Гарайшина Э.С. Влияние выбросов автотранспорта на
реклама
МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ОБРАЗОВАНИЮ ФГАОУВПО «КАЗАНСКИЙ (ПРИВОЛЖСКИЙ) ФЕДЕРАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ» ИНСТИТУТ ФУНДАМЕНТАЛЬНОЙ МЕДИЦИНЫ И БИОЛОГИИ КАФЕДРА БИОЭКОЛОГИИ Специальность: 020803.65 – биоэкология Специализация: биолог-эколог ВЫПУСКНАЯ КВАЛИФИКАЦИОННАЯ ДИПЛОМНАЯ РАБОТА СТУДЕНТКИ V КУРСА ГАРАЙШИНОЙ ЭЛЬВИНЫ СИРИНЬЕВНЫ ВЛИЯНИЕ ВЫБРОСОВ АВТОТРАНСПОРТА НА СОДЕРЖАНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ В РАСТЕНИЯХ ГОРЦА ПТИЧЬЕГО (POLYGONUM AVICULARE L.) Работа завершена: «_____»_____________ 2014 г. ______________________(Э.С. Гарайшина) Работа допущена к защите: Научный руководитель кандидат биологических наук, доцент «_____»______________ 2014 г. ______________________(Н.С. Архипова) Заведующий кафедрой доктор биологических наук, профессор «_____»______________ 2014 г. ______________________(И.И.Рахимов) Казань - 2014 2 Оглавление Введение .................................................................................................................. 5 Глава 1. Особенности метаболизма растений в условиях антропогенного загрязнения среды ................................................................................................. 8 1.1. Автомобильные выбросы как один из основных источников загрязнения окружающей среды в условиях урбанизированных территорий ....................... 8 1.2. Флавоноиды растений: разнообразие, значение, особенности накопления ................................................................................................................................. 11 1.3. Влияние экологических факторов на накопление флавоноидов .............. 16 1.4. Пигментная система растений: характеристика, значение, особенности накопления ............................................................................................................. 20 1.5. Содержание флавоноидов и хлорофилла в растениях как индикатор состояния окружающей среды ............................................................................. 30 Глава 2. Материалы и методы исследования ............................................... 31 2.1. Характеристика объекта и участков исследования .................................... 31 2.2. Сбор растительного сырья и подготовка образцов для анализа ............... 35 2.3. Методика количественного определения суммы флавоноидов в растительном сырье спектрофотометрическим методом ................................. 38 2.4. Количественное определение пигментов .................................................... 42 2.5. Методика определения выбросов автомобильного транспорта ................ 43 2.6. Статистическая обработка результатов исследования ............................... 46 Глава 3. Результаты и их обсуждение ............................................................. 46 3.1. Оценка степени загрязнения атмосферного воздуха исследуемых участков .................................................................................................................. 47 3.2. Оценка количественного содержания флавоноидов в надземной массе Polygonum aviculare L. в зависимости от условий произрастания ................... 48 3 3.3. Исследование суммарного содержания хлорофилла и соотношения его форм в растениях Polygonum aviculare L. ........................................................... 54 Выводы .................................................................................................................. 61 Литература............................................................................................................ 62 Приложения 4 Введение Образование и накопление в растениях биологически активных веществ (БАВ) является динамическим процессом, изменяющимся в онтогенезе растения, а также зависящим от многочисленных факторов окружающей среды [Харборн, 1968; Запрометов, 1974; Минаева, 1978].Из литературных источников известно [Благовещенский, 1966; Gollmick и др.1970; Ноздрюхина и др. 1980; Ильин, 1989; Олешко и др., 1997; Трембаля, 1997], что от наличия биологически активных веществ, к которым относятся флавоноиды, алколоиды, гликозиды и многие другие соединения,зависят процессы метаболизма растений. Флавоноиды являются наиболее обширной группой фенольных соединений и важной составной частью растительного организма. Они принимают активное участие в окислительно-восстановительных процессах в растениях, являются пероксидазной системы необходимыми растений, компонентами играют роль дыхательной поглотителей ультрафиолетовых лучей, предохраняя тем самым хлорофилл и цитоплазму [Благовещенский, 1966; Георгиевский и др., 1989; Кенжебаева и др., 1998]. Полагают, что флавоноиды являются неотъемлемой частью высших растений и участвуют в важных процессах обмена веществ [Гусев и др., 2004]. Ряд авторов выдвигает предположения о том, что флавоновые соединения повышают толерантность растений к неблагоприятным условиям среды [Георгиевский и др.,1989; Олешко и др., 1997]. Известно, что в нетипичных для вида местообитаниях его флавоноидный комплекс существенно меняется и не совпадает с аналогичными профилями, характерными для вида в данном регионе [Олешко и др., 1997]. Растения являются неисчерпаемым источником сырья для получения лекарственных средств. Безопасность использования получаемых из растительного сырья препаратов напрямую связана с экологическим состоянием мест произрастания используемой флоры [Великанова, 2013]. 5 Обильные массивы горца птичьего, с учетом экологической чистоты, могут быть рассмотрены с позиций возможного использования в качестве дешевого источника этих ценных биологически активных соединений. Целью исследования было изучить влияние автомобильных выбросов на содержание биологически активных веществ - флавоноидов и хлорофиллов - в растениях горца птичьего (PolygonumaviculareL.), собранных в разных с экологической точки зрения районах города Казани. Задачи: 1. Оценить уровень загрязнения атмосферного воздухаисследуемых участков по количественному и качественному составу выбросов автотранспорта. 2. Провести сравнительный анализ количественного состава флавоноидов и хлорофиллов в растениях PolygonumaviculareL.,собранного в различных условиях произрастания. 3. Выявить корреляционную зависимость содержания флавоноидов и хлорофиллов от компонентов выбросов автотранспорта и оценить возможные механизмы адаптации PolygonumaviculareL.к влиянию антропогенного загрязнения среды. Актуальность.В настоящее время актуальна проблема загрязнения окружающей наиболее среды автомобильными распространенными выбросами, загрязняющими которые являются веществами на урбанизированных территориях. Загрязнения автотранспорта приводит к изменениям физиологических свойств растений [Гусев и др., 2004]. Сведений по изучению флавоноидов горца птичьего (PolygonumaviculareL.) мало, и поэтому представляет интерес их изучения, так как горец птичийявляется, во-первых, лекарственным растением, естественных а во-вторых, растительных наиболее типичным сообществ, так и представителем, урбанотерриторий. как В настоящее время ведется поиск источников флавоноидов и интересна зависимостьих от различных стрессовых воздействий. 6 Научная новизна. Впервые проведена оценка корреляционных зависимостей флавоноидов и компонентов выбросов для горца птичьего (PolygonumaviculareL.). Изучены закономерности их изменения в онтогенезе; получены данные, свидетельствующие о возможности биоиндикации окружающей среды с помощью PolygonumaviculareL. 7 Глава 1. Особенности метаболизма растений в условиях антропогенного загрязнения среды 1.1.Автомобильные выбросы как один из основных источников загрязнения окружающей среды в условиях урбанизированных территорий В последние десятилетия в связи с быстрым развитием автомобильного транспорта существенно обострились проблемы воздействия его на окружающую среду.Автомобили сжигают огромное количество нефтепродуктов, нанося ощутимый вред главным образом атмосфере. Поскольку основная масса автомобилей сконцентрирована в крупных городах, воздух этих городов не только обедняется кислородом, но и загрязняется вредными компонентами отработавших газов.С каждым годом количество автотранспорта растет, а, следовательно, растет содержание в атмосферном воздухе вредных веществ[Павлова, 2000]. Основными источниками загрязнения воздушного бассейна при эксплуатации автотранспорта являются двигатели внутреннего сгорания, которые выбрасывают в атмосферу отработавшие газы и топливные испарения. В отработавших газах обнаружено около 280 компонентов продуктов полного и неполного сгорания нефтяного топлива, а также неорганические соединения тех или иных веществ, присутствующих в топливе[Денисов и др., 2005]. Отрицательное воздействие автотранспорта на окружающую среду проявляется в различных аспектах. Это и отчуждение земель для строительства дорог, и нарушение экологического равновесия при их строительстве и эксплуатации (изменение ландшафта и «разделяющий эффект», водная и ветровая эрозия, усиление геодинамических процессов, загрязнение местности и вод продуктами эксплуатации автомобилей и дорог, а также потери сельского хозяйства), исчезновение заповедных, нетронутых природных комплексов, ухудшение здоровья человека[Николайкин и др., 2004]. 8 Отработавшие газы двигателей внутреннего сгорания (ДВС) содержат около 200 компонентов. Период их существования длится от нескольких минут до 4-5 лет. По химическому составу и свойствам, а также характеру воздействия на организм человека их объединяют в группы. Первая группа. В нее входят нетоксичные вещества: азот, кислород, водород, водяной пар, углекислый газ и другие естественные компоненты атмосферного воздуха. Вторая группа. К этой группе относят только одно вещество - оксид углерода, или угарный газ (СО). Продукт неполного сгорания нефтяных видов топлива не имеет цвета и запаха, легче воздуха. Оксид углерода обладает выраженным отравляющим действием. Третья группа. В ее составе оксиды азота, главным образом NО оксид азота и NO2 - диоксид азота. Это газы, образующиеся в камере сгорания ДВС при температуре 2800°С. Четвертая группа. В эту группу входят различные углеводороды, то есть соединения типа СХНУ. Они образуются в результате неполного сгорания топлива в двигателе. Углеводородные соединения отработавших газов, наряду с токсическими свойствами, обладают канцерогенным действием. Пятая группа. Ее составляют альдегиды - органические соединения, содержащие альдегидную группу, связанную с углеводородным радикалом. Шестая группа. В нее выделяют сажу и другие дисперсные частицы (продукты износа двигателей, аэрозоли, масла, нагар и др.). Сажа - частицы твердого углерода черного цвета, образующиеся при неполном сгорании и термическом разложении углеводородов топлива. Седьмая группа представляет собой сернистые соединения - такие неорганические газы, как сернистый ангидрид, сероводород, которые появляются в составе отработавших газов двигателей, если используется топливо с повышенным содержанием серы. 9 Восьмая группа. Компоненты этой группы - свинец и его соединения встречаются в отработавших газах карбюраторных автомобилей только при использовании этилированного бензина. Негативное воздействие на экосистемы оказывают не только рассмотренные компоненты отработавших газов двигателей, выделенные в восемь групп, но и сами углеводородные топлива, масла и смазки. В местах заправки транспортных средств топливом и маслом происходят случайные разливы и намеренные сливы отработанного масла прямо на землю или в водоемы. На месте масляного пятна длительное время не произрастает растительность[Павлова, 2000]. Наблюдения за состоянием загрязнения атмосферного воздуха на территории Республики Татарстан проводятся в городах Казань, Набережные Челны и Нижнекамск. Загрязнение атмосферы определяется по значениям концентраций примесей (в мг/м3). Степень загрязнения атмосферы примесью оценивается при сравнении концентрации примесей с ПДК (таблица 1) (предельно допустимая концентрация примеси, установленная Минздравом России) [http://www.tatarmeteo.ru/pub/spravka.pdf]. Таблица 1 Предельно допустимые концентрации (ПДК) загрязняющих веществ в атмосферном воздухе населенных мест Примесь ПДК Оксид углерода, мг/м3 5 Диоксид азота, мг/м3 0.2 Углеводород, мг/м3 300 Диоксид серы, мг/м3 0.5 Формальдегид, мг/м3 0,035 Бенз(а)пирен, мг/м3 0,001 10 1.2.Флавоноиды растений: разнообразие, значение, особенности накопления Изучение флавоноидов относится к началу XIX в., когда в 1814 г. Шевроле выделил из коры особого вида дуба кристаллическое вещество, названное кверцетрином. Спустя 40 лет Риганд установил гликозидный характер этого вещества и агликон назвал кверцетином. В 1903 г. Валяшко установил строение рутина. Систематическое изучение строения природных флавоноидов многие годы проводили польские химики. Большую работу по изучению антоцианов провел Вильштеттер. Исследованиями катехинов занимались А. Л. Курсанов, М. Н. Запраметов, К. Фрейденберг и др. Интерес к флавоноидным соединениям особенно возрос в 40-е годы нашего столетия, флавоноиды привлекают внимание ученых разносторонней биологической активностью и чрезвычайно низкой токсичностью. После 1970 г. выделено свыше 1400 соединений, относящихся к флавоноидам. Перспективным направлением является поиск биологически активных соединений группы ксантонов - близких по строению к флавоноидам[http://www.fito.nnov.ru/special/glycozides/flavo/]. Флавоноидами называется группа природных биологически активных веществ (БАВ) - производных бензо-γ-пирона (рис. 1), в основе которых лежит фенилпропановый скелет, состоящий из С6-С3-С6 углеродных единиц. Это гетероциклические соединения с атомом кислорода в кольце [Яковлева, 2006]. Рис. 1.Структура бензо-γ-пирона При замещении в хромоне атома водорода в α-положении на фенильную группу образуется 2-фенил-(α)-бензо-γ-пирон или флавон (рис.2), 11 который состоит из 2 ароматических остатков А и В и трехуглеродного звена (пропановый скелет) [Cookи др., 1996]. Рис. 2. Структура флавона В зависимости от степени окисления и гидроксилированияпропанового скелета С6-С3-С6 и положения фенильного радикала флавоноиды делятся на несколько групп (рис.3)[Муравьева и др., 2002]. Классификация флавоноидов O O O флавон O изофлавон O OH O флавонол O OH OH O флавонон O флавононол Рис.3. Классификация флавоноидов Флавоны - органические соединения гетероциклического ряда, фенильная группа находится во 2-м положении. Содержатся в цветках пижмы, ромашки. Изофлавоны -фенильная группа находится в 3-м положении. Содержатся в корнях стальника полевого. 12 Флавонолы отличаются от флавонов наличием группы ОН в 3-м положении, наиболее распространенными представителями являются кверцетин, кемпферол. У высших растений особенно часто встречается кверцетин, у однодольных преобладают производные кемпферола [Geissmanи др., 1982]. Флавононы -гидрированное производное флавона, в отличие от флавона не имеют двойной связи между углеродами во 2-м и 3-м положениях.Известно свыше 30 представителей этой группы флавоноидов. Они обнаружены в семействах Rosaceae, Fabaceae и Asteraceae. Флавононолы отличаются от флавонола отсутствием двойной связи между углеродами во 2-м и 3-м положениях. ОН-группа, как и у флавонола, находится в 3-м положении. Скелет флавонола составляет гликозид аромадендрин, содержащийся в листьях эвкалипта. Флавоноиды, которые связаны с одной или более молекулой сахара называют гликозидами флавоноидов. Гликозиды - это сложные безазотистые органические соединения, при гидролизе распадающиеся на сахаристую часть- гликон и несахаристую -агликон или генин. Большинство из флавоноидов находятся в клетках в виде гликозидов (О-гликозидов - основная группа и С-гликозидов (гликофлавоноиды)) или находятся в виде соединений с органическими кислотами [Головкин и др., 2002]. По физическим свойствамфлавоноиды являются кристаллическими веществами с определенной температурой плавления, без запаха, имеющие жёлтый цвет (флавоны, флавонолы), бесцветные (изофлавоны, флаваноны) [Георгиевский и др., 1988].К группе флавоноидов относятся также антоцианы (природные красящие вещества растений), которые окрашиваются поразному в зависимости от ρН среды: в кислой среде они имеют красный цвет (соли катионов), в щелочной - синий (соли анионов). Агликоны флавоноидов, как правило, растворимы в ацетоне, спиртах, органических растворителях и нерастворимы в воде. Гликозиды плохо растворимы в воде, за исключением гликозидов, имеющих в своей молекуле 13 более трёх остатков сахара, не растворимы в органических растворителях (эфире и хлороформе) [Harbomeи др., 2000]. Флавоноидные гликозиды обладают оптической активностью, для них характерна способность к кислотному и ферментативному гидролизу. Скорость гидролиза и условия его проведения различны для различных групп флавоноидов. По химическим свойствам О-гликозиды (цианогенные гликозиды, агликоновый компонент которых образован из α-циангидринов) при действии разбавленных минеральных кислот и ферментов легко гидролизуются до агликона и углеводного остатка. С-гликозиды с трудом расщепляются под действием концентрированных кислот (HCI или СН3СООН) или их смесей при длительном нагревании[Rahiminejadи др.,2004]. Примерами флавоноидов, значимых для человека являются рутин и квертецин. Рутин - органическое соединение из группы флавоноидов, обладающее витаминной активностью. По химической структуре рутин представляет собой 5,7,3’,4’-OH-3-рамноглюкозид (рис. 4) [Беликов, 2007; Головкин и др., 2002]. OH HO O OH O OH Glu-O-Ram O Рис.4. Химическая структура рутина Основные противовоспалительные, функции рутина: антиканцерогенные, антиоксидантные, антитромбические, противоязвенные, антиаллергические, противоотечные, спазмолитические, сахароснижающие, желчегонное действие; коррекция микроциркуляции крови и лимфы; укрепление стенок капилляров, защита от кровоизлияний; уменьшение венозного отека; сдерживание агрегации тромбоцитов; защита 14 от токсинов; увеличение плотности костной ткани; ингибирование альдолазы, трансминазы, С - реактивного белка; ингибирование перекисного окисления липидов; увеличение активности щитовидной железы. активности В адреналина; организме человека снижение рутин не вырабатывается. К основным природным источникам рутина относятся: листья гречихи, листья чайного куста, черная смородина, шиповник, клюква, соки черники и рябины, можжевельник (ягоды), боярышник (бутоны), ромашка (цветы), календула [Головкин и др., 2002; Муравьева, 2002;Государственная фармакопея СССР, 1990]. Кверцетин (рис. 5) является агликоном рутина. По химической структуре кверцетин представляет собой 3,5,7,3'4'-Пентаоксифлавон [Havsteen и др., 1983]. Рис.5. Химическая структура кверцетина К основным функциям кверцетина относится: антиоксидантное, противоотечное, тельное, спазмолитическое, диуретическое, иммуностимулирующее, противовирусное, антигистаминное, противоязвенное, гипотензивное, противодиабетическое, ранозаживляющее, противовоспали- гипогликемическое, геропротекторное, анаболическое действия; снижение проницаемости стенок капилляров; повышение тонуса сосудов; блокада синтеза лейкотриенов и других воспалительных медиаторов; процессы ремоделирования костной ткани; эстрогено-подобное действие; нормализация выработки кортизона и инсулина; защита ЛНПхолестерина от окисления; улучшение реологии крови; угнетение синтеза тромбоксана; поддержка миокарда; стабилизация клеточных мембран; 15 стимуляция ферментных систем; улучшение функций фагоцитов, Т- и Влимфоцитов; транспорт калия и натрия; адаптация к гипоксии; апоптоз раковых клеток. В организме человека кверцетин, как и рутин, не вырабатывается. К основным источникам кверцетина природного происхождения относятся: брусника, черная смородина, малина, ежевика, клюква, черника, рябина, облепиха [Головкин и др., 2002; Муравьева, 2002]. 1.3. Влияние экологических факторов на накопление флавоноидов Синтез и накопление вторичных метаболитов зависят от стадии развития растения и его возраста. Наибольшее количество их накапливается у многих растений в фазе цветения, а в фазе плодоношения уменьшается[Ibrahim и др., 2007]. В то же время общих закономерностей изменений вторичного метаболизма в онтогенезе, по-видимому, не существует. Разворачивание вторичного метаболизма во времени зависит от вида растения, типа вторичного метаболита и его физиологической роли и - очень сильно - от внешних воздействий. Например, максимальный уровень накопления многих изопреноидов (эфирных масел, стероидных гликозидов) часто приходится на период бутонизации и цветения. Синтез алкалоидов закономерно разворачивается в процессе онтогенеза. Например, в семенах и всходах мака алкалоидов нет. Через две недели появляется наркотин, а когда проростки достигают в длину 5-7 см - кодеин, морфин, папаверин, сангвинарин. К моменту цветения к ним прибавляются тебаин и нарцеин. В млечном соке коробочек мака присутствует уже до 25 алкалоидов. Приведенный пример и целый ряд других фактов показывают, что процесс вторичного метаболизма четко работающая система, отслеживающая как внутренние факторы (этапы онтогенеза растения), так и внешние воздействия[Rice-Evansи др., 1996]. Еще больший спектр химической изменчивости наблюдается у растений подвлиянием произрастания). факторов Бесспорность окружающей влияния 16 условий среды (условий произрастания на образование и накопление флавоноидов доказана многими исследованиями [Харборн, 1985]. Воздействиекомплекса внешних условий может выражаться в зависимости от количества и состава флавоноидов от местапроизрастания в определенных географических пунктах. Степень влияния отдельных факторов среды на образование флавоноидов выявлена еще недостаточно,хотя мнение большинства исследователей сходятся в одном: решающим фактором, оказывающим воздействие на эти процессы, служит свет. Светозависимость биосинтеза флавоноидов в растениях проявляется в стимулирующем влиянии света на их количество и качественный состав. Энергичный синтези накопление флавоноидов играют защитную роль и являются фактором приспособления растений неблагоприятным условиям среды. к Для выявления влияния эколого-фитоценотических факторов на накопление флавоноидовортилии однобокой (OrthiliasecundaHouse) - анализу подвергли образцы надземной части растений виргинильного возрастного состояния из 11популяций ортилии однобокой. Изучение количественного содержания флавоноидных соединений в растениях разных местообитаний показало значительное межпопуляционное варьирование по этому показателю - от 2.52 до 3.39%.При рассмотрении влияния фактора освещенности на содержание флавоноидовортилии однобокой выявлена несомненная зависимость накопления этих веществ, одной из физиологических функций которыхявляется защита от ультрафиолетовой радиации. Очевидно, что в растениях более освещенных местообитаний суммарное содержание флавоноидов выше, нежели у растений, произрастающихв более затененных условиях. Так, максимальное накопление флавоноидов – 3.39% - отмечено в надземнойчасти ортилии однобокой, произрастающей на открытых участках соснового леса в условиях хорошего освещения, минимальное – 2.52% - у растений, произрастающих в условиях глубокого затенения при высокой сомкнутости крон. Прямая зависимость накопления флавоноидных соединений ортилииоднобокой от степени освещенности прослеживаетсяво 17 всех исследованных местообитаниях[Ломбоева и др., 2008]. Исследовано радиационное воздействие на растение пятилистник кустарниковый (Pentaphylloidesfruticosa (L.) O. Schwarz). Установлено, что давление радиационного фактора инициирует адаптационные процессы, затрагивающие рост и развитие растений, а также физиолого-биохимическую перестройку метаболических процессов, определяющих существование популяции в пространстве. Экспериментально показано, что при радиационном воздействии усиливается биосинтез общей суммы флавоноидов в листьяхпятилистникакустарникового. Установлено, что содержание флавонолов (в сумме и по группам) в листьях пятилистника кустарникового увеличивается в 2-3 раза по сравнению с контролем, причем с увеличением уровня загрязнения разность с контролем растет. Индивидуальные флавоноидные компоненты формируют разнонаправленные типы ответной реакции организма на радиационное воздействие. Содержание гиперозида, кверцитрина радиационного и кемпферола загрязнения, содержание снижается остальных с повышением флавоноидных компонентов, напротив, возрастает. Качественный состав флавоноидов в листьях облученных и контрольных растений остается постоянным. Обнаружено уменьшение листовой поверхности, снижение прироста годичного побега и черешка листа в длину, увеличение количества листьев на побеге. Обнаружено, что с повышением облучения по большинству критериев различия по сравнению с контролем увеличивались. Разные органы пятилистника кустарникового обладают различной накопительной способностью радионуклидов: в листьях содержание 90Sr выше по сравнению со стеблями независимо от уровня загрязнения, для 137 Cs подобной связи не отмечено[Храмова и др., 2008]. Влияние влажности и почвенных микроэлементов.Почва как источник питательных веществ и среда с определенным химическим составом, содержаниемводы и микрофлоры, механической структурой имеет важное значение, определенным образом воздействуя на метаболизм растений. 18 Данные литературы свидетельствуют о том, что наибольшее влияние из составляющих эдафического фактора на образование флавоноидов оказывает обеспеченность растений элементами исследователей выявлено как минерального положительное, так питания. и Рядом отрицательное воздействие повышенных количеств фосфора и калия на накопление флавоноидов; также установлено,что дефицит азота в почве стимулирует накопление фенольных соединений, в том числе и флавоноидов [Ломбоева и др., 2008]. Из числа биологически активных веществ красоднева малого(HemerocallisminorMillerL.)было определено содержание флавоноидов как основных действующих веществ данного вида. С помощью хроматографического метода подтверждено наличие кверцетина и рутина в надземных органах красоднева малого. При этом кверцетин превалирует над рутином. Количественный анализ показал неравномерность распределения суммы флавоноидов по органам красоднева и зависимость их содержания от сроков и места сбора растения. При этом в корневищах обнаружены только следы флавоноидов, а наибольшая вариабельность количества флавоноидов определена в листьях [Жапова, 2006]. Содержание флавоноидов в листьях красоднева малого, отобранных в одну и ту же дату в 2000, 2001, 2002, 2003 гг. зависит от суммы осадков, выпавших за весенний период. Наблюдается следующая закономерность: чем больше сумма осадков, тем выше содержание флавоноидов.Влияние влажности почвы на содержание флавоноидов было подтверждено результатами их количественного определения. По полученным данным, накопление и распределение флавоноидов по органам красоднева малого зависит от условий произрастания вида и сроков сбора растения. При этом у красоднева малого, собранного в гигрофильных и мезофильных сообществах, высокое содержание флавоноидов наблюдается во всех органах растения. Наибольшее содержание флавоноидов отмечено во время интенсивного роста вегетативных органов; а в период формирования 19 цветоносного стебля и цветка содержание флавоноидов уменьшается. Для рационального сбора и использования растительного сырья необходимо применение методов прогнозирования содержания флавоноидов и микроэлементов. Для этого применяют уравнение множественной регрессии Гаусса -Жордана, которое позволяет, используя ряд известных данных, прогнозировать содержание флавоноидов и микроэлементов. Показано, что изменение содержания микроэлементов в почве влияет на содержание флавоноидов в листьях растений. Используя метод множественной регрессии можно показать взаимосвязь содержания микроэлементов с флавоноидами в органах растений. При прогнозировать использовании изменение уравнения количества появляется флавоноидов при возможность изменении содержания микроэлементов в листьях растений. Полученные низкие коэффициенты корреляции указывают на невозможность применения данного метода (парной регрессии), так как прямой зависимости содержания одного отдельного микроэлемента с накоплением флавоноидов не установлено. Однако, несомненно, на содержание флавоноидов в растении влияет совокупность микроэлементного состава[Жапова, 2006]. 1.4.Пигментная система растений: характеристика, значение, особенности накопления Важнейшую роль в процессе фотосинтеза играют зеленые пигменты хлорофиллы. Французские ученые П.Ж. Пелетье и Ж. Кавенту (1818) выделили из листьев зеленое вещество и назвали его хлорофиллом (от греч. «хлорос» - зеленый и «филлон» - лист). Это открытие ими было сделано случайно в процессе поиска новых лекарственных средств из различных растений. В кристаллическом виде хлорофилл был впервые получен (1882) русским физиологом и ботаником И.П. Бородиным [Медведев, 2004]. В настоящее время известно около десяти хлорофиллов. Они отличаются по химическому строению, окраске, распространению среди 20 живых организмов. У всех высших растений содержатся хлорофиллы а и b. Хлорофилл с обнаружен в диатомовых водорослях, хлорофилл d - в красных водорослях. Кроме того, известны четыре бактериохлорофилла (a, b, c и d), содержащиеся в клетках фотосинтезирующих бактерий. В клетках зеленых бактерий имеются бактериохлорофиллыс и d, в клетках пурпурных бактерий -бактериохлорофиллыа и b. Основными пигментами, без которых фотосинтез не идет, являются хлорофилла для зеленых растений и бактериохлорофиллы для бактерий. Впервые точное представление о пигментах зеленого листа высших растений было получено благодаря работам крупнейшего русского ботаника М.С. Цвета (1872-1919). Он разработал новый хроматографический метод разделения веществ и выделил пигменты листа в чистом виде. Хроматографический метод разделения веществ основан на их различной способности к адсорбции. Метод этот получил широкое применение. М.С. Цвет пропускал вытяжку из листа через стеклянную трубку, заполненную порошком - мелом или сахарозой (хроматографическую колонку). Отдельные компоненты смеси пигментов различались по степени адсорбируемости и передвигались с разной скоростью, в результате чего они концентрировались в разных зонах колонки. Разделяя колонку на отдельные части (зоны) и используя соответствующую систему растворителей, можно было выделить каждый пигмент. Оказалось, что листья высших растений содержат хлорофилл а и хлорофилл b, а также каротиноиды (каротин, ксантофилл и др.). Хлорофиллы, так же как и каротиноиды, нерастворимы в воде, но хорошо растворимы в органических растворителях. Хлорофиллы а и b различаются по цвету: хлорофилла имеет сине-зеленый оттенок, а хлорофилл b - желто-зеленый. Содержание хлорофиллаа в листе примерно в три раза больше по сравнению с хлорофиллом b[Андрианова и др., 2000]. Химические свойства хлорофилла.По химическому строению хлорофиллы - сложные эфиры дикарбоновой органической кислоты хлорофиллина и двух остатков спиртов -фитола и метилового. Эмпирическая 21 формула - C55H7205N4Mg. Хлорофиллин представляет собой азотсодержащее металлорганическое соединение, относящееся к магнийпорфиринам.В хлорофилле водород карбоксильных групп замещен остатками двух спирит метилового СН3ОН и фитола С20Н39ОН, поэтому хлорофилл является сложным эфиром. На рисунке 6, Адана структурная формула хлорофилла а[Медведев, 2004]. А Б Рис.6. Строение хлорофилла а (А) и хлорофилла b (Б) Хлорофилл b отличается тем, что содержит на два атома водорода меньше и на один атом кислорода больше (вместо группы СН3 группа СНО) (рис.6, Б). В связи с этим молекулярная масса хлорофилла а - 893 и хлорофилла b - 907. В 1960 г. Г.Б. Вудворд осуществил полный синтез хлорофилла. В центре молекулы хлорофилла расположен атом магния, который соединен четырьмя атомами азота пиррольных группировок. В пиррольных группировках хлорофилла имеется система чередующихся двойных и простых связей. Это N есть хромофорная 22 группа хлорофилла, обусловливающая поглощение определённых лучей солнечного спектра и его окраску. Диаметр порфиринового ядра составляет 10 нм, а длина фитольного остатка - 2 нм. Расстояние между атомами азота пиррольных группировок в ядре хлорофилла составляет 0.25 нм. Интересно, что диаметр атома магния равен 0.24 нм. Таким образом, магний почти полностью заполняет пространство между атомами азота пиррольных группировок. Это придает ядру молекулы хлорофилла дополнительную прочность[Якушкина и др., 2005]. Еще К.А. Тимирязев (1914) обратил внимание на близость химического строения двух важнейших пигментов: зеленого - хлорофилла листьев и красного — гемина крови. Действительно, если хлорофилл относится к магнийпорфиринам, то гемин - к железопорфиринам. Сходство это не случайно и служит еще одним доказательством единства всего органического мира. Одной из специфических черт строения хлорофилла является наличие в его молекуле помимо четырех гетероциклов еще одной циклической группировки из пяти углеродных атомов -циклопентанона. В циклопентановом кольце содержится кетогруппа, обладающая большой реакционной способностью. Есть данные, что в результате процесса энолизации по месту этой кетогруппы к молекуле хлорофилла присоединяется вода. Молекула хлорофилла полярна, ее порфириновое ядро обладает гидрофильными свойствами, а фитольный конец - гидрофобными. Это свойство молекулы хлорофилла обусловливает определенное расположение ее в мембранах хлоропластов. Порфириновая часть молекулы связана с белком, а фитольная цепь погружена в липидный слой. Извлеченный из листа хлорофилл легко реагирует как с кислотами, так и со щелочами. При взаимодействии со щелочью происходит омыление хлорофилла, в результате чего образуются два спирта и щелочная соль кислоты хлорофиллина. В интактном живом листе от хлорофилла может отщепляться фитол под воздействием фермента хлорофиллазы [Badgerи др., 1974]. При взаимодействии со слабой кислотой извлеченный хлорофилл 23 теряет зеленый цвет, образуется соединение феофитин, у которого атом магния в центре молекулы замещен на два атома водорода. Хлорофилл в живой интактной клетке обладает способностью к обратимому фотоокислению и фотовосстановлению. Способность к окислительновосстановительным реакциям связана с наличием в молекуле хлорофилла сопряженных двойных связей с подвижными π-электронами и атомов азота с неподеленными электронами. Азот пиррольных ядер может окисляться (отдавать электрон) или восстанавливаться (присоединять электрон)[Андрианова и др., 2000]. Исследования показали, что свойства хлорофилла, находящегося в листе и извлеченного из листа, различны, так как в листе он находится в комплексном соединении с белком. Это доказывается следующими данными: 1. Спектр поглощения хлорофилла, находящегося в листе, иной по сравнению с извлеченным хлорофиллом. 2. Хлорофилл невозможно извлечь абсолютным спиртом из сухих листьев. Экстракция протекает успешно, только если листья увлажнить или к спирту добавить воды, которая разрушает связь между хлорофиллом и белком. 3. Выделенный из листа хлорофилл легко подвергается разрушению под влиянием самых разнообразных воздействий (повышенная кислотность, кислород и даже свет)[Якушкина и др., 2005]. Между тем в листе хлорофилл достаточно устойчив ко всем перечисленным факторам. Следует отметить, что хотя крупный русский ученый В. Н. Любименко и предлагал этот комплекс назвать хлороглобином, по аналогии с гемоглобином, связь между хлорофиллом и белком иного характера, чем между гемином и белком. Для гемоглобина характерно постоянное соотношение - на 1 молекулу белка приходится 4 молекулы гемина. Между тем соотношение между хлорофиллом и белком различно и претерпевает изменения в зависимости от типа растений, фазы их развития, условий среды (от 3 до 10 молекул хлорофилла на 1 молекулу белка). Связь 24 между молекулами белка и хлорофиллом осуществляется путем нестойких комплексов, образующихся при взаимодействии кислотных групп белковых молекул и азота пиррольных колец. Чем выше содержание дикарбоновых аминокислот в белке, тем лучше идет их комплексирование с хлорофиллом (Т.Н. Годнев). Белки, связанные с хлорофиллом, характеризуются низкой изоэлектрической точкой (3.7-4.9). Молекулярная масса этих белков порядка 68 кДа. Вместе с тем хлорофилл может взаимодействовать и с липидами мембран. Важным свойством молекул хлорофилла является их способность к взаимодействию друг с другом. Переход из мономерной в агрегированную форму возник в результате взаимодействия двух и более молекул при их близком расположении друг к другу. В процессе образования хлорофилла его состояние в живой клетке закономерно меняется. При этом и происходит его агрегация. В настоящее время показано, что хлорофилл в мембранах пластид находится в виде пигмент-липопротеидных комплексов с различной степенью агрегации[Якушкина и др., 2005]. Физические свойства хлорофилла.Как уже отмечалось, хлорофилл способен к избирательному поглощению света. Спектр поглощения данного соединения определяется его способностью поглощать свет определенной длины волны (определенного цвета). Для того чтобы получить спектр поглощения, К.А. Тимирязев (1914) пропускал луч света через раствор хлорофилла. Часть лучей поглощалась хлорофиллом, и при последующем пропускании через призму в спектре обнаруживались черные полосы. Было показано, что хлорофилл в той же концентрации, как в листе, имеет две основные линии поглощения в красных и сине-фиолетовых лучах (рис.7). При этом хлорофилла в растворе имеет максимум поглощения 429 и 660 нм, тогда как хлорофилл b - 453 и 642 нм. Однако необходимо учитывать, что в листе спектры поглощения хлорофилла меняются в зависимости от его состояния, степени агрегации, адсорбции на определенных белках.В настоящее время показано, что есть формы хлорофилла, поглощающие свет с 25 длиной волны 700, 710 и даже 720 нм. Эти формы хлорофилла, поглощающие свет с большой длиной волны, имеют особенно большое значение в процессе фотосинтеза. Рис.7. Спектры поглощения хлорофиллов a и b Хлорофилл обладает способностью к флуоресценции. Флуоресценция представляет собой свечение тел, возбуждаемое освещением и продолжающееся очень короткий промежуток времени (10-8 - 10-9 с). Свет, испускаемый при флюоресценции, имеет всегда большую длину волны по сравнению с поглощенным. Это связано с тем, что часть поглощенной энергии выделяется в виде тепла. Хлорофилл обладает красной флуоресценцией[Гавриленко и др., 1986]. Биосинтез хлорофилла.Синтез хлорофилла происходит в две фазы: темновую - до протохлорофиллида и изпротохлорофиллидахлорофиллида.Синтез световую - образование начинается с превращения глутаминовой кислоты в δ-аминолевулиновую кислоту. 2 молекулы δаминолевулиновой кислоты конденсируются в порфобилиноген. Далее 4 молекулы порфобилиногена превращаются в протопорфирин IX. После этого в кольцо встраивается магний и получается протохлорофиллид. На свету и в присутствии НАДН образуется хлорофиллид: 26 протохлорофиллид + 2Н+ +hv →хлорофиллид Протоны присоединяются к четвертому пиррольному кольцу в молекуле пигмента. На последнем этапе происходит взаимодействие хлорофиллида со спиртом фитолом: хлорофиллид + фитол → хлорофилл Поскольку синтез хлорофилла — процесс многоэтапный, в нем участвуют различные ферменты, составляющие, по-видимому, полиферментный комплекс. Интересно заметить, что образование многих из этих белков-ферментов ускоряется на свету. Свет косвенно ускоряет образование предшественников хлорофилла. Одним из наиболее важных ферментов является фермент, катализирующий синтез δ-аминолевулиновой кислоты (аминолевулинатсинтаза). Важно отметить, что активность этого фермента также повышается на свету. Содержание хлорофилла в листе колеблется незначительно. Это связано с тем, что идет непрерывный процесс разрушения старых молекул и образование новых молекул хлорофилла. Причем эти два процесса уравновешивают друг друга. При этом предполагается, что вновь образовавшиеся молекулы хлорофилла не смешиваются со старыми и имеют несколько иные свойства[Андрианова и др., 2000]. Условия образования хлорофилла.Исследования влияния света на накопление хлорофилла в этиолированных проростках позволили установить, что первым в процессе зеленения появляется хлорофилл а. Спектрографический анализ показывает, что процесс образования хлорофилла идет очень быстро. Так, уже через 1 мин после начала освещения выделенный из этиолированных проростков пигмент имеет спектр поглощения, совпадающий со спектром поглощения хлорофилла а. По мнению А.А. Шлыка (1971), хлорофилл b образуется из хлорофилла а. При исследовании влияния качества света на образование хлорофилла в большинстве случаев проявилась положительная роль красного света. Большое значение имеет интенсивность освещения. Существование нижнего 27 предела освещенности для образования хлорофилла было показано в опытах В.Н. Любименко для проростков ячменя и овса. Оказалось, что освещение электрической лампой мощностью 10 Вт на расстоянии 400 см было пределом, ниже которого образование хлорофилла прекращалось. Существует и верхний предел освещенности, выше которого образование хлорофилла тормозится. Проростки, выросшие в отсутствие света, называют этиолированными. Такие проростки характеризуются измененной формой (вытянутые стебли, неразвившиеся листья) и слабой желтой окраской (хлорофилла в них нет). Как было сказано выше, образование хлорофилла на заключительных этапах требует света[Гавриленко и др., 1986]. Еще со времен Ю. Сакса (1864) известно, что в некоторых случаях хлорофилл образуется и в отсутствие света. Способность образовывать хлорофилл в темноте характерна для организмов, стоящих на нижней ступени эволюционного процесса. Так, при благоприятных условиях питания некоторые бактерии могут синтезировать в темноте бактериохлорофилл. Цианобактерии при достаточном снабжении органическим веществом растут и образуют пигменты в темноте. Способность к образованию хлорофилла в темноте обнаружена и у таких высокоорганизованных водорослей, как харовые. Лиственные и печеночные мхи сохраняют способность образовывать хлорофилл в темноте. Почти у всех видов хвойных при прорастании семян в темноте семядоли зеленеют. Более развита эта способность у теневыносливых пород хвойных деревьев. По мере роста проростков в темноте образовавшийся хлорофилл разрушается, и на 35-40-й день проростки в отсутствие света погибают. Интересно заметить, что проростки хвойных, выращенные из изолированных зародышей в темноте, хлорофилла не образуют. Однако достаточно присутствия небольшого кусочка нераздробленного эндосперма, чтобы проростки начинали зеленеть. Зеленение происходит даже в том случае, если зародыш соприкасается с эндоспермом другого вида хвойных деревьев. При этом наблюдается прямая корреляция между величиной окислительно-восстановительного потенциала 28 эндосперма и способностью проростков зеленеть в темноте[Якушкина и др., 2005]. Можно сделать заключение, что в эволюционном плане хлорофилл первоначально образовался как побочный продукт темнового обмена. Однако в дальнейшем на свету растения, обладающие хлорофиллом, получили большее преимущество благодаря возможности использовать энергию солнечного света, и эта особенность была закреплена естественным отбором. Образование хлорофилла зависит от температуры. Оптимальная температура для накопления хлорофилла 26-30°С. От температуры зависит лишь образование предшественников хлорофилла (темновая фаза). При наличии уже образовавшихся предшественников хлорофилла процесс зеленения (световая фаза) идет с одинаковой скоростью независимо от температуры. На скорость образования хлорофилла оказывает влияние содержание воды. Сильное обезвоживание проростков приводит к полному прекращению образования хлорофилла. Особенно чувствительно к обезвоживанию образование протохлорофиллида. Еще В.И. Палладин обратил внимание на необходимость углеводов для протекания процесса зеленения. Именно с этим связано то, что зеленение этиолированных проростков на свету зависит от их возраста. После 7-9дневного возраста способность к образованию хлорофилла у таких проростков резко падает. При опрыскивании сахарозой проростки снова начинают интенсивно зеленеть. Важнейшее значение для образования хлорофилла имеют условия минерального питания. Прежде всего, необходимо достаточное количество железа. При недостатке железа листья даже взрослых растений теряют окраску. Это явление названо хлорозом. Железо - важный катализатор образования хлорофилла. Оно необходимо на этапе синтеза δ-аминолевулиновой кислоты, а также синтеза протопорфирина. Большое значение для обеспечения синтеза хлорофилла имеет нормальное снабжение растений азотом и магнием, так как оба эти элемента входят в состав хлорофилла. При недостатке меди хлорофилл легко 29 разрушается. Это, по-видимому, связано с тем, что медь способствует образованию устойчивых комплексов между хлорофиллом и соответствующими белками. Исследование процесса накопления хлорофилла у растений в течение вегетационного периода показало, что максимальное содержание хлорофилла приурочено к началу цветения. Есть даже мнение, что повышение образования хлорофилла может быть использовано как индикатор, указывающий на готовность растений к цветению. Синтез хлорофилла зависит от деятельности корневой системы. Так, при прививках содержание хлорофилла в листьях привоя зависит от свойств корневой системы подвоя. Возможно, что влияние корневой системы связано с тем, что там образуются гормоны (цитокинины). У двудомных растений большим содержанием хлорофилла характеризуются листья женских особей [Якушкина и др., 2005]. 1.5. Содержание флавоноидов и хлорофилла в растениях как индикатор состояния окружающей среды В литературе есть данные о влиянии техногенного загрязнения на содержание флавоноидов. Н.Ф. Гусев(2004) иД.С. Елагина (2013) установили, что содержание суммы флавоноидов в биомассе растений, произрастающих в зоне действия атмосферных выбросов, превышает количество флавоноидов в биомассе растений контрольных участков. Известно, что содержание хлорофиллов в листьях растений используют как индикатор для определения изменения условий окружающей среды [Фролов и др., 1982].Исследование пигментного аппарата липы сердцевидной (TiliacordataL.), березыповислой (BetulapendulaL)и подорожника большого (PlantagomajorL.)в условиях городской среды свидетельствует о том, что содержание хлорофиллов (а, b) уменьшается по мере увеличения загрязняющих веществ в атмосферном воздухе [Михайлова и др., 2013]. 30 Исследовано радиационное воздействие на растение пятилистник кустарниковый (Pentaphylloidesfruticosa (L.) O. Schwarz). Установлено, что давление радиационного фактора инициирует адаптационные процессы, затрагивающие рост и развитие растений, а также физиолого-биохимическую перестройку метаболических процессов, определяющих существование популяции в пространстве. радиационном воздействии Экспериментально усиливается показано, биосинтез что общей при суммы флавоноидов в листьяхпятилистникакустарникового. Установлено, что содержание флавонолов (в сумме и по группам) в листьях пятилистника кустарникового увеличивается в 2-3 раза по сравнению с контролем, причем с увеличением уровня загрязнения разность с контролем растет. Индивидуальные флавоноидные компоненты формируют разнонаправленные типы ответной реакции организма на радиационное воздействие. Содержание гиперозида, кверцитрина радиационного и кемпферола загрязнения, содержание снижается остальных с повышением флавоноидных компонентов, напротив, возрастает. Качественный состав флавоноидов в листьях облученных и контрольных растений остается постоянным. Обнаружено уменьшение листовой поверхности, снижение прироста годичного побега и черешка листа в длину, увеличение количества листьев на побеге. Обнаружено, что с повышением облучения по большинству критериев различия по сравнению с контролем увеличивались. Разные органы пятилистника кустарникового обладают различной накопительной способностью радионуклидов: в листьях содержание 90Sr выше по сравнению со стеблями независимо от уровня загрязнения, для 137 Cs подобной связи не отмечено[Храмова и др., 2008]. Глава 2. Материалы и методы исследования 2.1. Характеристика объекта и участков исследования 31 Объект исследования. Горец птичий (рис. 8) (спорыш, птичья гречиха) -Polygonumaviculare L.- сорное однолетнее травянистое растение, относится к родуPolygonum L. семействаPolygonaceaeJuss[Гончарова, 1997]. Рис. 8. Горец птичий (PolygonumaviculareL.) Предпочитает голые, питательно богатые минеральные почвы, избегает крайне сухие, постоянно влажные и очень тенистые местообитания. В лесной и лесостепной зонах встречается особенно часто, в горах. В степной и пустынной зонах - только во влажных местообитаниях. На орошаемых полях растёт только на валиках и откосах оросительных каналов. Естественные местообитания - берега озёр, дорожные насыпи, железнодорожные зоны, дворы ферм, тропинки, навозные кучи, скудные газоны, голые кусочки на пастбищных землях. Растение устойчиво к вытаптыванию. Хорошо отрастает после многократного скашивания [Агаев, 1988]. Корень стержневой, слаборазветвленный. Стебель один или несколько, восходящие или прямостоячие, 10-50 (100) см, неразветвлённые в большинстве узлов. Листья от чисто зелёных до серо-зелёных, острые или тупые. Средние стеблевые листья с черешком 0.5-9 мм длины, от очень узких эллиптических до лопатовидных. Раструбы буроватые в нижней половине. Цветки обоеполые. Околоцветник 1.9-5.5 мм. Лепестков 5, равных, с 32 единственной жилкой, бледно- зелёные с белыми или розовыми краями. Тычинок 5-8. Нектарники отсутствуют. Пестиков 3, с очень коротким головчатым рыльцем. Соцветия состоят из пазушных щитков, 1-5-цветковые, вдоль побегов или на концах стеблей и ветвей. Плод - орешки обычно трёхгранные, длиной 2- 3.5 мм, скрытые в околоцветнике или с видимой верхушкой, от тёмно-коричневых до черноватых. Цветет с июня по сентябрь. Размножается исключительно семенами. В листьях горца содержатся дубильные вещества; аскорбиновая кислота; флавоновый гликозид авикулярин и рутин. В корнях обнаруженыоксиметилантрахиноны[Гончарова, 1997]. Применение. Корни раньше употреблялись для получения синей краски, однако способ ее получения в настоящее время утрачен. При обычных приемах крашения дает зеленые и желтые тона; нейтральные и кислые вытяжки окрашивают шелк и шерсть в кремовые, ярко-желтые тона. Молодая зелень травы идет в пищу. В Средней Азии порошок из травы курят при усталости. Травой спорыша хорошо отмывается посуда. Дает прекрасные газоны в виде зеленого ковра, эффективен для больших площадей. Рекомендуется для закрепления грунтов и озеленения стадионов и аэродромов. Является ценной кормовой культурой. Сено из его травы по питательности не уступает люцерне, клеверу, чине. Его охотно поедает крупный рогатый скот, овцы, свиньи, куры, гуси. Плоды являются кормом для домашних и промысловых птиц [http://medicalherbs.sci- lib.com/herbs042.html]. В медицине препараты горца птичьего применяются в акушерскогинекологической послеродовом практике периоде, как при маточное маточных кровоостанавливающее кровотечениях в после аборта.В народной медицине горец применяется как вяжущее, мочегонное и кровоостанавливающее средство. В эксперименте водные и спиртовые извлечения травы повышают скорость свертывания крови, понижают кровяное давление, увеличивают амплитуду дыхательных движений и 33 вентиляционный объем легких, тонизируют мускулатуру матки, увеличивают диурез. Мочегонное действие обусловлено наличием флавонового гликозида [Гончарова. 1997]. Хозяйственное значение.Polygonumaviculare - сорное растение в посевах зерновых и овощных культур. Меры борьбы: очистка семенного материала на семяочистительных машинах, своевременная уборка урожая и ранняя зяблевая вспашка (в августе) сразу после уборки урожая зерновых, междурядная обработка в посевах пропашных культур[Комаров, 1986]. Участки исследования. Были выбраны 3 участка, расположенные в разных частях города, отличающихся условиями рельефа, характером и типом застройки и степенью автотранспортной нагрузки: №1 - ул. Кремлёвская (университетский двор), №2 - ул. Татарстан и №3 - ул. Горьковское шоссе. За условный контроль был выбран участок №1 (рис. 9). Улица Кремлевская находится в исторической части города, где запрещен проезд грузового транспорта. Это одна из наиболее высоких точек городского рельефа. Автобусных остановок и светофоров вблизи нет. Рис. 9. Схема расположения участка №1 Участок №2 (рис. 10.). Улица Татарстан расположена в центральной части города. Рядом с участком сбора расположены Казанский автовокзал, 34 железнодорожные пути, АЗС Татнефть-центр, парк им. К. Тинчурина и Сад Молодоженов. Рис. 10. Схема расположения участка №2 Участок № 3 (рис. 11). Улица Горьковское шоссе расположена на западе г. Казани. Растительное сырье собиралось между территорией школы №137 и многоэтажными домами, напротив крупной дорожной развилки. Рис. 11. Схема расположения участка №3 2.2. Сбор растительного сырья и подготовка образцов для анализа 35 1) Сбор и предварительная подготовка сырья. Собирали надземную массу растений в течение вегетационного периода в мае – сентябре (1 раз в месяц). Отбор производили с площади 10х10 м, где выделяли по 4 площадки 1х1 м. Необходимо следить за однородностью сырья по способу подготовки (цельное, измельченное, прессованное и т.д.), цвету, запаху и засоренности. Учитывать и по возможности устранять наличие плесени, гнили, устойчивого постороннего запаха, не исчезающего при проветривании; засоренность ядовитыми растениями и посторонними примесями (камни, стекло, помет грызунов и птиц и т.д.). 2) Сушка растительного сырья. Сушку проводили сразу после сбора, так как в нем содержится большое количество влаги. Для сушки растительное сырье рассыпали тонким слоем так, чтобы на один квадратный метр приходилось не более 1 - 2 кг сырья. Чтобы оно сохло быстрее и не согревалось, его чаще переворачивали.Все виды лекарственного сырья лучше сушить под открытым навесом, где имеется хорошая вентиляция и на сырье не падают прямые солнечные лучи, а также в закрытых помещениях с вентиляцией[Киселева, 2007]. 3) Измельчение. Сырье измельчали на электрической кофемолке до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 1 мм. 4) Определение влажности растительного сырья. Производится согласно ГОСТ24027.2-80 (1981). Основан данный метод на определении потери в массе за счет гигроскопической влаги и летучих веществ при высушивании сырья до абсолютно сухого состояния.Растительное сырье помещали в сушильный шкаф, нагретый до 100-105°С. Влажность сырья (Х) в процентах вычисляют по формуле (2.1): Х m m1 100 m где, m – масса сырья до высушивания, г; m1 – масса сырья после высушивания, г. 36 ( 2.1) Допускаемое расхождение между результатами двух параллельных определений не должно превышать 0.5%. Влажность лекарственного сырья не должна превышать 13% [www.fito.nnov.ru/common/common_04.phtml/]. В исследованных нами образцах влажность составляла 8-11%. 5) Отбор аналитических проб для определения содержания флавоноидов. Аналитические пробы отбирают методом квартования. Для этого сырье помещают на гладкую, чистую, ровную поверхность, перемешивают, разравнивают, по возможности тонким, равномерным по толщине слоем в виде квадрата, и по диагонали делят на четыре треугольника. Два противоположных треугольника удаляют, а два оставшихся соединяют, осторожно перемешивают, разравнивают в виде квадрата, вновь делят по диагонали и удаляют следующие два треугольника. Так повторяют до тех пор, пока в двух противоположных треугольниках не останется количество сырья, соответствующее массе аналитической пробы (5 г). Аналитические пробы должны быть отобраны с погрешностью не более 0.01г [ГОСТ 24027.0-80, 1981]. 6) Экстрагирование. Для флавоноидов, как и для других веществ, не существует способа выделения, универсального для всех растительных материалов. В каждом конкретном случае прибегают к наиболее подходящему методу или сочетанию методов, с учётом в основном свойств веществ и особенностей растительного сырья[Каухова, 2006]. Приготовление экстрактов.Для получения экстракта растений горца птичьего был применён классический метод экстрагирования – настаивание[Высочина и др., 2009]. Аналитическую пробу 0.5 г (точная навеска) измельченного сырья помещали в колбу со шлифом вместимостью 100 мл, прибавляли 50 мл 70% спирта этилового и настаивали в течение 48 часов. В таблице 2 представлены условия получения экстракта из исследованных нами образцов. 37 Таблица 2 Условия проведения экстрагирования биологически активных веществ из растений горца птичьего Кратность Степень Вид Концентрация Соотношение Время экстрагирования измельчения экстрагента экстрагента сырье – экстракции сырья экстрагент 1,0 мм 1 Водный раствор этанола 70% 48 ч 1:100 Спиртовые извлечения растений горца птичьего фильтровали через бумажный беззольный фильтр и помещали в прохладное место. В результате получили прозрачное извлечение темно-зеленого цвета с характерным запахом спирта этилового и ароматическим запахом растений горца птичьего [Латыпова и др., 2009]. 2.3. Методика количественного определения суммы флавоноидов в растительном сырье спектрофотометрическим методом При оценке качества растительного сырья и фитопрепаратов, содержащих флавоноиды, наибольшее распространение получил спектрофотометрический метод анализа, основанный на использовании реакции комплексообразования Количественное определение флавоноидов флавоноидов с алюминия проводили по хлоридом. методике, основанной на методе В.В. Беликова (1985). Фотометрический метод определения без предварительного разделения компонентов основан на аддитивности значений оптической плотности всех компонентов смеси при одной длине волны. Метод достаточно прост в исполнении, является высокочувствительным предпочтительным для и относительно использования недорогим, в что делает его контрольно-аналитических лабораториях. Использование такого метода позволяет определить сумму флавоноидов в присутствии других полифенольных соединений, не образующих комплекса с алюминием хлорида в среде 30-96% спирта. 38 В качестве стандарта используется тот флавоноид (рутин, кверцетин, гесперетин и т.д.), максимум поглощения комплекса которого наиболее соответствует максимуму поглощения комплекса с хлоридом алюминия исследуемого образца. В нашей работе в качестве стандарта использовался ГСО рутина, так как при измерении оптической плотности в интервале 408–616 нм максимум поглощения был зафиксирован в области 408–420 нм[Лобанова, 2004]. Измерение оптической плотности проводили на спектрофотометре ПЭ - 5300ВИ в кюветах с толщиной слоя 10 мм. Оборудование, материалы и реактивы: - мерная колба объемом 100 см3 – 1 шт.; - мерные колбы объёмом 25 см3 – 6 шт.; - пипетки объёмом 1 см3– 3 шт.; - пипетки объёмом 5 см3 – 1 шт.; - мерный цилиндр объемом 100 см3; - часы; - кюветы на 10 мм; - спектрофотометр ПЭ - 5300ВИ; - алюминия хлорид 5%; - спирт этиловый 70%; - спирт этиловый 95%. 1) Подготовка к анализу включает приготовление 5%-го раствора алюминия хлорида: 5 г алюминия хлорида х.ч. или ч.д.а. (ГОСТ 3759-75) растворяют в 50 мл 95% спирта в мерной колбе на 100 мл, доводят объём раствора этим же спиртом до метки и перемешивают. Срок годности раствора 3 месяца. Устойчивое окрашивание спиртового раствора густого экстракта с хлоридом алюминия наступает через 30 мин и сохраняется в течение 1,5 ч, что достаточно для проведения анализа. 39 2) Приготовление 70%-го этилового спирта: для приготовления 1л 70% этилового спирта смешивают 675 г этилового спирта 95% и 325 г воды. В объемных единицах: 95% этилового спирта – 855 см3, воды – 325 см3. После приготовления раствора проверяют его плотность или объемную долю спирта ареометром (ГОСТ 3639-79) [Государственная фармакопея СССР, 1990]. 3) Приготовление раствора рутина: ГСО рутина массой 0,05 г перенесли в мерную колбу объемом 50 мл, прилили 40 мл 70%-ного спирта, нагрели на водяной бане до растворения рутина. Остудили до комнатной температуры и довели до метки 70% спиртом. Для построения калибровочного графика зависимости оптической плотности от количества рутина в растворе было приготовлено две серии растворов – опытные и растворы сравнения. Для этого в мерную колбу 25 мл переносили по 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0; 1,2 мл раствора рутина. При этом количество рутина в 25 см3 спектрофотометрируемого раствора равно соответственно: 200, 400, 600, 800, 1000, 1200 мкг/25см3. Для калибровочной кривой пересчитывали содержание в мкг/1см3: 8,0; 16,0; 24,0; 32,0; 40,0; 48,0. Приливали в каждую пробу по 4 мл раствора хлорида алюминия, взбалтывали, доводили до метки 70% спиртом, получая растворы с комплексным соединением со II1 по II6. 4) Приготовление раствора сравнения. Для этого в мерную колбу 25 мл последовательно переносили по 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0; 1,2 мл раствора рутина, доводили до метки 70% спиртом, получая растворы сравнения с I1 по I6 . На спектрофотометре ПЭ - 5300ВИ при длине волны 415 нм получили следующие результаты: Концентрация раствора 8,0 3 рутина, мкг/см Оптическая плотность 0 16,0 24,0 32,0 40,0 48,0. 0 0,113 0,192 0,295 0,373 40 Построили калибровочный график (рис. 12). Рис. 12.Зависимость оптической плотности от количества рутина в растворе Получено уравнение Ү(мкг/мл)=139,82∙Х. Коэффициент, полученный из уравнения линейной зависимости, использовали в дальнейшем для расчета содержания рутина в наших образцах. Для определения содержания флавоноидов в опытных образцах готовили две серии образцов (с хлоридом алюминия и без него (растворы сравнения), т.е. применяли дифференциальный вариант спектрофотометрии, который позволяет исключить влияние на результаты анализа сопутствующих веществ [Латыпова, 2009]). Расчет содержания рутина (мкг/см3) проводили с помощью коэффициента пересчета (см.выше). Расчет содержания флавоноидов в растительном сырье проводили по формуле (2.2): ( ) где: Ү- содержание рутина в мкг/1см3; V1- общий объем экстракта, мл; V2- объем разведения (в нашем случае 25 мл); 41 ( ) V3 – объем экстракта, взятый для анализа, мл; М – масса воздушно-сухого сырья, г; 106 – пересчет мкг в г; 100 – пересчет в %. Ошибка определения составляет 0,4 % [Высочина и др., 2009]. 2.4. Количественное определение пигментов Для использовали определения количественного спектрофотометрический содержания метод. Измерение хлорофиллов оптической плотности экстрактов опытных образцов проводили на спектрофотометре ПЭ - 5300ВИ при длине волны 665 нм - для хлорофилла а, при длине волны 649 нм – для хлорофилла bв кюветах с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения использовали 70% водный раствор этанола. Определяли концентрации хлорофиллов а и b в общей смеси пигментов по формулам (2.3; 2.4): (2.3) (2.4) Установив концентрацию пигмента в вытяжке, определили его содержание в исследуемом материале с учетом объема вытяжки и массы пробы по формуле (2.5): , (2.5) где F – содержание пигмента в растительном материале, мг/г сырой массы; C – концентрация пигментов, мг/л; V – объем вытяжки пигментов, мг/л; P – навеска растительного материала, г. Определив содержание пигментов, вычислили их сумму и отношение a/b. 42 2.5. Методика определения выбросов автомобильного транспорта Для определения автомагистралях выбросов проводится автотранспорта изучение на особенностей городских распределения автотранспортных потоков (их состава и интенсивности) по городу и их изменений во времени (в течение суток, недели и года). Территориальные различия состава и интенсивности транспортных потоков зависят от площади и поперечных размеров города, количества населения, схемы планировки улично - дорожной сети, особенностей расположения промышленных предприятий, автохозяйств, бензозаправочных станций и станций техобслуживания[Ложкин и др., 1990]. Временные различия в значительной степени связаны с режимом работы промышленных предприятий и учреждений города и с климатическими особенностями района, в котором расположен город. На основе изучения схемы улично - дорожной сети города, а также информации о транспортной нагрузке составляется перечень основных автомагистралей (и их участков) с повышенной интенсивностью движения и перекрестков с высокой транспортной нагрузкой. В качестве таких магистралей (участков) рассматриваются: - для городов с населением до 500 тысяч человек - магистрали (или их участки) с интенсивностью движения в среднем более 200 - 300 автомобилей в час; - для городов с населением более 500 тыс. человек - магистрали (или их участки) с интенсивностью движения в среднем более 400 - 500 автомобилей в час[Жегалин и др., 1985]. Для определения характеристик автотранспортных потоков на выбранных участках улично - дорожной сети проводится учет проходящих автотранспортных средств в обоих направлениях с подразделением по следующим группам: 1.Л - легковые, из них отдельно легковые и легковые дизельные автомобили; 43 2. ГК < 3 - грузовые карбюраторные грузоподъемностью менее 3 тонн и микроавтобусы (ГАЗ -51-53, УАЗы, «Газель», РАФ и др.); 3. ГК > 3 - грузовые карбюраторные грузоподъемностью более 3 тонн (ЗИЛы, Урал и др.); 4. АК - автобусы карбюраторные (ПАЗ, ЛАЗ, ЛИАЗ); 5. ГД - грузовые дизельные (КРАЗ, КАМАЗ); 6. АД - автобусы дизельные (городские и интуристовские «Икарусы»); 7. ГГБ - грузовыегазобалонные, работающие на сжатом природном газе. Подсчет проходящих по данному участку автомагистрали транспортных средств проводится в течение 20 минут каждого часа. При высокой интенсивности движения (более 2 - 3 тыс. автомашин в час) подсчет проходящих автотранспортных средств проводится синхронно раздельно по каждому направлению движения (а при недостаточности числа наблюдателей - первые 20 минут - в одном направлении; следующие 20 минут - в противоположном направлении). Для выявления максимальной транспортной нагрузки наблюдения выполняются в часы «пик». Для большинства городских автомагистралей отмечается два максимума: утренний и вечерний (соответственно с 7 - 8 часов до 10 - 11 часов и с 16 - 17 часов до 19 - 20 часов), для многих транзитных автомагистралей наибольшая транспортная нагрузка характерна для дневного времени суток. С целью получения исходных данных о выбросах для проведения сводных расчетов загрязнения атмосферы города наблюдения организуются в часы «пик» летнего сезона года. Натурные обследования состава и интенсивности движущегося автотранспортного потока проводятся не менее 4 - 6 раз в часы «пик» на каждой автомагистрали[Ложкин и др., 1990]. Выброс i-го загрязняющего вещества в зоне перекрестка определяется по формуле: 44 (2.6) где Р (мин.) - продолжительность действия запрещающего сигнала светофора (включая желтый цвет); N Ц - количество циклов действия запрещающего сигнала светофора за 20- минутный период времени; N гр - количество групп автомобилей; М´Пi,k (г/мин) - удельный выброс i -гo загрязняющего вещества автомобилями, k - ой группы, находящихся в «очереди» у запрещающего сигнала светофора; Gk , n - количество автомобилей k группы, находящихся в «очереди» в зоне перекрестка в конце n - го цикла запрещающего сигнала светофора. Значения М´Пi определяются по таблице 3, в которой приведены усредненные значения удельных выбросов (г/мин), учитывающие режимы движения автомобилей в районе пересечения перекрестка (торможение, холостой ход, разгон), а значения Gk - по результатам натурных обследований. Таблица 3 Удельные значения выбросов для автомобилей, находящихся в зоне перекрестка М´Пi Выброс, г/мин Наименование группы автомобилей СО NOx (в пересчете на NO2) 3.5 0.05 0.13 0.08 6.3 0.075 Легковые Легковые дизельные Грузовые карбюраторные с грузоподъемностью до 3 т (в том числе работающие на сжиженном нефтяном газе) и микроавтобусы Грузовые 18.4 карбюраторные с 0.2 СН SО2 Формальдегид Бенз(а)пирен 0.25 0.06 1.0 0,01 0,04 0,02 0.0008 0.0008 0.0015 2.0 · 10-6 4.0 · 10-6 2.96 0,028 0.006 4.4 · 10-6 45 Выброс, г/мин Наименование группы автомобилей СО грузоподъемностью более 3 т (в том числе работающие на сжиженном нефтяном газе) Автобусы карбюраторные Грузовые дизельные Автобусы дизельные Грузовыегазобалонные, работающие на сжатом природном газе * NOx (в пересчете на NO2) СН SО2 Формальдегид Бенз(а)пирен 16.1 0.16 2.64 0.03 0,012 4.5 · 10-6 2.85 3.07 6.44 0.81 0.7 0.09 0.3 0.075 0.41 0.09 0.26* 0.01 0,015 0,020 0,0004 6.3 · 10-6 6.4 · 10-6 3.6 · 10-6 - значение выброса за вычетомметана [http://www.gosthelp.ru/text/Metodikaopredeleniyavybro.html] 2.6. Статистическая обработка результатов исследования При обработке результатов количественных анализов использовали методы математической статистики согласно рекомендациям [Александров и др., 2002]. Статистическую обработку данных [Иванов и др., 2004] проводили с использованием пакета программ MicrosoftExcel 2007 и OriginPro – 7.0. Определяли средние значения показателей, их стандартное отклонение и достоверность(при Р=0.05)(Приложения 1, 2), коэффициенты корреляции рассчитывали по программе MicrosoftExcel 2007. Глава 3. Результаты и их обсуждение 46 3.1.Оценка степени загрязнения атмосферного воздуха исследуемых участков Для расчета выбросов автотранспорта, в районе регулируемого перекрестка исследуемых участков проводили учет количества автотранспортных средствпо месяцам (таблица 4). Таблица 4 Количество и группы автотранспортана исследуемых участках Месяц Группа подсчета автомобилей май легковые до 3-х т. грузовые июнь легковые до 3-х т. грузовые июль легковые до 3-х т. грузовые август легковые до 3-х т. грузовые Сентябрь легковые до 3-х т. грузовые Общее число: Количество автомобилей, шт. Ул. Ул. Ул. Горьковское Кремлевская Татарстан шоссе 79 310 1172 0 47 83 0 51 80 86 487 943 0 51 74 0 77 78 85 417 1387 0 54 138 0 76 98 64 467 980 0 68 85 0 86 75 67 532 1095 0 69 84 0 75 80 381 2867 6452 Согласно данным таблицы 4 на участке №2 и №3 количество автомобилей больше, чем на участке №1, где нет грузового автотранспорта. Наибольшее количество автомобилей по всем группам на участке №3. В таблице 5 приведены средние значения компонентов выбросов, сделанные по расчетам Приложение 3. Исследуемые участки можно отнести: №1 – к слабо загрязненному, № 2 - к загрязненному, а № 3 - к сильно загрязненному. Таблица 5 47 Удельные значения выбросов автомобилей в зоне регулируемого перекрестка (в г/мин., среднее ± SD, n=5) Вещество Средние значения выбросов, в г/мин №1 Ул. Кремлевская №2 Ул. Татарстана №3 Ул. Горьковское шоссе 266.7±35.6 2137.5±378.8 4740.9±793.7 NOX(в расчете на NO2) CH 3.81±0.5 77.6±13.3 120.3±16.7 19.1±2.6 198.4±33.8 405.4±71.7 SO2 0.8±0.1 13.2±2.1 20.4±3 0.06±0.01 1.9±0.3 5.3±0.9 0.00015±0.0002 0.002±2.7 0.003±5 CO Формальдегид Бенз(а)пирен 3.2. Оценка количественного содержания флавоноидов в надземной массе Polygonumaviculare L.в зависимости от условий произрастания На диаграмме(рис. 13, Приложение 5, 6) представлены результаты определения содержания флавоноидов в образцах растений горца птичьего, собранных в разных с экологической точки зрения районах города Казани. В ходе исследования установлено, что растения собранные в различных экологических условиях, отличаются уровнем содержания флавоноидов. Наибольшее количество общей суммы флавоноидов в биомассе растений отмечено на участке №3 в июле (9%) и на участке №2 в августе (8%), что в 1.7 раз и 2.5 раза соответственно превышает количество флавоноидов на контрольном участке, а наименьшее - на участке №2 в мае (2.4%) и на участке №3 в июне (2.7%). В разные месяцы значения содержания флавоноидов варьировали: в мае и в июле они были выше на участке №3, а в июне, августе и сентябре – на участке №2 по сравнению с контрольным участком (№1). 48 Содержание флавоноидов (рутина), в % на сухую массу 10 dem o dem o - №1 - ул. Кремлевская - №2 - ул. Татарстан - №3 - ул. Горьковское шоссе dem o dem o dem o dem o dem o dem o dem o dem o dem o dem o dem o dem o dem o dem o dem o dem o dem o dem o dem o dem o dem o dem o dem o dem o dem o dem o dem o dem o dem o dem o 8 6 4 2 0 май июнь июль август сентябрь Месяцы Рис. 13.Содержание флавоноидов в траве PolygonumaviculareL. с трёх исследуемых участков в течение вегетационного периода ул. Кремлевская ул. Татарстан ул. Горьковское шоссе 1800 Общее количество машин, шт. 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200 0 май июнь июль август сентябрь Месяцы Рис. 14. Общее количество автомобилей на трёх исследуемых участках в исследуемый период 49 На рисунке 14 представлены значения общего количества автомобилей за исследуемый период. Отмечено, что на участке №3 в мае и июле наблюдается наибольшее количество флавоноидов и автомобилей; на участке №1 количество автомобилей было низким и относительно ровным, количество флавоноидов максимально в июне и июле. Известно, что количество флавоноидов может меняться не только в зависимости от выбросов, но и от онтогенеза [Минаева, 1978] имаксимальное содержание наблюдается в фазе цветения (середина июня - середина июля). На контрольном участке, где влияние автотранспорта незначительно, количество флавоноидов зависит от онтогенеза; на участках №2 и №3, где значимо воздействие автотранспорта, на количество флавоноидов влияют выбросы. Нами была рассчитана корреляция и выявлена прямая зависимость между количествами выбросов и флавоноидов. На рисунках15- 17(Приложения 7-9) представлены выявленные зависимости для участков №1 - №3. 50 270 260 250 4 230 220 июнь июль август сентябрь Удельные значения выбросов CH, в г/мин Месяцы 3,8 3,6 4 3,4 3,2 май 21 5 20 19 18 4 17 16 май июнь Удельные значения выбросов SO, в г/мин SO Флаваноиды 0,9 5 0,8 0,7 4 0,6 июль август сентябрь 0,066 5 0,064 0,062 0,060 0,058 0,056 4 0,054 0,052 0,050 Месяцы август сентябрь Удельные значения выбросов бенз(а)пирена,в г/мин 0,068 Содержание флавоноидов, в % от сухого веса Удельные значения выбросов формальдегида, в г/мин 0,070 июль август сентябрь R=0,8421R=0,8357 Формальдегид Флаваноиды июнь июль Месяцы июнь август сентябрь CH Флаваноиды 22 Месяцы май июль Месяцы R=0,8368R=0,8372 май июнь Содержание флавоноидов, в % от сухого веса май 5 4,0 0,00017 5 0,00016 0,00015 0,00014 4 0,00013 0,00012 R=0,8379R=0,8371 51 Бенз(а)пирен Флаваноиды 0,00018 май июнь июль Месяцы август сентябрь Содержание флавоноидов, в % от сухого веса 240 4,2 Содержание флавоноидов, в % от сухого веса 5 280 NO Флаваноиды 4,4 Содержание флавоноидов, в % от сухого веса 290 Удельные значения выбросов NO, в г/мин 300 Содержание флавоноидов, в % от сухого веса Удельные значения выбросов CO, в г/мин СО Флавоноиды 310 Рис. 15. Корреляционная зависимость между количеством компонентов 7 2200 6 2000 5 4 1800 3 1600 2 1400 июнь июль август сентябрь Месяцы 7 200 6 5 4 3 150 2 май июнь июль август сентябрь Месяцы Удельные значения выбросов SO, в г/мин 8 7 75 6 70 5 65 4 60 3 55 2 50 май 7 6 5 4 1.5 3 2 июль август сентябрь 9 14 8 13 7 12 6 11 5 4 10 3 9 2 8 май июнь июль август сентябрь Месяцы сентябрь Удельные значения выбросов бенз(а)пирена, в г/мин 8 2.0 Содержание флавоноидов, в % от сухого веса Удельные значения выбросов формальдегида, в г/мин 9 Месяцы август R=0,8216 Формальдегид Флаваноиды июнь июль SO Флаваноиды R=0,7318 май июнь R=0,8422 Содержание флавоноидов, в % от сухого веса Удельные значения выбросов CH, в г/мин 9 8 80 Месяцы R=0,6932 CH Флаваноиды 9 85 R=0,862 Бенз(а)пирен Флаваноиды 0,0019 9 0,0018 8 0,0017 7 0,0016 6 0,0015 5 0,0014 0,0013 4 0,0012 3 0,0011 2 май июнь июль Месяцы август сентябрь Содержание флавоноидов, в % от сухого веса май 90 Содержание флавоноидов, в % от сухого веса 8 2400 NO Флаваноиды Содержание флавоноидов, в % от сухого веса 9 2600 Удельные значения выбросов NO, в г/мин CO Флаваноиды Содержание флавоноидов, в % от сухого веса Удельные значения выбросов CO, в г/мин выбросов автотранспорта и флавоноидов на участке №1 R=0,7595 Рис. 16. Корреляционная зависимость между количеством компонентов выбросов автотранспорта и флавоноидов на участке №2 52 8 7 5000 6 5 4 3 4000 2 май июнь июль август сентябрь Месяцы NO Флаваноиды 10 9 140 8 7 6 120 5 4 3 100 2 май июнь июль август сентябрь Месяцы Содержание флавоноидов, в % от сухого веса 9 Удельные значения выбросов NO, в г/мин 10 6000 Содержание флавоноидов, в % от сухого веса Удельные значения выбросов СO, в г/мин CO Флаваноиды 9 500 8 7 6 5 400 4 3 2 июнь июль август сентябрь Месяцы 26 10 25 9 24 8 23 7 22 6 21 5 20 4 19 3 18 17 2 май 8 3,0 7 6 5 4 2,5 3 2 Месяцы август сентябрь Удельные значения выбросов бенз(а)пирена, в г/мин 9 Содержание флавоноидов, в % от сухого веса Удельные значения выбросов формальдегида, в г/мин 10 июль август сентябрь R=0,9968 Формальдегид Флаваноиды июнь июль Месяцы R=0,9941 май июнь R=0,9959 Бенз(а)пирен Флаваноиды 0,0040 10 0,0038 9 0,0036 8 7 0,0034 6 0,0032 5 0,0030 4 0,0028 3 0,0026 2 май июнь июль Месяцы август сентябрь Содержание флавоноидов, в % от сухого веса май SO Флаваноиды Содержание флавоноидов, в % от сухого веса 10 Удельные значения выбросов SO, в г/мин CH Флаваноиды Содержание флавоноидов, в % от сухого веса Удельные значения выбросов CH, в г/мин R=0,9914 R=0,9972 R=0,9943 Рис. 17. Корреляционная зависимость между количеством компонентов выбросов автотранспорта и флавоноидов на участке №3 53 Как видно из графиков, значения корреляции являются высокими для всех участков, но особенно высокий коэффициент корреляции наблюдали на участке №3, который выделен по нашим данным, как сильно загрязненный (см. таблица 5). Исходя содержание из полученных флавоноидов результатов, изменяется под можно заключить, воздействием что загрязнения автомобильным транспортом, что подтверждается и литературными данными [Гусев и др, 2004]. Отмеченный факт свидетельствует об изменении хода метаболических вынужденных процессов и адаптироваться фитохимического состава к выбросами загрязненной растений, среде. Следовательно, данный признак может быть использован в качестве диагностического. 3.3. Исследование суммарного содержания хлорофилла и соотношения его форм в растениях Polygonumaviculare L. На рисунке 18 приведена диаграмма зависимости суммарной Содержание хлорофиллов (a+b), мг/г сухого веса концентрации хлорофиллов от степени загрязненности участков. ул. Кремлевская ул. Татарстан ул. Горьковское шоссе 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 май июнь июль Месяцы 54 август сентябрь Рис. 18. Содержание хлорофиллов (а+в) в растениях горца птичьего исследуемых участков В целом, исходя из полученных нами данных, показатель суммы пигментовизменялся неоднозначно. На участке №2 содержание хлорофиллов на протяжении всех месяцев, кроме сентября, было выше содержания хлорофиллов на контрольном участке (№1). А на участке №3 значения скакали по месяцам: в мае, июле и сентябре содержание хлорофиллов было выше, а в июне и августе – ниже по сравнению с участком №1. Наибольшего количества сумма хлорофиллов по сравнению с контрольным участком достигла на участке №2 (1.5 мг/г) и на участке №3 (1.8 мг/г) в июле. Это вероятно связано с тем, что это время самого активного вегетационного периода (цветение), когда растению нужно больше энергии. На участке №3 в июле наблюдается максимальное количество содержания и флавоноидов (см. рис. 13) и хлорофиллов, возможно, что в данном случае флавоноиды выполняют защитную функцию относительно пигментного аппарата растений, что и приводит к резкому увеличению содержания хлорофиллов а и b. Отношение Хлa/Хлb 2,0 1,5 1,0 ул. Кремлевская ул. Татарстан ул. Кремлевская ул. Горьковское шоссе 0,5 0,0 май июнь июль 55 август сентабрь Рис. 19. Отношение содержания хлорофилла a к содержанию хлорофилла b Известно, что физиологическая адаптация может проявляться в изменениисоотношения содержания хлорофиллов a и b по сравнению с контролем[Черкашина и др., 2007]. Отношение Хл(а)/Хл(b) (рис. 19) у растений горца птичьего возрастает в ходе жизненного цикла, что свидетельствует об адаптации фотохимического аппарата к негативному влиянию атмосферных загрязнителей [Тарчевский, 2000]. Нами была рассчитана зависимость между количеством хлорофилла (a+b) и выбросами автотранспорта (рис. 20 - 22). 56 1.2 270 1.1 260 1.0 250 0.9 240 0.8 230 0.7 220 май июнь июль август сентябрь Месяцы 1,3 20 1,2 1,1 19 1,0 18 0,9 17 0,8 16 0,7 май июнь июль август сентябрь Месяцы Удельные значения выбросов SO, в г/мин 1,4 21 1,3 0,066 1,2 0,064 0,062 1,1 0,060 1,0 0,058 0,056 0,9 0,054 0,8 0,052 0,7 0,050 май июнь июль Месяцы август сентябрь 20. 0,9 3,4 0,8 3,2 0,7 май июнь июль август сентябрь SO Хлорофилл 0,9 1,4 1,3 1,2 0,8 1,1 1,0 0,7 0,9 0,8 0,7 0,6 май июнь июль август сентябрь R=0,3371 Бенз(а)пирен Хлорофилл 0,00018 1,4 0,00017 1,3 0,00016 1,2 1,1 0,00015 1,0 0,00014 0,9 0,00013 0,8 0,7 0,00012 R=0,3369 Рис. 1,0 3,6 Удельные значения выбросов бенз(а)пирена, в г/мин 1,4 0,068 Содержание хлорофиллов (а+b), мг/г сухого веса Удельные значения выбросов формальдегида, в г/мин Формальдегид Хлорофилл 1,1 3,8 Месяцы R=0,3365 0,070 1,2 R=0,3381 Содержание хлорофиллов (а+b), мг/г сухого веса Удельные значения выбросов CH, в г/мин CH Хлорофилл 4,0 Месяцы R=0,3375 22 1,3 Содержание хлорофиллов (а+b), мг/г сухого веса 280 1,4 4,2 Содержание хлорофиллов (а+b), мг/г сухого веса 290 NO Хлорофилл 4,4 май июнь июль Месяцы август сентябрь Содержание хлорофиллов (а+b), мг/г сухого веса 1.3 Удельные значения выбросов NO, в г/мин 1.4 300 Содержание хлорофиллов (а+b), мг/г сухого веса Удельные значения выбросов CO, в г/мин CO Хлорофилл 310 R=0,3373 Корреляционная зависимость между количеством компонентов выбросов автотранспорта и хлорофилла (a+b) на участке №1 в исследуемый период 57 1,2 2000 1,0 1800 0,8 1600 0,6 1400 май июнь июль август сентябрь Месяцы 80 1,2 70 60 0,6 50 май 1,2 1,0 0,8 150 0,6 август сентябрь Месяцы Удельные значения выбросов SO, в г/мин 1,4 июль 1,2 1,0 1,5 0,8 0,6 май июнь июль Месяцы август сентябрь R=0,4696 Рис. 21. июль август сентябрь SO Хлорофилл 1,8 14 1,6 13 1,4 12 1,2 11 1,0 10 0,8 9 0,6 8 май июнь июль август сентябрь R=0,3413 Удельные значения выбросов бенз(а)пирена, в г/мин 1,4 Содержание хлорофиллов (а+b), мг/г сухого веса Удельные значения выбросов формальдегида, в г/мин 1,8 1,6 2,0 июнь Месяцы R=0,1165 Формальдегид Хлорофилл 0,8 55 Месяцы Содержание хлорофиллов (а+b), мг/г сухого веса Удельные значения выбросов CH, в г/мин 1,8 200 июнь 1,0 65 R=0,4074 1,6 май 1,4 75 R=0,0785 CH Хлорофилл 1,6 85 Содержание хлорофиллов (а+b), мг/г сухого веса 1,4 2200 1,8 90 Содержание хлорофиллов (а+b), мг/г сухого веса 1,6 2400 NO Хлорофилл Бенз(а)пирен Хлорофилл 0.0019 0.0018 1.8 1.6 0.0017 1.4 0.0016 1.2 0.0015 0.0014 1.0 0.0013 0.8 0.0012 0.6 0.0011 май июнь июль Месяцы август сентябрь Содержание хлорофиллов (а+b), мг/г сухого веса 2600 Удельные значения выбросов NO, в г/мин 1,8 Содержание хлорофиллов (а+b), мг/г сухого веса Удельные значения выбросов CO, в г/мин CO Хлорофилл R=0,2022 Корреляционная зависимость между количеством компонентов выбросов автотранспорта и хлорофилла (a+b) на участке №2 в исследуемый период 58 1,8 1,6 1,4 1,2 1,0 4000 0,8 май июнь июль август сентябрь Месяцы 1,6 1,4 1,2 1,0 0,8 июнь июль август сентябрь Месяцы Удельные значения выбросов SO, в г/мин 1,8 Содержание хлорофиллов (а+b), мг/г сухого веса Удельные значения выбросов СН, в г/мин 2,2 2,0 май 1,6 1,4 1,2 1,0 2,5 0,8 май июнь июль Месяцы август сентябрь R=0,9602 Рис. 22. 1,2 1,0 0,8 100 май июнь июль август сентябрь SO Хлорофилл 2,2 26 2,0 25 24 1,8 23 1,6 22 1,4 21 20 1,2 19 1,0 18 0,8 17 май июнь июль август сентябрь R=0,9481 Удельные значения выбросов бенз(а)пирена, в г/мин 1,8 Содержание хлорофиллов (а+b), мг/г сухого веса Удельные значения выбросов формальдегида, в г/мин 2,2 2,0 3,0 1,4 120 Месяцы R=0,9516 Формальдегид Хлорофилл 1,6 R=0,9507 500 400 1,8 140 Месяцы R=0,9276 CH Хлорофилл 2,0 Содержание хлорофиллов (а+b), мг/г сухого веса 5000 2,2 Содержание хлорофиллов (а+b), мг/г сухого веса 2,0 NO Хлорофилл Бенз(а)пирен Хлорофилл 2,2 0,0040 2,0 0,0038 1,8 0,0036 1,6 0,0034 1,4 0,0032 0,0030 1,2 0,0028 1,0 0,8 0,0026 май июнь июль Месяцы август сентябрь Содержание хлорофиллов (а+b), мг/г сухого веса 6000 Удельные значения выбросов NO, в г/мин 2,2 Содержание хлорофиллов (а+b), мг/г сухого веса Удельные значения выбросов CO, в г/мин CO Хлорофилл R=0,9371 Корреляционная зависимость между количеством компонентов выбросов автотранспорта и хлорофилла (a+b) на участке №3 в исследуемый период 59 Из рисунков 20, 21 и расчетов коэффициента корреляции (R) видно, что зависимость между содержанием хлорофиллов (а+b) и компонентами выбросов наблюдалось только в отдельные периоды онтогенеза (в основном в период с мая по июнь). В целом, коэффициенты корреляции между отдельными компонентами выбросов и содержанием флавоноидов были низкими. Как видно из графиков (рис. 22), на самом загрязненном участке (№3) обнаружена высокая прямая корреляционная зависимость между содержанием хлорофиллов (а+b)и компонентами выбросов.Коэффициенты корреляции для всех исследованных компонентов составляли 0.92 – 0.96. Ранее была показана высокая прямая корреляционная зависимость между содержанием флавоноидов и компонентов выбросов для этого участка (см. рис. 17). Представляло интерес выяснить степень зависимости изменения содержания флавоноидов и хлорофиллов (а+b). Произведенные расчеты (Приложение 4) показали, что на участке №3 действительно наблюдается высокая корреляционная зависимость (R=0.9406) между этими двумя биологически активными соединениями. Известно, метаболизма, что может неспецифической Шакирова, воздействием индуцируя повышать общие устойчивости[Ishikamaetal., 2001]. свидетельствует стресс, об Можно предположить, изменении хода физико-химических обитания[Тарчевский, 2000]. 60 избыточную активацию адаптивные механизмы 1995; Francoetal., 1999; что отмеченный факт метаболических процессов под характеристик среды Выводы 1. Согласно методике определения выбросов автотранспорта участки определены как: №1 (ул. Кремлевская) – слабо загрязненный, №2 (ул. Татарстан) - загрязненный, а №3 (ул. Горьковское шоссе) - сильно загрязненный. 2. Суммарное содержание флавоноидов и хлорофиллов в траве PolygonumaviculareL. изменялось в течение вегетационного периода на исследуемых участках.Наибольшего количества флавоноиды в биомассе растений достигали на участке №3 в июле (9%) и на участке №2 в августе (8%), что в 1.7 раз и 2.5 раза соответственно превышало количество флавоноидов на контрольном участке. Сумма хлорофиллов на участках №2 (1.5 мг/г) и №3 (1.8 мг/г) также максимальна в июле. Расчет показал высокую корреляционную зависимость (R=0.9406) между изменением флавоноидов и хлорофиллов (а+b) на участке №3. 3. Выявлена высокая корреляционная зависимость между отдельными компонентами выбросов (CO, NO2, CH, SO2, формальдегид и бенз(а)пирен) и содержанием флавоноидов на всех участках (Rот 0.69 до 0.99) и между содержанием хлорофиллов (а+b) и этими же компонентами выбросов на участке №3 (R от 0.93 до 0.96). 4. Содержание биологически активных веществ - флавоноидов и хлорофиллов - в растениях горца птичьего (PolygonumaviculareL.), собранных в разных с экологической точки зрения районах города Казани, отличалось и изменялось в зависимости от степени загрязнения атмосферного воздуха. 61 Литература 1. Андрианова Ю.Е., Тарчевский И.А. Хлорофилл и продуктивность растений. М.,2000. – 135 с. 2. Александров Ю.И., Беляков В.И. Погрешность и неопределенность результата химического анализа // Журнал аналитической химии. - 2002. Т. 57. - №2. - С. 118-129. 3. Беликов В.В. Оценка содержания флаванонол-производных в плодах Silybummarianum (L.) Gaertn. // Растительные ресурсы. 1985. - Т. 21. - Вып. 3. - С. 350-358. 4. Беликов В.Г. Фармацевтическая химия: учебник для высш. шк. / В.Г.Беликов - М.: МЕДпресс-информ, 2007. - 624 с. 5. Биохимия фенольных соединений / ред. Дж. Харборн. М., 1968. - 451 с. 6. Благовещенский А.В. Биохимическая эволюция цветковых растений. М.: Наука, 1966. - 327 с. 7. Великанова Н.А., Сливкин А.И., ГапоновС.П. флавоноидов экологической травой горца точки зрения птичьего, районах Изучение накопления собранного города в разных Воронежа и с его окрестностей// Вестник ВГУ. Серия: Химия. Биология. Фармация. - 2013. - №1. - С. 181 - 185. 8. Высочина Г.И., Шалдаева Т.М., Коцупий О.В., Храмова Е.П. Флавоноиды мари белой (Сhenopodiumаlbum L.), произрастающей в Сибири// Химия растительного сырья. - 2009. - №4. - С. 107-112. 9. Гавриленко В.Ф., Гусев М.В., Никитина К.А., Хоффман П. Главы физиологии расстений. М., 1986. 10. Георгиевский В.П., Рыбаченко А.И. Физико-химические и аналитические характеристики флавоноидных соединений// Северо-Кавказский научный центр высш. шк. - Ростов-на-Дону: университета, 1988. - 143 с. 62 Издательство Ростовского 11.Головкин Б.Н., Руденская Р.Н., Трофимова А.И., Шретер А.И. Биологически активные вещества растительного происхождения. В 3-х томах. Том 3. М.: Наука, 2002. - 216 с. 12. Гончарова Т.А. Энциклопедия лекарственных растений. - М.: Дом МСП, 1997. 13. ГОСТ 24027.0-80. Правила приемки и методы отбора проб. - Введ. 1981 01 - 01. - М.: Изд-во стандартов. - 5 с. 14. ГОСТ 24027.2-80. Сырье лекарственное растительное. Методы определения влажности, содержания золы, экстрактивных веществ, эфирного масла. - Введ. 1981 - 01 - 01. - М.: Изд-во стандартов. - 10 с. 15. Государственная фармакопея СССР. 11-е изд. М., 1990. , Вып. 2. - 398 с. 16. Гусев Н.Ф., Немерешина О.Н. Влияние техногенного загрязнения на содержание флавоноидов в растениях семейства норичниковых Степного Предуралья // Вестник ОГУ. - 2004. - №10. - С.123-126. 17. Денисов В. Н., Рогалев В. А. Проблемы экологизации автомобильного транспорта. - СПб.: МАНЭБ, 2005. – 311 c. 18. Елагина Д.С., Воробьев В.Н., Архипова Н.С. Влияние условий произрастания на содержание флавоноидов в листьях мари белой (Chenopodium albumL.) // Труды второй международной научно – практической конференции молодых ученых «Индикация состояния окружающей среды: теория, практика, образование». - 2013. – С.158-163. 19.Жапова О.И. Эколого-фитоцинотическая приуроченность HemerocallisminorMiller и накопление в нем биологически активных веществ (Забайкалье) / Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук; ред. Т.Н. Чудинова. Издательство ВСГТУ, 2006 г. 20.Жегалин О. И., Лупачев П. Д. Снижение токсичности автомобильных двигателей. М., Транспорт, 1985. 21.Запрометов М.Н. Основы биохимии фенольных соединений. М., 1974. 123 с. 63 22. Иванов В.Б., Плотникова И.В., Живухина Е.А. и др. Практикум по физиологии растений: учебное пособие для студ. высших пед. учеб.заведений; под ред. В.Б. Иванова. - 2-е изд., испр. - М.: Издательский центр «Академия», 2004. - 144 с. 23. Ильин В.Б. Элементарный химический состав растений. - Новосибирск: Наука, 1985. - 129 с. 24.Каталог мировой коллекции ВИР. Ред. Агаев М. Г. Л.: ВИР, 1988. - C. 1113. 25.Каухова, И. Е. Особенности экстрагирования биологически активных веществ двухфазной системой экстрагентов при комплексной переработке лекарственного растительного сырья // Растительные ресурсы. - 2006. - Т. 42. - Вып. 1. - С. 82-91. 26.Кенжебаева С.Т., Кульмагамбетова Э.А., Прибыткова Л.Н., Адекенов С.М. ФлавоноидыAchilleaglabellaKar. EtKir. Физиолого-биохимические аспекты изучения лекарственных растений. Материалы междунар. совещ., посвящено памяти Минаевой В.Г. Новосибирск, 1998. - С. 56. 27. Киселева Т.Ф. "Технология сушки: Учебно-методический комплекс" / Кемеровский технологический институт пищевой промышленности. Кемерово, 2007. - 117 с. 28.Латыпова Г.М., Романова З.Р., Бубенчикова В.Н., Аюпова Г.В. Исследование качественного и количественного состава флавоноидных соединений густого экстракта первоцвета лекарственного // Химия растительного сырья. - 2009. - №4. - С. 113-116. 29.Лобанова А.А., Будаева В.В., Сакович Г.В. Исследование биологически активных флавоноидов в экстрактах из растительного сырья // Химия растительного сырья. - 2004. - №1. - С. 47–52. 30. Ложкин В. Н., Демочка О. И. Экспериментально - расчетная оценка выбросов вредных веществ с отработавшими газами ДВС на эксплуатационных режимах работы. Технический отчет по НИР. С - Пб., НПО ЦНИТА, 1990. 64 31.Ломбоева С.С., Танхаева Л.М., Оленников Д.Н. Динамика накопления флавоноидов в надземной части ортилии однобокой (Orthiliasecunda (L.)House) // Химия растительного сырья. - 2008. - №3. - С. 83-88. 32. Медведев С.С. Физиология растений. Спб.: Изд-во С.-Петерб. Ун-та, 2004. - 336 c. 33. Минаева В.Г. Флавоноиды в онтогенезе растений и их практическое использование. Новосибирск, 1978. - 252 с. 34. Михайлова Е. А., Полтасова А. Г., Скочилова Е. А. Влияние выбросов автотранспорта на пигментную систему растений // Принципы и способы сохранения биоразнообразия: материалы V Международной научной конференции: в 2 ч. / Map. гос. ун-т. – Йошкар-Ола, 2013. – Часть II. – 2013. 35. Муравьева Д.А., Самылина И.А, Яковлев Г.П. Фармакогнозия. - М.: Медицина, 2002. 36.Николайкин М.И. Экология: Учебник для вузов 3 е изд. – М.: Дрофа 2004. - 624 с. 37.Ноздрюхина Л.Р., Гринкевич Н.И. Нарушение микроэлементного обмена и пути его коррекции. М.: «Наука», 1980. - 280 с. 38. Олешко Г.И., Зеленина М.В., Вотинова Т.И., Марценюк В.Б., Елабугина О.В., Челпанова Е.В. Влияние условий обитания на накопление флавоноидов некоторыми видами рода вероника и брусника региона Урала // Мат. юбилейной науч-практ. конференции, посв. 60-летию Пермской государственной фармацевтической академии. Пермь: ПГФА, 1997. - С. 15-16. 39. Павлова Е.И. Экология транспорта: Учебник для вузов. – М.: Транспорт, 2000. - 248 с. 40. Тимирязев К.А. Жизнь растения: 10 общедоступных чтений К.А. Тимирязева. – Изд. 8-е. – М., 1914. – 360 с. 41.Тарчевский И.А. Элиситор-индуцируемые сигнальные системы и их взаимодействие // Физиология растений. - 2000. - Т. 47, №2. - С. 321-331. 65 42.Трембаля Я.С. Влияние микроудобрений на сезонный ритм развития тысячелистника обыкновенного в условиях культуры // Сб. науч. тр., Курский гос. мед.ун-т. - Курск, 1997. - С. 172-174. 43.Флора СССР, т. 5. Ред. Комаров В. Л. M.- Л.: AН СССР, 1986. - С. 614-618. 44. Фролов А.К., Горышина Т.К. Особенности фотосинтетического аппарата некоторых древесных пород в городских условиях // Ботан. журн., 1982. Т. 67, вып. 5. - С. 599-609. 45.Харборн Дж. Введение в экологическую биохимию. М., 1985. - 312 с. 46.Храмова Е.П., Высочина Г.И., Тарасов О.В., Куценогий К.П., Крылова Е.И., Трубина Л.К., Сыева С.Я. Биохимические механизмы адаптации растений в условиях радиационного воздействия // Химия в интересах устойчивого развития - 2008. - №16. - С. 1-9. 47.Шакирова Ф.М. Неспецифическая устойчивость растений к стрессовым факторам и ее регуляция. - Уфа: Гилем, 2001. - 160 с. 48. Шлык А.А. Определение хлорофиллов и каротиноидов в экстрактах зеленых листьев // Биохимические методы в физиологии растений. М.: Наука, 1971. С. 154-170. 49. Черкашина М.В., Петухова Г.А. Влияние техногенной нагрузки на изменение содержания пигментов фотосинтеза и степени окраски древесных и травянистых растений // Современные наукоемкие технологии. - 2007. - № 5 - С. 81-82. 50. Яковлева, Г.П. Лекарственное сырье животного и растительного происхождения. Фармакогнозия./ Г.П. Яковлева -Спб.: Спецлит, 2006. 845с. 51. Якушкина Н.И., Бахтенко Е.Ю. Физиология растений. М.: Гуманитар. изд. центр ВЛАДОС, 2005. - 463 c. 52.Badger M.R., Andrews T.J. Effect of CO2, O2and temperature on a high affinity form of ribulosediphosphatecarboxylase from spinach // Biochem. Biophys. Res. Communs. — 1974. – V.60, №1. — P. 204–260. 66 53.Cook N.C., Samman S. Flavonoids -сhemistry, metabolism, cardioprotective effects, and dietary sources // J. Nutrit.Boichem. 1996. V. 7. №2. Р. 66-76. 54.Franco E., Alessandrelli S. Modulation of D1 protein turnover under cadmium and heat stress monitored by [35S] methionine incorporation // Plant Sci. - 1999. - V. 144. - P. 53-61. 55.Geissman T.A. The chemistry of Flavonoid compounds. Pergamon Press., New.Jork., 107. Oxford-London, 1982. 56.Gollmick F., Neubert P., Vielemeyer H.P. Moglickeiten und Grenzen der Pflanzenanalysebei der Ermittlung des MineralstoffbedarfslandwirtschaflicherKylturpflanzen. - Fortschrittsberichte fur dieLandwirtschaft und Nabrungsguterwirtschaft, 1970, Bd. 8, H. 4 - S. 5-83. 57.Harbome J.B., Williams C.A. Advances in flavonoid research since 1992 // Phytochemistry.-2000. - Vol. 55. - P. 481-504. 58.Havsteen B. Flavonoids, a class of natural products of high pharmacological potency // Biochem. Pharmacol. 1983. V. 32. № 7. P. 1141-8. 59.Ibrahim L.F., Kawashty S.A., Baiuomy A.R., Shabana M.M., El-Eraky W.I., El-Negoumy S.I. A comparative study of the flavonoids and some biological activities of two Chenopodium species // Chem. Nat. Comp. 2007. V. 43. №1.P. 24-28. 60.Ishikama M., Robertson A.J., Gusta L. Comparation of viability tests for assessing cross-adaptation to freezing, heat salt stress induced by abscisic in bromegrass (Bromusinermisleyss) suspension culture cells // Plant Sci. - 1995. V. 107. - P. 83-93. 61.Rahiminejad M.R., Gornall R.J. Flavonoid evidence for allopolyploidy in the Chenopodium album aggregate (Amaranthaceae)// Plant Syst. Evol. 2004. V. 246. №1-2. P. 77-78. 62.Rice-Evans С.A., Miller N.J. Antioxidant activities of flavonoids as bioactive components of food // Biochem. Soc.Trans. 1996. V. 24. №3. P. 790-795. 63.Горец птичий / Лекарственные растения. URL: http://medicalherbs.scilib.com/herbs042.html (дата обращения 22.03.2014). 67 64. Ежемесячные справки о состоянии окружающей среды на территории республики Татарстан (расчетные характеристики уровня загрязнения по обощенным за месяц материалам о состоянии окружающей среды) / Мониторинг // Федеральное государственное бюджетное учреждение Управление по гидрометеорологии среды Республики и мониторингу Татарстан, окружающей 2014. URL: http://www.tatarmeteo.ru/pub/spravka.pdf (дата обращения 10.05.2014) 65.Методика определения выбросов автотранспорта для проведения сводных расчетов загрязнения атмосферы городов / Помощь по ГОСТам, 1999. URL: http://www.gosthelp.ru/text/Metodikaopredeleniyavybro.html (дата обращения 10.02.2014) 66.Флавоноиды, общая характеристика / Частная фармакогнозия // Зеленая аптека, 2013. URL: http://www.fito.nnov.ru/special/glycozides/flavo/ (дата обращения 15.04.2014) 67. Хранение, упаковка и маркировка лекарственного растительного сырья / Общая фармакогнозия // Зеленая аптека, http://www.fito.nnov.ru/common/common_04.phtml/ 15.04.2014) 68 (дата 2013. URL: обращения
