Клиническая лабораторная диагностика диагностика

Государственное бюджетное образовательное
высшего профессионального образования
«Сибирский государственный медицинский университет»
Министерства здравоохранения Российской Федерации
(ГБОУ ВПО СибГМУ Минздрава России)
Научно-образовательный курс
Клиническая лабораторная
диагностика
При поддержке Федеральной целевой программы «Научные и научнопедагогические кадры инновационной России» на 2009 – 2013 годы»
Соглашение на предоставление гранта от 23 октября 2012 г. № 8302
Томск, 2013
Введение
Интенсивное развитие и внедрение достижений научнотехнического прогресса в медицинскую практику
послужило основой для значительного расширения
арсенала высокотехнологичных методов анализа в
клинической лабораторной диагностике.
В настоящее время специалисту в области лабораторной
медицины широко доступны иммунологические,
молекулярно-генетические, фотометрические и другие
технологии, обладающие высоким диагностическим и
прогностическим потенциалом.
Введение
В настоящем курсе представлен материал об основных
современных
лабораторных
диагностических
технологиях, принципах их работы и областях
применения.
Данная информация в одинаковой мере будет полезна
специалистам
лабораторной
медицины,
врачам
клинических
специальностей
и,
безусловно,
работникам научно-исследовательской сферы.
Применение выделенных клеток иммунной
системы:
I уровень:
фагоцитоз частиц латекса (фагоцитарный показатель,
поглотительная активность);
микробицидная активность кислородозависимых систем
нейтрофилов (НСТ -тест);
II уровень:
Т-лимфоциты, Т-хелперы, Т-цитотоксические, NKлимфоциты, моноциты (проточная цитометрия);
пролиферативный ответ Т- и В- лимфоцитов на митогены
(РБТЛ)
исследование продукции цитокинов в культуре клеток
Определение антителозависимой клеточной
цитотоксичности, определение активности естественных
киллеров
РТМЛ
Получение лейкоконцентратов:
• Гепаринизированные растворы
Гепарин может изменять ход процессов,
связанных с пролиферацией и направленностью
дифференцировки клеток
• Раствор желатина
Желатин опсонизирует лейкоциты, увеличивая их
способность к адгезии и агрегации
• Раствор ЭДТА
ЭДТА снижает вероятность слипания лейкоцитов,
однако может вызвать нарушение их
функциональной активности и ряда кальцийзависимых ферментативных систем
Получение лейкоконцентрата с
помощью гепаринизированных
растворов:
Кровь забирают в пробирку с гепарином
Центрифугируют при 1500-2000 об/мин в
течение 15-20 минут, после чего оставляют на
1-2 часа при комнатной температуре
При этом жидкость разделяется на три части
Лейкоцитарную пленку собирают и
переносят в пробирку с изотоническом
раствором хлористого натрия на фосфатном
буфере
 Два-три раза отмывают клеточную
суспензию
Выделение фракции гранулоцитов:
Выделение фракций гранулоцитов и
мононуклеаров основано на различной
плотности клеток крови, что позволяет выделять
их в градиенте плотности. Гранулоциты
выделяют в градиенте декстрана, фиколлверографина или перкола.
Выделение фракции мононуклеаров:
Мононуклеары чаще всего выделяют методом
дифференциального центрифугирования в
градиенте фиколл-верографина с плотностью
1.077 г/см3. Кровь наслаивают на фиколл, после
чего центрифугируют. Эритроциты оседают на
дно, над ними фиколл, над которым
располагается кольцо мононуклеаров.
Рост клеток в культуре:
Начальная фаза, получившая название «лаг-фаза»,
характеризуется низкой активностью клеток, которые в это
время начинают адаптироваться к новым условиям обитания.
Обычно он длиться от нескольких часов до 1-2 суток, после чего
клетки вступают в фазу логарифмического роста (лог-фаза).
Как правило, во втором периоде наблюдается увеличение
количества клеток за счет процессов пролиферации.
Увеличение клеточной массы в это время может быть связано с
разрастанием и гипертрофией, не сопровождаясь делением
клеток.
После завершения активной фазы роста культура переходит в
стационарное состояние, когда количество образовавшихся и
погибших клеток находится в динамическом равновесии (фаза
насыщения). По мере старения клеток, истощения питательной
среды, накопления продуктов метаболизма происходит
постепенная дегенерация клеток в культуре (фаза деградации).
Их количество снижается, процессы инволюции системы
преобладают над способностью к самообновлению.
Системы культивирования клеток
• Непроточные культуры - по мере роста
клеток происходит использование
питательных веществ и накопление
метаболитов
• Проточные культуры - постоянное
вхождение среды в культуру и
одновременное удалением равного объема
среды с клетками
Культуральные среды
• Основу питательных сред составляют солевые
растворы
• Для поддержания рН в большинстве сред
используется бикарбонатный буфер: HCO3 =
CO2 + OH
• Как правило, для создания подходящих
условий культивирования клеток в
стандартные среды вводят различные добавки
• Сыворотка используется в качестве добавки в
большинстве культуральных сред. Содержит
гормоны, ростовые факторы, молекулы
адгезии, транспортные белки, витамины,
сахара, липиды и другие активные вещества.
Добавочные компоненты культуральных сред
Компонент
L-глутамин
Альбумин
Назначение
Незаменимая аминокислота
Исполняет роль буфера, транспортирует многие
белковые и липидные соединения, обладает
способностью связывать металлы, гидрофобные
субстанции и аминокислоты.
Липиды из бобов В составе многих бессывороточных сред.
сои
Выпускаются
в
виде
липосом
(40%
триглицеридов, 60% фосфатидов)
2-меркаптоэтанол Антиоксидант, вызывает реактивацию многих
и α-тиоглицерол ферментов, используется при культивировании
лимфоидных клеток
Стрептомицин,
Предотвращают бактериальный рост
пенициллин,
Факторы роста
Добавляют в среду определенные факторы роста,
в зависимости от типа культивируемых клеток
Стимуляторы пролиферации
Для Т-клеток:
• фитогемагглютинин (ФГА) – лектин из фасоли (Phaseolus
vulgaris)
• конканавалин А (Кон-А) – лектин из растения Canavalia
ensiformis
Для В-клеток
• лектин лаконоса, выделяемый из фитолакки (Phytolacca
americana);
• липополисахариды (ЛПС), выделяемые из грамотрицательных
бактерий
Для оптимальной пролиферации, дифференцировки и
последующей продукции антител В-лимфоциты нуждаются так
же в сигналах макрофагов и Т-хелперов. Роль вспомогательных
клеток могут играть продуцируемые ими лимфокины
Иммуноферментный анализ — лабораторный
иммунологический метод качественного или
количественного определения различных соединений,
макромолекул, вирусов и пр., в основе которого лежит
специфическая реакция антиген-антитело. Выявление
образовавшегося комплекса проводят с
использованием фермента в качестве метки для
регистрации сигнала.
Любой вариант ИФА содержит 3 обязательные
стадии:
• Стадия узнавания тестируемого соединения
специфическим к нему антителом, что ведет
к образованию иммунного комплекса;
• Стадия формирования связи конъюгата с
иммунным комплексом или со свободными
местами связывания;
• Стадия превращения ферментной метки в
регистрируемый сигнал.
Твердофазный ИФА
• Адсорбция антигенов или антител на твердой фазе.
• В сенсибилизированных лунках инкубируют исследуемый образец. В
лунках с положительным контролем – стандартные реагенты. При
этом на поверхности твердой фазы формируются иммунные
комплексы.
• При добавлении конъюгата антитело-фермент или антиген-фермент
и связывании его с иммобилизованным иммунным комплексом
активный центр фермента остается доступным для последующего
взаимодействия с субстратом. Инкубация субстрата в лунках с
иммобилизованным конъюгатом приводит к развитию цветной
реакции. Эту реакцию можно остановить на нужной стадии,
выраженность окрашивания можно оценить визуально или по
оптической плотности.
• Важный этап любого варианта твердофазного анализа – процедура
отмывки от несвязавшихся реагентов. Важно не просто сполоснуть
фиксированные на твердой фазе компоненты, а удалить реагенты из
всей глубины слоя.
Прямой ИФА
• В качестве контроля
используют лунки с
адсорбированным
положительным
контрольным
образцом, в котором
обязательно
содержится искомый
антиген, и
отрицательным
контрольным
образцом заведомо
не содержащим
исследуемого
антигена.
Непрямой ИФА
1. Антиген адсорбируют на
твердой фазе, затем отмывают.
2. Блокируют свободные места
связывания. Отмывают.
3. В лунки вносят исследуемый
материал, инкубируют,
проводят процедуру отмывки.
Параллельно ставят пробы с
положительным и
отрицательным контролями.
4. Добавляют антиглобулиновый
конъюгат в рабочем
разведении, инкубируют,
отмывают.
5. Вносят субстрат, инкубируют.
Добавляют стоп-раствор.
6. Измеряют количество продукта
реакции на ИФА-ридере
«Сэндвич»метод ИФА
Конкурентный ИФА
1. На твердой фазе иммобилизуют специфические
для выявляемого антигена моноклональные
антитела.
2. В лунки панелей вносят в известной
концентрации антиген, меченный ферментом, и
исследуемый образец. Проводят инкубацию и
отмывку. Параллельно в соседних лунках ставят
положительный и отрицательный контроли. Для
построения калибровки используют стандартный
немеченый антиген в различных разведениях.
3. Добавляют субстрат, инкубируют, останавливают
реакцию при развитии оптимального
окрашивания в лунках с положительным
контролем.
4. Учет реакции на ИФА-ридере.
Ингибиторный ИФА
1. В лунках панелей адсорбируют стандартный
антиген. Подбирают рабочее разведение
меченых антител с помощью титрования
2. Проводят предварительную инкубацию
конъюгата в разведении, предшествующем
рабочему, с разведениями исследуемого
образца, стандартного антигена и
положительных контрольных проб.
3. Смесь переносят в лунки панелей. Для контроля
100%-ного связывания в несколько лунок вносят
только меченые антитела, без ингибирующего
антигена. Панели инкубируют, затем проводят
отмывку.
4. Добавляют субстрат.
5. Проводят учет результатов.
Метод иммуноферментных пятен (ELISPOT)
1. На поверхности полистироловой лунки сорбируют антигены
или антитела, которые служат «ловушечными» реагентами.
2. Добавляют исследуемые лимфоидные клетки, культивируют
несколько часов при 37°С, давая им возможность занять
определенное место и выполнить секреторную функцию.
Антитела или антигены, секретируемые такими клетками,
улавливаются адсорбированными на твердой фазе реагентами.
3. Клетки удаляют, используя для этого отмывающий раствор с
детергентом, лизирующим клетки.
4. Участки накопления секреторных продуктов проявляют,
добавляя связанные с ферментом антитела (антиглобулиновый
реагент).
5. Добавляют смесь субстрата с агарозой (используемые
субстраты должны растворяться в агарозе и образовывать
нерастворимые продукты реакции), на поверхности твердой
фазы образуются коричневые или голубые пятна (в
зависимости от используемых ферментов и субстратов),
выявляя участки, где располагались клетки.
Практическое применение ИФА
• массовой диагностики инфекционных заболеваний
(выявление различных специфических антигенов или
антител к ним);
• выявления и определения уровня гормонов и
лекарственных препаратов в биологических образцах;
• определения изотипов (IgG, IgM и другие) антител
против конкретного антигена;
• выявления иммунных комплексов;
• выявления онкомаркеров;
• определения белков сыворотки крови (ферритин,
фибронектин и др.);
• определения общего IgE и специфических IgE
антител;
• скрининга моиоклональных антител;
• определения цитокинов в биологических жидкостях.
Задачи, которые можно решать с помощью ПЦР
1. Позволяет амплифицировать желаемый участок ДНК, даже если
препарат содержит суммарную клеточную ДНК.
2. Можно апмлифицировать ДНК, присутствующую в ничтожно малых
количествах.
3. Возможен анализ препаратов содержащих сильно деградированную
ДНК.
4. Изучение эволюционно консервативных последовательностей.
5. Анализируемый материал может быть представлен не только ДНК, но и
РНК.
Механизм ПЦР
Компоненты реакционной смеси
Праймеры – искусственно синтезированные олигонуклеотиды, имеющие размер от 15 до 30
нуклеотидов, идетичные соответствующим участкам ДНК-мишени. Они играют ключевую роль в
образовании продуктов реакции амплификации. Правильно подобранные праймеры обеспечивают
специфичногсть и чувствительность тест-системы и должны отвечать ряду критериев:
• Быть специфичными
• Не должны образовывать димеры и петли
• Область отжига праймеров должна находится вне зон мутаций, делеций или инсерций.
Taq-полимераза – термостабильный фермент, обеспечивающий достраивание 3’ –конца второй
цепи ДНК согласно принципу комплементарности.
Смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов (дНТФ)
Буфер – смесь катионов и анионов в определенной концентрации, обеспечивающей оптимальные
условия для реакции, а также стабильное значение pH.
Анализируемый образец – подготовленные к внесению в реакционную смесь препарат,
который может содержать искомую ДНК, например, ДНК микроорганизмов, служащую мишенью
для последующего многократного копирования.
Этапы ПЦР
1. Денатурация – это переход ДНК из двухнитевой формы в однонитевую при
разрыве водородных связей между комплементарными парами оснований под
воздействием высоких температур.
2. Отжиг – это присоединение праймеров к одноцепочечной ДНК-мишени.
Праймеры подбирают так, что они ограничивают искомый фрагмент и
комплементарны противоположными цепями ДНК. Отжиг происходит в
соответствии с правилом комплементарности Чаргаффа.
3. Элонгация (синтез) – после отжига праймеров Taq-полимераза начинает
достраивание второй цепи ДНК с 3’-конца праймера. Температуру в
реакционной смеси доводят до оптимума работы Taq-полимеразы, которая с
максимальной эффективностью начинает синтез второй цепи ДНК от 3’-конца
праймера, связанного с матрицей, и движется в направлении от 3’ к 5’ концу.
«Эффект плато»
Термин «эффект плато» используют для описания процесса накопления
продуктов ПЦР на последних циклах амплификации, когда количество
ампликонов достигает 0,3 – 1 пмолей.
В зависимости от условий и количества циклов реакции амплификации, на
момент достижения «эффекта плата» влияют:
• Утилизация субстратов (дНТФ и праймеров)
• Стабильность реагентов (дНТФ и фермента)
• Количество ингибиторов, включая пирофосфаты и ДНК-дуплексы
• Неспецифические продукты и праймеры-димеры, конкурирующие за
праймеры, дНТФ и полимеразу.
• Концентрация специфического продукта за счет неполной денатурации
при высокой концентрации ампликонов.
Способы постановки ПЦР
ПЦР с «горячим» стартом (hot-start PCR) – модификация, суть которой состоит в
предотвращении возможности начала реакции до момента достижения в пробирке
условий, обеспечивающих специфический отжиг праймеров.
ПЦР с обратной транскрипцией – используется для амплификации, выделения
или идентификации известной последовательности РНК. На первом этапе с помощью
ревертазы (обратной транскриптазы), используя в качестве матрицы мРНК, проводят
синтез одноцепочечной молекулы ДНК, которая используется для последующей ПЦР.
ПЦР с анализом результатов «по конечной точке» (End-point PCR) – это
модификация метода ПЦР, которая позволяет учитывать результаты реакции по
наличию флуоресценции после амплификации, не открывая пробирки. Таким образом,
решается одна из основных проблем ПЦР – проблема контаминации ампликонами.
ПЦР в режиме «реального времени» (Real-time PCR) – используется для
одновременной амплификации и измерения количества молекулы ДНК.
Преимуществом данного подхода является возможность совмещения детекции и
количественного определения специфической последовательности ДНК в образце в
реальном времени после каждого цикла амплификации.
Мультиплексная ПЦР – это одновременная амплификация двух и более
последовательностей ДНК в одной пробирке. Преимуществом данного метода является
возможность выявления ряда патогенов, генетических модификаций организмов или
генотипирования множественных аллелей.
Способы постановки ПЦР
Гнездовая ПЦР – применяется для уменьшения числа побочных продуктов
реакции.
ПЦР «инвертированная» – используется в том случае, если известен лишь
небольшой участок внутри нужной последовательности. Этот метод полезен, когда
нужно определить соседние последовательности после вставки ДНК в геном.
Ассиметричная ПЦР – проводится тогда, когда нужно амплифицировать
преимущественно одну из цепей исходной ДНК. Используется в некоторых
методиках секвенирования и гибридизационного анализа.
ПЦР длинных фрагментов (Long-range PCR) – вариант ПЦР для
амплификации протяженных участков ДНК (10 тысяч и более оснований).
Групп-специфическая ПЦР – ПЦР с использованием консервативных
праймеров к последовательностям ДНК для родственных групп внутри одного или
между разными видами.
Детекция результатов ПЦР
На сегодняшний день существует несколько основных способов детекции результатов
ПЦР:
• Электрофоретический (в агарозном или полиакриламидном геле)
•
Гибридизационно-ферментный
Гибридизационно-флуоресцентный:
- регистрация продукта после окончания реакции амплификации – «анализ по
конечной точке»;
- детекция продукта в режиме «реального времени»
•
Вестерн блоттинг (белковый
иммуноблот)
Метод вестерн-блоттинг позволяет определить
искомый белок в общей смеси белков:
получить информацию о молекулярной
массе (kDa) и о содержании в пробе.
Общая схема идентификации белков методом вестерн-блоттинга
Этапы вестерн-блотинга
Подготовка образца
Гель-электрофорез
Перенос на мембрану
Блокирование
Детекция
Подготовка образца
• Образец из цельной ткани или из клеточной
культуры.
• Твёрдые ткани сначала измельчаются механически с
использованием гомогенизатора или обработки
ультразвуком.
• Различные детергенты, соли и буферы применяются
для улучшения лизиса клеток и растворения белков.
• Ингибиторы протеаз и фосфатаз добавляются для
предотвращения расщепления образцов их
собственными ферментами.
• Подготовка тканей часто выполняется при низких
температурах, чтобы избежать денатурации белка.
Гель-электрофорез
• Белки разделяются при
помощи электрофореза в
полиакриламидном геле.
• Разделение белков можно
производить по
изоэлектрической точке (pI),
молекулярной массе,
электрическому заряду или
по сочетанию этих
параметров.
• Присутствие
додецилсульфата натрия
(SDS) вызывает денатурацию
белков и поддерживает их в
денатурированном состоянии
Перенос на мембрану
• Чтобы сделать белки доступными для
антител и дальнейшей детекции, их вместе с
полоской геля переносят на мембрану,
изготовленную из нитроцеллюлозы или
поливинилиденфторида.
• Мембрана накладывается поверх геля, а
поверх неё кладут стопку фильтровальной
бумаги. Всю стопку помещают в буфер для
переноса, который продвигается верх по
бумаге под действием капиллярных сил,
уносит с собой белки.
• Другой метод переноса белков называется
электроблоттингом и использует
электрический ток, который переносит белки
из геля на мембрану.
Блокирование
• Требуется для исключения неспецифическоого
связвания антитела с мембраной.
• Для блокирования используют бычий
сывороточный альбумин (BSA) или обезжиренное
сухое молоко, с небольшим процентом детергента
типа Tween 20.
Детекция
•Колориметрическая детекция
•Хемилюминесцентная
детекция
•Радиоактивная детекция
•Флюоресцентная детекция
Применение иммуноблота
• Иммуноблотинг применяется в диагностике
бактериальных инфекций
• В диагностике вирусных инфекций, например ВИЧ,
коронавирус, вызывающий САРС или вирус простого
герпеса (HSV).
• Можно диагностировать некоторые паразитические
болезни, как финноз
• Возможно проведение подробного анализа
антигенспецифических-IgE (АС-IgE) к различным
компонентам сложных аллергенов.
Цитохимия
основывается на использовании цветных
химических реакций для определения
химической природы клеток и выявления в них
метаболически активных энзимов и веществ
Недостатком всех цитохимических реакций
является их приблизительная качественная
оценка, основанная на степени интенсивности
окраски
Наиболее часто проводятся
следующие цитохимические
исследования:
определение гликогена
определение липидов
определение активности ферментов:
миелопероксидазы,
щелочной фосфатазы,
кислой фосфатазы,
неспецифических эстераз (альфанафтилацетат-эстеразы, кислой альфанафтилацетат-эстеразы, нафтол-AS-ацетатэстеразы, нафтол-AS-D-хлорацетат-эстеразы)
Выявление углеводов (гликоген)
• ШИК-реакция=PAS-реакция (Periodic Acid
Schiff)
• Принцип метода: под влиянием перйодата
калия гликоген окисляется с образованием
альдегидных соединений, легко
реагирующих с реактивом Шиффа (фуксинсернистая кислота) → вишневофиолетовое окрашивание
Выявление миелопероксидазы (МП)
Служит маркером клеток нейтрофильного
ряда
Активность обнаруживается на стадии
миелобласта и возрастает в процессе
созревания клетки, наибольшая активность в
промиелоцитах.
Принцип метода: в присутствии
миелопероксидазы бензидин окисляется
перекисью водорода в коричневый
оксибензидин
Выявление липидов
Для выявления нейтрального жира
пользуются суданом III
III, окрашивающим
жир в оранжевый цвет
Судан черный B окрашивает
фосфолипиды в черный цвет
Липиды выявляются параллельно с
миелопероксидазой, но могут
обнаруживаться и в менее зрелых клетках
α-Нафтилацетат-эстераза
• Обнаруживается во всех миелоидных клетках
• Наибольшая активность в моноцитах, в
которых присутствует изоформа αНАЭ,
подавляемая фторидом натрия (NaF) свойственная только клеткам моноцитарной
линии
Хлорацетат-эстераза (хаэ)
маркер клеток нейтрофильного ряда (как и МП)
Сдвоенную реакцию на ХАЭ и αНАЭ проводят последовательно
на одном мазке - разделение клеток гранулоцитарной и
моноцитарной линий (для диагностики миеломоноцитарного
лейкоза)
Иммунофлюоресцентный
метод – это
иммунохимический метод,
основанный на использовании
явления флюоресценции для
исследования реакции антигенантитело, происходящей на
поверхности клеток или в
срезах тканей.
Антитела,
меченые
флюоресцентными
красителями, связываются с антигенами,
которые
фиксированы
в
ткани
либо
присутствуют на клетках.
Обнаружение свечения флюорофора с помощью
люминесцентного
микроскопа
или
фотодетекторов
позволяет
локализовать
антигены, присутствующие в анализируемом
субстрате
 Применяется для экспресс-диагностики
инфекционных заболеваний
(идентификация возбудителя в
исследуемом материале), а также для
определения антител.
 Реакция иммунофлюоресценции - самая
чувствительная реакция для
диагностики сифилиса (положительна
уже при серонегативной стадии
заболевания).
К недостаткам данного вида диагностики
можно отнести:
• необходимую высокую квалификацию
лабораторного работника,
• недостаточная точность диагностики,
• исследуемого материала должно быть
достаточно много,
• заболевание должно находиться уже в активной
фазе.
К преимуществам РИФ относится простота и
быстрота метода. Анализ может быть готов уже
через час. Однако, так как точность находится
в пределах 60-80%, поэтому требует
подтверждения другими методами
исследования.
Прямая реакция
иммунофлюоресценции
Прямой метод РИФ основан на том,
что антигены тканей или
микробы, обработанные
иммунными сыворотками с
антителами , меченными
флюорохромами, способны
светиться в УФ-лучах
люминесцентного микроскопа.
Бактерии в мазке, обработанные
такой люминесцирующей
сывороткой, светятся по
периферии клетки в виде каймы
зеленого цвета.
РПИФ используют для изучения клеточных
антигенов, выявления вируса в зараженных клетках и
обнаружения бактерий и риккетсий в мазках. Так,
для диагностики бешенства отпечатки кусочков мозга
животных, подозреваемых на вирусоносительство,
обрабатывают люминесцирующей антирабической
сывороткой. При положительном результате в
цитоплазме нервных клеток выявляются глыбки
ярко-зеленого цвета.

В диагностике аутоиммунных заболеваний метод
прямой иммунофлюоресценции используется для
обнаружения отложений иммуноглобулинов и
факторов комплемента в биопсиях кожи и почек.
Реакция непрямой
иммунофлюоресценции
Непрямой метод
иммунофлюоресценции
(РНИФ) заключается в
выявлении комплекса
антиген - антитело с
помощью
антиглобулиновой
сыворотки, меченной
флюорохромом
Проточная цитометрия
Современная технология быстрого
оптического измерения параметров
клетки, ее органелл и происходящих в
ней процессов.
Причём, степень световой дисперсии
позволяет получить представление о
размерах и структуре клетки.
Кроме того, в ходе анализа учитывается
уровень флуоресценции химических
соединений, входящих в состав клетки
(аутофлюоресценция) или внесённых в
образец перед проведением проточной
цитометрии.
Методика заключается в выявлении
рассеяния света лазерного луча при
прохождении через него клетки в струе
жидкости
Принцип метода
• Клеточная суспензия, предварительно
меченная флюоресцирующими
моноклональными антителами или
флуоресцентными красителями, попадает в
поток жидкости, проходящий через
проточную ячейку
• Условия подобраны таким образом, что клетки
выстраиваются друг за другом за счет так
называемого гидродинамического
фокусирования струи в струе
Гидродинамическое
фокусирование
Суспензия клеток под
давлением подается в
проточную ячейку, где за
счет разности давлений
между образцом и
обтекающей жидкостью
клетки, находясь в
ламинарном потоке
жидкости,
выстраиваются в цепочку
друг за другом (т.н.
гидродинамическое
фокусирование).
Образец
Обжимающая
жидкость
Луч лазера
Параметры клеток,
регистрируемые при помощи проточного цитометра
Боковое
светорассеяние
Прямое
(малоугловое)
светорассеяние
Лазер
Y
Регистрация
флуоресценции
Проточная цитометрия
Применение
Детектирование/Количественное
определение
Мембранные структуры
 антигены/рецепторы
бактерии/грибы/водоросли ...
 внутриклеточные структуры.
 Цитокины
 Ферменты
 ДНК/РНК ...
Проточная цитометрия
Основные преимущества
• Анализ большого количества
клеток
(107 клеток)
• Короткое время анализа (сек)
• Логические ограничения
допускают детектирование
субпопуляций клеток
• Измерение редко встречающихся
клеток
• Объективное измерение
интенсивности флуоресценции
• Одновременное детектирование
нескольких параметров на клетке
Области применения
проточной цитометрии
КЛИНИЧЕСКИЕ:
иммунология,
ОБЩЕБИОЛОГИЧЕСКИЕ:
клеточная кинетика,
онкология (включая мониторинг
пациентов, входящих в группу риска),
трансплантология,
изучение механизмов действия
различных иммуномодуляторов и
других биологически активных
веществ,
общая гематология,
диагностическое типирование клеток и
др.
клеточная физиология и др.
Принцип метода
Спектрофотометрия — оптический метод
исследования веществ, основанный на определении
интенсивности поглощения света веществом
(абсорбционная спектрофотометрия) или
интенсивности излучения им света (эмиссионная
спектрофотометрия) в зависимости от длины волны.
Получаемые при этом (при помощи специальных
приборов — спектрофотометров) абсорбционные и
эмиссионные спектры являются характерными для
каждого данного вещества.
Различают спектрофотометрию в ультрафиолетовой
(УФ), видимой и инфракрасной (ИК) областях
спектра.
Применение
1. Измерение концентрации белков и нуклеиновых
кислот
2. Оценка кровоснабжения тканей на основе
измерений степени оксигенации гемоглобина.
3. Измерение рН среды с помощью веществ,
изменяющих спектр поглощения с изменением рН.
4. Определение концентрации различных
лекарственных средств, имеющих характерные
спектры поглощения (рутин, берберин).
5. Отслеживание динамики размножения
микроорганизмов по изменению оптической
плотности среды, в которой они находятся.
В условиях современного темпа развития медицинских
технологий знание базовых принципов, лежащих в основе их
работы, значительно облегчает внедрение и освоение новых
видов лабораторного анализа.
Умение взвешенно и грамотно подойти к выбору комплекса
взаимодополняющих
методов
исследования
позволяет
значительно
повысить
информативность
полученных
результатов, сформировать более целостное представление о
механизмах изучаемых процессов. Актуально это как в
практической медицине, так и в научно-исследовательской
деятельности.