных Гамма А-26 и Fah ВНИИВВиМ. 4. Обосновать возможность использования сибиреязвенных препаратов иммуноглобулинов адсорбированных флуоресцирующих и бактериофага (вегетативные Гамма А-26 для и споровые) индикации и идентификации возбудителя сибирской язвы в лабораторной диагностике сибирской язвы. Научная новизна Впервые установлена высокая специфическая активность иммуноглобулинов сибиреязвенных вегетативных адсорбированных при исследовании мазков из чистых культур, биологического материала (мясо) и проб из объектов окружающей среды, контаминированных B. anthracis. Показано, что иммуноглобулины в разведении 1:64 обеспечивают 10 специфическое свечение 93,8±6,0 % из 16 исследуемых штаммов B. anthracis в вегетативной форме. Впервые на представительном материале (объекты окружающей среды, биологический материал, чистые культуры) установлена диагностическая ценность иммуноглобулинов флуоресцирующих сибиреязвенных споровых адсорбированных, обеспечивающих в разведении 1:64 специфическое свечение сибиреязвенного микроба в споровой форме в мазках чистых культур, из объектов окружающей среды (смывы, корма, вода, почва) и биологического материала и не вызывающих специфического свечения со штаммами близкородственных микроорганизмов. Доказано преимущество проведения РИФ с помощью иммуноглобулинов флуоресцирующих сибиреязвенных вегетативных и споровых адсорбированных перед бактериологическим методом (тест на гемолиз) при исследовании проб объектов окружающей среды и биологического материала по времени учета результатов – 2,5-3 ч против 40 ч соответственно. Новыми являются данные сравнительных исследований бактериофагов сибиреязвенных Гамма А-26 и Fah ВНИИВВиМ (ветеринарного). Испытываемый бактериофаг Гамма А-26 обладает широким диапазоном действия к исследуемым штаммам B. anthracis и высокой специфичностью в отношении близкородственных микроорганизмов. Установлено, что сибиреязвенный бактериофаг Гамма А-26 лизировал 97,9±2,1 % типичных и атипичных штаммов B. anthracis из 47 исследуемых и не лизировал 95,8±2,36 % из 72 штаммов близкородственных микроорганизмов. Обоснована здравоохранении вегетативных и сибиреязвенного целесообразность изучаемых споровых Гамма применения иммуноглобулинов адсорбированных, А-26, в а предназначенных идентификации возбудителя сибирской язвы. практическом сибиреязвенных также для бактериофага индикации и 11 Практическая значимость работы. В результате работы внедрены в практику следующие препараты: - иммуноглобулины флуоресцирующие сибиреязвенные вегетативные адсорбированные сухие (Регистрационное удостоверение № ФСР - иммуноглобулины флуоресцирующие сибиреязвенные споровые 2011/11338); адсорбированные сухие (Регистрационное удостоверение № ФСР 2011/11339); - бактериофаг сибиреязвенный Гамма А-26 (Регистрационное удостоверение № ФСР 2011/10415). Внесены изменения в нормативную документацию на: - иммуноглобулины диагностические флуоресцирующие сибиреязвенные вегетативные адсорбированные сухие «Технические условия 9389-003-01897080-2010» и «Инструкция по применению» (Акт внедрения рекомендаций, утвержденный директором ФКУЗ Ставропольского НИПЧИ); - иммуноглобулины диагностические флуоресцирующие сибиреязвенные споровые адсорбированные сухие «Технические условия 9389-005-01897080-2010» и «Инструкция по применению» (Акт внедрения рекомендаций, утвержденный директором ФКУЗ Ставропольского НИПЧИ); - бактериофаг диагностический сибиреязвенный Гамма А-26 жидкий «Технические условия 9389-013-01897080-2009» и «Инструкция по применению» (Акт внедрения рекомендаций, утвержденный директором ФКУЗ Ставропольского НИПЧИ). Материалы диссертации используются при чтении лекций на курсах повышения квалификации специалистов по особо опасным инфекциям. Основные положения, выносимые на защиту 1. Испытываемые флуоресцирующие иммуноглобулины сибиреязвенные вегетативные диагностические адсорбированные в разведении 1:64 обеспечивают специфическое свечение 93,8±6,0 % штаммов 12 B. anthracis в вегетативной форме, что позволяет их использовать для индикации при исследовании чистых культур, объектов окружающей среды и биологического материала в лабораторной диагностике сибирской язвы. 2. Диагностический препарат иммуноглобулины флуоресцирующие сибиреязвенные споровые адсорбированные в разведении 1:64 выявляет 93,8±6,0 % исследуемых штаммов B. anthracis и в 96,9±3,1 % случаев не реагирует со штаммами близкородственных микроорганизмов; в пробах из объектов внешней среды и биологического материала сибиреязвенный микроб обнаруживается в 100 % случаев. 3. Использование иммуноглобулинов сибиреязвенных вегетативных и споровых адсорбированных в РИФ имеет явное преимущество перед бактериологическим методом (тест на гемолиз) при исследовании проб объектов окружающей среды и биологического материала по времени постановки и учету результатов – 2,5-3 ч против 40 ч. 4. Бактериофаг диагностический сибиреязвенный Гамма А-26 обладает широким диапазоном литической активности и специфичностью, что подтверждено наличием лизиса 97,9±2,1 % штаммов B. anthracis из 47 исследуемых и ее отсутствием в 95,8±2,36 % случаев при исследовании 72 штаммов близкородственных микроорганизмов. При учете результатов установлено, что бактериофаг сибиреязвенный Гамма А-26 превосходит препарат сравнения по четкости лизиса исследуемых штаммов B. anthracis. Работа выполнена на базах лаборатории препаратов против чумы и др. особо опасных инфекций ГИСК им Л.А. Тарасевича, Государственной коллекции патогенных бактерий РосНИПЧИ «Микроб», Иркутского НИПЧИ, Государственного научного центра прикладной микробиологии и биотехнологии (п. Оболенск), бактериологической лаборатории ФГКУ 294 ЦСООР МЧС РФ. 13 Апробация работы Материалы диссертации нашли отражение на Всероссийских и межгосударственных научно-практических конференциях: научно- практической конференции «Итоги и перспективы фундаментальных и прикладных исследований в РосНИПЧИ «Микроб» (Саратов, 2009); XI Межгосударственной научно-практической конференции «Современные технологии в совершенствовании мер предупреждения и ответных действий на чрезвычайные ситуации в области общественного здравоохранения санитарно-эпидемиологического характера» (Саратов, 2012); на 2 научнопрактической повышению конференции качества молодых экспертизы ученых «Научные лекарственных средств: подходы к реалии и перспективы» в ФГБУ «НЦЭСМП Минздрава России» (Москва, 2013 г.). Материалы диссертации вошли в отчеты по законченным техническим и медицинским испытаниям сибиреязвенных препаратов за период 2007 2010 гг. Результаты исследований были использованы при составлении 3 нормативных документов: Технические условия 9389-003-01897080-2010 и инструкция по применению на Иммуноглобулины диагностические флуоресцирующие сибиреязвенные вегетативные адсорбированные сухие; Технические условия 9389-005-01897080-2010 и инструкция по применению на Иммуноглобулины диагностические флуоресцирующие сибиреязвенные споровые адсорбированные сухие; Технические условия 9389-013-01897080-2009 и инструкция по применению на Бактериофаг диагностический сибиреязвенный Гамма А-26 жидкий. Личный вклад автора. Обоснование проблемы, постановка цели и задачи работы, выбор методов исследования, выполнение 14 экспериментальной и аналитической части работы, обобщение и интерпретация полученных данных, подготовка научных публикаций. Соискателем проведен анализ полученных данных, сформулированы основные положения диссертации, составляющие ее новизну и практическую значимость. Структура и объем диссертации. Работа изложена на 135 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов и обсуждений, заключения и выводов. Диссертация иллюстрирована 14 таблицами и 7 рисунками. Библиографический указатель включает 168 источников литературы отечественных и зарубежных авторов. По теме диссертации опубликованы 4 статьи, 3 из них в изданиях, рекомендованных ВАК Российской Федерации. 15 Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Эпидемиологическая ситуация по сибирской язве в мире и на территории Российской Федерации Сибирская язва – острое инфекционное заболевание животных и человека, относящееся к группе особо опасных инфекций. Впервые проявившись в какой-либо регионе, она может сохранять на многие года угрозу повторного развития, способствуя этим развитию и существованию эпизоотической цепи [51, 109, 131]. Сибирская язва относится к природноочаговым сапрозоонозам со своеобразным инфекционным циклом, который предполагает обязательный внеорганизменный этап споруляции возбудителя [4, 59, 130, 156]. Согласно сведениям Dixon T. [126], на протяжении многих веков, болезнь регистрировалась не менее, чем в 200 странах мира, заболеваемость людей составила 20-100 тысяч случаев в год. По данным ВОЗ, ежегодно на земном шаре гибнут около 1 млн. животных и заболевают около 1 тысячи людей с нередким летальным исходом. Из общего числа людей, заболевших сибирской язвой, 21,9 % зарегистрированы в Европе; 25,1 % - в Африке; 42,8 % - в Азии и 10,1 % - в Америке [4, 118, 120, 131]. Суммарно регистрируемая ежегодно заболеваемость животных и людей на уровне 900-1000 случаев выявляется в десятках стран не только слаборазвитого афро-азиатского региона, но и на территориях Европы, Америки, Австралии, в наиболее развитых странах – США, Канаде, Франции, Финляндии [61, 122, 139, 165]. В эпизоотический процесс, наряду с крупным рогатым скотом (КРС) и мелким рогатым скотом (МРС), вовлекаются и подвержены гибели травоядные животные многочисленных видов, в том числе и хищники, так или иначе контактирующие с почвой как основным резервуаром и источником инфекции [7, 55, 132, 154]. Среднегодовая глобальная инцидентность варьирует в пределах 250-300 вспышек и более со 16 стереотипными индексами очаговости от десятков до единиц в зависимости от групповой специфики поражаемых животных, что отражает также их биосистемную роль в сибиреязвенном инфекционном цикле [40, 41, 64, 65]. Исключения, выпадающие из общестатистических характеристик, представляют уникальные эпизоотические прецеденты вспышечного характера, сопровождающиеся гибелью многих десятков домашних и сотен диких животных, регулярно возникающие в определенных регионах мира [133]. Многочисленными примерами последних лет могут служить внезапная гибель гиппопотамов, зебр (Уганда, Намибия, Кения) антилоп, коров (Зимбабве), слонов (Ботсвана), газелей (Монголия, Китай), лошадей (Новый Уэльс, Австралия), буйволов и бизонов (Южная Дакота, штат Монтана, США, Канада) и др. [87, 119, 121, 133, 140, 153, 161, 162]. Такое широкое распространение сибирской язвы в мире свидетельствует о существовании и сохранении на Земле уникальных гиперэндемичных природно-территориальных локусов, что может быть обусловлено наличием там специфической совокупности условий, наиболее благоприятных для сибиреязвенной биосистемы [111, 129, 165]. Принципиально важно, что спонтанная заболеваемость человека облигатно зоогенна и вторична по отношению к сибирской язве животных [169]. Поэтому эпидемическая цепь «контаминированная почва как резервуар и источник заражения животных → больное животное или его продукты как амплификатор → заражение человека» обусловливает аналогичную по своей природе и совпадающую территориально эндемичность глобального характера [14, 63, 66, 110]. Человек относительно резистентен к естественной сибиреязвенной инфекции. Тем не менее, в 2005-2013 г.г. ежегодно регистрировалось более 100 спонтанных вспышек болезни с заражением людей и усредненными индексами очаговости и смертности 3-5 и 0.5-1.0, соответственно, со средней летальностью 25 % [39, 88]. На общем фоне особенно неблагополучны такие 17 регионы, как Индонезия, Индия, Казахстан, Киргизия, Монголия, Вьетнам, Россия (Бурятия и Башкирия), где регистрируются сотни контактировавших (общение с больными животными, убой, разделка туш, потребление контаминированного мяса), десятки заболевших кожной и кишечной формой, высокая летальность [8, 29, 49, 58, 120, 131, 157]. Согласно многолетней мировой эпидемиологической статистике на каждые 10 заболеваний сибирской язвой животных регистрируется 1 кожная форма сибирской язвы у человека, на каждые 150 кожных форм – 1 генерализованная форма [17, 66, 129, 134]. В общей структуре заболеваемости сибирской язвы 1-2 % составляют заболевания среди людей [14, 22]. Территории гибели или места организации скотомогильников павших от сибирской язвы животных, за более чем столетний период изучения данной болезни, представляют собой почвенные очаги сибирской язвы, которые весьма медленно санируются в естественных условиях благодаря антагонизму микроорганизмов, бактерицидному действию ризосферы отдельных видов растений и инсоляции [23, 94]. Установлено, что возникновение чрезвычайных эпизоотических и эпидемических прецедентов в зонах с использованием выпасов животных на зараженных территориях экстраполируется на рост заболеваемости по цепи «животное-человек» [41, 95, 134, 166]. Сибирская язва на современном этапе причисляется к индигенным инфекциям, т.е. постоянно встречается на территории, но не имеет массового характера [4, 76]. Экологические особенности инфекционного цикла, в основном, определяемые случайными событиями, обуславливают спорадичность проявления эпизоотического процесса [7, 18, 52, 162]. Анализ данных литературы свидетельствует о том, что экологические, природные, техногенные катастрофы обладают потенциалом сопряженной и синэргической эффективности в отношении эпизоотических и 18 эпидемических прецедентов [25, 63, 139]. В последние годы, когда существенно возросли риски техногенных и природных катастроф (землетрясения, цунами, извержения вулканов, засуха, наводнение и т.п.), эпидемиологическая обстановка по сибирской язве прогнозируется как неблагополучная, поскольку высока вероятность вскрытия сибиреязвенных скотомогильников и возникновения сибиреязвенных эпизоотий [12, 37, 58, 113]. Кроме того, в связи с устойчивыми тенденциями в отношении повышения температурного режима, особенно в осенне-зимний период, существенно возрастает вероятность повышения напряженности эпизоотической и эпидемической ситуации по ряду природно-очаговых заболеваний, в том числе и по сибирской язве [37, 58, 60, 68]. Учитывая данные МЧС России, о том, что в стране сохраняется негативная динамика роста количества чрезвычайных ситуаций различного характера, прогноз по заболеваемости сибирской язвой остается неблагоприятным [60, 94, 95]. Длительный промежуток времени, более 10 лет, в районах Севера, Северо-Запада и Дальнего Востока, не было зарегистрировано ни одного случая заболевания людей и животных. Абсолютное большинство учтенных ранее тундровых, лесотундровых и таежных почвенных очагов сибирской язвы не проявляло активности в течение нескольких десятилетий [88, 99]. За последние 10 лет заболеваемость сибирской язвой в Российской Федерации относительно стабилизировалась. За период с 2000 по 2009 г.г. зарегистрирован 101 случай заболевания сибирской язвой, причем половина (55 случаев) приходится на 2000-2004 г.г. Рассматривая заболеваемость сибирской язвой по Федеральным округам, выявлено, что на территории Приволжского Федерального округа (ПФО) в период 2000–2009 г.г. зарегистрировано 25 случаев заболевания, в том числе 13 – в 2000-2004 г.г. и 12 – в 2005-2009 г.г. На долю ПФО в 2000-2004 г.г. приходилось 23,6 %, а в 2005-2009 г.г. – 26,0 % от общего числа больных сибирской язвой, 19 зарегистрированных в Российской Федерации [37, 45, 53, 75, 87]. Необходимо отметить территории, на которых возникали небольшие вспышки и спорадические случаи заболевания сибирской язвы – Республика Татарстан (2000 г.), Пензенская и Оренбургская области (2004-2009 г.г.) [44]. На фоне тотальной систематической повсеместной вакцинации животных как безальтернативного метода контроля болезни на территории всей страны ежегодно регистрируемое количество случаев (пунктов) сибирской язвы животных на протяжении многих лет стабильно колеблется на уровне 2-4 десятков с непредсказуемой амплитудой в этих пределах и индексом очаговости от 1 (для КРС, свиней, лошадей) до 5 и более (для овец, бывают случаи гибели нескольких десятков голов, например, в Бурятии в 2008 году) [8, 31, 116]. Проявление эпизоотического процесса имеет спорадический характер, со случайной инцидентностью и смертностью преимущественно КРС и овец, значительно реже свиней и лошадей [38, 47]. Спонтанная заболеваемость людей регистрируется от 1-2 до 10 случаев в год. Поэтому экстраполировалось возникновение чрезвычайных эпизоотических и эпидемических прецедентов в зонах с использованием выпасов на зараженных территориях (скотомогильники, места падежа и захоронений животных) в Центральном, Приволжском, Южном, Сибирском федеральных округах с ростом заболеваемости по цепи «животные → человек», однако зарегистрированы единичные случаи заболевания у людей [17, 54]. Эпидемиологическая ситуация по сибирской язве в Российской Федерации продолжает оставаться нестабильной, а заболеваемость не имеет тенденции к снижению. В 2010 г. в период с июня по сентябрь (октябрь) на территории РФ зарегистрировано 22 случая заболевания людей сибирской язвой. На субъекты юга РФ пришлось 72,73 % (16 случаев): 11 случаев заболевания (50 %) выявлено в Северо-Кавказском федеральном округе (Республика Дагестан – 8, Чеченская Республика – 3, 5 случаев (22,73 %) в 20 Южном федеральном округе (Волгоградская область – 2, Краснодарский край – 2, Ростовская область – 1); 27,27 % (6 случаев) зарегистрировано в Сибирском федеральном округе (Омская область). В 2010 г. заболевания людей сибирской язвой были зарегистрированы также в некоторых странах ближнего зарубежья: в Грузии (22 случая), Казахстане (7 случаев), Кыргызстане (23 случая) [18, 47, 56, 58, 88]. Случаи сибирской язвы среди людей выявлялись и в странах дальнего зарубежья. В период с декабря 2009 по июль 2010 г. в Великобритании зарегистрировано 47 случаев так называемой инъекционной формы сибирской язвы среди наркоманов, употреблявших внутривенно героин, контаминированный спорами возбудителя сибирской язвы. Два подобных случая отмечены в Германии [88]. Масштабная групповая вспышка зарегистрирована в Бангладеш, где в период с августа по октябрь 2010 г. кожной формой сибирской язвы заболело 607 человек. Это самая крупная в истории страны вспышка заболевания связана с бесконтрольным массовым забоем больных животных (104 головы КРС) и продажей/раздачей мяса местным жителям [18, 73, 88, 120]. В 2011 г. на территории РФ зарегистрировано 4 случая заболевания людей без летальных исходов и отмечено значительное снижение заболеваемости по сравнению с 2010 г. Все случаи заболевания в 2011 г. пришлись на субъекты Южного Федерального округа (Краснодарский край – 2, Волгоградская область – 2). В 2011 г. групповые случаи заболевания людей сибирской язвой, обусловленные контактом с заболевшими сельскохозяйственными животными, регистрировались в ряде граничащих с Российской Федерацией стран: Грузии – 33 случая, Республике Таджикистан – 14, Кыргызской Республике – 13, Республике Казахстан – 5, Китае – 4. В Республике Казахстан имела место крупная эпизоотия среди КРС, МРС и лошадей. Эпизоотии сибирской язвы среди сельскохозяйственных и диких животных регистрировались в странах Азии (Бангладеш – КРС; Вьетнам – 21 КРС; Индия – КРС, слон; Индонезия – КРС; Иран – МРС, олени), Африки (Гвинея-Бисау – КРС; Замбия, Зимбабве – дикие животные; Конго – КРС; Судан – КРС), Европы (Италия – КРС, МРС, лошади; Румыния – КРС; Сербия, Хорватия, Швеция – КРС), Северной (Канада – КРС) и Южной Америки (Аргентина, Колумбия – КРС; Перу – МРС), некоторые из них стали причиной масштабных вспышек среди людей [16, 17, 73, 87, 120]. Так, в Замбии с подозрением на сибирскую язву госпитализировано 230 местных жителей, которые имели контакт с тушами и употребляли мясо гиппопотамов, погибших в процессе крупной эпизоотии сибирской язвы (более 100 особей), наряду с прочими видами животных (слонами, львами, павианами, буйволами и др.). В результате контакта с заболевшим скотом и употреблением в пищу инфицированного мяса в Бангладеш сибирской язвой заболели 119 человек, в Судане – 100, Вьетнаме – 53, Индии – 33, Индонезии – 11. В Гвинее-Бисау заболели и погибли от сибирской язвы 4 человека. Сибирская язва стала предполагаемой причиной летального исхода одного случая заболевания в Румынии. Заболевания сибирской язвой регистрируется не только в экономически не развитых странах, но и в благополучных странах. Летом 2011 года зафиксирован один случай сибирской язвой зафиксированн в США [87, 120, 157]. В 2012 г. в Российской Федерации официально зарегистрировано 12 случаев сибирской язвы у людей, что на 8 случаев превышает заболеваемость в 2011 г. Заболеваемость людей в приграничных с Российской Федерацией государствах. В 2012 г. отмечались случаи сибирской язвы у людей в Грузии (41 случай за первое полугодие), Армении (10), Таджикистане (8), Кыргызстане (5), Китае (5), обусловленные контактом с заболевшим КРС, заражение человека в Украине (1) произошло в результате контакта с больной свиньей [34, 39, 47]. В 2012 г. вспышки сибирской язвы среди людей и животных зафиксированы во многих странах дальнего зарубежья. В Европе 22 возобновились случаи регистрации инъекционной формы сибирской язвы у наркоманов, применявших героин в виде внутривенных инъекций. Всего в 2012 г. выявлено 13 случаев заболевания инъекционной формой сибирской язвы, 5 из которых закончились летальным исходом: 6 человек заболели в Великобритании – 4 в Англии (3 летальных), по одному в Шотландии и Уэльсе; 4 случая зарегистрированы в Германии (1 летальный), 2 – в Дании (1 летальный), 1 – во Франции. В Италии зарегистрирован случай кожной формы сибирской язвы у владельца МРС. Случаи кожной формы сибирской язвы регистрировались также в других европейских странах (Сербия – 3, Болгария – 1, Греция – 1), государствах Америки (Перу – 13, Колумбия – 3, США – 1), в Азии (в Бангладеш по состоянию на июнь 2012 г. Заболело 67 чел.). В Зимбабве (Африка) вспышка, начавшаяся в ноябре 2011 г. в результате крупной эпизоотии среди диких животных, к январю 2012 г. Охватила 149 чел. В ряде стран Африки преобладали случаи заболевания людей с летальным исходом каждого из них: Лесото – 7 чел., Гана – 5 чел. в период двух вспышек, Того – 2 чел., Намибия – 1 чел., Южный Судан – 1 чел. [34, 39, 87, 88]. Среди сельскохозяйственных и диких животных 2012 г. отмечен повсеместными эпизоотиями сибирской язвы. Лидирующее место в видовой структуре заболеваемости сельскохозяйственных животных принадлежало КРС. Вспышки среди КРС зарегистрированы в Европе: Болгария – 1 (3 головы), Германия – 1 (10), Молдавия – 1 (1), Словакия – 2 (4), Хорватия – 1 (2), Черногория – 1 (1); в Азии: Бутан – 4 вспышки (15 голов), Израиль – 1 (8), Индонезия – 1 (более 100); в Америке: Аргентина – 14 вспышек (219 голов), Боливия – 13 (37), Гватемала – 7 (7), Перу – 2 (5), Чили – 2 (3), Канада – 1 (1); в Африке: Ангола – 1 вспышка (1 голова), Бенин – 1 (1), Гана – 2 (20), Того – 1 (15), Кения – более 2100 голов. В Турции в первой половине года имели место 29 вспышек, в которые были вовлечены 65 голов КРС, 27 овец, 16 коз. Подобные сочетанные эпизоотии выявлялись в Сербии (1 вспышка – 23 3 головы КРС, 1 коза, 1 лошадь), Индии (11 вспышек – 30 голов КРС, 9 овец, 1 слон), США (7 вспышек – 65 голов КРС, 50 овец, 10 оленей), Уругвае (3 вспышки – 22 головы КРС, 18 свиней), Лесото (1 вспышка – 18 голов КРС, 6 ослов). Эпизоотии сибирской язвы с вовлечением в процесс сельскохозяйственных животных отмечались так же в Греции (2 вспышки – 25 овец и коз), Италии (1 вспышка – 2 овцы), Колумбии (2 вспышки – 31 овца, 26 коз, 3 свиньи), Австралии (1 вспышка – 30 овец) [34, 39, 47, 87, 88]. В 2012 г. зарегистрировано несколько крупных эпизоотий сибирской язвы среди диких животных. Имела продолжение масштабная вспышка в Зимбабве, начавшаяся в ноябре 2011 г. По состоянию на январь 2012 г. от сибиреязвенной инфекции пало свыше 165 животных (гиппопотамов, буйволов, слонов, антилоп куду), что стало причиной крупной вспышки среди людей, а в течение августа-сентября погибли еще несколько сотен животных. Вспышки среди диких животных зафиксированы в Канаде, когда в процесс были вовлечены около 340 бизонов, а также в ЮАР, где в период с августа по ноябрь от сибирской язвы пали 45 лошадиных антилоп, 30 гиппопотамов [18, 34, 39, 47, 87, 88]. Экстремальная выживаемость внеорганизменных, споровых форм возбудителя в почве, непредсказуемая по длительности, создает благоприятные предпосылки для формирования эндемии и природной очаговости [85, 111]. С позиций учения Б.Л. Черкасского об эпидемическом и эпизоотическом процессах как саморегулирующихся паразитарных системах межпопуляционные язвы ↔ восприимчивые взаимоотношения организмы также возбудитель сибирской укладываются в рамки самостоятельной симбиотической системы [110]. Однако B. аnthracis не относится к каноническим паразитам, для которых существуют четкие биоэкологические границы, по крайней мере из-за абсолютной летальности и обязательного жизненного диморфизма [25]. 24 Сибирская язва террористических представляет целях, как угрозу средств при применении массового в поражения бактериологической природы. Это явление - альтернатива биологической войне [6]. Попытки применения спор B. anthracis с поражающей целью были предприняты в 1940 гг. во время вторжения японских войск в Манчжурию, в 1942 году в период второй мировой войны британские исследователи проводили аналогичные полевые испытания у северных берегов Шотландии [121, 128]. Первым же серьезным актом использования в этих целях B. anthracis явилась биологическая атака националистов, направленная против аборигенов ЮАР и Родезии (Зимбабве) для подавления освободительного движения в 1978-1980 гг. Результатом этого стали многие тысячи погибшего скота, более 10000 заболевших людей и около 200 смертельных случаев, коснувшихся только коренного населения [134, 162]. В сентябре 2001 года в США был предпринят акт биотерроризма путем рассылаемых возбудителей сибирской язвы в письмах по почте. В результате чего возникло 22 случая заболевания сибирской язвой, в том числе 5 случаев были со смертельными исходами [6, 129, 144, 145, 166]. Данный прецедент послужил импульсом к экстренным разработкам по проблеме защиты в случаях проведения террористических актов с применением возбудителя сибирской язвы. Были отработаны эффективные средства индикации возбудителя сибирской язвы, включающие упрощенный диагностический экспресс-метод иммуноферментного анализа, позволяющий оперативно определять специфические антитела и, таким образом, быстро идентифицировать заболевших [75]. Помимо этого, состоявшиеся акты реального биотеррора с применением в качестве агента спор B. anthracis позволили по новому переосмыслить масштабность возникших последствий. Полученные цифры 25 вызывают глубокую озабоченность: согласно расчетам, распыление сибиреязвенных спор на площади 20 км² в течение 2 часов над городом с пятимиллионным населением подвергнет риску заражения 500 тысяч человек, при этом прогнозируемое число заболевших может составить 250 тысяч человек, из них со смертельными исходами – 125 тысяч [77, 128]. В условиях расширяющегося антропогенного влияния на природу и учитывая особенности сибиреязвенного микроорганизма пребывания во внешней среде, санация сибиреязвенных очагов естественным путем не произойдет Сложившаяся [60]. ситуация с учетом и содержанием сибиреязвенных скотомогильников в неблагополучных по данной болезни регионах РФ представляет собой «бомбу» замедленного действия [61, 110]. Специальная программа по борьбе с сибирской язвой в настоящее время должна быть комплексной и включать не только мероприятия по выявлению старых сибиреязвенных захоронений и их санацию, но и специфическую диагностику, основанную на современных методах исследования [19, 61, 77, 83]. Опыт многолетнего анализа заболеваемости сибирской язвой позволяет прогнозировать сохранение заболеваемости людей на среднегодовом для последнего десятилетия уровне – от 1 до 22 случаев в субъектах федеральных округов юга России и Сибири [52]. Нет оснований рассчитывать на значительное улучшение эпизоотолого-эпидемической ситуации по сибирской язве в вышеупомянутых странах ближнего и дальнего зарубежья, так как остается животноводства и угроза сырья, завоза больных контаминированных животных, спорами продуктов возбудителя сибирской язвы на территорию страны [62, 78, 91, 109]. Учитывая вышеизложенное эпидемиологическая обстановка по анализируемой нозологической форме на территории Российской Федерации остается неблагополучной, что диктует необходимость проведения 26 комплексных мероприятий, включающих совершенствование лабораторной диагностики сибирской язвы. 1.2. Современное представление о патогенности возбудителя сибирской язвы Особо опасная инфекция – сибирская язва, вызываемая B. anthracis, характеризуется острым началом и тяжелым течением. Ключевой момент патогенеза заболевания – воздействие экзотоксина возбудителя на инфицированный макроорганизм [97, 124]. Токсин B. anthracis состоит из трех частей – отечного фактора (ОФ), летального фактора (ЛФ) и протективного антигена (ПА) [41, 121, 126, 159]. ПА, с одной стороны, участвует в образовании токсичных комплексов, а с другой – является основным иммуногеном возбудителя сибирской язвы [81, 82, 104]. Образование токсина и капсулы является основными факторами, которые лежат в основе патогенности для микроба сибирской язвы. Понятие полной вирулентности В. anthracis, по мнению Smith H. (1954), связано с уникальными особенностями возбудителя. Кроме этого, способность образовывать протеазу, разлагать казеин и желатин, вызывать гемолиз эритроцитов являются дополнительными факторами патогенности В. anthracis [164]. На современном этапе проводимые исследования направлены на изучение механизмов взаимодействия сибиреязвенного микроба с организмом «хозяина» и уточнение особенностей развития заболевания с целью установления доли каждого фактора в проявлении патогенности [55, 127]. Капсула играет основную роль в начале развития инфекционного процесса в патогенезе сибирской язвы [76]. Сибиреязвенный микроб в капсулированном состоянии способен в инфицированном организме или при культивировании на искусственных питательных средах вырабатывать экзотоксины. Синтез капсулы и токсинов происходит под воздействием окружающей среды, как ответ на повышение концентрации углекислоты и 27 бикарбонат-ионов [151]. Полипептид D-глутаминовой кислоты с не большим содержанием L-изомера составляет капсулу В. anthracis [123, 143]. Капсула играет решающую роль в диссеминации патогена при ингаляционном заражении сибирской язвой. Одним из свойств капсулы является влияние на уменьшение фагоцитоза, направленного на поглощение бацилл при увеличении гидрофильности микробной клетки, а также способствует фиксации капсульных форм микроба к клеткам организма. Капсула под воздействием собственного фермента микроба подвергается деполимеризации. Низкомолекулярное вещество, освобождающееся во внешнюю среду, является основным компонентом при размножении возбудителя in vivo [159]. Характер и степень скорости формирования капсулы лежит в основе классификации штаммов сибиреязвенного микроба. Утрата способности к синтезу капсулы приводит к потере вирулентности штаммов В. anthracis [70]. Синтез капсулы зависимост способности усвоения углекислоты капсулой, что определяет степень вирулентности штаммов. Sweeney D.A. et al., в зависимости от характера капсулообразования и вирулентности, различал три типа возбудителя [165]. Типичные вирулентные штаммы В. anthracis образуют капсулу при культивировании на 1 % бикарбонатном агаре в атмосфере, содержащей от 5 до 50 % СО2, или на жидкой среде ГКИ, содержащей 40 % инактивированной бычьей (лошадиной) сыворотки и 60 % раствора Хенкса. На 1 % бикарбонатном агаре микроб растет в SM-форме, в виде гладких, блестящих, влажных, слизистых колоний с неровными краями [76]. При капсулообразовании отмечаются существенные различия в вирулентности штаммов [114, 151]. Экзотоксин выступает основным фактором в развитии инфекционного процесса сибиреязвенной инфекции и формировании специфического иммунитета. Впервые о продуцировании токсина клетками B. anthracis сообщили в 1954 г. Smith et al. [163], показавшие, что стерильная сыворотка 28 крови морских свинок, погибших от сибирской язвы, вызывает при ее введении интактным животным отек подкожной клетчатки и быструю их гибель. Сибиреязвенный токсин разрушается при нагревании до 60 оС в течение 1,5 ч, а также инактивируется при рН ниже 5,0 и выше 10,0 и утрачивает специфическую активность при температуре минус 8-10°оС в течение 2 мес, при температуре 34 оС - в течение 1 суток, а при температуре 56°оС - через 30 мин [164]. Экзотоксин имеет два вида биологической активности и относится к бинарным двухкомпонентным белковым токсинам АВ-типа [125, 139]. Отечный фактор, протективный антиген и летальный фактор составляют основу экзотоксина. Это белки с молекулярными массами 89, 83 и 85 кДа [70, 72, 153]. Для А-В модели сибиреязвенного токсина ПА является обшей субъединицей (В), обеспечивающей взаимодействие с клеточными рецепторами субъединицы А, представленной ОФ или ЛФ. ПА связывается с гликопротеиновым рецептором на поверхности клетки и происходит активация и протеолитический гидролиз под воздействием эукариотной протеазы (фурина). В результате этого связанным с рецептором остается его N-терминальный фрагмент молекулярной массой 63 кДа. Сформировавшийся N-терминальный фрагмент регулирует создание токсинных комплексов, которые стимулируют переход отечного и летального факторов в цитозоль. Введение комплекса токсина (ПА+ОФ) морским свинкам или кроликам вызывает отек подкожной клетчатки, а внутривенное введение летального токсина (ПА+ЛФ) приводит к смерти экспериментальных животных [35, 71, 150, 168]. Штаммы различные по своей степени вирулентности, которые создают комплексы токсинов и типичную капсулу имеют дополнительные факторы патогенности. Некоторые субстанции такие как белок, кодируемый геном gerX, необходим для прорастания спор in vivo или связывающие железо 29 ферритинподобные белки (сидерофоры) и фосфолипазы; два белка S-слоя сибиреязвенного микроба Sap и ЕА1 [82]; автоиндуктор сигнальных молекул; аутолизин сибиреязвенного микроба; антролизин О (холестеринзависимый цитолизин); антрализины (гемолизины) [148]. В состав гена сибиреязвенного микроба входит одна кольцевая хромосома и две плазмиды pXOl и рХО2, которые вызывают токсинообразование и построение антифагоцитарной капсулы, которая противодействуют защитным свойствам иммунной системы. Утрата одной или обеих плазмид приводит к авирулентности изолята. В настоящее время кроме «классических» биплазмидных штаммов регистрируются с меньшей частотой атипичные моно- и бесплазмидные варианты возбудителя [34, 55, 99, 135]. При детальном рассмотрении плазмида pXOl имеет размер 181,7 т. п.н. и содержит 143 открытые рамки считывания (ОРС). На этой плазмиде расположен «остров патогенности» размером 448 т. п.н., который включает три структурных гена токсинов pagA, lef и суа, регуляторные гены pagR и atxA, три гена оперона прорастания спор и еще 19 ОРС. «Остров патогенности» ограничен с двух сторон инвертированными инсерционными последовательностями IS 1627. В исследованиях установлено, что из 106 открытых рамок считывания плазмиды pXOl половина имеют гомологи в составе геномов двух штаммов В. cereus и одного – В. thuringiensis. В этом случае идентичность фрагментов ДНК достигает 90 %. При изучении причин тяжелой пневмонии, во многом напоминавшей легочную форму сибирской язвы ведущим явился штамм В. cereus, который содержал плазмиду, идентичную pXOl В. anthracis и при этом продуцировал токсины, полисахаридную капсулу [149, 155]. Размер плазмида рХО2 составляет 94-96 т. п.н., на которой находится оперон биосинтеза капсулы capBCAD, а также ген деполимеризации капсульного полипептида dep и регуляторные гены асрА и асрВ. Для 30 совершенной координации хромосомных и плазмидных детерминант участвует ген atxA плазмиды pXOl, также числа генов синтеза капсулы [104]. В штаммах В. circulans и В. luciferensis при формировании оперона капсулообразования имеются некоторые гены плазмиды рХО2. Между более чем 5000 хромосомных генов сибиреязвенного микроба и генами В. cereus и В. thuringiensis установлено 150 существенных отличий. Почти все открытые рамки считывания, экспрессия которых определяет синтез факторов вирулентности и поверхностных белков, имеют гомологи в геноме В. cereus. Однако ряд хромосомных локусов (rpoB, gyrA, plcR, sap) обладает высокой специфичностью для В. anthracis, что обусловило использование их в качестве ДНК-мишеней при разработке диагностических препаратов [130, 146, 152, 160]. Сибиреязвенный микроб является наиболее генетически однородным микроорганизмом. Изоляты сибиреязвенного микроба имеют отличия, которые представлены разнообразными параллельными повторами (VNTR) и единичных нуклеотидов (SNR), а также различия единичных нуклеотидов (SNP) [94]. На современном этапе для генетического типирования штаммов сибиреязвенного микроба широко используется мультилокусный VNTRанализ (MLVA) [35, 89, 107]. Существуют данные об использовании для изучения генетической характеристики сибиреязвенного микроба анализа полиморфизма единичных нуклеотидов (SNP), нуклеотидных повторов (SNR), полиморфизма длины амплифицированных фрагментов (AFLP), ПЦР с праймерами, комплементарными повторяющимся элементам (Rep-PCR), секвенирования гена pagA, мультилокусного секвенирования [107, 108]. Проанализировав вышеизложенное, установлено что B.anthracis имеет сложный комплекс генетических механизмов, определяющих патогенность и вирулентность штаммов. Сложность индикации сибирской язвы заключается 31 в наличии гомологичных совпадений до 90 % в генетическом аппарате с близкородственными штаммами микроорганизмов [115, 158]. 1.3. Современные диагностические препараты, используемые для индикации и идентификации возбудителя сибирской язвы Анализ данных мировой литературы показывает, что сибирская язва все еще остается эндемичной инфекцией и встречается практически во всех странах мира. Ежегодно регистрируются случаи заболевания не только среди животных, но и людей, в том числе со смертельным исходом. Опасность обусловлена наличием на территории многих стран неблагополучных пунктов и очагов, создающих реальную угрозу возникновения вспышек заболевания [12, 46, 52, 118, 131]. Угроза инфекции заключается также в несвоевременной диагностике, затрудненной индикации и идентификации возбудителя в патологическом материале и объектах внешней среды. В ряде стран разрабатывается биологическое оружие, где в качестве поражающего агента может использоваться возбудитель сибирской язвы [65, 78, 136, 141]. Учитывая существование на территории России большое количество стационарно неблагополучных пунктов по сибирской язве, создающих потенциальную возможность ухудшения эпидемической обстановки, а также отсутствие зарегистрированных диагностических препаратов, предназначенных для индикации возбудителя сибирской язвы, возникает необходимость регистрации в установленном порядке новых высокочувствительных препаратов [48, 51, 78]. В настоящее время в научных лабораториях многих стран постоянно разрабатываются и совершенствуются диагностические технологии для индикации и идентификации особо опасных этиологических агентов, одним из которых является сибиреязвенный микроб [28, 79, 140]. Для проведения 32 эффективного мониторинга сибирской язвы необходима разработка новых высокочувствительных диагностических препаратов [2, 50, 138]. Арсенал методов индикации возбудителей заболеваний, имеющийся в настоящее время в распоряжении эпидемиологов, достаточно широк от традиционных бактериоскопических и бактериологических методов, постановки биопроб на животных, до методов МФА, РНГА, ТИФА, ПЦР [10, 11, 30, 67, 80, 112, 137, 151]. Перечисленные выше методы индикации и идентификации микроорганизмов хорошо зарекомендовали себя на практике, но в то же время не лишены известных недостатков занимают много времени – с учетом предварительного культурального обогащения пробы время индикации может достигать 72 ч и более [67, 98]. Роль экспресс-методов в диагностике особо опасных инфекционных болезней значима и особенно ценна при расследовании актов биотерроризма, спорадических случаев и вспышек среди людей и животных [9, 112, 144]. Вместе с тем, следует отметить, что начиная с 90-х годов прошлого столетия, отмечалась тенденция сокращения производства выпускаемых ранее препаратов, в том числе и тех, которые достаточно широко востребованы, в том числе диагностикум сибиреязвенный эритроцитарный иммуноглобулиновый и аллерген сибиреязвенный для внутрикожной пробы [79]. К 2010 г. в практическом здравоохранении использовалась только зарегистрированная тест-система ГенСиб, предназначенная для выявления ДНК сибиреязвенного микроба в исследуемом материале методом ПЦР. Данная тест-система выявляет только плазмиду рХО1 и не позволяет дифференцировать вирулентные штаммы от авирулентных и вакцинных. Учитывая, что специфические продукты амплификации на этапе учета результатов могут попадать в окружающую среду и искажать получаемые данные, все большее значение уделяется развитию альтернативных методик детекции ПЦР-продуктов [105]. 33 Учеными ФГУН «ЦНИИ эпидемиологии» и ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб» разработан набор реагентов для выявления вегетативных форм и спор B. anthracis pagA (плазмида pXOI) capA (плазмида pXO2) в клиническом материале и объектах внешней среды методом ПЦР в режиме «реального времени» («Амплисенс B. anthracis-FRT»). Для предотвращения получения ложноположительных и ложноотрицательных результатов в набор введен внутренний контрольный образец (ВКО). Разработчиками данных тест-систем было показано, снижение временных затрат в ходе проведения ПЦР, затрачиваемое на один анализ, так как исключается этап электрофореза, а также риск контаминации реагентов или исследуемых проб [106, 117]. При расшифровке вспышки сибирской язвы в Баргузинском районе Республики Бурятия в 2008 г. успешно применен целый комплекс методов экспресс-диагностики (бактериоскопический, МФА, ПЦР). Благодаря этому в ранние сроки (через 3-5 ч от начала исследования) удалось подтвердить клинический диагноз «сибирская язва» у заболевших людей, выявить источник инфекции (больное животное), определить фактор передачи (мясо) и оперативно доказать неблагополучную эпизоотолого-эпидемиологическую ситуацию на данной территории [8, 31, 45]. Одним из перспективных направлений развития экспресс-индикации возбудителей инфекционных заболеваний считается энзимоиндикационное, связанное с наличием у микроорганизма определенных биохимических свойств, отличающих его от других представителей данного рода. Это направление реализовано иностранными исследователя на основе применения метода резонансного переноса энергии флюоресценции (FRET), для индикации этим методом наличия ферментов, присущих определенным видам микроорганизмов [146]. Чувствительным, быстрым и специфичным методом идентификации микроорганизмов и токсинов, пригодным для применения в условиях небольших стационарных и мобильных лабораторий, а также в полевых 34 условиях, является иммунохроматографический анализ. Этим методом можно выявлять бактериальные вегетативные клетки, споры, вирусы токсины, при анализе неизвестных порошков, проб пищевых продуктов, смывов из окружающей среды, а также идентифицировать культуры микроорганизмов, выращенных в бактериологической лаборатории. Известны иммунохроматографические экспресс-тесты Singlepath и Duopath производства фирмы Merck (Германия) для выявления бактерий рода Salmonella, Listeria, энтерогеморрагических продовольственном Escherichia штаммов сырье, O157:H7 coli E. водных coli в объектах и веротоксинов пищевых продуктах окружающей среды и и биоматериале от человека [69]. Выпускается отечественная укладка иммунохроматографических индикаторных элементов «УИХЭ-1» (разработчик и производитель ФГУП ГосНИИ биологического приборостроения Федерального медико- биологического агентства) для выявления возбудителей чумы, туляремии, сапа, сибирской язвы и ботулинического токсина типа А в смывах из объектов внешней среды. Чувствительность индикации по данным авторов составляет 1х105 - 1х106 м.к./мл и 250 нг/мл ботулинического токсина типа А. Длительность анализа без учета времени пробоподготовки – 25-30 мин. Перечисленные иммунохроматографические технические средства имеют колориметрический принцип регистрации и основаны на применении золей коллоидного золота, используемых в качестве маркера антител [96]. Иммунохроматографические индикаторные образовавшиеся полоски иммунные – тесты «стрипы», комплексы (ИХТ) позволяют в виде – портативные визуализировать полосы в тест-зоне индикаторной полоски уже через 15-20 мин. «Тест-полоска B. anthracis» обладает чувствительностью 109 м.к./мл и высоким уровнем специфичности – при использовании микробных взвесей штаммов близкородственных 35 сапрофитов рода Bacillus были получены только отрицательные результаты [45, 101]. Чувствительность колориметрических иммунохроматографических тестов близка к чувствительности РНГА и ТИФА, однако исключает такие стадии анализа, как сенсибилизация полистирольных планшетов, разведения пробы, промывки, термостатированные инкубации, внесение хромогенных субстратов и меченных ферментной меткой антител [10, 98]. Методологические приемы, позволяющие многократно повысить чувствительность иммунохроматографического люминесцентного метода детекции, сохраняют анализа такие за счет достоинства иммунохроматографического анализа, как отсутствие многостадийности процедуры, применение минимума реагентов. Созданы экспериментальные образцы люминесцентных ИИХЭ для выявления вегетативных и споровых форм микроорганизмов, растворимых антигенов, вирусов, токсинов [79]. Основное направление исследований по разработке тестов экспрессдиагностики ориентировано не только на сокращение времени учета результатов, повышение чувствительности, специфичности и воспроизводимость анализа, но и на максимальную простоту постановки реакций и сокращение энерго- и трудозатрат. Одним из простых и надежных методов детекции возбудителей инфекционных заболеваний является реакция латекс-агглютинации, отличающаяся простотой постановки, возможностью быстрого получения ответа, отсутствием необходимости использования специальных устройств для регистрации результатов при достаточно высокой чувствительности метода. Реакция латекс-агглютинации может быть использована как для качественного, так и для полуколичественного определения инфекционных агентов. Метод основан на специфическом взаимодействии антител, иммобилизованных на твердом носителе (полиакролеиновых микрочастицах), с целевыми микроорганизмами (или их компонентами) и 36 образованием визуально регистрируемого агглютината. Очевидно, что при разработке латексных диагностикумов преимущество должно отдаваться МКА, как более стандартным и высокоспецифичным иммунологическим компонентам [74, 103]. Одними из последних примеров подобных разработок являются экспериментальные образцы «Набор реагентов для определения спор B. anthracis в реакции латекс-агглютинации» и «Набор реагентов для быстрой идентификации вегетативной формы возбудителя сибирской язвы (Тестполоска B. anthracis)», сконструированные в ФГУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии». Принцип работы латексного взаимодействии спор диагностикума B. anthracis основан с на специфическом моноклональными антителами, сорбированными на латексе, что приводит к агглютинации латексных частиц. Чувствительность при выявлении спор B. anthracis методом латексной агглютинации составляет 2·106 спор/мл и, что особенно важно, диагностикум не определяет гетерологичные культуры рода Bacillus в споровой форме в концентрации 2,5·108 спор/мл и менее [20, 102, 103]. Совместными научными исследованиями, проведенными в Иркутском научно-исследовательском противочумном институте Сибири и Дальнего Востока и Государственном научном центре прикладной микробиологии и биотехнологии (г. Оболенск) проведена апробация экспериментальных серий тест-систем латекс-агглютинации и иммунохроматографии для идентификации спор и вегетативных клеток Bacillus anthracis. Тест-системы пригодны для ускоренной диагностики сибирской язвы и обладают рядом преимуществ перед уже существующими коммерческими тестами [45, 101, 103]. В настоящее время общепризнано, что наиболее эффективными являются молекулярно-биологические методы диагностики, которые соответствуют требованиям, предъявляемым к современным методам 37 лабораторной диагностики, и являются перспективными для широкого практического использования [24, 106, 117]. Перспективность применения методов молекулярного типирования B. anthracis показана учеными Ставропольского научно-исследовательского противочумного института в рамках деятельности Референс-центра по мониторингу за возбудителем сибирской язвы. Специалисты обобщили опыт использования генотипирования при проведении эпидемиологического расследования вспышек сибирской язвы. Отмечено, что MLVA- генотипирование с анализом от 8 до 25 VNTR-локусов при изучении штаммов B. anthracis, выделенных в Российской Федерации на сопредельных территориях, позволяет проводить корректное сравнение генотипов с данными всемирной MLVA-базы данных [89]. Возбудитель сибирской язвы, B. anthracis, до недавнего времени считался генетически высокомономорфным. Индивидуальные различия геномов штаммов стали очевидными только после внедрения наиболее результативных методов молекулярного типирования, основанных на многолокусном анализе вариабельных областей генома B. anthracis (MLVA). Схема исследования восьми генетических областей с вариабельным числом тандемных повторов (VNTR-локусы), предложенная Keim P. et al. широко применяется как самостоятельно, так и с использованием дополнительных VNTR-локусов [147]. В настоящее время в мировой практике молекулярное типирование возбудителя сибирской язвы проводят, применяя метод MLVA в качестве самостоятельного, а также в сочетании с другими методами. В частности, MLVA дополняют анализом медленно эволюционирующих единичных нуклеотидных полиморфизмов и единичных нуклеотидных повторов, являющихся одной из разновидностей VNTR-локусов и обладающих очень высокой частотой мутаций [89]. 38 Ретроспективное исследование 14 штаммов B. anthracis, выделенных из разных объектов в Ставропольском крае, Кабардино-Балкарской Республике и двух районах Республики Калмыкия в июле-августе 1998 г., позволило выявить четыре разных MLVA-генотипа, идентичных в пределах каждой группы штаммов одной территории, что свидетельствует о независимом характере вспышек сибирской язвы в четырех регионах. Напротив, MLVAгенотип штаммов, выделенных от людей и из почвы с места вынужденного убоя животных во время двух последовательных вспышек сибирской язвы, произошедших осенью 2006 г. и весной 2007 г. на сопредельных территориях Республики Северная Осетия, Алания и Ставропольского края, оказался одинаковым. Эти данные свидетельствовали о происхождении штаммов из одного и того же стационарно неблагополучного пункта на территории Курского района эпидемиологическим Ставропольского расследованием. края, что подтверждалось Использование MLVA- генотипирования при мониторинге за штаммами возбудителя сибирской язвы анализе штаммов, выделенных в Российской Федерации и на сопредельных территориях, позволяет их анализировать и проводить корректное сравнение генотипов со всемирной MLVA-базы данных, а также прогнозировать возникновение вспышек сибирской язвы [3, 34, 36, 89, 108]. MLVA-генотипирование и секвенирование были использованы при проведении оперативного эпидемиологического расследования в Омской области с целью установления причинно-следственных связей формирования эпидемического неблагополучия по сибирской язве, сложившегося в 2010 г. Результаты исследования с использованием данного метода имели ключевое значение при проведении эпидемиологического анализа случаев сибирской язвы [45, 89]. При проведении лабораторного исследования материала от заболевших людей выделение культуры не всегда возможно, особенно, если этот отбор был осуществлен после начала антибиотикотерапии. В СтавНИПЧИ также 39 разработан методический подход к генетическому типированию возбудителя сибирской язвы, состоящий в сочетанном использовании MLVA, анализа PCR-RFLP PA и SNR. Включение в схему PCR-RFLP PA или SNR-локуса 16 A ch дает возможность разделить штаммы относящиеся к одной вспышки заболевания, имеющие одинаковый MLVA-генотип, на группы. Проведенные исследования позволили разработать базу генотипов коллекционных штаммов сибиреязвенного микроба B. anthracis genotypes, выделенных в разных регионах Российской Федерации и некоторых бывших республиках СССР [35, 105]. Известно, что основным резервуаром возбудителя сибирской язвы и основным фактором, поддерживающим непрерывность эпизоотического процесса в очагах, является почва, которую можно считать вторым, после инфицированных животных, источником этого заболевания, поскольку доказана возможность заражения животных и людей непосредственно от почвы. В связи с этим, остается актуальной проблема выявления и мониторинга захоронений животных, погибших от сибирской язвы [33, 37, 42, 94]. Из почвы старого скотомогильника выделены два типичных эпидемически значимых штамма B. anthracis, несущих генетические элементы, кодирующие синтез компонентов токсина и капсулы [108]. Вместе с тем, оценивая приведенные авторами данные по идентификации выделенных из старого скотомогильника бацилл можно сделать заключение, что для точного подтверждения выделения возбудителя сибирской язвы попрежнему необходимо проведение комплексных исследований – микробиологических, иммунобиологических и молекулярно-генетических. В модельной системе штаммов были представлены изоляты пребывавшего на разных стадиях жизненного цикла. микроба, Результаты микробиологического анализа обнаружения в почве скотомогильника двух культур B. anthracis, обладающих всеми типичными для возбудителя 40 сибирской язвы характеристиками, были подтверждены результатами ПЦР с пятью праймерами к pag, lef, cya, сар, Ba 813, разработанными для генома сибиреязвенного микроба [34, 35]. Еременко Е.И. с соавторами (2010 г.) подтвердили наличие различия фено-генотипических свойств, предположительно или определенно ассоциирующихся с патогенностью, у штаммов B. anthracis с отличающейся вирулентностью и выделенных из разных экологических ниш, и получение новых данных о корреляции этих свойств с вирулентностью изолятов, выделенных на протяжении длительного отрезка времени из разных источников, в различных географических регионах, и их производных с отличающейся вирулентностью, а также стандартный вирулентный штамм 81/1 [35]. Keim P. с соавторами (2000 г.) эпидемическую значимость выделенных штаммов оценивали по результатам ПЦР с видоспецифическими праймерами и по данным многолокусного VNTR-анализа. Исследователями показана принципиальная возможность использования данной комплексной методики для типизации сибиреязвенных штаммов и их дифференциации от близкородственных микроорганизмов [147]. Известно, что эффективность лабораторной диагностики прямо зависит от качества и стандартности используемого препарата, и как следствие, информативности Современная и достоверности лабораторная полученных диагностика результатов предоставляет [93]. различные возможности при проведении эпидемиологического расследования типов сибирской язвы [78, 79, 113]. В системе противоэпидемических мероприятий, направленных на обеспечение эпидемиологического благополучия населения, важное место отводится мониторингу за циркуляцией возбудителя сибирской язвы. Лабораторными критериями установления диагноза сибирской язвы являются положительные результаты в МФА, ПЦР, иммуносерологических 41 методах, выделение и идентификация культуры сибиреязвенного микроба бактериологическим усовершенствование методом методов Несмотря [81]. лабораторной на постоянное диагностики возбудителя сибирской язвы, этот вопрос в должном объеме не решен до конца. Одной из основных причин является недостаточное обеспечение лабораторных служб зарегистрированными препаратами [92]. Анализ литературных данных показывает, что из всех апробированных способов индикации возбудителя сибирской язвы наиболее высокочувствительными являются молекулярно-биологические методы, в том числе ПЦР-метод, что послужило основанием его широкого использования в практическом здравоохранении нашей страны и зарубежных странах [13, 24, 43, 106, 117, 140, 142]. Одним из важных моментов лабораторной диагностики инфекционных болезней является проведение дополнительных исследований с помощью серологических методов с применением диагностических сывороток, диагностикумов, флуоресцирующих иммуноглобулинов и иммуноферментных тест-систем. К основным методам индикации относится метод флуоресцирующих антител, так как он является достаточно информативным, обеспечивающим быстрое и достоверное обнаружение возбудителя сибирской язвы на этапах ранней диагностики. Предварительное заключение с использованием данного метода может быть дано через 3–5 ч после поступления материала [15]. Положительные результаты, полученные с помощью МФА, позволяют сделать предварительный вывод о наличии возбудителя сибирской язвы или его антигенов в исследуемом биологическом материале или объектах внешней среды и своевременно начать противоэпидемиологических и профилактических мероприятий. проведение 42 До проведения наших исследований зарегистрированные препараты для выявления возбудителя сибирской язвы в объектах окружающей среды и биологическом материале методом МФА отсутствовали. В практическом здравоохранении до середины 90-х лет прошлого столетия широко иммуноглобулиновые применялись эритроцитарные диагностикумы. С антигенные помощью и эритроцитарных диагностикумов в реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) диагноз сибирской язвы подтверждался в 95 % случаев [10]. С помощью РНГА были исследованны также образцы почв из скотомогильников и мест убоя больных животных. Выделение возбудителя сибирской язвы во всех образцах соответствовало положительным результатам РНГА [10]. В настоящее время в Российской Федерации эритроцитарные диагностикумы не выпускаются [92]. Важное значение при идентификации возбудителя сибирской язвы имеет постановка пробы с использованием специфического бактериофага на основании которого можно сделать заключение о принадлежности выделенной культуры к B. aпthracis [1, 25, 32]. Фагоидентификация позволяет исходя из специфичности действия фага, которая может быть столь точна, что позволяет дифференцировать не только отдельные виды, но и не имеющих серологических различий среди штаммов одного вида [21, 27, 100]. Применение теста фаголизабельности в качестве дополнительного критерия позволит значительно улучшить диагностику при идентификации типичных и атипичных штаммов B. anthracis от близкородственных микроорганизмов. Используя строгую родовую и видовую специфичность селекционированных бактериофагов, исследователями Ульяновской Государственной сельскохозяйственной академии была разработана схема выделения и ускоренной идентификации бактерий видов Bacillus subtilis и Bacillus cereus [21, 100]. 43 К моменту проведения наших исследований в Российской Федерации только часть препаратов, необходимых для диагностики особо опасных инфекционных болезней, в том числе и сибирской язвы, была зарегистрирована в установленном порядке. В соответствии с приказом Роспотребнадзора № 88 от 17.03.08 «О мерах по совершенствованию мониторинга за возбудителями инфекционных и паразитарных болезней» лабораторная диагностика особо опасных инфекционных болезней осуществляется по трехуровневой системе: в лабораториях территориального (ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии» в субъекте РФ), регионального (Региональные центры по мониторингу за возбудителями I-II групп патогенности, Центрах индикации и диагностики инфекционных болезней) и федерального (референс-центрах и Национальных центрах верификации диагностической деятельности) уровнях. Указанные центры должны быть обеспечены зарегистрированными препаратами для проведения всех этапов лабораторной идентификация, диагностики изучение (индикация, генетических идентификация, и расширенная молекулярно-биологических характеристик возбудителя и т.д.) в соответствии с возложенными на них задачами и в зависимости от уровня организации лабораторной базы [84]. Учитывая сложившуюся эпидемическую ситуацию по сибирской язве в Российской Федерации, вопрос своевременного выявления B. anthracis из объектов внешней среды и биологического материала с применением высокочувствительных и доступных диагностических препаратов является актуальным. В связи с этим, исследования по изучению диагностической ценности сибиреязвенных иммуноглобулинов и бактериофага Гамма А-26, предназначенных для выявления и идентификации возбудителя сибирской язвы с целью обоснования их целесообразности применения в лабораторной диагностике, является важной задачей. 44 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Работа выполнена на базах лаборатории препаратов против чумы и других особо опасных инфекций ГИСК им Л.А. Тарасевича, Госколлекции патогенных бактерий (ГосКПБ «М») РосНИПЧИ «Микроб», Иркутского научно-исследовательского Государственного противочумного научного центра института прикладной (НИПЧИ), микробиологии и бактериологии (ГНЦ ПМБ), п. Оболенск, ФГКУ «294 Центр спасательных операций особого риска» (ЦСООР) МЧС Российской Федерации в соответствии с разработанными нами Программами исследований иммуноглобулинов диагностические флуоресцирующих сибиреязвенных вегетативных адсорбированных, флуоресцирующих иммуноглобулинов сибиреязвенных споровых диагностических адсорбированных, бактериофага диагностического сибиреязвенного Гамма А-26. Каждый опыт проводили с соблюдением принципов строго контролируемого эксперимента. Испытуемые штаммы были подобраны специалистами лаборатории препаратов против чумы и др. ООИ ГИСК им Л.А. Тарасевича в ГосКПБ «М» РосНИПЧИ «Микроб и зашифрованы сотрудниками, не принимающими участия в приготовлении мазков и учете результатов; пробы биологического материалы и объектов внешней среды – сотрудниками Иркутского НИПЧИ, ГНЦ ПМБ, ФГКУ 294 ЦСООР МЧС РФ. Материалами для исследования являлись: - иммуноглобулины сибиреязвенные диагностические адсорбированные вегетативные диагностические адсорбированные флуоресцирующие (Ставропольский флуоресцирующие и иммуноглобулины сибиреязвенные НИПЧИ), споровые предназначенные для обнаружения вегетативных форм и спор В. aпthracis в РИФ в мазках из чистых культур, объектах окружающей среды и биологического материала. 45 - бактериофаг диагностический сибиреязвенный Гамма А-26, (Ставропольский НИПЧИ); - бактериофаг диагностический сибиреязвенный Fah ВНИИВВиМ (ВНИИВВиМ РАСН). С целью определения активности и специфичности сравниваемых диагностических препаратов было исследовано: 16 штаммов B. anthracis, в том числе B. anthracis М-164, B. anthracis М-165, B. anthracis М-166, B. anthracis С-611, B. anthracis С-914, B. anthracis С-1264, B. anthracis 10М, B. anthracis «лошадь», B. anthracis Ихтиман, B. anthracis 228/8, B. anthracis Sterne 34 F2, B. anthracis 55, B. anthracis СТИ-1, B. anthracis 3R, B. anthracis КМ-48 (М-29), B. anthracis 71/12; - 32 штамма близкородственных микроорганизмов, в том числе B. cereus, Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, Bacillus thuringiensis, Bacillus anthracoides. Были отобраны пробы из объектов внешней среды: - вода, искусственно контаминированная B. anthracis в концентрации 1х106, 1х107, 1х108 м.к./мл; 1х106, 1х107, 1х108 спор/мл и близкородственными микроорганизмами (B. subtilis, B. megaterium, B. cereus, B. thuringiensis, B. anthracoides) в концентрации 1х108 м.к./мл; 1х108 спор/мл - 45 проб; - почва, искусственно контаминированная B. anthracis в концентрации 1х106, 1х107, 1х108 м.к./мл; 1х106, 1х107, 1х108 спор/мл и близкородственными микроорганизмами (B. subtilis, B. megaterium, B. cereus, B. thuringiensis, B. anthracoides) в концентрации 1х108 м.к./мл; 1х108 спор/мл - 45 проб; - смывы с объектов внешней среды, искусственно контаминированные B. anthracis в концентрации 1х106, 1х107, 1х108 м.к./мл; 1х106, 1х107, 1х108 спор/мл и близкородственными микроорганизмами (B. subtilis, B. megaterium, 46 B. cereus, B. thuringiensis, B. anthracoides) в концентрации1х108 м.к./мл; 1х108 спор/мл - 45 проб; - корма, искусственно контаминированные B. anthracis в концентрации 1х106, 1х107, 1х108 м.к./мл; 1х106, 1х107, 1х108 спор/мл и близкородственными микроорганизмами (B. subtilis, B. megaterium, B. cereus, B. thuringiensis, B. anthracoides) в концентрации 108 м.к./мл; 108 спор/мл - 45 проб; - мясо, искусственно контаминированное B. anthracis в концентрации 1х06, 1х107, 1х108 м.к./мл; 1х106, 1х107, 108 спор/мл и бликородственными микроорганизмами (B. subtilis, B. megaterium, B. cereus, B. thuringiensis, B. anthracoides) в концентрациях 1х108 м.к./мл; 1х 108 спор/мл - 45 проб. Методы исследования включали следующие этапы: I. Подготовительный этап 1. Подготовка предметных стекол: - новые стекла кипятили в 5 % растворе синтетического моющего средства в течение 30-40 мин, промывали в горячей воде и помещали в 10 % раствор серной кислоты, где хранили до использования не менее 2-3 сут; - стекла, бывшие в употреблении, опускали на 2-3 ч в хромовую смесь (150 мл концентрированной серной кислоты и 25 мг бихромата калия) на 1-2 сут., стекла затем промывали в теплой проточной воде и помещали в 10 % раствор серной кислоты, где хранили до использования; - если стекла длительно находились в загрязненном состоянии, то к рабочему 0,4 % раствору моющего средства добавляли 10 % перекиси водорода 1:10 (по объему) и обрабатывали вышеуказанным способом. Для проведения флуоресцентной микроскопии использовались тонкие предметные стекла, со шлифом на одном конце, которые использованием ополаскивали дистиллированной водой и сушили. 2. Подготовка растворов: перед 47 для проведения РИФ готовили фосфатно-солевой буферный раствор с рН 7,4+0,1 (ФСБ), используя сухую навеску, приготовленную из следующих реактивов: 1,42 г двуводного натрия гидрофосфата, 0,27 г калия фосфорнокислого 1-замещенного, 9,0 г натрия хлорида. Полученную навеску растворяли в 700,0 мл дистиллированной воды и доводили до объема 1,0 л. 3. Подготовка проб чистых культур микроорганизмов: - ампулы с лиофилизированными культурами B. anthracis стерильно вскрывали и вносили 0,5 мл натрия хлорида раствора 0,9 % мерной пипеткой емкостью 1-2 мл II класса точности. После растворения микробную взвесь в объеме 0,1 мл засевали в пробирки (ГОСТ 1770-74) с 5 мл бульона Хоттингера рН 7,2 0,1 и инкубировали в течение (22±2) ч при температуре (35±1) оС; - культуры B. anthracis, B. cereus, B. subtilis, B. thuringiensis, B. megaterium, B. anthracoides со среды хранения высевали в объеме 0,1 мл на бульон Хоттингера рН 7,2 0,1, инкубировали в течение (22±2) ч при температуре (35±1) оС; - проводили визуальный контроль роста бульонных культур: в пробирках с B. anthracis наблюдался придонный осадок в виде «комочка ваты» с полностью прозрачным раствором над ним; при выращивании близкородственных микроорганизмов – легко разбивающийся осадок с мутным или слегка опалесцирующим бульоном; - бульонные культуры в объеме 0,1 мл высевали в чашки Петри с агаром Хоттингера рН 7,2 0,1, материал распределяли бактериологической петлей по поверхности среды и инкубировали в течение (22±2) ч при температуре (36±1) оС, получая вегетативные формы микроорганизмов. - споровые формы сибиреязвенного микроба и близкородственных микроорганизмов получали путем высева исследуемых бульонных культур в пробирки со скошенной средой Гладстона-Филдса. Материал распределяли 48 бактериологической петлей или покачиванием по поверхности среды и инкубировали в течение 7 суток при температуре (36+1) оС. II. Этап приготовления мазков - приготовление взвеси микроорганизмов из выращенных культур в 0,9 % растворе натрия хлорида по стандартному образцу мутности ФГУН ГИСК им. Л.А. Тарасевича 10 МЕ (ОСО 42-28-85П), соответствующего года выпуска, эквивалентных концентрации 1х108 м.к./мл; - нанесение взвеси каждого штамма тонким слоем на обезжиренные предметные стекла (ГОСТ 9284-75) по 8 мазков; - фиксация высушенных на воздухе мазков путем погружения в 96 % этиловый спирт с добавлением перекиси водорода до 3 % концентрации на 30 мин., не допускалось слипания отдельных предметных стекол; - высушивание препаратов на воздухе после окончания срока фиксации с последующей обводкой сверху стекла восковым карандашом. Приготовление III. диагностических рабочих флуоресцирующих разведений иммуноглобулинов сибиреязвенных вегетативных и споровых адсорбированных сухих: - содержимое одной ампулы растворяли в 0,5 мл дистиллированной воды в течение 1 мин., после чего готовили разведения в фосфатно-солевом буферном растворе от 1:8 до 1:128 в стеклянных пробирках отдельной стерильной пипеткой. IV. Подготовка мазков к микроскопии - на поверхность фиксированного и высушенного мазка каждого штамма с помощью пастеровской пипетки наносили по капле иммуноглобулинов в разведениях 1:8, 1:16, 1:32, 1:64, 1:128 и помещали их во влажную камеру (чашка Петри с кусочком смоченной в воде ваты); - инкубация мазков в течение 30 мин при температуре (37±1) оС; 49 - после инкубации мазки дважды промывали в стакане с ФСБ в течение 7 мин, затем ополаскивали в дистиллированной воде и тщательно высушивали на воздухе. V. Микроскопия мазков - с помощью люминесцентного микроскопа «Carl Zeiss Primo Star» под иммерсионным объективом, применяя иммерсионное нефлуоресцирующее масло или смесь 9 частей глицерина и 1 части 0,9 % раствора натрия хлорида (рН смеси доводили 10 % раствором гидроокиси натрия до 8,5±0,5). VI.Определение чувствительности изучаемых иммуноглобулинов - проводили в мазках-препаратах, приготовленных из взвесей чистых культур 5 штаммов B. anthracis, с концентрацией в пробах 1х108, 1х107, 1х106, 1х105, 1х104 м.к./мл (спор/мл). Подготовку и «окраску» мазков иммуноглобулинами в рабочем разведении проводили по методике, описанной выше. VII. Постановка воспроизводимости - исследовались положительные (1 штамм B. anthracis) и отрицательные пробы (1 штамм B. cereus), каждая в 10 повторностях. Постановку анализа проводили в разные дни и разными исполнителями. Подготовка проб из объектов окружающей среды 1. вода из открытых водоемов: - фильтрование загрязненной воды (грязь, ил и т.д.) через 3 слоя марли, чистую воду исследовали без предварительной подготовки; - готовили разведения 3 штаммов B. anthracis с концентрацией 1х109, 1х108, 1х107 м.к./мл (спор/мл) и по 1 штамму B. subtilis, B. megaterium, B. cereus, B. thuringiensis, B. anthracoides в концентрации 1х109 м.к./мл (спор/мл). Концентрацию взвеси 1х109 м.к./мл (спор/мл) определяли методом подсчета в камере Горяева; - затем в каждую пробирку вносили по 0,5 мл бактериальной взвеси 1 штамма B. anthracis и по 5 мл 1 штамма из близкородственных 50 микроорганизмов, получая конечные концентрации 10 6, 107, 108 м.к./мл (спор/мл) для B. anthracis и 108 м.к./мл (спор/мл) для гетерологичных штаммов. 2. проба смывов с поверхностей объектов окружающей среды: - смывы с поверхности объекта исследования (100 см2) проводили стерильным марлевым тампоном (3х3 см), смоченным стерильной дистиллированной водой и помещали его во флакон с 15 мл стерильной дистиллированной воды. 3. подготовка проб почвы: - пробы почвы (газон, клумба, лесопосадки и т.д.), отбирали на глубине до 15 см в количестве 100 г, свободную от корней и камешков. Почву перемешивали помещали в колбу и заливали 0,9 % раствором натрия хлорида из расчета получения 180 мл суспензии (надосадочной жидкости). Колбу закрывали, тщательно встряхивали в течение 5-10 мин, давали отстояться 3-5 мин. Надосадочную жидкость переносили в пробирку. 4. подготовка кормов: - корма (зерно, отруби, комбикорм, сено, солома) исследовали в количестве 500 г., помещали в колбу и заливали 0,9 % раствором натрия хлорида из расчета получения 180 мл суспензии (надосадочной жидкости). Колбу закрывали, тщательно встряхивали в течение 5-10 мин, давали отстояться 3-5 мин. Надосадочную жидкость переносили в пробирку. 5. подготовка мяса: - 100-130 граммов мяса с лимфоидной тканью измельчали в ступке ножницами, переносили в колбу и заливали 0,9 % раствором натрия хлорида из расчета 1:10. Колбу закрывали, тщательно встряхивали в течение 5-10 мин, давали отстояться 3-5 мин, фильтровали через 3 слоя марли. Надосадочную жидкость переносили в пробирки. 51 Учет результатов Результаты учитывали по следующей схеме: 4 креста – сверкающая флуоресценция зеленовато-желтого цвета оболочки микробной клетки, четко контрастирующая с темным телом клетки; 3 креста – яркая флуоресценция зеленовато-желтого цвета оболочки микробной клетки; 2 креста или 1 крест – слабое свечение всей клетки. Специфическим считали сверкающую или яркую флуоресценцию зеленовато-желтого цвета оболочки микробной клетки, четко контрастирующей с темным цветом клетки (свечение с яркостью на 3 или 4 креста). Слабое свечение всей микробной клетки или с едва заметными ее контурами оценивали на 2 или 1 крест, считали неспецифическим и не учитывали. Постановка теста на гемолиз В качестве метода сравнения был использован бактериологический метод – тест на гемолиз. С этой целью готовили агар Хоттингера рН 7,2±0,1 с 3-5 % дефибринированной кровью барана по общепринятой методике. Дефибринированную кровь добавляли в количестве 3-5 % в расплавленный и остуженный до 45 оС агар Хоттингера, который сразу же разливали в чашки Петри (МУ., Приложение 1.4., М., 2007). Посев испытуемых культур производили бактериологической петлей секторами и инкубировали в термостате при температуре (35±1) оС в течение (20±2) ч, после чего учитывали результат. Методы исследования бактериофага диагностического сибиреязвенного Гамма А-26 жидкого Материалом для исследования служил препарат, представляющий собой стерильный фильтрат фаголизата бульонной культуры сибиреязвенного штамма В. aпthracis 228/8, содержащий взвесь частиц фага Гамма А-26, обладающих лизирующим действием в отношении типичных и атипичных по 52 морфологическим, культуральным, биохимическим и антигенным свойствам штаммов B. anthracis в вегетативной форме. В качестве контрольного препарата был использован бактериофаг диагностический сибиреязвенный жидкий Fah ВНИИВВиМ серия № 02-09 производства ВНИИВВиМ РАСН (г. Покров). Всего исследовано 119 штаммов чистых культур микроорганизмов: B. anthracis, Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, Bacillus thuringiensis, Bacillus anthracoides, Bacillus mesentericus. Определение диапазона действия бактериофага диагностического сибиреязвенного Гамма А-26 жидкого Изучение диапазона действия по специфической активности и специфичности исследуемого бактериофага и бактериофага Fah ВНИИВВиМ проводили на чашках Петри с агаром Хоттингера рН 7,2+0,1. Для этого после застывания и подсушивания агара в термостате чашку Петри с обратной стороны расчерчивали карандашом на 2 квадрата, в которые бактериологической петлей диаметром 5 мм или пастеровской пипеткой вносили каплю бульонной культуры одного из исследуемых штаммов, затем каплю растирали бактериологической петлей до диаметра 1-1,5 см. Чашки Петри с приоткрытыми крышками подсушивали в термостате при температуре (36±1) оС до полного впитывания бульонной культуры, после чего в центр квадратов с подсушенной культурой бактериологической петлей диаметром 3 мм наносили по одной капле неразведенного препарата бактериофагов: в одну – бактериофаг «Гамма А-26», в другую – бактериофаг Fah ВНИИВВиМ. Чашки с приоткрытыми крышками подсушивали в термостате при температуре (36±1) оС, закрывали, переворачивали агаром вверх и инкубировали при температуре (36±1) оС в течение (18 2) ч. Результаты учитывали через (5 1) ч (предварительный учет) и через (18±2) ч (окончательный учет) путем визуального просмотра невооруженным глазом участков нанесения культуры исследуемого штамма и бактериофага. 53 Лизис оценивали по четырехкрестовой системе:4 креста – сливной (полный) лизис культур с прозрачным дном литического пятна, 3 креста – прозрачное пятно с единичными колониями вторичного роста в месте нанесения фага, 2 креста – прозрачное пятно лизиса со значительным вторичным ростом, 1 крест – полупрозрачное слабо заметное пятно лизиса культуры. Положительной считали пробу при результатах реакции не менее, чем на 3 креста. Постановку воспроизводимости сибиреязвенного бактериофага осуществлялась по аналогии с иммуноглобулинами, описанной выше. Статистические методы оценки результатов исследования В работе использованы стандартные методы вариационной статистики экспериментальных данных (Ашмарин И.П., Воробьев А.А., 1962; Лакин Г.Ф., 1990). Обработку результатов проводили с использованием программ MS Excel 2007 для Windows. За предоставление образцов иммуноглобулинов диагностических флуоресцирующих сибиреязвенных вегетативных и споровых адсорбированных, и бактериофага Гамма А-26 автор приношу благодарность сотрудникам Ставропольского НИПЧИ: заведующей лабораторией диагностических препаратов особо опасных и других инфекций Тюменцевой И.С., гл.н.с. Афанасьеву Е.Н., в. н. с. Жарниковой И.В., с.н.с. Ждановой Е.В., главному специалисту-технологу Юркиной И.В., м.н.с. Горобец Е.А.; заведующей лабораторией сибирской язвы Рязановой А.Г., гл.н.с. Буравцевой Н.П., н.с. Головинской Т.М., с.н.с. Цыганковой Е.А. Выражаю глубокую признательность за проведение медицинских испытаний сотрудникам РосНИПЧИ «Микроб»: н.с. Абдрашитовой А.С., с.н.с. Малахаевой А.Н., врачу-бактериологу Ляшовой О.Ю., н.с. Валовой Т.В. врачу-бактериологу исследовательского Мироновой противочумного Н.П.; института: Иркутского научно- заведующей отделом биологического и технологического контроля Гефан Н.Г., в.н.с. отдела 54 зоонозных инфекций Родзиковскому А.В., с.н.с. Мазепа А.В., н.с. Дугаржаповой З.Ф., н.с. Кравец Е.В.; сотрудникам Государственного научного центра прикладной микробиологии: заместителю директора по качеству и развитию Храмову М.В., заведующему лабораторией сибирской язвы с.н.с. Маринину Л.И., заведующему отделом особо опасных инфекций с.н.с. Мокриевич А.Н., с.н.с. Голову Е.А., н.с. Мироновой Р.И., заведующей отделом биологического и технологического контроля Василенко Т.И. 55 Глава 3. ИЗУЧЕНИЕ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ И СПЕЦИФИЧНОСТИ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ ФЛУОРЕСЦИРУЮЩИХ СИБИРЕЯЗВЕННЫХ ВЕГЕТАТИВНЫХ АДСОРБИРОВАННЫХ Анализ данных литературы свидетельствует о том, что проблема лабораторной диагностики сибирской язвы для практического здравоохранения остается актуальной [28, 79]. Одной из основных причин сложившегося положения является недостаточное обеспечение лабораторных служб зарегистрированными диагностическими препаратами. Критериями положительные установления результаты иммунологических диагноза исследований, (МФА), сибирской язвы проведенных молекулярно-генетических являются с помощью (ПЦР) и бактериологических (выделение и идентификация культуры сибиреязвенного микроба) методов [51, 84]. МФА относится к основным сигнальным методам, так как является достаточно информативным, обеспечивающим быстрое и достоверное обнаружение возбудителя сибирской язвы на этапах ранней диагностики. Предварительное заключение с использованием данного метода может быть получено через 3-5 ч после поступления материала, что позволяет использовать его в качестве экспресс-диагностики. Положительные результаты, полученные с помощью МФА, позволяют сделать предварительный вывод о наличии возбудителя сибирской язвы или его антигенов окружающей в исследуемом среды и биологическом своевременно материале, начать объектах проведение противоэпидемических, профилактических и терапевтических мероприятий. До настоящего времени зарегистрированные препараты для выявления возбудителя сибирской язвы методом МФА в лабораторной диагностике отсутствовали. Учитывая это, в Ставропольском научно-исследовательском противочумном институте, разработаны иммуноглобулины диагностические 56 флуоресцирующие сибиреязвенные вегетативные адсорбированные, представляющие собой иммуноглобулиновую фракцию к водорастворимому антигену вегетативной формы B. anthracis, выделенную из гипериммунной кроличьей сыворотки, адсорбированную на основе магноиммуносорбентов водорастворимыми антигенами штаммов B. cereus. Иммуноглобулины предназначены для обнаружения вегетативной формы В. anthracis в реакции иммунофлуоресценции (РИФ) в мазках из чистых культур, объектах окружающей среды (почва, подстилка, вода, продовольственное сырье, фураж) и биологического материала (животного происхождения). Способность возбудителя сибирской язвы переходить из споровой форму в вегетативную доказывает актуальность работ по изучению иммуноглобулинов диагностических флуоресцирующих сибиреязвенных вегетативных. 3.1. Оценка специфической активности иммуноглобулинов диагностических флуоресцирующих сибиреязвенных вегетативных адсорбированных Изучение иммуноглобулинов сибиреязвенных вегетативных проводилось по разработанной нами Программе исследования по следующим показателям: физико-химическим свойствам; определению рабочего разведения (наибольшее разведение препарата, при котором возможно обнаружение возбудителя); чувствительности (способность препарата в рабочем разведении выявлять в исследуемых пробах чистых культур минимальные концентрации B. аnthracis); специфической активности (процент выявления штаммов B. anthracis положительных проб объектов окружающей среды и биологического материала к числу контаминированных B. anthracis); специфичности (процент отрицательных результатов при исследовании проб, контаминированных близкородственными микроорганизмами); воспроизводимости (процент совпадений результатов 57 исследования положительных и отрицательных проб); продолжительности анализа (в часах). При оценке внешнего вида иммуноглобулинов в ампуле установлено, что они представляли собой аморфную пористую массу желто-оранжевого цвета, при растворении имели вид прозрачной опалесцирующей жидкости желто-оранжевого цвета. По физико-химическим свойствам препарат соответствовал требованиям проекта нормативной документации рН 7,6 (норма 7,5-8,5). С целью изучения специфической активности иммуноглобулинов сибиреязвенных вегетативных адсорбированных использовались чистые культуры B. anthracis. Всего исследовано 47 штаммов чистых культур микроорганизмов. Все штаммы морфологическим, биохимическим были типичными свойствам и по культурально- имели отличия по генетическим свойствам. Исследуемые штаммы прошли независимую процедуру шифрования сотрудниками, не принимающими участия в приготовлении мазков и учете результатов. Результаты оценивали с помощью люминесцентной микроскопии по четырех крестовой схеме. Специфическим считали свечение с яркостью на 4 или 3 креста, свечение с яркостью 2 или 1 крест считали неспецифическим. Определение специфической активности иммуноглобулинов сибиреязвенных вегетативных адсорбированных в разведениях от 1:8 до 1:256 проводилось в РИФ с использованием 16 различных штаммов B. anthracis. Нами проведен анализ полученных результатов исследования штаммов B. anthracis с помощью иммуноглобулинов в ходе постановки РИФ (табл. 3.1). Результаты проведенных исследований позволили выявить высокую специфическую активность испытываемого препарата. Как видно из представленных разведения данных, специфическая иммуноглобулинов активность флуоресцирующих с уменьшением сибиреязвенных 58 вегетативных существенно не изменились. Так, из 16 штаммов B. anthracis, взятых в исследование, все штаммы были выявлены в разведении препарата 1:8. С применением испытуемого препарата в разведениях 1:16, 1:32 и 1:64 специфическое свечение на 3-4 креста наблюдалось у 15 штаммов B. anthracis. Таблица 3.1 Результаты изучения специфической активности иммуноглобулинов сибиреязвенных вегетативных адсорбированных в РИФ с методом сравнения № Шифр Название штамма Тест на гемолиз Разведения иммуноглобулинов п/п 1:8 В. anthracis КМ-48 (М- 4+ 29) 2. 37 В. anthracis 228/8 4+ 3. 1 В. anthracis М-164 4+ 4. 48 В. anthracis 55 4+ 5. 19 В. anthracis Sterne 34 4+ F2 6. 4 В. anthracis СТИ-1 4+ 7. 7 В. anthracis С-914 4+ 8. 17 В. anthracis С-611 4+ 9. 9 В. anthracis С-1264 4+ 10. 34 В. anthracis «лошадь» 4+ 11. 35 В. anthracis 71/12 3+ 12. 58 В. anthracis М-165 3+ 13. 42 В. anthracis 3R 3+ 14. 51 В. anthracis М-166 3+ 15. 22 В. anthracis 10М 3+ 16. 40 В. anthracis Ихтиман 3+ Примечание: -* отрицательный результат 1. 36 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ - 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 3+ 4+ 3+ 2+ 2+ - 4+ 4+ 4+ 4+ 3+ 3+ 3+ 3+ 3+ 3+ 2+ 4+ 4+ 4+ 4+ 3+ 3+ 3+ 3+ 3+ 3+ 2+ 4+ 3+ 3+ 3+ 3+ 3+ 3+ 3+ 3+ 3+ 1+ 3+ 3+ 3+ 1+ 3+ 3+ 2+ 2+ 2+ 2+ - 2+ 3+ 2+ 2+ 1+ 2+ 2+ - - Результаты проведенных исследований позволили выявить высокую специфическую активность представленных данных, разведения исследуемого специфическая иммуноглобулинов препарата. активность флуоресцирующих Как с видно из уменьшением сибиреязвенных вегетативных существенно не изменились. Так, из 16 штаммов B. anthracis, взятых в исследование, все штаммы были выявлены в разведении препарата 1:8. С применением испытуемого препарата в разведениях 1:16, 1:32 и 1:64 59 специфическое свечение на 3-4 креста наблюдалось у 15 штаммов B. anthracis. Анализируя полученные результаты необходимо отметить, что с увеличением разведения иммуноглобулинов степень снижалась. специфической Обнаружено, что с активности применением испытуемого препарата в разведении 1:128 специфическое свечение на 3-4 креста наблюдалось у 10 штаммов B. anthracis, что составило 62,5±12,1 %. С увеличением разведения иммуноглобулинов до 1:256 специфическое свечение наблюдалось только с 3 штаммами B. anthracis. Показано, что из 16 исследованных штаммов B. anthracis 15 штаммов были выявлены иммуноглобулинами сибиреязвенными вегетативными в разведении 1:64, что подтверждается яркостью свечения на 3 или 4 креста. Учитывая вышеизложенное за рабочее разведение опытных иммуноглобулинов было принято разведение 1:64, о чем свидетельствовало яркое зеленовато-желтое свечение интенсивностью на 3-4 креста у 93,8±6,0 % исследованных штаммов B. anthracis. Установленное рабочее разведение 1:64 соответствует требованиям проекта нормативной документации, в соответствии с которыми препарат в рабочем разведении не менее 1:16 должен вызывать специфическое свечение вегетативной формы сибиреязвенного микроба в концентрации 1,0х108 м.к./мл с интенсивностью на 3-4 креста. На основании полученных результатов нами были выделены 3 группы (высоко, средне и низкочувствительные) штаммов возбудителя сибирской язвы по их выявлению исследуемыми иммуноглобулинами в РИФ (рис. 1). В группу высокочувствительных штаммов по отношению к иммуноглобулинам сибиреязвенным вегетативным вошли штаммы В. anthracis КМ-48 (М-29), В. anthracis 228/8, В. anthracis С-914 и В. anthracis М-164, окрашивание которых иммуноглобулинами в разведениях от 1:8 до 1:256, вызывало специфическое свечение на 3-4 креста; среднечувствительными были 60 штаммы В. anthracis 55, В. аnthracis Sterne 34 F2, В. anthracis С-611, В. anthracis СТИ-1, В. anthracis С-914, В. аnthracis «лошадь», В. anthracis 71/12 (специфическое окрашивание иммуноглобулинами в разведениях от 1:8 до 1:128); в группу низкочувствительных отнесены штаммы B. anthracis М165, В. anthracis 3R, В. anthracis М-166, В. anthracis 10М, B. anthracis С-1264 (специфическое окрашивание иммуноглобулинами в разведениях от 1:8 до 1:64) и только 1 штамм B. anthracis Ихтиман не определялся препаратом в РИФ. Как видно из данных специфической активности иммуноглобулинов, представленных на рисунке 1, высокочувствительные штаммы составляют 37,5 %, среднечувствительные – 31,3 %. На долю штаммов с низкой чувствительностью к иммуноглобулинам приходится 25,0 % и 1 штамм, что составило 6,3 %, не определялся препаратом. Таким образом, проведенными исследованиями было показано, что иммуноглобулины сибиреязвенные вегетативные обладают высокой специфической активностью. Рис. 1. Результаты специфической активности иммуноглобулинов сибиреязвенных вегетативных адсорбированных к штаммам B. anthracis В качестве метода сравнения в работе использовался тест на гемолиз. Посев испытуемых культур B. anthracis на агар Хоттингера с 5% 61 дефибринированной кровью барана проводили бактериологической петлей секторами и инкубировали в термостате при температуре (35+1) оС в течение (20+2) ч, после чего учитывали результат. Сибиреязвенный микроб не лизирует эритроциты барана в отличие от большинства близкородственных спорообразующих сапрофитов, образующих широкую зону гемолиза вокруг выросших колоний, что подтверждается отсутствием зон лизиса при посеве штаммов B. anthracis на агаровые пластины. В тесте на гемолиз чистые культуры штаммов B. anthracis были идентифицированы в 100 % случаев. Все исследуемые штаммы B. anthracis не лизировали эритроциты барана (табл. 3.1). Учитывая вышеизложенное можно сделать заключение, что рабочее разведение иммуноглобулинов диагностических флуоресцирующих сибиреязвенных вегетативных адсорбированных составляет 1:64, что соответствуют требованиям проекта нормативной документации (препарат в рабочем разведении не менее 1:16 должен вызывать специфическое свечение возбудителя сибирской язвы в вегетативной форме). В ходе исследований была определена чувствительность препарата, то есть способность испытываемых иммуноглобулинов выявлять минимальную концентрацию возбудителя сибирской язвы в рабочем разведении 1:64. С этой целью данный показатель изучали с применением 5 штаммов B. anthracis (B. anthracis 228/8), B. anthracis Sterne 34 F2, B. anthracis СТИ-1, B. anthracis 71/12, B. anthracis КМ-48 (М-29). Каждый штамм B. anthracis был исследован в заданной концентрации микроорганизмов – от 1х104 до 1х108 м.к./мл (табл. 3.2). Результаты исследования по определению минимальной концентрации сибиреязвенных исследуемых микробов показали, иммуноглобулинов что РИФ с использованием флуоресцирующих сибиреязвенных вегетативных обладает высокой чувствительностью. 62 Таблица 3.2 Результаты чувствительности РИФ с использованием иммуноглобулинов флуоресцирующих сибиреязвенных вегетативных адсорбированных Номер п/п 1. 2. 3. 4. 5. Название штамма Исследуемые концентрации штаммов B. anthracis 1х108 м.к./мл B. anthracis ≤10 м.к. 228/8 в5 полях зрения на 4+ B. anthracis > 10 м.к. Sterne 34 в 20 F2 полях зрения на 4+ 1х107 м.к./мл > 10 м.к. в 20 полях зрения на 4+ > 10 м.к. в 30 полях зрения на 4+ 1х106 м.к./мл ≤10 м.к. в 30 полях зрения на 4+ ≤10 м.к. 2-11 в поле зрения на 4+ 5х105 м.к./мл ≤10 м.к. в5 полях зрения на 4+ ≤10 м.к. в 20 полях зрения 4+ 1х105 м.к./мл ≤10 м.к. в 30 полях зрения 4+ B. anthracis > 10 м.к. СТИ-1 в 30 полях зрения на 4+ > 10 м.к. в 20 полях зрения на 4+ ≤10 м.к. в поле зрения на 4+ ≤10 м.к. в 10 полях зрения На 4+ - B. anthracis > 10 м.к. 71/12 в 30 полях зрения на 3+ B. anthracis > 10 м.к. КМ-48 в 30 (М-29) полях зрения на 4+ > 10 м.к. в 30 полях зрения на 3+ > 10 м.к. в 20 полях зрения на 4+ ≤10 м.к. в поле зрения на 3+ ≤10 м.к. в 10 полях зрения на 3+ ≤10 м.к. в 10 полях зрения На 3+ ≤10 м.к. в 30 полях зрения 3+ ≤10 м.к. в поле зрения на 3+ 1х104 м.к./мл -* - - - - - - Примечание: –* отрицательный результат Исследование мазков приготовленных из взвесей чистых культур 5 штаммов B. anthracis с концентрациями от 1х104 до 1х108 м.к./мл, позволило установить, что при просмотре 30 полей зрения в мазках наблюдали специфическое свечение с интенсивностью на 3-4 креста 1-2 и более микробных клеток B. anthracis в концентрации 5,0х105 м.к./мл. В мазках из 5 63 штаммов B. anthracis в других концентрациях обнаруживались более 10 микробных клеток в 5-30 полях зрения с интенсивностью на 3-4 креста. Анализ результатов исследований, проведенных в специализированных лабораториях различных профильных учреждений по разработанным нами Программам, включающих исследование проб объектов окружающей среды (смывы с объектов внешней среды, корма) и биологического материала (мясо), искусственно инфицированных B. anthracis, показал, что сибиреязвенный микроб в РИФ с помощью испытуемых иммуноглобулинов обнаружен в 100 % случаев. В рабочем разведении в РИФ иммуноглобулины вызывали специфическое свечение сибиреязвенного микроба в мазках интенсивностью на 3-4 креста. Чувствительность препарата составила 1,0х106 м.к./мл. Настоящими исследованиями доказано, что испытываемые иммуноглобулины в РИФ обладают высокой специфической активностью в отношении большинства штаммов возбудителя сибирской язвы и могут широко применяться в лабораторной диагностике с целью индикации штаммов возбудителя сибирской язвы. 3.2. Определение специфичности иммуноглобулинов диагностических флуоресцирующих сибиреязвенных вегетативных Для изучения специфичности исследуемых иммуноглобулинов сибиреязвенных вегетативных адсорбированных в работе использовались 32 штамма близкородственных спорообразующих сапрофитных микроорганизмов: B. anthracoides, B. cereus, B. megaterium, B. thuringiensis, B. subtilis. Отобранные нами для исследования штаммы были типичными по культурально-морфологическим, биохимическим и генетическим свойствам. Каждый опыт с близкородственными штаммами микроорганизмов проводили с соблюдением принципов строго контролируемого эксперимента. 64 В результате иммуноглобулины адсорбированные проведенных испытаний флуоресцирующие обладают различной установлено, сибиреязвенные степенью что вегетативные специфичности к близкородственным микроорганизмам, использованных в исследовании (табл. 3.3). При постановке метода флуоресцирующих антител было зарегистрировано специфическое свечение с интенсивностью на 3 креста у 8 штаммов других видов Bacillus, окрашенных сибиреязвенными иммуноглобулинами вегетативными в рабочем разведении 1:64. В общей сложности неспецифические реакции были обнаружены в 25,0±7,65 % случаев, что составляет достаточно высокий процент. Однако невысокую специфичность препарата 75,0±5,6 % можно объяснить генетическим родством (до 90 % гомологии) сибиреязвенного микроорганизма с другими видами рода Bacillus [65, 152]. В качестве метода сравнения использовали регламентируемый МУК 4.2.2413-08 «Лабораторная сибирской язвы» тест диагностика на гемолиз. и обнаружение Известно, что возбудителя большинство близкородственных сапрофитов образовывают широкую зону гемолиза вокруг выросших колоний на чашках Петри с питательной средой и дефибринированной кровью барана. Нами выявлено, что при высеве всех изучаемых штаммов близкородственных спорообразующих сапрофитов на агаровые пластинки с агаром Хоттингера и 5 % дефибринированной кровью барана, вокруг выросших колоний в 100 % случаев отмечалась зона гемолиза (табл.3.3). В результате проведенных сравнительных испытаний показана диагностическая равноценность исследуемых иммуноглобулинов в РИФ и теста на гемолиз. Несмотря на то, что с помощью иммуноглобулинов сибиреязвенных вегетативных адсорбированных выявлено 93,8% штаммов B. anthracis и специфичность составила 96,9 %, а с помощью метода 65 сравнения подтверждена принадлежность штаммов к виду B. anthracis и другим видам Bacillus в 100 % случаев, получение результатов при исследовании с помощью иммуноглобулинов было значительно быстрее, чем при исследовании бактериологическим методом. Таблица 3.3 Результаты изучения специфичности иммуноглобулинов сибиреязвенных вегетативных адсорбированных к близкородственным штаммам рода Bacillus № п/п 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. 24. 25. 26. 27. 28. 29. 30. 31. 32. Шифр 15 27 28 32 56 57 3 46 41 50 60 44 10 38 6 5 31 21 64 49 13 62 20 26 52 29 8 23 18 30 12 25 Название штамма В. anthracoides 1312 В. anthracoides 449 В. anthracoides 430 В. anthracoides 80 В. anthracoides 27 В. cereus 104 В. cereus 108 В. cereus 8 В. cereus 16 В. cereus 96 В. cereus 504 В. cereus 688В В. cereus 1 В. megaterium 3 В. megaterium 654 В. megaterium 2 В. megaterium 5 В. megaterium 89 В. megaterium 1 В. subtilis 35 В. subtilis 36 В. subtilis 37 В. subtilis 83 В. subtilis 3 В. subtilis 38 В. subtilis 168 В. subtilis 33 В. thuringiensis 5 В. thuringiensis 3 В. thuringiensis 2 В. thuringiensis 1 В. thuringiensis 4ав Разведения иммуноглобулинов 1:8 2+ 1+ 1+ -* 4+ 4+ 3+ 3+ 3+ 4+ 3+ 4+ 3+ 3+ 3+ 2+ 2+ 4+ 3+ 3+ 2+ - Примечание: -* отрицательный результат 1:16 2+ 1+ 1+ 4+ 4+ 3+ 2+ 3+ 4+ 3+ 4+ 3+ 3+ 3+ 2+ 2+ 4+ 3+ 3+ 2+ - 1:32 2+ 3+ 3+ 3+ 2+ 4+ 3+ 4+ 3+ 3+ 3+ 2+ 3+ 2+ 2+ - 1:64 2+ 3+ 3+ 3+ 2+ 4+ 2+ 3+ 3+ 3+ 2+ 2+ 3+ 2+ - Тест на 1:128 1:256 гемолиз 1+ 3+ 1+ 2+ 4+ 1+ 3+ 2+ 2+ - - + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 66 Нами проведен анализ результатов специфической активности иммуноглобулинов диагностических флуоресцирующих сибиреязвенных вегетативных адсорбированных в РИФ со штаммами B. anthracis и специфичности с близкородственными спорообразующими сапрофитными микроорганизмами (рис. 2). Рис. 2. Результаты специфической активности иммуноглобулинов вегетативных адсорбированных и специфичности Как видно из рисунка 3, результаты теста на гемолиз со штаммами B. anthracis были отрицательными, зоны лизиса ни с одним штаммом данного вида не были зафиксированы. В то время как, спорообразующие сапрофиты образовывали зоны гемолиза в 100 % случаев. Рис. 3. Результаты анализа теста на гемолиз штаммов B. anthracis и близкородственные спорообразующих сапрофитных штаммов (в %%) 67 Для подтверждения возможности использования исследуемых иммуноглобулинов в РИФ в лабораторной диагностике сибирской язвы нами были проведены исследования по воспроизводимости совпадения положительных со штаммом B. аnthracis и отрицательных со штаммом B. сereus результатов. Исследования, проведенные в 10 повторностях, при постановке реакции в разные дни и разными исполнителями показали, что во всех реакциях со штаммом B. аnthracis получены совпадающие положительные результаты, во всех случаях со штаммом B. сereus – отрицательные результаты, что соответствует 100 % воспроизводимости. Данное положение подтверждается результатами в таб. 3.4. Таблица 3.4 Данные воспроизводимости результатов, полученных с помощью иммуноглобулинов сибиреязвенных вегетативных адсорбированных в РИФ № Шифр Название штамма п/п 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 66 75 74 84 71 70 65 69 83 67 78 73 79 80 72 68 77 76 82 81 B. anthracis СТИ-1 B. anthracis СТИ-1 B. anthracis СТИ-1 B. anthracis СТИ-1 B. anthracis СТИ-1 B. anthracis СТИ-1 B. anthracis СТИ-1 B. anthracis СТИ-1 B. anthracis СТИ-1 B. anthracis СТИ-1 B. cereus 16 B. cereus 16 B. cereus 16 B. cereus 16 B. cereus 16 B. cereus 16 B. cereus 16 B. cereus 16 B. cereus 16 B. cereus 16 Примечание: -* отрицательный результат Результаты исследований в зависимости от разведения иммуноглобулинов 1:8 1:16 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 2+ 2+ 2+ 2+ 2+ 2+ 2+ 2+ 2+ 1+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 2+ 2+ 2+ 2+ 2+ 2+ 2+ 2+ 1+ 1+ 1:32 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 2+ 2+ 2+ 2+ 2+ -* - - 1:64 1:128 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 2+ 2+ 4+ 4+ 4+ 3+ 3+ 3+ 3+ 3+ 3+ 3+ - - - 68 В результате проведенных исследований показана диагностическая равноценность иммуноглобулинов по выявлению B. anthracis в реакции иммунофлуоресценции и бактериологического метода (тест на гемолиз). При изучении специфичности в отношении близкородственных микроорганизмов установлено, что иммуноглобулины в 75,0±5,6 % случаев не обнаруживали штаммы других видов рода Bacillus в реакции иммунофлуоресценции. Несмотря на достаточно высокий процент получения ложноположительных результатов, данный препарат может использоваться в лабораторной диагностике сибирской язвы. При выявлении возбудителей, относящихся ко II группе патогенности, допускается гипердиагностика, для того чтобы не пропустить обнаружении возбудителя, и своевременно приступить к проведению противоэпидемических мероприятий. При этом использование иммуноглобулинов сибиреязвенных вегетативных в РИФ имело преимущество перед бактериологическим методом (тест на гемолиз) при исследовании проб объектов внешней среды и биологического материала по времени постановки и учету результатов. Продолжительность анализа при исследовании чистых культур с помощью иммуноглобулинов составила 2,5-3 ч, при исследовании объектов окружающей среды и биологического материала (20±2) ч. Показано, что положительный ответ при исследовании чистых культур методом гемолиза можно получить через 20 ч и через 40 ч при исследовании проб объектов окружающей среды и биологического материала. Несомненно, по срокам получения заключения при исследовании подозрительного на инфицированность возбудителем сибирской язвы материала с помощью сибиреязвенных иммуноглобулинов в РИФ имеет преимущество перед бактериологическим методом, что особенно важно при оперативном решении вопроса о мероприятий в очагах сибирской язвы. проведении противоэпидемических 69 По результатам исследований, проведенных в специализированных лабораториях различных профильных учреждений в соответствии с разработанными Программами отмечена высокая специфичность иммуноглобулинов сибиреязвенных вегетативных в РИФ, так как со всеми близкородственными штаммами были получены отрицательные результаты (100 %). При исследовании проб объектов окружающей среды (вода, почва), искусственно инфицированных B. anthracis, также подтверждена высокая диагностическая эффективность испытуемого препарата (табл. 3.5). Таблица 3.5 Обобщенные данные исследований иммуноглобулинов флуоресцирующих сибиреязвенных вегетативных адсорбированных № п/п 1 2 3 4 5 Показатели Чувствительность (минимальное количество микробных клеток B. anthracis, выявляемое в РИФ) Специфическая активность (выявляемые штаммы B. anthracis), M±m % Специфичность (отрицательные результаты с близкородственными микроорганизмами), M±m % Выявляемые штаммы B. anthracis в пробах из объектов внешней среды и биологического материала, M±m % Отрицательные результаты с близкородственными микроорганизмами в пробах из объектов окружающей среды и биологического материала M±m % Скорость учета результатов (с учетом подготовки всех материалов), в часах Количество проб 5 5,0х105 м.к./мл –* 16 93,8±6,0 100,0 32 75,0±5,6 100,0 225 100,0 – 225 100,0 – чистые культуры объекты внешней среды, биологический материал Примечание: –* не предусмотрено методом 6 Результаты иммуноглобулины тест на флуоресцирующие гемолиз в разведении 1:64 20 20 2,5-3 40 70 В рабочем разведении препарат выявлял B. anthracis в минимальной концентрации 1,0·106 м.к./мл в 100 % случаев. Полученные данные позволили внести изменения в проект нормативной документации, касающиеся уточнения названия, состава и назначения препарата. Существенные изменения были внесены в методику обеззараживания мазков при приготовлении их из спорообразующих микроорганизмов. При оценке качества поступивших первых серий сибиреязвенных вегетативных иммуноглобулинов на соответствие препарата требованиям нормативной документации было выявлено, что иммуноглобулины, даже в разведении 1:16 (норма не менее 1:16), не вызывали специфического свечения сибиреязвенных штаммов. Вместе с тем, по данным авторов, иммуноглобулины выявляли штаммы сибиреязвенного микроба в разведении 1:128. При анализе причин было установлено, что обеззараживание мазков, приготовленных из сибиреязвенных штаммов, авторы проводили 96 % спиртом без добавления 3 % перекиси водорода, использование которой негативно воздействует на специфическое свечение при окраске мазков препаратом. В процессе нашей работы мазки обеззараживали в соответствии с требованиями СП 1.3.1285-03, которые предусматривают обязательное добавление к спирту перекиси водорода. В дальнейшем были проведены дополнительные исследования на этапе приготовления мазков, заключающиеся в промывке стекол с мазками после их обеззараживания в дистиллированной воде в течение 5 мин. Полученные результаты послужили основанием для внесения в проект нормативной документации дополнения по приготовления мазков. Таким образом, в результате проведенных исследований установлена высокая специфическая активность иммуноглобулинов сибиреязвенных вегетативных, обеспечивающих специфическое зеленовато-желтое свечение штаммов B. anthracis в вегетативной форме в мазках из чистых культур, биологического материала и объектов окружающей среды в концентрации 71 1,0х108 м.к./мл. исследований Чувствительность установлена от препарата 5,0х105 до по 1х106 результатам м.к./мл. всех Показана диагностическая равноценность иммуноглобулинов и теста на гемолиз при исследовании специфической активности. При изучении специфичности препарата с близкородственными микроорганизмами более точным оказался тест на гемолиз (100 %), тогда как специфичность испытываемых иммуноглобулинов составила 75,0±5,6 %, что допустимо при выявлении микроорганизмов, относящихся ко II группе патогенности. При этом получение результатов значительно быстрее при исследовании с помощью иммуноглобулинов, чем при исследовании бактериологическим методом. Проведенные исследования позволяют использовать иммуноглобулины флуоресцирующие сибиреязвенные вегетативные адсорбированные в РИФ для специфической индикации при исследовании чистых культур, биологического материала и объектов окружающей среды при диагностике сибирской язвы. 72 Глава 4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ДИАГНОСТИЧЕСКОЙ ЦЕННОСТИ (СПЕЦИФИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ, СПЕЦИФИЧНОСТЬ) ИММУНОГЛОБУЛИНОВ ФЛУОРЕСЦИРУЮЩИХ СИБИРЕЯЗВЕННЫХ СПОРОВЫХ АДСОРБИРОВАННЫХ Одной из главных причин имеющегося эпидемического неблагополучия по сибирской язве является способность возбудителя образовывать во внешней среде устойчивые споры, которые могут годами сохранять жизнеспособность и патогенные свойства, что обуславливает не только дальнейшее пребывание возбудителя в анабиотическом состоянии, но и возможность размножаться и накапливаться в почве [59, 61, 62]. Не исключена возможность завоза инфицированных животных, сырья и продуктов животного происхождения, контаминированных спорами возбудителя, из неблагополучных по сибирской язве стран. Учитывая спорообразующую способность возбудителя сибирской язвы и длительное пребывание в таком состоянии во внешней среде, вопрос своевременного выявления B. anthracis является весьма актуальным. При этом возникает острая необходимость в проведении лабораторной диагностики стандартными препаратами с целью индикации возбудителя сибирской язвы в чистых культурах, а также в различных объектах окружающей среды: почва, подстилка, вода, продовольственное сырье, фураж, продукты животного происхождения. Известно, что основными критериями оценки диагностических препаратов должны быть их высокие чувствительность, специфическая активность и специфичность [92, 93]. Кроме этого не менее важным является время, затрачиваемое на проведение анализа и получение результата. Одним из простых и надежных методов индикации возбудителей инфекционных заболеваний является метод флуоресцирующих антител, отличающийся 73 достаточно высокой чувствительностью, простотой постановки и изучению в возможностью быстрого получения ответа. В разделе изложены сведения, посвященные сравнительных испытаниях иммуноглобулинов сибиреязвенных споровых адсорбированных, разработанных в Ставропольском НИПЧИ, с целью определения возможности их использования в практическом здравоохранении. 4.1. Определение специфической активности иммуноглобулинов диагностических флуоресцирующих сибиреязвенных споровых Испытуемые иммуноглобулины диагностические флуоресцирующие сибиреязвенные споровые адсорбированные, представляют собой меченую флуоресцеином-изотиоционатом иммуноглобулиновую фракцию к водорастворимому антигену споровой формы B. anthracis, выделенную из гипериммунной кроличьей сыворотки и адсорбированную на основе магноиммуносорбентов водорастворимыми антигенами штаммов B. cereus. Иммуноглобулины предназначены для обнаружения споровой формы В. anthracis в реакции иммунофлуоресценции в мазках из чистых культур, объектах окружающей среды (смывы, вода, почва, корма) и биологического материала (мясо животного происхождения). Изучение иммуноглобулинов сибиреязвенных споровых проводилось по разработанной Программе исследований, в том числе по физикохимическим свойствам; чувствительности; определению специфической рабочего активности разведения; идентифицированных штаммов B. anthracis и выявленных положительных проб объектов окружающей среды контаминированных; и биологического специфичности, продолжительности анализа (в часах). материала воспроизводимости, к а числу также 74 В результате проведенных исследований установлено, что испытуемый препарат представлял собой аморфную пористую массу желто-оранжевого цвета, после растворения – прозрачную опалесцирующую жидкость желтооранжевого цвета, рН – 8,0 (норма от 7,5 до 8,5). С целью изучения специфической активности иммуноглобулинов диагностических флуоресцирующих сибиреязвенных споровых адсорбированных нами были использованы 16 штаммов B. anthracis, в том числе B. anthracis М-164, B. anthracis М-165, B. anthracis М-166, B. anthracis С-611, B. anthracis С-914, B. anthracis С-1264, B. anthracis 10М, B. anthracis «лошадь», B. anthracis Ихтиман, B. anthracis 228/8, B. anthracis Sterne 34 F2, B. anthracis 55, B. anthracis СТИ-1, B. anthracis 3R, B. anthracis КМ-48 (М-29), B. anthracis 71/12, в концентрации 1,0х108 спор/мл (табл. 4.1). Все испытуемые штаммы были зашифрованы сотрудниками, не принимающими участия в приготовлении мазков и учете результатов. Таблица 4.1 Результаты специфической активности иммуноглобулинов диагностических флуоресцирующих сибиреязвенных споровых адсорбированных и теста на гемолиз № п/п Шиф р Название штамма B. anthracis С-611 B. anthracis С-914 B. anthracis С-1264 B. anthracis «лошадь» B. anthracis Ихтиман B. anthracis 228/8 B. anthracis 55 B. anthracis Sterne 34 F2 B. anthracis СТИ-1 B. anthracis М-165 B. anthracis М-166 B. anthracis 3R B. anthracis М-164 B. anthracis 71/12 B. anthracis 10М B. anthracis КМ-48 (М29) Примечание: -* отрицательный результат 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 10 7 1 9 14 20 16 18 26 2 5 33 6 27 4 35 1:8 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 3+ 2+ 3+ Разведения иммуноглобулинов 1:16 1:32 1:64 1:128 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 3+ 3+ 2+ 3+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 3+ 3+ 3+ 2+ 3+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 3+ 3+ 3+ 1+ 3+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 3+ 3+ 3+ 2+ 2+ 3+ Тест на гемолиз -* - 75 Результаты исследований оценивали с помощью люминесцентной микроскопии. Специфическим считали свечение с яркостью на 4 или 3 креста, свечение на 2 или 1 крест считали неспецифическим, что не учитывалось при оценке результатов. Нами проведен анализ результатов изучения специфической активности иммуноглобулинов сибиреязвенных споровых адсорбированных при исследовании различных штаммов B. anthracis в разведениях от 1:8 до 1:128. Полученные данные свидетельствуют о высокой специфической активности испытуемого препарата. Показано, что из 16 исследованных штаммов B. 15 anthracis штаммов (93,8±6,0 были %) выявлены иммуноглобулинами в разведениях 1:32-1:64 и оценивались по яркости свечения на 4 или 3 креста. Необходимо отметить, что 2 штамма (B. anthracis КМ 48 (М-29) и B. anthracis 71/12) из 16 исследуемых выявлялись испытываемым препаратом в начальном разведении 1:8 с результатом свечения на 3 креста, в то время как большинство штаммов (14) окрашивались данном разведением препарата на 4 креста. Из всех исследуемых штаммов обращает на себя внимание штамм B. anthracis 10М, иммуноглобулинами даже который в не выявлялся разведении 1:8, при что окрашивании подтверждается неспецифическим свечением, которое оценивалось на 2 креста. С споровых увеличением разведения адсорбированных иммуноглобулинов результаты показателей сибиреязвенных специфической активности существенно не изменились. Установлено, что из 16 штаммов B. anthracis, взятых в исследование, 15 штаммов в разведении 1:16 имели специфическое свечение в виде яркой флуоресценции зеленовато-желтого цвета на 4 или 3 креста. Штамм B. anthracis 10М даже в разведении иммуноглобулинов 1:16 не имел специфического свечения на 2 креста. Анализируя результаты исследования в зависимости от разведения иммуноглобулинов сибиреязвенных споровых адсорбированных необходимо 76 отметить, что с увеличением разведения постепенно снижается их специфическая активность по отношению к изучаемым штаммам B. anthracis, что подтверждается уменьшением яркости свечения окрашенных мазков в РИФ. Так, с применением испытываемого препарата в разведении 1:8 специфическое свечение на 4 креста отмечалось у 13 штаммов B. anthracis, в то же время в разведении 1:32 свечение на 4 креста выявлено у 11 штаммов. Специфическое свечение штаммов B. anthracis 3R и B. anthracis М-164 на 4 креста отмечали в разведении иммуноглобулина 1:8, а в разведениях 1:16 и 1:32 штаммы обнаруживались в РИФ со свечением на 3 креста. Проведенные исследования по изучению специфической активности иммуноглобулинов различным сибиреязвенных штаммам B. споровых anthracis адсорбированных показали, что к наиболее высокочувствительными иммуноглобулины явились к 9 исследуемым штаммам B. anthracis С-611, B. anthracis С-914, B. anthracis С-1264, B. anthracis «лошадь», B. anthracis Ихтиман, B. anthracis 228/8, B. anthracis Sterne 34 F2, B. anthracis 55 и B. anthracis СТИ-1. Полученные данные подтверждаются сверкающей флуоресценцией желто-зеленого цвета оболочки микробной клетки, четко контрастирующей с темным телом клетки в реакции иммунофлуоресценции, которая была оценена на 4 креста. Учитывая, что штаммы B. anthracis М-165 и М-166 выявлялись иммуноглобулинами в разведении от 1:8 до 1:64 на 4 креста, а в разведении 1:128 на 3 креста, были отнесены к высокочувствительным штаммам. Обращает на себя внимание окрашивание иммуноглобулинами штаммов B. anthracis, М- 164 и B. anthracis 71/12, которые в процессе исследования в зависимости от разведения препарата, выявлялись с оценкой свечения от 3 до 2 крестов. Наиболее низкая специфическая активность иммуноглобулинов диагностических флуоресцирующих сибиреязвенных споровых отмечалась в исследованиях со штаммом B. anthracis 10М. Даже в разведении 77 иммуноглобулинов 1:8 яркость свечения в реакции флюоресценции определялась на 2 креста. Таким образом, проведенными исследованиями было показано, что специфическая активность иммуноглобулинов сибиреязвенных споровых адсорбированных к штаммам B. anthracis оценивалась не равнозначно (3 или 4 креста). При этом выявлено, что 13 штаммов B. anthracis (81,2±9,8 %) из 16 исследуемых при окрашивании мазков исследуемыми иммуноглобулинами имели специфическое свечение на 4 креста. К высокочувствительным штаммам отнесены B. anthracis: B. anthracis С-611, B. anthracis С-914, B. anthracis С-1264, B. anthracis «лошадь», B. anthracis Ихтиман, B. anthracis 228/8, B. anthracis Sterne 34 F2, B. anthracis 55, B. anthracis СТИ-1, B. anthracis М-165, B. anthracis М-166, B. anthracis 3R и B. anthracis КМ-48 (М-29). Со средней чувствительностью к иммуноглобулинам можно отнести 2 штамма B. anthracis М-164, и B. anthracis 71/12, что составляет 12,5 % от общего количества. Отмечено, что специфическая активность испытуемых иммуноглобулинов в разведениях 1:8-1:128 со штаммом B. anthracis 10М была низкой. Данные результаты по исследованию специфической активности препарата отражены в диаграмме (рис. 4). Рис. 4. Результаты специфической активности иммуноглобулинов сибиреязвенных споровых адсорбированных к различным штаммам B. anthracis 78 Таким образом, из представленных данных следует, что из 16 штаммов B. anthracis, взятых нами в исследование, 2 штамма (B. anthracis М-164 и B. anthracis 71/12) не были выявлены в разведении иммуноглобулинов выше 1:64, а штамм B. anthracis 10М не был обнаружен испытываемым препаратом в РИФ. Для подтверждения принадлежности изучаемых культур микроорганизмов к виду B. anthracis проводили постановку теста на гемолиз (метод сравнения). Изучаемые культуры высевали на агар Хоттингера с 5 % дефибринированной кровью барана и инкубировали в термостате при температуре (35±1) оС в течение (20±2) ч, после чего учитывали результат. В тесте на гемолиз чистые культуры штаммов B. anthracis были идентифицированы в 100 % случаев. Сибиреязвенный микроб не лизировал эритроциты барана в отличие от большинства родственных спорообразующих сапрофитов, образующих широкую зону гемолиза вокруг выросших колоний. Все исследуемые штаммы B. anthracis не лизировали эритроциты барана. Нами проведены исследования по определению способности испытываемых иммуноглобулинов в рабочем разведении 1:64 выявлять в исследуемом материале возбудителя сибирской язвы в минимальной концентрации. Данный показатель был изучен на 5 штаммах: B. anthracis 228/8, B. anthracis Sterne 34 F2, B. anthracis СТИ-1, B. anthracis 71/12, B. anthracis КМ-48 (М-29). Каждый штамм был исследован в зависимости от концентрации микроорганизмов – от 1х104 до 1х108 спор/мл (табл. 4.2). Результаты оценивали с помощью люминесцентной микроскопии исследуемых препаратов с использованием иммуноглобулинов в разведении 1:64 по четырех крестовой схеме. Определение чувствительности препарата по способности выявлять в рабочем разведении минимальную концентрацию сибиреязвенного микроба в мазках из штаммов B. anthracis в концентрациях от 1х104 до 1х108 спор/мл, 79 позволило установить его высокую чувствительность. При просмотре 30 полей зрения в мазках наблюдали специфическое свечение с интенсивностью на 3-4 креста 1-2 и более микробных клеток B. anthracis в концентрации 5,0х105 спор/мл. Таблица 4.2 Результаты чувствительности иммуноглобулинов сибиреязвенных споровых адсорбированных Исследуемые концентрации штаммов B. anthracis 1х10 1х107 1х106 5х105 1х105 1х104 спор/мл спор/мл спор/мл спор/мл спор/мл спор/мл ≤10 > 10 ≤10 ≤10 спор ≤10 спор в 5 спор в спор в в 5 полях спор в B. anthracis полях 20 полях 30 полях зрения 30 1. 228/8 зрения зрения зрения на 4+ полях на 4+ на 4+ на 4+ зрения 4+ > 10 > 10 ≤10 -* B. anthracis спор в спор в спор в 2. Sterne 34 30 полях 20 полях поле F2 зрения зрения зрения на 4+ на 4+ на 4+ > 10 > 10 ≤10 ≤10 спор спор в спор в спор в в 10 B. anthracis 3. 30 полях 30 полях поле полях СТИ-1 зрения зрения зрения зрения на 3+ на 3+ на 3+ на 3+ > 10 > 10 ≤10 м в ≤10 спор спор в спор в поле в 10 B. anthracis 4. 30 полях 30 полях зрения полях 71/12 зрения зрения на 3+ зрения на 3+ на 3+ на 3+ > 10 > 10 ≤10 ≤10 спор B. anthracis спор в спор в спор в в 10 5. КМ-48 30 полях 20 полях поле полях (М-29) зрения зрения зрения зрения на 4+ на 4+ на 3+ на 3+ Примечание: -* отрицательный результат Номер п/п Название штамма 8 Важным этапом работы явилось изучение диагностической ценности иммуноглобулинов сибиреязвенных споровых адсорбированных при исследовании проб из объектов окружающей среды (смывы, корма, вода, почва) и биологического материала (мясо). По разработанной нами 80 Программе исследования иммуноглобулинов сибиреязвенных споровых проведены испытания их эффективности на базах профильных учреждений. Полученные результаты испытаний препарата показали, что в пробах объектов окружающей среды и биологического материала с помощью исследуемого препарата в рабочем разведении 1:64 возбудитель сибирской язвы выявлялся в 100 % случаев (табл. 4.5). Таким образом, диагностический препарат иммуноглобулины флуоресцирующие сибиреязвенные споровые адсорбированные в разведении 1:64 выявляет 93,8±6,0 % исследуемых штаммов B. anthracis, в пробах из объектов окружающей среды и биологического материала сибиреязвенный микроб обнаруживает в 100 % случаев, что позволяет его использовать для индикации при исследовании чистых культур, объектов окружающей среды и биологического материала в лабораторной диагностике сибирской язвы. 4.2. Изучение специфичности иммуноглобулинов диагностических флуоресцирующих сибиреязвенных споровых адсорбированных Для изучения специфичности испытуемых иммуноглобулинов сибиреязвенных споровых адсорбированных в работе использовались 33 штамма близкородственных спорообразующих сапрофитных микроорганизмов: B. anthracoides, B. cereus, B. megaterium, B.thuringiensis, B. subtilis. Отобранные нами для исследования штаммы были типичными по культурально-морфологическим, биохимическим и генетическим свойствам. Каждый опыт с близкородственными штаммами микроорганизмов проводили с соблюдением принципов строго контролируемого эксперимента. Специфическим считали свечение с яркостью на 4 или 3 креста, свечение с яркостью 2 или 1 крест считали неспецифическим и не учитывали. В результате проведенных испытаний установлено, что иммуноглобулины сибиреязвенные споровые адсорбированные обладают 81 различной степенью спорообразующим специфичности сапрофитным к микроорганизмам, близкородственным использованных в исследованиях. Полученные данные представлены в табл. 4.3. Таблица 4.3 Результаты изучения специфичности иммуноглобулинов сибиреязвенных споровых адсорбированных № п/п Шифр Название штамма 1:8 1. 46 B. cereus ИНА 3+ 2. 43 B. cereus 16 2+ 3. 30 B. cereus 104 2+ 4. 32 B. cereus 108 5. 22 B. cereus 8 6. 13 B. cereus 96 2+ 7. 11 B. cereus 1 8. 3 B. cereus 688 В 3+ 9. 8 B. cereus 504 1+ 10. 45 B. megaterium 5 11. 50 B. megaterium 89 12. 36 B. megaterium 3 2+ 13. 31 B. megaterium 654 14. 17 B. megaterium 1 15. 12 B. megaterium 2 16. 23 B. thuringiensis 1 2+ 17. 34 B. thuringiensis 2 18. 51 B. thuringiensis 5 19. 44 B. thuringiensis 3 20. 47 B. thuringiensis 4ав 1+ 21. 21 B. subtilis 33 1+ 22. 24 B. subtilis 35 23. 25 B. subtilis 36 24. 37 B. subtilis 37 25. 28 B. subtilis 3 26. 19 B. subtilis 38 27. 38 B. subtilis 83 28. 48 B. subtilis 168 1+ 29. 40 B. anthracoides 430 2+ 30. 29 B. anthracoides 27 31. 49 B. anthracoides 449 32. 42 B. anthracoides 80 2+ 33. 15 B.anthracoides 1312 3+ Примечание: -* отрицательный результат Разведение иммуноглобулинов 1:16 3+ 2+ 2+ 2+ 3+ 1+ 1+ 2+ 1+ 1+ 1+ 2+ 2+ 3+ 1:32 2+ -* 1+ 3+ 1+ 2+ 1:64 2+ 3+ - 1:128 3+ - Тест на гемолиз + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 82 В результате проведенных исследований по изучению специфичности иммуноглобулинов по отношению к близкородственным спорообразующим сапрофитным штаммам микроорганизмов специфичность испытываемого Bacillus препарата. Из 33 выявлена высокая близкородственных штаммов, взятых в исследование, зарегистрировано яркое флуоресцирующее свечение желто-зеленого цвета на 3 креста только с одним штаммом B. cereus 688В. В связи с этим специфичность иммуноглобулинов составила 96,9±3,1 %. Анализируя данные, полученные по специфической активности и специфичности иммуноглобулинов сибиреязвенных споровых адсорбированных, можно сделать заключение, что препарат обладает высокой специфической активностью, так как из 16 штаммов B. anthracis, взятых в исследование, в разведении 1:64 выявлены 15 штаммов (93,8±6,0 %) B. anthracis. В отношении близкородственных штаммов, специфичность иммуноглобулинов также была высокой и составила 96,9±3,1 % (рис. 5). Рис. 5. Результаты специфической активности и специфичности иммуноглобулинов сибиреязвенных споровых адсорбированных Исследование близкородственных спорообразующих культур сапрофитных микроорганизмов проводили в постановке теста на гемолиз (метод сравнения). Для этого 32 штамма рода Bacillus высевали на агар 83 Хоттингера с 5 % дефибринированной кровью барана. Результат учитывали через (20±2) ч инкубирования в термостате при температуре (35±1) оС. Установлено 100 % наличие зон гемолиза эритроцитов барана при посеве исследуемых штаммов спорообразующих сапрофитов на агаровые пластины в чашках Петри (табл. 4.3). При сравнительном использованием штаммов анализе результатов B. anthracis и данного теста с близкородственных спорообразующих сапрофитов показано разное отношение указанных штаммов по отношению к эритроцитам барана, добавленных к агару Хоттингера (рис. 6). Рис. 6 Результаты сравнительного анализа теста на гемолиз штаммов B. anthracis и близкородственных микроорганизмов Как видно из данных, представленных на рис. 6, результаты теста на гемолиз со штаммами B. anthracis были отрицательными, зоны лизиса ни с одним штаммом данного вида не были зафиксированы. В то время как, близкородственные спорообразующие сапрофиты образовывали зоны гемолиза в 100% случаев. Принимая во внимание вышеизложенное, можно сделать вывод о высокой специфичности иммуноглобулинов флуоресцирующих 84 сибиреязвенных споровых к близкородственным спорообразующим штаммам микроорганизмов, за исключением штаммов B. cereus ИНА, B. cereus 688 В. С целью изучения воспроизводимости результатов с помощью иммуноглобулинов сибиреязвенных споровых нами было проведено исследование штамма B. anthracis СТИ-1 (положительный результат) и штамма B. cereus 16 (отрицательный результат) в 10 повторностях. Исследования проводили в разные дни и разными исполнителями, при этом все штаммы микроорганизмов были зашифрованы (табл. 4.4). Таблица 4.4 Результаты изучения воспроизводимости иммуноглобулинов сибиреязвенных споровых Номер п/п Шифр Разведения иммуноглобулинов Название штамма 1. 53 B. anthracis СТИ-1 2. 70 B. anthracis СТИ-1 3. 61 B. anthracis СТИ-1 4. 58 B. anthracis СТИ-1 5. 67 B. anthracis СТИ-1 6. 68 B. anthracis СТИ-1 7. 59 B. anthracis СТИ-1 8. 56 B. anthracis СТИ-1 9. 69 B. anthracis СТИ-1 10. 62 B. anthracis СТИ-1 11. 66 B. cereus 16 12. 54 B. cereus 16 13. 57 B. cereus 16 14. 63 B. cereus 16 15. 65 B. cereus 16 16. 55 B. cereus 16 17. 71 B. cereus 16 18. 64 B. cereus 16 19. 60 B. cereus 16 20. 52 B. cereus 16 Примечание: -* отрицательный результат 1:8 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 1+ 1+ 1+ 1+ 1+ 1+ 1+ 1+ - 1:16 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 1+ 1+ 1+ 1+ 1+ 1+ 1+ 1+ - 1:32 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ -* - 1:64 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ - 1:128 4+ 3+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 3+ 4+ 4+ - Как видно из представленных в таблице данных, воспроизводимость совпадения результатов исследования как штаммов B. anthracis СТИ-1, так и штаммов B. cereus 16 при 10-кратном повторении составила 100 %. 85 Показатель воспроизводимости является критерием стабильности специфической активности, специфичности и эксплуатационных свойств иммуноглобулинов диагностических флуоресцирующих сибиреязвенных споровых адсорбированных, что объективно доказывает достоверность полученных результатов. Анализ результатов специализированных исследований, лабораторий проведенных профильных на базах учреждений по разработанным нами Программам исследований проб объектов окружающей среды (смывы, вода, почва, корма) и биологического материала (мясо), контаминированных высокую близкородственными специфическую активность и микроорганизмам специфичность показал испытуемого препарата (табл. 4.5). Таким образом, проведенные испытания показали высокую диагностическую ценность иммуноглобулинов флуоресцирующих сибиреязвенных споровых адсорбированных, обеспечивающих специфическое свечение штаммов B. anthracis в споровой форме в мазках из чистых культур, биологического материала и объектов внешней среды и не вызывающих специфического свечения со штаммами близкородственных микроорганизмов. Показано, что метод флуоресцирующих антител с использованием иммуноглобулинов сибиреязвенных споровых адсорбированных имеет преимущество перед тестом на гемолиз, так как бактериологический метод более трудоемкий и длительнее по времени получения результатов. Приведенные временные затраты с использование иммуноглобулинов в РИФ (табл. 4.5) значительно меньше, чем при проведении исследований бактериологическим методом, что особенно важно при обнаружении возбудителя сибирской биологического материала. язвы из объектов окружающей среды и 86 Отмечено, что во всех случаях при исследовании контаминированных близкородственными микроорганизмами проб были получены отрицательные результаты. Таблица 4.5 Результаты исследований иммуноглобулинов флуоресцирующих сибиреязвенных споровых адсорбированных № п/п 1 2 3 4 5 6 Количество проб Показатели Чувствительность (минимальное количество спор B. anthracis, выявляемое в РИФ), Специфическая активность (процент правильно идентифицированных штаммов B. anthracis), M±m % Специфичность (процент отрицательных результатов с близкородственными микроорганизмами), % Выявляемые штаммы B. anthracis в пробах объектов окружающей среды, M±m % Отрицательные результаты с близкородственными микроорганизмами в пробах объектов окружающей среды, M±m % Скорость учета результатов (с учетом подготовки всех материалов), часах Результаты иммуноглобулины тест на флуоресцирующие гемолиз в разведении 1:64 5 5,0х105 спор/мл –* 16 93,8±6,0 100,0 32 96,9±3,1 100,0 225 100,0 – 225 100,0 – чистые культуры 20 20 объекты внешней среды, биологическ ий материал 2,5-3 40 Примечание: –* не предусмотрено методом Полученные нормативной данные документации позволили на внести изменения иммуноглобулины в проект сибиреязвенные флуоресцирующие споровые адсорбированные, касающиеся уточнения назначения препарата. Существенные изменения были внесены в методику обеззараживания мазков при приготовлении их из спорообразующих микроорганизмов. При оценке качества поступивших первых серий 87 сибиреязвенных споровых иммуноглобулинов на соответствие препарата требованиям проекта нормативной документации было выявлено, что иммуноглобулины, даже в разведении 1:16 (норма не менее 1:16), не вызывали специфического свечения сибиреязвенных штаммов. При этом по данным авторов, иммуноглобулины выявляли штаммы сибиреязвенного микроба в разведении 1:128. При выяснении причин расхождения по вопросу определения рабочего разведения препарата было установлено, что обеззараживание мазков, приготовленных из сибиреязвенных штаммов, авторы проводили без соблюдения требований, предусматривающих СП 1.3.1285-03. В процессе нашей работы мазки обеззараживали способом, который предусматривает обязательное добавление к спирту перекиси водорода. В дальнейшем были проведены дополнительные исследования на этапе приготовления мазков, заключающиеся в промывке стекол с мазками после их обеззараживания в дистиллированной воде в течение 5 мин. Проведенные исследования послужили основанием для внесения в проект нормативной документации дополнений по приготовлению мазков. Таким образом, в результате проведенных исследований установлена высокая специфическая активность иммуноглобулинов сибиреязвенных споровых, обеспечивающих специфическое зеленовато-желтое свечение штаммов B. anthracis в споровой форме в мазках из чистых культур, биологического материала и объектов внешней среды. Чувствительность препарата по результатам всех исследований установлена от 5,0х10 5 до 1х106 спор/мл. Показана диагностическая равноценность иммуноглобулинов и теста на гемолиз при исследовании специфической активности и специфичности и их преимущество по времени получения результатов. Учитывая вышеизложенное иммуноглобулины сибиреязвенные споровые могут быть использованы для специфической индикации при исследовании чистых культур, материала из объектов внешней среды и биологического материала в практике лабораторной диагностики сибирской язвы различных учреждений. 88 Глава 5. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ДИАГНОСТИЧЕСКОЙ ЦЕННОСТИ СИБИРЕЯЗВЕННОГО БАКТЕРИОФАГА ГАММА А-26 В настоящее время диагностика сибирской язвы осуществляется в соответствии с требованиями МУК 4.2.2413-08 «Лабораторная диагностика и обнаружение возбудителя сибирской язвы» и МУК 4.2. 2941-11 «Порядок организации и проведения лабораторной диагностики сибирской язвы для лабораторий территориального, регионального и федерального уровней», в которых одним из опорных тестов, позволяющих идентифицировать штаммы B. аnthracis, является лизабельность бактериофагом. Определение лизабельности выделенных культур специфическим бактериофагом многие исследователи считают одним из наиболее надежных, быстрых и простых методов идентификации штаммов B. anthracis [1, 51, 81]. Особую ценность приобретает этот метод при выявлении атипичных по капсулообразованию, вирулентности и биохимическим свойствам штаммов сибиреязвенного микроба. По данным А.Г. Рязановой с соавт., (2010 г.) частота выделения атипичных штаммов возбудителя сибирской язвы приблизительно равна частоте выделения штаммов, ошибочно идентифицированных как B. aпthracis. Это объясняется общностью свойств B. aпthracis (до 90 % гомологичных совпадений) с близкородственными микроорганизмами рода Bacillus, что значительно затрудняет их идентификацию. До проведения настоящих исследований в Российской Федерации отсутствовал зарегистрированный сибиреязвенный бактериофаг. Вместе с тем решение вопроса по обеспечению лабораторной диагностики особо опасных инфекционных болезней зарегистрированными препаратами было заложено в Федеральной целевой программе «Национальная система химической и биологической безопасности Российской Федерации» (2009 – 2013 годы). В ходе ее реализации, помимо разработки современных средств 89 диагностики, предусмотрена регистрация экспериментальных диагностических препаратов. Специалистами Ставропольского НИПЧИ предложен бактериофаг Гамма А-26, представляющий собой стерильный фильтрат фаголизата бульонной культуры сибиреязвенного штамма B. aпthracis 228/8, содержащий взвесь частиц фага Гамма А-26, они обладают лизирующем действием в отношении типичных штаммов B. aпthracis по культуральноморфологическим и биохимическим свойствам, а также различающихся по фенотипическим и генотипическим свойствам. Препарат предназначен для идентификации штаммов B. aпthracis. Учитывая вышеизложенное, диагностической ценности целью (диапазон работы явилось литической изучение активности, специфичность, воспроизводимость) сибиреязвенного бактериофага Гамма А-26. 5.1. Изучение диапазона литической активности сибиреязвенного бактериофага Гамма А-26 Диапазон литической активности сибиреязвенного бактериофага Гамма А-26 изучали в сравнении с бактериофагом диагностическим сибиреязвенным Fah ВНИИВВиМ, используемым в ветеринарной практике. Диапазон литической активности бактериофага Гамма А-26 оценивали по проценту выявления испытываемым препаратом различных штаммов B. aпthracis. Результаты учитывали по четырехкрестовой схеме: 4 креста – сливной (полный) лизис культур с прозрачным дном литического пятна, 3 креста – прозрачное пятно с единичными колониями вторичного роста в месте нанесения фага, 2 креста – прозрачное пятно лизиса со значительным вторичным ростом, 1 крест – полупрозрачное слабо заметное пятно лизиса культуры. Положительной считали пробу при результатах реакции не менее, чем на 3 креста. 90 Изучаемые штаммы прошли независимую процедуру шифрования сотрудниками, не принимающими участия в исследовании и учете результатов. бактериофагов Каждый Гамма штамм А-26 изучали и с Fah помощью сибиреязвенных ВНИИВВиМ. Исследование микроорганизмов с помощью бактериофага Гамма А-26 проводили в соответствии с разработанной Программой, включающей подбор штаммов B. aпthracis и близкородственных микроорганизмов; выбор препарата сравнения; показатели (М±m % идентифицированных штаммов B. anthracis к числу исследованных, М±m % отрицательных результатов при исследовании близкородственных микроорганизмов; совпадение результатов исследования положительных и отрицательных проб, каждая в 10 повторностях, при постановке анализа в разные дни и разными специалистами; четкость реакции, выраженной в степени лизиса бактериофагами штаммов B. anthracis или близкородственных микроорганизмов; продолжительность анализа в часах с учетом подготовки материалов), по которым определялась диагностическая ценность препарата. Постановку пробы с использованием бактериофага Fah ВНИИВВиМ проводили согласно инструкции по его применению. При оценке внешнего вида бактериофагов Гамма А-26 и Fah ВНИИВВиМ контрольного препарата установлено, что препараты представляли собой прозрачную жидкость светло-желтого цвета. Бактериофаг Гамма А-26 имел рН 6,6 и содержал 4,7х109 фаговых частиц/мл, что соответствовало требованиям нормативной документации. Препарат сравнения имел рН 7,1 и содержал 1,2х109 фаговых частиц/мл. В работе было изучено 47 штаммов B. anthracis, в том числе типичные по культурально-морфологическим и биохимическим свойствам, а также различающиеся по генотипическим свойствам. При визуальном просмотре участков нанесения бактериофагов и культур исследуемых штаммов B. anthracis на чашках Петри нами проведен 91 учет результатов литической активности исследуемого бактериофага и препарата сравнения через (5 1) ч (предварительный учет) и через (18±2) ч (окончательный учет) инкубирования посевов при температуре (36±1) оС. Полученные результаты свидетельствовали о широком диапазоне спектра литической активности бактериофага Гамма А-26. Показано, что при окончательном учете результатов из 47 исследованных штаммов B. anthracis 46 штаммов (97,9±2,1 %) лизировались препаратом. При этом, как видно из представленных данных (табл. 5.1), штаммы В. anthracis отличались по чувствительности к бактериофагу Гамма А-26 в зависимости от времени учета результатов. Показано, что с помощью испытываемого бактериофага при предварительном просмотре и окончательном учете результатов полный лизис культур (4 креста) отмечался у 42 штаммов В. anthracis. Таблица 5.1 Результаты изучения специфической активности бактериофагов сибиреязвенных Гамма А-26 и Fah ВНИИВВиМ № Название штамма п/п 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. В. anthracis М-164 В. anthracis М-165 В. anthracis М-166 В. anthracis С-611 В. anthracis С-1264 В. anthracis 10М В. anthracis «лошадь» В. anthracis Ихтиман В. anthracis 228/8 В. anthracis Sterne 34 В. F2 anthracis 55 В. anthracis 3R В. anthracis КМ-48 В. anthracis 71/12 (29) В. anthracis С-914 В. anthracis СТИ-1 В. anthracis 401 В. anthracis 402 В. anthracis 34F2 Степень лизиса бактериофагами Гамма А-26 Fah ВНИИВВиМ учет через учет через учет через учет через (5±1) ч (18±2) ч (5±1) ч (18±2) ч 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 3+ 4+ 3+ 3+ 3+ 3+ 3+ 4+ 1+ 4+ 4+ 4+ 4+ 3+ 4+ 4+ 3+ 4+ 4+ 4+ 3+ 4+ 92 Продолжение табл. 5.1 20. 21. 22. 23. 24. 25. 26. 27. 28. В. anthracis 220 В. anthracis 71/12 В. anthracis М-29 В. anthracis 228/8 В. anthracis 228 В. anthracis Ч-7 В. anthracis Ames В. anthracis V-770 В. anthracis №1 4+ 4+ 4+ 3+ 4+ 4+ 4+ 2+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 2+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 3+ 4+ 4+ 3+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 29. 30. 31. 32. 33. 34. 35. 36. 37. 38. 37. 38. 39. 40. 41. 42. 43. 44. 45. 46. 47. В. anthracis №5 В. anthracis 81/1 В. anthracis 174 В. anthracis Ланге 1 В. anthracis Ланге 2 В. anthracis ПС-1 В. anthracis ПС-2 В. anthracis ПС-4оm В. anthracis И-9 В. anthracis И-29 В. anthracis И-45 В. anthracis И-47 В. anthracis И-63 В. anthracis Т-271 В. anthracis И-319 В. anthracis И-345 В. anthracis И-358 В. anthracis И-359 В. anthracis И-361 В. anthracis С-1264 В. anthracis 10М 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 3+ 3+ 3+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 3+ 3+ 3+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ Установлено, что при предварительном просмотре штаммы В. anthracis СТИ-1, В. anthracis 228/8, В. anthracis V-770 через (5±1) ч лизировались бактериофагом Гамма А-26 только на 3 креста, так как наблюдалось прозрачное пятно с единичными колониями вторичного роста в месте нанесения фага. При окончательном учете результатов отмечалось лизирование штаммов изучаемым бактериофагом на 4 креста (прозрачное дно литического пятна). Необходимо также отметить, что штамм В. anthracis С-914 при предварительном и окончательном учете результатов лизировался 93 препаратом на 3 креста. В то же время при предварительном и окончательном учете результатов было установлено, что штамм В. anthracis ПС-4оm лизировался бактериофагом Гамма А-26 на 2 креста, так как на месте нанесения культуры и бактериофага имелось прозрачное пятно лизиса со значительным вторичным ростом. В этом случае проба с бактериофагом оценивалась как отрицательная. В связи с этим для полной идентификации штамма следует проводить дополнительные исследования, предусмотренные нормативными документами. Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что при идентификации большинства исследуемых штаммов с помощью сибиреязвенного бактериофага Гамма А-26, уже при просмотре посевов через (5±1) ч, можно сделать предварительное заключение о возможной их принадлежности к виду В. anthracis. Определение диапазона литической активности препарата сравнения бактериофага Fah ВНИИВВиМ проводили одновременно с использованием тех же штаммов B. anthracis. Результаты, полученные при окончательном учете, позволили выявить широкий диапазон литического спектра препарата сравнения. Лизис исследуемых культур на 4 креста по предварительному через (5±1) ч и окончательному учету (18±2) ч наблюдался у 38 штаммов В. anthracis. Следует отметить, что штаммы В. anthracis С-914, В. anthracis И-9, В. anthracis ПС-2 и при предварительном, и при окончательном учете результатов лизировались препаратом сравнения на 3 креста. При изучении литической активности бактериофага Fah ВНИИВВиМ со штаммами В. anthracis 71/12 и В. anthracis СТИ-1 установлено, что при предварительном учете результатов зоны лизиса были оценены на 3 креста и 1 крест соответственно; при окончательном учете результатов в обоих случаях отмечалась зона лизиса бактериофагом сибиреязвенных штаммов, оцениваемая на 4 креста. Fah ВНИИВВиМ 94 В результате проведенных испытаний внесены изменения в методику нанесения культуры на чашки Петри при постановке пробы с бактериофагом, а именно, предложено растирать каплю культуры бактериологической петлей до диаметра 1-1,5 см для получения более четкого литического пятна. При проведении контроля по методике, описанной в проекте ТУ, при нанесении капли культуры без ее растирания, невозможно было определить степень лизиса. Анализ результатов исследований, проведенных в специализированных лабораториях различных профильных учреждений по разработанной Программе исследования диагностической ценности препарата также показал, что бактериофаг Гамма А-26 имеет широкий диапазон литического действия по отношению к штаммам сибиреязвенного микроба, которые лизировались в 97,9±2,1 % случаев на 3-4 креста. Обобщенные данные также свидетельствуют о диагностической равноценности двух сравниваемых бактериофагов - Гамма А-26 и Fah ВНИИВВиМ (табл. 5.3). Таким образом, проведенные исследования показали, что широта диапазона литического спектра диагностических сибиреязвенных бактериофагов Гамма А-26 и Fah ВНИИВВиМ со штаммами В. anthracis у обоих препаратов была высокой и достоверно не различалась. Испытываемый бактериофаг Гамма А-26 лизировал 97,9±2,1 % штаммов B. anthracis из 47 исследованных. В то время как, процент правильно идентифицированных культур штаммов B. anthracis к числу исследованных с помощью препарата сравнения составил 89,4±4,5 %. Продолжительность анализа с учетом подготовки исследуемых культур составила 28-30 ч. Было отмечено, что через (5 1) ч учет результатов ни в одном случае не вызывал затруднений. При этом было выявлено, что бактериофаг Гамма А-26 превосходил препарата сравнения по четкости лизиса и размеру литического пятна со штаммами B. anthracis. 95 5.2. Оценка специфичности сибиреязвенного бактериофага Гамма А-26 Для определения специфичности испытываемого бактериофага Гамма А-26 в работе спорообразующих использовались сапрофитных 72 штамма близкородственных микроорганизмов, в том числе B. anthracoides 7 штаммов; B. cereus 26 штаммов; B. megaterium 10 штаммов; B. thuringiensis 12 штаммов и B. subtilis 17 штаммов. Отобранные для исследования штаммы были типичными по культурально-морфологическим и биохимическим свойствам. Каждый опыт с близкородственными штаммами микроорганизмов проводили с соблюдением принципов строго контролируемого эксперимента. Результаты учитывали через (5 1) ч (предварительный учет) и через (18±2) ч (окончательный учет) после инкубирования при температуре (36±1) оС путем визуального просмотра в чашках Петри участков нанесения культуры исследуемого штамма и бактериофага. Лизис оценивали также как и при определении специфической активности препарата по четырехкрестовой системе. В результате проведенных испытаний установлено (табл. 5.2), что диагностическая ценность испытываемого бактериофага Гамма А-26 и бактериофага Fah ВНИИВВиМ в пробах с близкородственными микроорганизмами была равноценна и весьма высока. Изучение специфичности бактериофага Гамма А-26 по разработанной Программе исследований лабораториях различных также было учреждений проведено в независимых здравоохранения, что дало возможность получить более объективные и достоверные результаты. На основании полученных бактериофагов в данных отношении по 72 изучению литического штаммов действия близкородственных микроорганизмов установлено, что 69 штаммов были резистентны к сибиреязвенному бактериофагу Гамма А-26, а два штамма B. cereus и один 96 штамм B. subtilis var. mesentericus лизировались испытываемым препаратом. Бактериофаг Fah ВНИИВВиМ не лизировал 71 штамм близкородственных микроорганизмов и лизировал штамм B. subtilis var. mesentericus. Таблица 5.2 Результат сравнительного изучения спектра литической активности сибиреязвенных бактериофагов Гамма А-26 и Fah ВНИИВВиМ на штаммах близкородственных микроорганизмов № Название штамма п/п 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. 24. 25. 26. 27. 28. 29. 30. 31. 32. 33. 34. В. anthracoides 1312 В. anthracoides 27 В. anthracoides 430 В. anthracoides 449 В. anthracoides 80 В. anthracoides 6 В. anthracoides 25 В. cereus 8 В. cereus 96 В. cereus 504 В. cereus 1 В. cereus 2 В. cereus 688В В. cereus 104 В. cereus 108 В. cereus 16 В. cereus 504 Т В. cereus 690 В. cereus № 4557 В. cereus № 1793 В. cereus № 1 В. cereus № 791 В. cereus № 792 В. cereus № 687 В. cereus № 160 В. cereus № 8035 В. cereus № 5006 В. cereus № 1565 В. cereus № 1477 В. cereus № 782 В. cereus № 164 В. cereus № 217 В. cereus № 412 В. megaterium 3 Степень лизиса бактериофагами Гамма А-26 Fah ВНИИВВиМ учет через учет через учет через учет через (5±1) ч (18±2) ч (5±1) ч (18±2) ч 1+ 1+ 4+ 3+ 4+ 3+ - 97 Продолжение табл. 5.2 35. 5. 36. 37. 38. 39. 40. 41. 42. 43. 44. 45. 46. 47. 48. 49. 50. 51. 52. 53. 54. 55. 56. 57. 58. 59. 60. 61. 62. 63. 64. 65. 66. 67. 68. 69. 70. 71. 72. В.3megaterium 654 В. megaterium 1 В. megaterium 2 В. megaterium 5 В. megaterium 89 В. megaterium 512Т В. megaterium № 5 В. megaterium № 6 В. megaterium № 654 В. subtilis 168 В. subtilis 83 В. subtilis 3 В. subtilis 36 В. subtilis 37 В. subtilis 35 В. subtilis 34 В. subtilis 38 В. subtilis 830 В. subtilis 412 В. subtilis 33 В. subtilis № 963 В. subtilis № 137 В. subtilis № 168 В. subtilis var. niger В. subtilis var. mesentericus № 66 В. subtilis № 35 В. thuringiensis 1 В. thuringiensis 2 В. thuringiensis 3 В. thuringiensis 4ав В. thuringiensis 5 В. thuringiensis 49 В. thuringiensis 2002 В. thuringiensis № 21 В. thuringiensis № 5 В. thuringiensis № 1373 В. thuringiensis № EG7566 В. thuringiensis finitimus PT 9141 №106 1+ 1+ 1+ 1+ 3+ 1+ 1+ 1+ 3+ 3+ 1+ 1+ 3+ - - - - - - - - - - - - Результаты определения литической активности и специфического действия исследуемых бактериофагов отражены на рисунке 7. 98 Рис. 7. Результаты определения литической активности и специфического действия бактериофагов Гамма А-26 и Fah ВНИИВВиМ Таким образом, в результате проведенных расширенных исследований на различных лабораторных базах установлено, что специфичность бактериофага сибиреязвенного Гамма А-26 достаточно высока и составила 95,8±2,36 %, контрольного – 98,6±1,38 % (табл. 5.3). При этом было отмечено, что четкость лизиса и размер литического пятна бактериофага Гамма А-26 со штаммами B. anthracis был визуально больше, чем у бактериофага Fah ВНИИВВиМ. Различие в результатах определения фагочувствительности штаммов, по нашему мнению, можно объяснить тем, что сибиреязвенные бактериофаги различаются по широте диапазона действия к штаммам возбудителя сибирской язвы, а также по специфичности их действия. Помимо этого, на изменения фенотипа сибиреязвенных штаммов может оказывать влияние, например, смена среды культивирования и др. 99 Таблица 5.3 Результаты определения диагностической ценности бактериофага сибиреязвенного Гамма А-26 и бактериофага Fah ВНИИВВиМ № п/п Показатели 1. Процент идентифицированных штаммов B. anthracis к числу исследованных, M±m % 2. 3. 4. КолиРезультаты чество бактериофаг сибиреязвенный штам- диагностический бактериофаг мов сибиреязвенный Fah ВНИИВВиМ Гамма А-26 Процент отрицательных результатов при исследовании близкородственных микроорганизмов, M±m % Воспроизводимость – процент совпадений результатов исследования положительных и отрицательных проб, M±m % Время учета результатов, процент правильности идентификации штаммов, (%) Поэтому феномены р 47 97,9±2,1 89,4 ±4,5 0,48 72 95,8 ±2,36 98,6 ±1,38 0,35 20 100,0 100,0 119 5 1ч 5 1ч предварительный предварительный учет, 100,0 учет, 100,0 18±2 ч 18±2 ч окончательный окончательный учет, учет, 100,0 100,0 чувствительности и фагорезистентности представляют интерес не только с точки зрения надежности теста фаголизабельности при идентификации сибиреязвенных культур, но и как основа метода выявления штаммов B. anthracis с разной чувствительностью к действию бактериофагов [1, 86]. Для изучения воспроизводимости результатов с помощью исследуемого бактериофага сибиреязвенного Гамма А-26 использовались штаммы B. anthracis СТИ-1 и B. cereus 16 (табл. 5.4). При постановке теста с помощью испытываемого бактериофага со штаммами B. anthracis и B. cereus в 10 повторностях в разные дни и разными исполнителями во всех случаях установлено совпадение результатов как с фагочувствительным, так и с фагорезистентным штаммами. Учет результатов 100 не вызывал затруднений ни в одном случае как при окончательном, так и при предварительном просмотре чашек с посевами. Через (5 1) ч инкубации на месте нанесения культуры с бактериофагом пятна лизиса были полупрозрачными или полностью прозрачными. Через (18 2) ч отмечался полный лизис культур с прозрачным дном литического пятна или с единичными колониями вторичного роста. Таблица 5.4 Воспроизводимость результатов исследований с помощью бактериофага диагностического сибиреязвенного Гамма А-26 № Шифр Название штамма 52 54 57 58 62 65 67 68 69 70 53 55 56 59 60 61 63 64 66 71 B. anthracis СТИ-1 B. anthracis СТИ-1 B. anthracis СТИ-1 B. anthracis СТИ-1 B. anthracis СТИ-1 B. anthracis СТИ-1 B. anthracis СТИ-1 B. anthracis СТИ-1 B. anthracis СТИ-1 B. anthracis СТИ-1 B. cereus 16 B. cereus 16 B. cereus 16 B. cereus 16 B. cereus 16 B. cereus 16 B. cereus 16 B. cereus 16 B. cereus 16 B. cereus 16 п/п 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19 20. Таким образом, Воспроизводимость результатов с применением бактериофага Гамма А-26 учет через 5±1 ч учет через 18±2 ч показатели 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ - воспроизводимости 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ 4+ - результатов исследования в 10 повторностях со штаммом B. anthracis СТИ-1 (положительный результат) и со штаммом B. cereus 16 (отрицательный 101 результат) свидетельствует о стабильности препарата и хороших его эксплуатационных и качественных характеристиках. Проведенные исследования позволили установить достаточно высокую информативность нового препарата. Вместе с тем следует отметить, что фаголизабельность не является строго специфичным видовым признаком, так как возбудитель сибирской язвы входит в группу близкородственных бацилл и имеет ряд общих свойств с другими ее представителями. В связи с этим выделяемые штаммы, не лизирующиеся сибиреязвенным бактериофагом, но по некоторым признакам соответствующие сибиреязвенному микробу, требуют дополнительных исследований. У всех выделенных культур, подозрительных на принадлежность к возбудителю сибирской язвы, должны определяться свойства, характеризующие их видовую принадлежность, а при необходимости, изучаться и дополнительные свойства. Метод изучения чувствительности испытуемых штаммов к лизирующему действию сибиреязвенного бактериофага Гамма А-26 является технически простым, информативным и легко воспроизводимым, что подтверждают проведенные эксперименты. Полученные данные явились основанием для внесения изменений в нормативную документацию. В проект Технических условий внесены изменения в методику постановки пробы для определения литической активности и специфичности бактериофага. С этой целью для получения более четкого литического пятна рекомендовано растирать исследуемую культуру на агаровой пластинке диаметром до 1,5 см. В Инструкцию по применению бактериофага Гамма А-26 внесено дополнение: «Ввиду наличия генетического родства сибиреязвенного микроба с другими представителями рода Bacillus, допускается лизис близкородственных штаммов не более, чем у 5 % от числа исследуемых». В связи с этим применение сибиреязвенного бактериофага должно 102 использоваться в комплексе с другими методами идентификации микрооорганизмов рода Bacillus. Таким образом, в результате проведенных нами исследований, показана возможность использования бактериофага Гамма А-26 для идентификации штаммов B. anthracis в вегетативной форме в лабораторной диагностике сибирской язвы. Исследование фаголизабельности культуры наряду с методами индикации (МФА, ПЦР) и другими идентификационными тестами (обнаружение капсулы in vitro, чувствительность к пенициллину и т.д.) позволит объективно и своевременно обнаружить возбудителя сибирской язвы. 103 ЗАКЛЮЧЕНИЕ Сибирская язва относится к особо опасным инфекциям со своеобразным инфекционным циклом, который предполагает обязательный внеорганизменный этап споруляции возбудителя [4, 131, 156]. Одной из главных причин неблагополучия по сибирской язве является способность возбудителя образовывать во внешней среде устойчивые споры, которые могут годами сохранять жизнеспособность и патогенные свойства, что обуславливает не только дальнейшее пребывание возбудителя в анабиотическом состоянии, но и, возможность, размножаться и накапливаться в почве [23, 85, 110]. В последние годы, когда существенно возросли риски техногенных и природных катастроф (землетрясения, цунами, извержения вулканов, засуха, наводнение и т.п.), эпидемиологическая обстановка по сибирской язве прогнозируется как неблагополучная, поскольку высока вероятность вскрытия сибиреязвенных скотомогильников, что способствует осложнению эпидемической ситуации [37, 58, 60, 68]. Не исключена возможность попадания животных, сырья и продуктов животноводства, контаминированных спорами возбудителя сибирской язвы, на территорию Российской Федерации [78, 91, 109]. Учитывая вышеизложенное, вопрос своевременного выявления B. anthracis является весьма актуальным. При этом возникает острая необходимость в проведении лабораторной диагностики стандартными препаратами, предназначенными для обнаружения и идентификации возбудителя сибирской язвы в различных объектах окружающей среды и биологическом материале. Основными методами индикации возбудителя сибирской язвы, являются экспресс-методы (МФА, ПЦР, ИФА, РНГА). Из современных методов серологической диагностики сибирской язвы наиболее быстрым и информативным методом является метод флуоресцирующих антител (МФА), 104 обеспечивающий обнаружение возбудителя сибирской язвы на ранних этапах диагностики [10, 67, 80, 151]. Положительные результаты, полученные с помощью реакции иммунофлуоресценции, позволяют сделать предварительный вывод о наличии возбудителя сибирской язвы или его антигенов в исследуемом окружающей среды биологическом и материале своевременно или начать объектах проведение противоэпидемических, профилактических и терапевтических мероприятий. Одним из важных тестов, позволяющих идентифицировать штаммы B. аnthracis, является лизабельность бактериофагом. Тест с сибиреязвенным бактериофагом является одним из опорных, с помощью которого сибиреязвенный микроб можно отличить от близкородственных бацилл. Особую ценность этот метод приобретает при идентификации атипичных по капсулообразованию, вирулентности и биохимическим свойствам штаммов сибиреязвенного микроба [1, 48]. Учитывая вышеизложенное и в соответствии с разработанными Программами исследования диагностической ценности иммуноглобулинов флуоресцирующих сибиреязвенных (вегетативные и споровые) адсорбированных, включающими выбор препаратов или метода сравнения, подбор штаммов B. anthracis и близкородственных микроорганизмов, проб объектов окружающей среды и биологического материала, контаминированных B. anthracis и близкородственными микроорганизмами, оценена возможность применения иммуноглобулинов сибиреязвенных (вегетативные и споровые) адсорбированных и бактериофага Гамма А-26 в лабораторной диагностике при индикации и идентификации возбудителя сибирской язвы. На основании полученных нами данных при оценке специфической активности испытуемых и специфичности сибиреязвенных было показано вегетативных явное преимущество иммуноглобулинов перед методом сравнения – тестом на гемолиз по времени получения и учету 105 результатов. Чувствительность препарата по результатам всех исследований установлена от 5,0х105 до 1х106 м.к./мл. Иммуноглобулины обеспечивали в реакции иммунофлуоресценции специфическое зеленовато-желтое свечение штаммов B. anthracis в вегетативной форме в мазках из чистых культур, биологического материала и объектов окружающей среды. Показана диагностическая равноценность иммуноглобулинов и теста на гемолиз. По специфической активности статистически значимых различий между методами не установлено. С помощью испытуемого препарата из 47 штаммов сибиреязвенного микроба было выявлено 93,8±6,0 %, в тесте на гемолиз – в 100 % случаев. При этом получение результатов было значительно быстрее при исследовании с помощью иммуноглобулинов в РИФ, чем бактериологическим методом. Показатель специфичности для диагностических препаратов является в такой же степени обязательным и важным, как и показатель их специфической активности. При исследовании большого набора типичных музейных штаммов близкородственных микроорганизмов более точным оказался тест на гемолиз (100 %), тогда как специфичность испытуемых иммуноглобулинов составила 75 %. Полученные результаты также подтверждают сведения о высокой гомологичности сибиреязвенного микроба с другими видами Bacillus. Необходимо отметить, что, результаты с помощью иммуноглобулинов в реакции иммунофлуоресценции, были получены в более короткие сроки по сравнению с бактериологическим методом, что подтверждается данными наших исследований. Продолжительность анализа при исследовании чистых культур с помощью иммуноглобулинов составила 2,5-3 ч и (20±2) ч при исследовании объектов окружающей среды и биологического материала. В то время как, положительный ответ при исследовании чистых культур с применением теста на гемолиз можно получить только через 20 ч и через 40 ч при исследовании проб объектов окружающей среды и биологического 106 материала. Проведенные исследования показывают возможность практического применения иммуноглобулинов вегетативных адсорбированных флуоресцирующих для сибиреязвенных специфической индикации при исследовании чистых культур возбудителя сибиреязвенного микроба, биологического материала и объектов окружающей среды. Основными сибиреязвенных показателями споровых оценки качества адсорбированных иммуноглобулинов являются специфическая активность и специфичность. Воспроизводимость результатов постановки реакции иммунофлуоресценции с помощью иммуноглобулинов сибиреязвенных споровых адсорбированных подтверждает их стабильность и хорошие тактико-технические свойства. С целью изучения специфической активности и специфичности иммуноглобулинов сибиреязвенных споровых адсорбированных в работе были использованы штаммы и B. anthracis близкородственных микроорганизмов, а также биологический материал и объекты окружающей среды (почва, вода, смывы с объектов окружающей среды, корма), искусственно контаминированные штаммами B. anthracis и B. cereus. Установлена высокая специфическая активность иммуноглобулинов, в разведении 1:64 в 93,8±6,0 % случаев наблюдалось специфическое свечение штаммов B. anthracis в споровой форме в мазках из чистых культур, и в 100 % проб из биологического материала и объектов окружающей среды. Специфичность препарата также была высокой и составила 96,9±3,1 %. Воспроизводимость совпадения результатов при исследовании положительных и отрицательных проб при 10-кратном повторении разными исполнителями и в разные дни во всех случаях составила 100 %. Проведенные сравнительные исследования выявили преимущество по срокам постановки РИФ с помощью иммуноглобулинов сибиреязвенных споровых адсорбированных перед методом сравнения (тест на гемолиз). 107 Продолжительность проведения исследований с помощью испытуемых иммуноглобулинов составила 20 ч при исследовании проб чистых культур и 2,5-3 ч при исследовании проб объектов окружающей среды и биологического материала; при исследовании проб с помощью теста на гемолиз - 20 ч при исследовании проб чистых культур и 40 ч при исследовании проб объектов окружающей среды и биологического материала. Как видно из полученных данных, временные затраты в РИФ значительно ниже, чем при проведении исследований бактериологическим методом, что особенно важно с целью оперативного обнаружения возбудителя сибирской язвы из объектов окружающей среды и биологического материала. Результаты, полученные в процессе исследования диагностической ценности испытываемого препарата, показали возможность его применения для специфической индикации при исследовании материала из объектов окружающей среды и биологического материала, а также чистых культур. На основании полученных данных были внесены предложения в проекты нормативной документации на иммуноглобулины диагностические сибиреязвенные вегетативные и споровые адсорбированные, касающиеся уточнения названия (вместо иммуноглобулины соматические включили иммуноглобулины вегетативные) и назначения препарата. Внесены дополнения в методику обеззараживания мазков, что позволило проводить ее в соответствии с Санитарными правилами «Безопасность работы с микроорганизмами I и II групп патогенности (опасности)» (СП 1.3.1285-03). В соответствии с требованиями МУ 4.2.2413-08 «Лабораторная диагностика для обнаружения сибирской язвы» и МУК 4.2.2941-11 «Порядок организации и проведения лабораторной диагностики сибирской язвы для лабораторий территориального, регионального и федерального уровней» важным тестом, позволяющем идентифицировать B. аnthracis, является лизабельность бактериофагом. штаммы 108 Известно, что существующие сибиреязвенные бактериофаги различаются по широте спектра лизируемых ими штаммов возбудителя сибирской язвы, а также по специфичности их действия. Изучение показателей фагочувствительности и фагорезистентности штаммов представляет интерес не только с точки зрения надежности теста лизабельности при идентификации сибиреязвенных культур, но и как основа метода выделения штаммов B. anthracis с разной чувствительностью к действию бактериофагов. Проведенные сравнительные исследования позволили установить высокую информативность испытуемого препарата - бактериофага Гамма А-26, который лизировал штаммы B. anthracis в 97,9±2,1 % случаев из 47 исследованных. C помощью бактериофага сибиреязвенного Fah ВНИИВВиМ процент правильно идентифицированных чистых культур штаммов B. anthracis к числу исследованных составил 98,6±1,38 %. При анализе данных литической активности бактериофага Гамма А-26 установлено, что испытываемый бактериофаг лизировал 95,8±2,36 %, препарат сравнения – 98,6±1,36 % штаммов B. anthracis. При изучении воспроизводимости результатов с помощью бактериофага сибиреязвенного Гамма А-26 с использованием штаммов B. anthracis СТИ-1 (положительный результат) и B. cereus 16 (отрицательный результат) во всех случаях получены совпадающие результаты в 10 повторностях, что свидетельствует о стабильности препарата и хороших его эксплуатационных и качественных характеристиках. Метод изучения чувствительности изучаемых штаммов к литическому действию сибиреязвенного бактериофага Гамма А-26 является технически простым, информативным и легко воспроизводимым, что подтверждается проведенными исследованиями. Полученные данные свидетельствуют о широком диапазоне действия и высокой специфической активности бактериофага сибиреязвенного Гамма А-26 и подтверждают возможность его 109 использования при идентификации штаммов B. anthracis в лабораторной диагностике сибирской язвы. К моменту проведения наших исследований в Российской Федерации только часть препаратов, необходимых для диагностики особо опасных инфекционных болезней, в том числе и сибирской язвы, была зарегистрирована в установленном порядке. В соответствии с приказом Роспотребнадзора № 88 от 17.03.08. «О мерах по совершенствованию мониторинга за возбудителями инфекционных и паразитарных болезней» лаборатории территориального, регионального и федерального уровнях для проведения всех этапов индикации и идентификация возбудителя сибирской язвы будут обеспечены зарегистрированными препаратами. Таким образом, проведенными исследованиями диагностической ценности иммуноглобулинов флуоресцирующих сибиреязвенных (вегетативные и споровые) адсорбированных, а также бактериофага сибиреязвенного Гамма, обоснована целесообразность их применения в лабораторной диагностике возбудителя сибирской язвы. на этапах индикации и идентификации 110 ВЫВОДЫ 1. Установлена высокая специфическая активность иммуноглобулинов сибиреязвенных вегетативных адсорбированных. Показано, что иммуноглобулины в разведении 1:64 обеспечивают специфическое свечение 93,8±6,0 % штаммов B. anthracis. При исследовании проб из биологического материала (мясо) и объектов окружающей среды (смывы, вода, почва, корма), контаминированных B. anthracis, сибиреязвенный микроб с помощью исследуемого препарата выявляется в 100 % случаев. 2. Проведенными исследованиями показано, что иммуноглобулины сибиреязвенные споровые адсорбированные в разведении 1:64 обеспечивают специфическое свечение штаммов B. anthracis в 93,8±6,0 % мазков из чистых культур, биологического материала и объектов окружающей среды в 100 % проб и не вызывают специфического свечения со штаммами близкородственных микроорганизмов. 3. Установлено явное преимущество применения реакции иммунофлуоресценции с использованием испытываемых иммуноглобулинов в сравнении с бактериологическим методом (тест на гемолиз) в отношении временных затрат при индикации возбудителя сибирской язвы. При исследовании проб объектов окружающей среды и биологического материала в РИФ с помощью иммуноглобулинов флуоресцирующих сибиреязвенных вегетативных и споровых адсорбированных учет результатов проводят через 2,5-3 ч, бактериологическим методом (тест на гемолиз) – через 40 ч. 4. Диагностический препарат бактериофаг сибиреязвенный Гамма А-26 обладает широким диапазоном действия к исследуемым штаммам B. anthracis и высокой специфичностью в отношении близкородственных микроорганизмов. Установлено, что сибиреязвенный бактериофаг Гамма А26 лизировал 97,9±2,1 % штаммов B. anthracis из 47 исследуемых и был не активным в отношении 69 штаммов (95,8±2,36 %) близкородственных 111 микроорганизмов из 72 исследуемых. При учете результатов установлено, что бактериофаг сибиреязвенный Гамма А-26 превосходит препарат сравнения по четкости лизиса. 5. Проведенными использования флуоресцирующих исследованиями сибиреязвенных (вегетативные обоснована препаратов и споровые) возможность иммуноглобулинов адсорбированных и бактериофага Гамма А-26 для индикации и идентификации B. anthracis в лабораторной диагностике сибирской язвы. 112 СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 1. Абдрашитова А. С., Саяпина Л. В., Малахаева А. Н., Касина И. В., Барулина И. С., Ляшова О. Ю., Валова Т. В., Попов Ю. А., Микшис Н. И., Осин А. В., Миронова Н. П., Лобовикова О. А., Мокриевич А. Н., Гефан Н. Г., Буравцева Н. П. Медицинские испытания нового бактериофага диагностического сибиреязвенного Гамма А-26 жидкого // Актуальные проблемы предупреждения и ликвидации последствий чрезвычайных ситуаций в области санитарно-эпидемиологического благополучия населения государств-участников СНГ: матер. Х Межгосударств. науч -практ. конф. государств-участников СНГ - Ставрополь, 2010. - С. 159-160. 2. Абрамов Д. Д., Воробьев А. А., Кузнецовский А. В., Савиных А. В., Онучина Н. В., Дармов И. В., Трофимов Д. Ю., Кузнецов С. Л. Разработка и испытания молекулярно-биологической тест-системы для выявления ДНК возбудителя сибирской язвы методом полимеразной цепной реакции в реальном времени // Клиническая лабораторная диагностика. - 2011. - № 3. С. 46-50. 3. Амосов М. Ю., Кузнецовский А.В., Сероглазов В.В., Савиных А.В., Онучина Н. В., Воробьев А.А., Дармов И.В., Колесников Д. П., Кузнецов С.Л. Идентификация и дифференциация микробных культур возбудителя сибирской язвы, выделенных на территории Южного федерального округа в мае 2007 г // Молекулярная медицина. - 2011. - № 6. - С. 43-48. 4. Антюганов С.Н., Рязанова А.Г., Еременко Е.И., Куличенко А.Н. Сибирская язва в Российской Федерации и за рубежом // Эпидемиология и инфекционные болезни. Актуальные вопросы. - 2012, № 5 - С.4-6. 5. Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях // Л. Гос. Изд. Мед. Литературы. - 1962 г. - 180 с. 113 6. Бакулов И.А., Гаврилов В.А., Селиверстов В.В. Сибирская язва (Антракс). Новые страницы в изучении «старой» болезни. Владимир: - Изд. «Посад», 2001. - 283 с. 7. Бакулов И.А., Юрков Г.Г., Ведерников В.А. и др. Методика эпизоотологического исследования // В кн.: Эпизоотологический словарьсправочник. - М.: 1986. - С. 148-161. 8. Балахонов С.В., Болошинов А.Б., Дугаржапова З.Ф., Шобоева Р.С., Родзиковский А.В., Иванова Т.А. и др. Эпидемиологическая ситуация по сибирской язве в Республике Бурятия // Дез. дело. - 2009. - № 2. С. 44-47. 9. Балахонов С.В., Мосорова А.В., Иванова Т.А., Кравец Е.В., Юзвик Л.Н., Колесникова О.Б. и др. Экспресс-диагностика сибирской язвы во время вспышки в Баргузинском районе Республики Бурятия // Журн. инф. патол. – 2009. - № 3(16).- С. 31. 10. Барков А.М., Баркова И.А., Алексеев В.В., Липницкий А.В., Кулаков М.Я. Обнаружение антител к протективному антигену Bacillus anthracis с использованием реакции непрямой гемагглютинации и твердофазного иммуноферментного метода // Проблемы особо опасных инфекций.- 2010.- № 105.- С. 42-45. 11. Баркова Использование И.А., Алексеев В.В., иммуноглобулинов Липницкий А.В., сибиреязвенной Барков А.М. монорецепторной сыворотки для идентификации Bacillus anthracis в МФА // Совр. технологии в реализации глобальной стратегии борьбы с инф. бол. на террит. государствучастников содруж. независимых гос-в: Матер. IX Межгосуд. науч.-практ. конф. гос-в-участников СНГ / Под ред. акад. РАМН Г.Г.Онищенко, чл.-корр. РАМН В.В.Кутырева, проф. В.В.Алексеева. - Волгоград, 2008. - С. 29-31. 12. Бектурдиев К.Б. Современные технологии в совершенствовании мер предупреждения и ответных действий на чрезвычайные ситуации в области общественного здравоохранения санитарно-эпидемиологического характера 114 // Материалы XI межгосударственной научно-практической конференции, 16-17 октября 2012 г. Саратов.- С. 38-39. 13. Белоножкина Л. Б. Применение полимеразной цепной реакции в лабораторной диагностике сибирской язвы // Карантинные и зоонозные инфекции в Казахстане. - Алматы, 2011. - № 1-2 (23-24). - С. 48-50. 14. Брико Н.И., Покровский В.И. Этапы развития и современные представления о структуре эпидемиологии // Эпидемиология и инфекционные болезни. Актуальные вопросы. - 2012.- № 1. - С.4-8. 15. Буравцева Н. П., Еременко Е. И., Рязанова А. Г., Головинская Т. М., Жданова Е. В., Жарникова И. В. К вопросу о фиксации вегетативных клеток Bacillus anthracis на предметных стеклах при окраске люминесцентными сыворотками // Актуальные проблемы предупреждения и ликвидации последствий чрезвычайных ситуаций в области санитарно- эпидемиологического благополучия населения государств-участников СНГ: матер. Х Межгосударств. науч -практ. конф. государств-участников СНГ. Ставрополь, 2010. - С. 167-168. 16. Буравцева Н. П., Мицаев Ш. Ш., Мезенцев В.М., Рязанова А.Г., Еременко Е.И., Куличенко А.Н. Эпизоотологическая и эпидемиологическая обстановка по сибирской язве в Чеченской Республике и Республике // Эпидемиология и инфекционные болезни. - 2011. - № 3. - С. 10-15. 17. Буравцева Н. П., Рязанова А.Г., Антюганов С. Н., Аксёнова Л.Ю., Гадзиева Г.К., Хацуков К. Х., Болатчиев К. Х., Хапаев Б. А., Бескакотов С. В. Ретроспективный анализ заболеваемости сибирской язвой людей и животных на административных территориях Северо-Кавказского федерального округа // Современные аспекты природной очаговости болезней: матер. Всерос. конф. с междунар. участием, посв. 90-летию ФБУН "Омский науч.-исслед. ин-т природно-очаговых инф." Роспотребнадзора. Омск: ИЦ "Омский научный вестник".- 2011. -№ 2 (5). - С. 49-50. 115 18. Бутаев Т. М., Родзиковский А. В., Чеснокова М. В., Балахонов С. В., Болошинов А. Б., Ханхареев С. С., Болошинова Н. П., Намноева Л. К., Шобоева Р. С., Юзвик Л. Н., Лауль З. Л., Мосорова А. В. Об эпидемиологической и эпизоотологической ситуации по сибирской язве в Республике Северная Осетия-Алания // Актуальные проблемы предупреждения и ликвидации последствий чрезвычайных ситуаций в области санитарноэпидемиологического благополучия населения государств-участников СНГ: матер. Х Межгосударств. науч -практ. конф. государств-участников СНГ. Ставрополь, 2010. - С. 24-25. 19. Бутаев Т.М., Гадзиева Г.К. Особенности организации противодействия эпидемиологическим рискам и угрозам в Республике Северная Осетия Алания // Совр. технологии в реализации глобальной стратегии борьбы с инф. бол. на террит. государств-участников содруж. независимых гос-в: Матер. IX Межгосуд. науч.-практ. конф. гос-в-участников СНГ / Под ред. акад. РАМН Г.Г.Онищенко, чл.-корр. РАМН В.В.Кутырева, проф. В.В.Алексеева. - Волгоград, 2008. - С. 182-183. 20. Буханцова Л.В., Храпова Н.П., Липницкий А.В. Получение моноклональных антител к антигенам спор сибиреязвенного микроба // XI Российский национ. конгресс "Человек и лекарство": Тез. докл., 19-23 апр. 2004 г. - М., 2004. - С. 428. 21. вида Васильев Д.А. Характеристика биологических свойств бактериофагов Вacillus subtilis // Вестник Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии (Научно-теоретический журнал) Ульяновск. – 2011.- №1(13). - С. 79-83. 22. Васильева Н.А., Луцук А.С., Ивахив О.Л., Завиднюк Н.Г., Вишневская Н.Ю. Сибирская язва: реальная угроза и возможности предупреждения // Вестник Рос. военно-мед. академии. - 2008. - № 3(23), ч. 1, прил. 2. - С. 329. 116 23. Гаврилов В.А. Перспективы решения проблемы биологической опасности сибиреязвенных скотомогильников // Дезинфекция. Антисептика. - 2010. - Т.1, № 3(3). - С. 12-15. 24. Гаранина С.Б., Куличенко А.Н., Федоров Ю.М., Куклев Е.В., Кутырев В.В., Окунев В.Б., Пикалов И.Н., Тучков И.В. Опыт использования генодиагностики в целях оптимизации эпидемиологического надзора за сибирской язвой // Эпидемиология и инфекционные болезни. - 2000. - № 4. С.17-20. 25. Глушков А.А. Эпизоотологический мониторинг и основы эпизоотологического исследования.- М.: 2003. - 49 с. 26. Головинская Т.М., Буравцева Н.П. Изучение специфичности диагностических сибиреязвенных бактериофагов // Актуальные проблемы предупреждения и ликвидации последствий чрезвычайных ситуаций в области санитарно-эпидемиологического благополучия населения государств-участников СНГ: матер. Х Межгосударств. науч -практ. конф. государств-участников СНГ . - Ставрополь, 2010. - С. 174-175. 27. Головинская Т.М., Буравцева Н.П., Цыганкова О.И. Сравнительное изучение литической активности и специфичности экспериментальных серий сибиреязвенных бактериофагов Гамма А-26, К ВИЭВ, ВА-9 и Fah-ВН ИИВВиМ // Проблемы особо опасных инфекций.- 2011.-№3(109).- С.28-30. 28. Горбунов А.В., Молодцов Н.А., Москаленко И.В. Методы лазерной спектроскопии для идентификации и количественного определения Bacillus anthracis в природных источниках // Жизнь без опасностей. - 2011. - Т.6, № 3. - С. 76-81. 29. Гражданов А.К., Жолшоринов А.Ж., Захаров А.В., Иманкул С.И., Аязбаев Т.З., Белоножкина Л.Б., Филиппова С.Л. О заболевании сибирской язвой в Жанибекском районе Западно-Казахстанской области Республики Казахстан // Вопросы реагирования на чрезвычайные ситуации санитарноэпидемиологического характера: материалы Круглого стола сан.-эпид. служб 117 Российской Федерации и Республики Казахстан, проводимого в рамках VIII форума межрегионального сотрудничества Российской Федерации и Республики Казахстан с участием глав государств / Под ред. Г. Г. Онищенко. - Астрахань, 2011. - С. 58-61. 30. Гришкевич Н.М., Фаизов Т.Х. Новые подходы для обнаружения патогенных бацилл сибирской язвы методами молекулярной биологии // Диагностика, профилактика и меры борьбы с особо опасными и экзотическими болезнями животных: Матер. международной научно-практ. конф., посв. 40-летию ВНИИВВиМ, 9-10 декабря 1998 г., Покров, 1998. - С. 334-335. 31. Дугаржапова З.Ф., Родзиковский А.В., Чеснокова М.В., Балахонов С.В., Болошинов А.Б., Ханхареев С.С., Болошинова Н.П., Намноева Л.К., Шобоева Р.С., Юзвик Л.Н., Лауль З.Л., Мосорова А.В. Эпизоотолого- эпидемиологический анализ ситуации по сибирской язве в Республике Бурятия (1995-2008) // Эпидемиология и инфекционные болезни. - 2010. - № 6. - С. 11-15. 32. Дудников С.А. Количественная эпизоотология: основы прикладной эпидемиологии и биостатистики // Владимир: 2005. - 460 с. 33. Егорова И.Ю., Селянинов Ю.О., Вологина И.В. Сравнительная оценка методов индикации B. anthracis в почве // Ветеринария. - 2006. -№ 6. - С.2630. 34. Еременко Е.И., Рязанова А.Г., Буравцева Н.П., Цыганкова О.И., Аксенова Л.Ю., Антюганов С.Н., Цыганкова Е.А., Головинская Т.М., Варопаев В.В., Куличенко А.Н. Анализ заболеваемости сибирской язвой в 2012 г., прогноз на 2013 г // Проблемы особо опасных инфекций.- 2013.- №1 (115). - С. 18-20. 35. Еременко Е.И., Рязанова А.Г., Цыганкова Е.А., Цыганкова О.И., Куличенко А.Н. Генотипические особенности штаммов Bacillus anthracis c 118 разным проявлением признаков, ассоциированных с патогенностью // Пробл. особо опасных инф. – 2010. - № 2(104).-С. 53-56. 36. Ермаков А.В., Ковальчук И.В., Герасименко А.А. К вопросу угрозы возникновения осложнений Ставропольского края // по сибирской Актуальные язве проблемы на территории предупреждения и ликвидации последствий чрезвычайных ситуаций в области санитарноэпидемиологического благополучия населения государств-участников СНГ: матер. Х Межгосударств. науч-практ. конф. государств-участников СНГ. Ставрополь, 2010. - С. 57. 37. Жолдошев С.Т. Влияние природных факторов на существование почвенных очагов сибирской язвы Кыргызстана // Вестник Рос. военно-мед. академии. - 2008. - № 3(23), ч. 1, прил. 2. - С. 329-330. 38. Жолдошев С.Т., Ковеленов А.Ю., Тойчуев Р.М. Эпизоотологическая характеристика и эпидемилогическая оценка сибирской язвы южных регионов Кыргызстана // Актуал. вопр. инф. патологии/ Под ред. проф. В.М.Семенова - Матер. междунар. Евро-Азиатского конгресса по инф. болезням. - Витебск, 2008. - Т. 1. - С. 50-51. 39. Инфекционная заболеваемость в Российской Федерации. http://rospotrebnadzor.ru/epidemiologic_situation/-/asset_publisher (дата обращения 15.08.2013). 40. Инфекционные болезни животных // Под ред. А.А. Сидорчука.- М.: Колос, 2007.- 671с. 41. Ипатенко Н.Г., Гаврилов В.А., Зелепукин В.С. и др. Сибирская язва. М.: Колос, 1996. - С. 105-108. 42. Карнаухов И.Г., Куклев В.Е., Плотников Е.А., Куклев Е.В., Куличенко А.Н. К вопросу о выживаемости спор B. anthracis и существованиии почвенных очагов сибирской язвы в климатических условиях Крайнего Севера // Матер. IX съезда Всерос. научно-практ. об-ва эпидемиологов, микробиологов и паразитологов // Под ред. Гинцбурга А.Л. 119 Минздравсоцразвития России; Роспотребнадзор; РАМН; ВНПОЭМП. - М.: Санэпидмедиа, 2007. - Т. 2. - С. 241-242. 43. Касимов М.С., Абдуллаев Р.М., Исмайлова Р.И., Талыбзаде А.Н. Эпидемиологический надзор за сибирской язвой в Азербайджане // Актуальные проблемы предупреждения чрезвычайных ситуаций благополучия населения Межгосударств. науч в области и ликвидации санитарно-эпидемиологического государств-участников конф. -практ. последствий СНГ: матер. государств-участников СНГ Х - Ставрополь, 2010. - С. 61-62. 44. Кологоров А.И., Эпидемиологическая Дмитриева ситуация по Л.Н., Шиянова природно-очаговым А.Е. и и др. зоонозным инфекциям в Приволжском федеральном округе в 2000-2009 г.г. и прогноз на 2010 // Проблемы особо опасных инфекций. - 2010. №2(104).-С.5 - 10. 45. Кравец Е.В., Дугаржапова З.Ф., Родзиковский А.В. и др. Применение методов латекс агглютинации и иммунохроматографии для ускоренной идентификации культур расследованиях вспышек Bacillus // anthracis Проблемы при особо эпидемиологических опасных инфекций.- 2011.№1(107). - С.81-82. 46. Кузнецов А.Ф. Справочник ветеринарного врача.- М.: Лань, 2002. - 896 с. 47. Куличенко А.Н., Буравцева Н.П., Антюганов С.Н. Сибирская язва в Дагестане // Пробл. особо опасных инф. 2013.-№ 2.- С. 22-25. 48. Куличенко А.Н., Еременко Е.И., Буравцева Н.П., Рязанова А.Г. Диагностика сибирской язвы в Российской Федерации // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол.- 2010. № 5. - С. 62 - 66. 49. Куличенко А. Н., Малецкая О.В., Дубянский В.М., Ерёменко Е.И. Актуальность проблемы болезней, общих для человека и животных (бруцеллез, сибирская язва), и КГЛ в рамках приграничного сотрудничества // Вопросы реагирования на чрезвычайные ситуации санитарно- 120 эпидемиологического характера: материалы Круглого стола сан.-эпид. служб Российской Федерации и Республики Казахстан, проводимого в рамках VIII форума межрегионального сотрудничества Российской Федерации и Республики Казахстан с участием глав государств /Под ред. Г. Г. Онищенко. - Астрахань, 2011. - С. 81-84. 50. Кутырев В.В., Смирнова Н.И. Генодиагностика и молекулярное типирование возбудителей чумы, холеры и сибирской язвы // Мол. генет., микробиол., вирусол. -2003.- № 1. - С. 6 - 14. 51. Лабораторная диагностика и обнаружение возбудителя сибирской язвы. Методические указания. МУ 4.2.2413-08. М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора; 2009. - 67 с. 52. Ладный В.И., Ющенко Г.В. Сибирская язва на территории Российской Федерации // Эпидемиол. и инф. бол. -2009.- № 2. - С.36 - 40. 53. Лакин Г. Ф. Биометрия. - М.: Высшая школа, 1990. - 352 с. 54. Литусов Н.В., Васильев П.Г., Садыков Н.С. и др. Патоморфогенез сибирской язвы. - М.: Медицина, 2002. - 240 с. 55. Лобзин Ю.В., Волжанин В.М., Захаренко С.М. Сибирская язва // Клин. микробиол. и антимикр. химиотерапия. - 2002. - Т. 4, № 2. - С. 104-127. 56. Лухнова Л. Ю., Айкимбаев А.М., Жумадилова З.Б., Пазылов Е.К. Современные особенности сибирской язвы в Казахстане // Актуальные проблемы предупреждения и ликвидации последствий чрезвычайных ситуаций в области санитарно-эпидемиологического благополучия населения государств-участников СНГ: матер. Х Межгосударств. науч -практ. конф. государств-участников СНГ. - Ставрополь, 2010. - С. 75-76. 57. Лухнова Л.Ю., Айкимбаев А.М., Пазылов Е.К., Гражданов К.А., Соломадин М.В., Иманкул С.И., Мека-Меченко Т.В., Некрасова Л.Е. Эпидемиологическая и эпизоотологическая ситуация по сибирской язве на территории Западно-Казахстанской области // Дезинфекция и Антисептика. 2012. - Т.3, №1. - С. 31-35. 121 58. Майтиева В.С., Гайбулин Д.Ш., Жукушов А.Т. Оценка пространственных закономерностей распространения сибирской язвы на территории Кыргызской республики // Совр. технологии в реализации глобальной стратегии борьбы с инф. бол. на террит. государств-участников содруж. независимых гос-в: Матер. IX Межгосуд. науч.-практ. конф. гос-вучастников СНГ / Под ред. акад. РАМН Г.Г.Онищенко, чл.-корр. РАМН В.В.Кутырева, проф. В.В.Алексеева. - Волгоград, 2008. - С. 245-246. 59. Макаров В. В., Сухарев О.И., Коломыцев А.А. Состояние и тенденции риска в эпидемиологии распространённых зоонозов // Пест-менеджмент. 2009. - №1-2. - С. 28-32. 60. Макаров В.В., Смирнов А.М., Сочнев В.В. и др. Эмерджентность, чрезвычайные ситуации и зоонозы // Ветеринарная патология. - 2004. - № 3. С. 36-45. 61. Макаров В.В., Сухарев О.И. Мировой нозоареал сибирской язвы // Ветеринарная патология.- 2012. - №1 (28). - С. 7-15. 62. Макаров В.В., Сухарев О.И., Коломыцев А.А. Ветеринарная эпидемиология распространенных инфекций: состояние и тенденции риска // Ветеринарная патология. - 2009. - № 1 (28). - С.15-20. 63. Макаров В.В., Сухарев О.И., Коломыцев А.А. Состояние и тенденции риска в эпидемиологии распространенных зоонозов // Инфекционные и паразитарные болезни. - 2000. - № 1-2 - С.28-32. 64. Макаров В.В., Тимофеев Б.А. Паразитизм, патогенность, паразитарная система // Ветеринарная патология. - 2006. -№ 4. - С. 174-181. 65. Маринин Л.И., Дятлов И.А., Мокриевич А.Н. и др. Методы изучения биологических свойств возбудителя сибирской язвы. М.: ЗАО МП «ГИГИЕНА», 2009. - 304 с. 66. Маринин Л.И., Онищенко Г.Г., Кравченко Т.Б. и др. Сибирская язва человека: эпидемиология, профилактика, диагностика, лечение. М.: ЗАО МП «Гигиена», 2008. - 416 с. 122 67. Маринин Л.И., Онищенко Г.Г., Степанов А.В. «Микробиологическая диагностика сибирской язвы» М.: ВУНМЦ МЗ РФ, 1999. - 224 с. 68. Мезенцев В.М. Современные технологии в совершенствовании мер предупреждения и ответных действий на чрезвычайные ситуации в области общественного здравоохранения санитарно-эпидемиологического характера. Материалы XI межгосударственной научно-практической конференции, 1617 октября 2012 г., Саратов.- С. 156-158. 69. Методы выявления патогенных микроорганизмов с использованием иммунохроматографических (Германия): методические экспресс-тестов рекомендации. производства М.: Merck Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России, 2004. - 23 с. 70. Микшис Н.И., Кудрявцева О.М., Гончарова А.Ю., Попова П.Ю., Живова Ю.Н., Попов Ю.А., Кутырев В.В. Оценка эффективности продукции протективного антигена аспорогенным рекомбинантным штаммом Bacillus anthracis // Биотехнология. - 2011. - № 5. - С. 38-43. 71. Микшис Н.И., Попова П.Ю., Гончарова А.Ю., Кудрявцева О.М. Попов Ю.А. Испытания сибиреязвенного рекомбинантного протективного антигена на лабораторных животных // Инфекционные болезни: матер. IV Ежегодного Всероссийского Конгресса по инфекционным болезням. Т. 10, прилож. 1. М., 2012. - С. 250. 72. Микшис Н.И., Попова П.Ю., Кудрявцева О.М., Гончарова А.Ю., Попов Ю.А., Кутырев В.В. Иммуногенность протективного антигена, выделенного из аспорогенного рекомбинантного штамма Bacillus anthracis // ЖМЭИ. 2011. - № 1. - С. 44-48. 73. Омариева Э.Я., Алжанбекова И.Г. Эпизоотолого-эпидемиологическая ситуация по сибирской язве в Республике Дагестан // Актуальные проблемы предупреждения и ликвидации последствий чрезвычайных ситуаций в области санитарно-эпидемиологического благополучия населения 123 государств-участников СНГ: матер. Х Межгосударств. науч -практ. конф. государств-участников СНГ. - Ставрополь, 2010. - С. 95-96. 74. Онасенко А.Г., Баранов А.М., Белова Е.В., Шемякин И.Г., Дятлов И.А. Получение моноклональных антител к спорам Bacillus anthracis // Чрезвычайные ситуации междунар. значения в обществ. здравоохранении и сан. охрана территорий государств-участников СНГ. Матер. VII Межгосуд. науч.-практ. конф. государств-участников СНГ // Под ред. акад. РАМН Г.Г.Онищенко, чл.-корр. РАМН В.В. Кутырева, докт. мед.наук, проф. И.А.Дятлова. - Протвино: А-ПРИНТ ЗАО, 2006. - С. 228-229. 75. Онищенко Г.Г. Организация ликвидации медико-санитарных последствий биологических, химических и радиационных террористических актов: практическое руководство. М.:ФГУ «ВЦМК «Защита», 2005. - 328 с. 76. Онищенко Г.Г., Васильев Н.Т., Литусов Н.В. и др. Сибирская язва: актуальные аспекты микробиологии, эпидемиологии, клиники, диагностики, лечения и профилактики. М.: ВУНМЦ МЗ РФ; 1999. - 448 с. 77. Онищенко Г.Г., Кожухов В.В. Сибирская язва: актуальные проблемы разработки и внедрения медицинских средств защиты. М.: Медицина; 2010. 423 с. 78. Н.Д., Онищенко Г.Г., Кузькин Б.П., Кутырев В.В., Щербакова С.А., Пакскина Топорков А.В. Актуальные направления совершенствования лабораторной диагностики особо опасных инфекционных болезней // Пробл. особо опасных инф. 2010.-№ 1(99).- С.5-10. 79. Онищенко Г.Г., Кутырев В.В. Лабораторная диагностика опасных инфекционных болезней. М.: Медицина, 2009. - 472 с. 80. Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I–IV групп патогенности. Методические указания МУ 1.3.2569-09. М.: 2009. 124 81. Попова П.Ю., Гончарова А.Ю., Микшис Н.И., Кудрявцева О.М., Попов Ю.А. Иммуногенная активность поверхностных антигенов возбудителя сибирской язвы // Актуальные проблемы предупреждения и ликвидации последствий чрезвычайных ситуаций в области санитарно- эпидемиологического благополучия населения государств-участников СНГ: матер. Х Межгосударств. науч - практ. конф. государств-участников. Ставрополь, 2010. - С. 219-220. 82. Попова П.Ю., Микшис Н.И., Кудрявцева О.М. и др. Влияние протективного антигена, синтезируемого аспорогенным рекомбинантным штаммом Bacillus anthracis, на иммунную систему экспериментальных животных // Проблемы особо опасных инфекций. -2012.- №.1 (111). - С. 8487. 83. Порядок организации и проведения лабораторной диагностики сибирской язвы для лабораторий территориального, регионального и федерального уровней.- Методические указания МУК 4.2. 2941-11. Москва, 2011. 84. Приказ Роспотребнадзора РФ № 88 от 17.03.08. «О мерах по совершенствованию мониторинга за возбудителями инфекционных и паразитарных болезней». 85. Пугачев В.Г., Таранов О.С., Чернявский В.Ф., Никифоров О.И., Софронова О.Н., Репин В.Е. Микробиологические исследования ископаемых животных вечной мерзлоты // Перспективы сотрудничества государствчленов ШОС в противодействии угрозе инфекционных болезней: Международная научно-практическая конференция. - Новосибирск: Изд-во "ЦЭРИС", 2009. - С. 170-172. 86. Рязанова А. Г., Головинская Т.М., Буравцева Н.П. Подбор производственного штамма сибиреязвенного микроба для размножения бактериофага "Гамма А-26" // Современные технологии обеспечения биологической безопасности: матер. науч.-практ. школы-конференции 125 молодых ученых и специалистов науч.-исслед. организаций Роспотребнадзора. - Оболенск, 2010. - С. 332-334. 87. Рязанова А.Г., Еременко Е.И., Буравцева Н.П. и др. Эпидемиологическая ситуация по сибирской язве в Российской Федерации: анализ заболеваемости в 2010 г., прогноз на 2011 г. Проблемы особо опасных инфекций.- 2011.- №1 (107). - С. 42-45. 88. Рязанова А.Г., Еременко Е.И., Цыганкова А.Е., Аксенова Л.Ю., Цыганкова О.И., Буравцева Н.П., Головинская Т.М., Куличенко А.М. Анализ заболеваемости сибирской язвой в 2011 г. и прогноз на 2012 г // Проблемы особо опасных инфекций.- 2012.- №1 (111). - С. 37-38. 89. Рязанова А.Г., Еременко Е.И., Цыганкова О.И. и др. Использование методов молекулярного типирования Bacillus anthracis в Референс-центре по мониторингу за возбудителем сибирской язвы // Проблемы особо опасных инфекций. - 2011.- №4 (110). - С. 68-70. 90. Рязанова А.Г., Еременко Е.И., Цыганкова О.И., Цыганкова Е.А. Усовершенствование методов идентификации атипичных штаммов возбудителя сибирской язвы и их дифференциация от близкородственных бацилл // ЖМЭИ. - 2009.- №3. - С. 76-80. 91. Санитарно-эпидемиологические правила «Профилактика сибирской язвы» СП 3.1.7.2629-10. Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека: М.; 2010. 92. Саяпина Л.В., Кутырев В.В. О состоянии производства медицинских иммунобиологических препаратов, используемых для диагностики ООИ. Санитарная независимых охрана территорий государств государств:проблемы участников биологической содружества безопасности и противодействия биотерроризму в современных условиях.- Материалы VI межгосударственной научно-практич. конф. государств-участников СНГ 1314 сентября 2005, г. Волгоград, 2005.- С. 282-284. 126 93. Саяпина Л.В., Малахаева А.Н., Касина И.В., Барулина И.С. Анализ качества диагностических флуоресцирующих иммуноглобулинов, используемых для выявления возбудителей особо опасных инфекций // Научно-практический журнал «Биопрепараты» Профилакт., диагност., лечение. - 2007. -№2 (26).- С. 26-28. 94. Симонова Е.Г., Галкин В.В., Локтионова М.Н., Ладный В.И. Сибиреязвенные скотомогильники на территории РФ и их биологическая безопасность // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии.2010. - № 4. - С. 23-26. 95. Симонова Е.Г., Локтионова М.Н., Хадарцев О.С., Картавая С.А. Проблема сибиреязвенных захоронений на территории Российской Федерации // Инфекционные болезни: матер. IV Ежегодного Всероссийского Конгресса по инфекционным болезням. Т. 10, прилож. 1. - М., 2012. - С. 344. 96. Соловьев П.В., Баранова Е.В., Рудницкий С.Ю., Королева-Ушакова А.Г., Колосова Н.В., Бикетов С.Ф. Разработка иммунохроматографических тестов для идентификации спор и вегетативных клеток B. anthracis // Современные технологии обеспечения биологической безопасности: матер. науч.-практ. школы-конференции молодых ученых и специалистов науч.исслед. организаций Роспотребнадзора. - Оболенск, 2010. - С. 210-211. 97. Супотницкий М.В. Микроорганизмы, токсины и эпидемии. М.: Вузовская книга, 2000. - 376 c. 98. Терешкина Н.Е., Девдариани З.Л. Современное состояние проблемы иммунодетекции возбудителя сибирской язвы // Проблемы особо опасных инфекций. - 2008.- №1(95). - С. 44-48. 99. Фаизов Т.Х., Иванов А.В., Александрова Н.М., Калиуллин А.К. Индикация и идентификация B. anthracis в эндемических очагах // Пробл. инфекц. патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера: III Рос. науч. конф. с междунар. участием - Новосибирск: ЦЭРИС, 2006. - С. 222-223. 127 100. Феоктистова Н.А., Калдыркаев А. И., Мустафин А.Х. Разработка схемы исследования материала с целью выделения и ускоренной идентификации бактерий видов Bacillus subtilis и Bacillus cereus // Известия.-2011.- № 4(32).С. 288-291. 101. Хлынцева А.Е., Баранов А.М., Белова Е.В., Шемякин И.Г., Маринин Л.И., Дятлов И.А. Изучение свойств моноклональных антител для разработки иммунохроматографического стрип-теста с целью определения спор возбудителя сибирской язвы // Совр. технологии в реализации глобальной стратегии борьбы с инф. бол. на террит. государств-участников содруж. независимых гос-в: Матер. IX Межгосуд. науч.-практ. конф. гос-вучастников СНГ / Под ред. акад. РАМН Г.Г.Онищенко, чл.-корр. РАМН В.В.Кутырева, проф. В.В.Алексеева. - Волгоград, 2008. - С. 140-141. 102. Хлынцева А.Е., Белова Е.В., Дятлов И.А., Шемякин И.Г. Разработка латекс-агглютинационной тест-системы для детекции спор Bacillus anthracis // Современные технологии обеспечения биологической безопасности: матер. науч.-практ. школы-конференции молодых ученых и специалистов науч.исслед. организаций Роспотребнадзора. - Оболенск, 2010. - С. 219-221. 103. Хлынцева А.Е., Лунева Н.М., Белова Е.В., Дятлов И.А., Шемякин И.Г. Разработка и испытания диагностикума на основе моноклональных антител для определения спор возбудителя сибирской язвы в реакции латексагглютинации // Проблемы особо опасных инфекций. - 2011.- № 4(110). - С. 71-75. 104. Цыганкова Е.А., Еременко Е.И., Рязанова А.Г., Цыганкова О.И., Куличенко А.Н. Секвенирование регуляторных (АТХА и АСРА ) и структурных генов оперона Capbcade штаммов B. anthracis с разной экспрессией признаков токсино- и капсулообразования // Современные технологии обеспечения биологической безопасности: матер. науч.-практ. школы-конференции молодых ученых и специалистов организаций Роспотребнадзора. - Оболенск, 2010. - С. 312-315. науч.-исслед. 128 105. Цыганкова Е.А., Еременко Е.И., Цыганкова О.И., Рязанова А.Г. Полиморфизм гена протективного антигена у вариантов штаммов Bacillus anthracis, обнаруживаемый методом PCR RFLP анализа // Совр. технологии в реализации глобальной стратегии борьбы с инф. бол. на террит. государствучастников содруж. независимых гос-в: Матер. IX Межгосуд. науч.-практ. конф. гос-в-участников СНГ / Под ред. акад. РАМН Г.Г.Онищенко, чл.-корр. РАМН В.В.Кутырева, проф. В.В.Алексеева. - Волгоград, 2008. - С. 149-150. 106. Цыганкова Е.А., Рязанова А.Г., Еременко Е.И., Цыганкова О.И. Сравнительный анализ специфичности и диагностической ценности коммерческих ПЦР-тест-систем для выявления ДНК Bacillus anthracis // Актуальные проблемы чрезвычайных ситуаций благополучия населения Межгосударств. предупреждения в науч-практ. области и ликвидации санитарно-эпидемиологического государств-участников конф. последствий СНГ: государств-участников матер. СНГ. Х - Ставрополь, 2010. - С. 238. 107. Цыганкова О.И., Еременко Е.И., Брюханов А.Ф., Абгарян А.Г., Ефременко В.И., Рязанова А.Г. Генотипирование штаммов сибиреязвенного микроба на территории стран СНГ // Журн. микробиол, эпидемиол. и иммунобиол. - 2003. - № 6. - С. 51-56. 108. Цыганкова О.И., Еременко Е.И., Цыганкова Е.А., Буравцева Н.П., Рязанова А.Г. Фенотипические и генетические особенности культуральноморфологических вариантов Bacillus anthracis // Журн. микробиол, эпидемиол. и иммунобиол.- 2008. - № 4. - С. 6-11. 109. Черкасский Б.Л. «Эпидемиология и профилактика сибирской язвы М.: ИНТЕРСЭН, 2002. - 384 с. 110. Черкасский Б.Л. Кадастр стационарно - неблагополучных по сибирской язве пунктов Российской Федерации: Справочник. М.: ИНТЕРСЭН, 2005. 829 с. 129 111. Черкасский Б.Л. Учение о механизме передачи возбудителей инфекций и социально-экологическая концепция эпидемического процесса // Журн. микробиол, эпидемиол. и иммунобиол. - 2003. - № 5. - С. 54-58. 112. Шарова И.Н, Казакова Е.С., Карнаухов И.Г., Щербаков Д.А., Щербакова С.А., Самойлова Л.В., Топорков А.В., Кутырев В.В. Принципы организации лаборатории и проведение индикации лабораторной для диагностики осуществления в мобильной эпизотоологичнского мониторинга особо опасных и других природно-очаговых инфекций // Проблемы особо опасныхинфекций.-2013. - № 3 (113). - С. 94-96. 113. Шарова И.Н, Казакова Е.С., Портенко С.А., Красовская Т.Ю., Осина Н.А., Куклев В.Е., Карнаухов И.Г., Щербакова С.А., Топорков А.В., Чеснокова М.В., Куличенкова А.Н., Кутырев В.В. Совершенствование и стандартизация лабораторной диагностики особо опасных, «новых» и «возвращающихся» инфекционных болезней // Проблемы особо опасных инфекций. - 2013. - № 2. - С. 46-48. 114. Шишкова Н.А., Маринин Л.И., Мокриевич А.Н., Тюрин Е.А., Дятлов И.А. Санация сибиреязвенного скотомогильника // Инфекционные болезни: матер. IV Ежегодного Всероссийского Конгресса по инфекционным болезням. Т. 10, прилож. 1. - М., 2012. - С. 430. 115. Шишкова Н.А., Мокриевич А.Н., Платонов М.Е., Светоч Т.Э., Маринин Л.И. Изучение генетического разнообразия штаммов сибиреязвенного микроба из коллекции ГНЦ ПМБ // Проблемы особо опасных инфекций.2010. - № 2(104). - С. 60-65. 116. Юзвик Л.Н., Шобоева Р.С., Болштнов А.Б., Номноева Л.К., Парфенов В.Н., Агапов В.А., Сониев Н.В., Лауль З.Л. Эпидемиологическая ситуация при вспышке сибирской язвы в Кяхтинском районе Республики Бурятия // Матер. VIII Всерос. съезда эпидем., микробиол. и паразитол.: Сб. статей в 4 томах. - Москва, 2002. - Т. 1. - С. 425. 130 117. Яцышина С.Б., Обухов И.Л., Кириллов Л.В., Саленко Л.С., Шмаргун Б.И., Шипулин Г.А. Применение мультиплексной ПЦР для идентификации вирулентных форм возбудителей сибирской язвы. // IV Всерос. научно-практ. конф. "Генодиагностика инфекц. заболеваний". Сб. тезисов под ред. акад. РАМН Покровского В.И. - Тверь, 2002. - С. 384-386. 118. Artenstein A.W. Anthrax: from antiquity to answers. J. Infect. Dis. 2007; 195(4):471-473. 119. Basilio D., Juris S.J., Collier R.J., Finkelstein A. Evidence for a protonprotein symport mechanism in the anthrax toxin channel. J. Gen Physiol. Mar. 2009; 133 (3): 307-314. 120. Be-Nazir Ahmed, Yasmin Sultana, Khorshed Ara, Nurjahan Begum, S.M Mostanzid, Shamim Jubayer. Anthrax: an emerging zoonotic disease in Bangladesh. Bangladesh J Med Microbiol 2010; 04 (01): 46-50. 121. Be-Nazir Ahmed, Yasmin Sultana, et al. Bacillus anthracis: an agent of biological weapon. JOPSOM 2001; 20 (2): 45-50. 122. Beyer W. Turnbull P.C.B. Anthrax in animals. Molecular Aspects of Medicine Dec. 2009; 30 (6): 481-489. 123. Boyer Anne E., Quinn Conrad P., Hoffmaster Alex R., Kozel Thomas R., Saile Elke et al. Kinetics of lethal factor and poly-D-glutamic acid antigenemia during inhalation Anthrax in Rhesus Macaques. Infect. Immun. Aug. 2009; 77 (8): 3432-3441. 124. Chand H.S., Drysdale M., Lovchik J., Koehler T.M., Lipscomb M.F., Lyons C.R. Discriminating virulence mechanisms among Bacillus anthracis strains by using a murine subcutaneous infection model. Infect Immun. Jan. 2009; 77 (1): 429-435. 125. Collier R.J., Young J.A. Anthrax toxin. Annu. Rev Cell Dev Biol. 2003;19: 45-70. 126. Dixon Terry C. et al. Anthrax. // New England Journal of Medicine. -1999; 341: 815-826. 131 127. Dixon Terry C., Fadl Amin A., Koehler Theresa M., Swanson Joel A., Hanna Philip C. Early Bacillus anthracis-macrophage interactions: intracellular survival and escape. Cellular Microbiology. Dec. 2000; 2(6): 453-463. 128. Doolan D.L., Freilich D.A., Brice G.T., Burgess T.H., Berzins M.P.,Bull R.L., Graber N.L., Dabbs J.L., Shatney L.L., Blazes D.L., Bebris L.M.,Malone M.F., Eisold J.F., Mateczun A.J., Martin G.J. The US capitol bioterrorism anthrax exposures: clinical epidemiological and immunological characteristics. J Infect Dis. Jan 2007; 195(2):174-184. 129. Durmaz R., Doganay M., Sahin M., Percin D., Karahocagil M. K., Kayabas U., Otlu B., Karagoz A. et ai. Molecular epidemiology of the Bacillus anthracis isolates collected throughout Turkey from 1983 to 2011. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases Oct. 2012; 31 (10): 2783-2790. 130. Еgren Joakim, Hamidjaja Raditijo A., Hansen Trine, Ruuls Robin, Thierry Simon et al. In silico and in vitro evaluation of PCR-based assays for the detection of Bacillus anthracis chromosomal signature sequences. J. Virulence Nov. 2013; 4 (8): 1-15. 131. Ezzell J.W., Abshire T., Ibrahim S., Teska J. et al. Identification of Bacillus anthracis: an overview. 3rd International Conference on Anthrax. Plymouth, England, 7-10 September, 1998. P. 47. 132. Fasanellaa A., Galantea D., Garofoloa G., Jones M. Hugh. Anthrax undervalued zoonosis. Veterinary Microbiology. Jan. 2010; 140(3-4): 318-331. 133. Gombe NT., Nkomo BMM., Chadambuka A., Shambira G., Tshimanga M. Risk factors for contracting anthrax in Kuwirirana ward, Gokwe North, Zimbabwe. African Health Sciences. 2010; 10 (2): 159-164. 134. Hampson K., Lembo T., Bessell P., Auty H., Packer C., Halliday Jo. et al. Predictability of anthrax infection in the Serengeti, Tanzania. J. of Applied Ecology. Dec. 2011; 48 (6): 1333-1344. 135. Harrell L. J., Andersen G. L. and Wilson K. H. Genetic variability of Bacillus anthracis and related species. J. Clin. Microbiol. July 1995; 33 (7): 18471850. 132 136. Hatano Ben, Maki Takayuki, Obara Takeyuki, Fukumoto Hitomi, Hagisawa Kohsuke, Matsushita Yoshitaro, Okutani Akiko, Bazartseren Boldbaatar, Inoue Satoshi, Sata Tetsutaro and Katano Harutaka. LAMP using a disposable pocket warmer for Anthrax detection, a highly mobile and reliable method for antibioterrorism. Jpn. J. Infect. Dis. 2010; 63: 36-40. 137. Helgaso E., Okstad O.A., Caugant D.A., Johansen H.A., Fouet A., Mock M. et al. Bacillus anthracis, Bacillus cereus, and Bacillus thuringiensis: one species on the basis of genetic evidence. Appl. Environ. Microbiol. 2000; 66: 2627-2630. 138. Herzog Amanda B., McLennan S. Devin, Pandey Alok K., Gerba Charles P., Haas Charles N., Rose Joan B. and Hashsham Syed A. Implications of limits of detection of various methods for Bacillus anthracis in computing risks to human health. Appl. Environ. Microbiol. Octob. 2009; 75 (19): 6331-6339. 139. Hugh-Jones M. Global Anthrax Report 1996-1997. Journal of Applied Microbiology 1999; 87: 189-191. 140. Irenge Léonid M, Durant Jean-François, Tomaso Herbert, Pilo Paola, Olsen Jaran S., Ramisse Vincent, Mahillon Jacques, Gala Jean-Luc. Development and validation of a real-time quantitative PCR assay for rapid identification of Bacillus anthracis in environmental samples. Applied Microbiology and Biotechnology. Nov. 2010; 88 (5): 1179-1192. 141. Irenge Léonid M., Gala Jean-Luc. Rapid detection methods for Bacillus anthracis in environmental samples: a review. Applied Microbiology and Biotechnology Feb. 2012; 93 (4): 1411-1422. 142. Jain Neha, Kumar Jyoti S., Parida M. M., Merwyn S., Rai G. P., Agarwal G. S. Real-time loop-mediated isothermal amplification assay for rapid and sensitive detection of anthrax spores in spiked soil and talcum powder. World Journal of Microbiology and Biotechnology. June 2011; 27(6): 1407-1413. 143. Jang J., Cho M., Chun J.H. et al. The poly-c-D-glutamic acid capsule of Bacillus anthracis enhances lethal toxin. Infect Immun 2011; 79: 3846-3854. 144. Jernigan D.B., Raghunathan P.L., Bell B.P. et al. Investigation of biotrrorism-related anthrax, United States, 2001: epidemiologic findings. J. Emer. Infect. Dis. 2002; 8(10): 1019-1029. 133 145. Jernigan J. et al. Bioterrorism-related inhalational anthrax: the first 10 cases reported in the United States // Emerging Infectious Diseases. 2001; 3: 933-944. 146. Kaman Wendy E., Hulst Albert G., Roffel Sanne, J. van der Schans Marcel, Merkel Tod, Alex van Belkum and Floris J. Bikker. Peptide-based fluorescence resonance energy transfer protease substrates for the detection and diagnosis of Bacillus species. Anal. Chem. 2011; 83 (7): 2511-2517. 147. Keim P., Price L.B., Klevytska A.M., Smith K.L., Schupp J.M., Okinaka R. et al. Multiple locus variable namber tandem repeat analysis reveals genetic relationships within Bacillus anthracis. J. Bacteriol. 2000; 182 (10): 2928-2936. 148. Kern Justin, Schneewind Olaf. BslA, the S-layer adhesin of B. anthracis, is a virulence factor for anthrax pathogenesis. Molecular Microbiology. Jan. 2010; 75(2): 324-332. 149. Kern Justin W., Schneewind Olaf. BslA, a pXO1-encoded adhesin of Bacillus anthracis. Molecular Microbiology. April 2008; 68 (2): 504-515. 150. Koehler T. Bacillus anthracis physiology and genetics. Mol. Aspects Med. 2009; 30 (3): 86-96. 151. Kuehn Andrea, Kovác Pavol, Saksena Rina, Bannert Norbert, Klee Silke R., Ranisch Heidrun and Grunow Roland. Development of antibodies against anthrose tetrasaccharide for specific detection of Bacillus anthracis spores. Clin Vaccine Immunol. Dec. 2009; 16 (12): 1728-1737. 152. Leski Tomasz A., Caswell Clayton C., Pawlowski Marcin, Klinke David J., Bujnicki Janusz M., Hart Sean J. and Lukomski Slawomir. Identification and classification of bcl genes and proteins of Bacillus cereus group organisms and their application in Bacillus anthracis detection and fingerprinting. Appl. Environ. Microbiol. Nov. 2009; 75 (22): 7163-7172. 153. Levy H., Weiss S., Altboum Z., et al. Lethal factor is not required for Bacillus anthracis virulence in guinea pigs and rabbits. Microb Pathog 2011; 51: 345-351. 134 154. Mudenda B Hang'ombe, James C L Mwansa, Sergio Muwowo, Phillip Mulenga, Muzala Kapina, Eric Musenga, David Squarre, Liywali Mataa, Suzuki Y Thomas, Hirohito Ogawa, Hirofumi Sawa, Hideaki Higashi. Human-animal anthrax outbreak in the Luangwa valley of Zambia in 2011. Trop Doct. July 2012; 42 (3): 136-139. 155. Oh Wan-Kyu, Jeong Yoon Seon, Song Jooyoung, Jang Jyongsik. Fluorescent europium-modified polymer nanoparticles for rapid and sensitive anthrax sensors. Biosensors and Bioelectronics. Nov. 2011; 29 (1): 172-177. 156. Oncü S, Sakarya S. Anthrax-an overview. Med. Sci. Monit. Nov 2003; 9 (11): 76-83. 157. Rajan R Patil. Anthrax: public health risk in India and socio-environmental determinants. Indian J Community Med. Jan 2010; 35 (1): 189-190. 158. Relman D.A. Microbial genomics and infectious diseases. N Engl J Med 2011; 365: 347-357. 159. Richter Stefan, Anderson Valerie J., Garufi Gabriella, Lu Lianghua, Budzik Jonathan M., Joachimiak Andrzej, He Chuan, Schneewind Olaf, Missiakas Dominique. Capsule anchoring in Bacillus anthracis occurs by a transpeptidation reaction that is inhibited by capsidin. Molecular Microbiology. Jan. 2009; 71 (2): 404-420. 160. Ryu Chunsun, Lee Kyunghee, Yoo Cheonkwon, Seong Won Keun and Oh Hee-Bok. Sensitive and rapid quantitative detection of anthrax spores isolated from soil samples by real-time PCR. J. Microbiol. Immunol., 2003; 47 (10): 693-699. 161. Schofield D.A., Westwater C. Phage-mediated bioluminescent detection of Bacillus anthracis. Journal of Applied Microbiology. Nov. 2009; 107 (5): 14681478. 162. Siamudaala Victor M., Bwalya John M., Munang'andu Hetron M., Sinyangwe, Peter G., Banda Fred, Mweene Aaron S., Takada Ayato, Kida Hiroshi. Ecology and epidemiology of anthrax in cattle and humans in Zambia. Japanese Journal of Veterinary Research, 2006; 54 (1): 15-23. 135 163. Smith H., Keppier J. Observation on experimental anthrax: demonstration of a specific lethal factor produced in vivo by Bacillus anthracis //Nature. 1954; 173: 689-690. 164. Sternbach G. The History of Anthrax. J Emerg. Med 2002; 24 (4):463-467. 165. Sweeney Daniel A., Hicks Caitlin W., Cui Xizhong, Yan Li and Peter Q. Eichacker. Anthrax Infection. American J. of Respiratory and Critical Care Med. Dec. 2011; 184 (12): 1333-1341. 166. Tasota Frederick J., Henker Richard A. and Hoffman Leslie A. Anthrax as a biological weapon: an old disease that poses a new threat. Crit Care Nurse.Octo. 2002; 22 (5): 21-34. 167. Woods CW, Ospanov K, Myrzabekov A, Favorov M, Plikaytis B, Ashford DA: Risk factors for human anthrax among contacts of anthrax infected livestock in Kazakhstan. American Journal Tropical Medicine Hygiene. Jul 2004; 71 (1): 4852. 168. Zornetta Irene, Brandi Lucia, Janowiak Blythe, Molin Federica Dal, Tonello Fiorella, Collier R. John, Montecucco Cesare. Imaging the cell entry of the anthrax oedema and lethal toxins with fluorescent protein chimeras. Cell. Microbiology. Oct. 2010; 12 (10): 1.
