Жизнестойкость популяции scenedesmus

Электронный научный журнал «ИССЛЕДОВАНО В РОССИИ»
2326 http://zhurnal.ape.relarn.ru/articles/2006/245.pdf
Жизнестойкость популяции scenedesmus quadricauda при
разных режимах интоксикации серебром
Дмитриева А.Г., Бойчук Т.В., Филенко О.Ф. (ofilenko@mail.ru)
Московский государственный университет им. М. В. Ломоносова
Одним из основных свойств любой популяции, определяющим ее
существование и развитие, является гетерогенность. Особи, составляющие
популяцию, отличаются по возрасту, размерам, физиологической активности,
скоростям роста, а также по реакциям на изменение условий обитания. Именно
неоднородность качественного состава популяции обеспечивает ее устойчивость и
адаптацию к внешним условиям [1, 2, 3].
Важной динамической переменной является уровень жизненной активности
каждого отдельного организма (клетки), оценка которой дает основание судить о
функциональной гетерогенности популяции. При помощи люминесцентной
микроскопии, как известно, можно выявить жизненное состояние клетки (живая,
мертвая, отмирающая), а для оценки способности клеток к выживанию и
размножению был разработан метод микрокультур [4, 5], позволяющий выявить
возможные перестройки в популяции как в норме, так и при интоксикации.
Токсическая нагрузка позволяет, с одной стороны, оценить общую резистентность
клеток, входящих в популяцию, а с другой стороны, модифицирует их
жизнестойкость.
В качестве токсиканта мы использовали нитрат серебра, как представителя
группы тяжелых металлов. Соединения серебра давно используются для
обеззараживания
воды.
Олигодинамическое
действие
серебра
на
клетки
водорослей и бактерий было известно еще исследователям XIX века. В 1883 г.
Негели обнаружил, что пресноводные водоросли отмирают в сосуде с водой, на дне
которого находятся предметы из серебра и меди. Позднее подобные опыты были
поставлены с амебами, инфузориями, клетками высших растений и различными
видами бактерий. Результаты таких исследований отражены, в частности, в обзоре
А. Г. Дмитриевой с соавторами [6]. Серебросодержащие соединения применяются
для стерилизации воды [7]. Токсическое действие тяжелых металлов, в том числе и
Электронный научный журнал «ИССЛЕДОВАНО В РОССИИ»
2327 http://zhurnal.ape.relarn.ru/articles/2006/245.pdf
серебра, на микроводоросли в значительной степени зависит от их вида, состава
среды выращивания, плотности популяции и других факторов.
В связи с вышесказанным, целью нашей работы было исследование
структуры культуры водорослей при действии ионов серебра и возможности ее
восстановления после продолжительного токсического воздействия.
Объектом исследования являлась лабораторная альгологически чистая
культура зеленой хлорококковой водоросли Scenedesmus quadricauda (Turp.) Breb.
Культивирование водорослей проводили в колбах Эрленмейера на среде
Успенского № 1 в люминостате при интенсивности света до 5 тыс. люкс со сменой
дня и ночи (12:12 ч) и температуре 20-24 0С. Во избежание оседания клеток
водорослей и для обогащения культуры СО2 содержимое колб перемешивали 1-2
раза в сутки [8, 9].
Для синхронизации культуру, достигшую плотности не менее 2 млн. кл/мл,
отстаивали в темноте при комнатной температуре в течение 3 суток. Затем верхний
слой отстоявшейся культуры пересевали в чистую среду и подращивали 10-15
суток. Этим же способом затем была проведена повторная синхронизация, и в
результате культура состояла исключительно из молодых, активно делящихся
клеток. Для опытов использовали культуру, находящуюся в начальной фазе
логарифмического роста (возраст – 7-10 суток) при исходной плотности 100-200
тыс. кл/мл. В качестве токсиканта использовали соль AgNO3 в концентрациях
0,0001; 0,001; 0,01 мг Ag/л. Испытания при каждой концентрации проводили в трех
повторностях.
После 30-суточной экспозиции при концентрации 0,01 мг Ag/л (I этап)
водоросли отфильтровывали через мембранные фильтры № 4 при помощи
водоструйного насоса, доводили численность клеток до исходной и перемещали в
среду с концентрацией нитрата серебра 0,1 мг Ag/л. Через 30 суток (II этап) клетки
в очередной раз отмывались и заново перемещались в такую же концентрацию (III
этап). После 30-суточной повторной экспозиции при концентрации 0,1 мг Ag/л
водоросли снова были отфильтрованы, отмыты дистиллированной водой и для
оценки возможности восстановления культуры пересеяны в чистую среду, не
содержащую токсиканта (IV этап).
Таким образом, общая схема опыта включала следующие этапы:
Электронный научный журнал «ИССЛЕДОВАНО В РОССИИ»
№ этапа опыта I
II
2328 http://zhurnal.ape.relarn.ru/articles/2006/245.pdf
III
IV
Условия
0,01 мг Ag/л → 0,1 мг Ag/л → 0,1 мг Ag/л → Чистая среда
этапа
30 сут
30 сут
30 сут
30 сут
Численность клеток определяли с помощью светового микроскопа в камере
Горяева [10]. Соотношение живых и мертвых клеток определяли с помощью
метода люминесцентной микроскопии [11, 12]. Оценку гетерогенности популяции
по способности клеток к выживанию и размножению проводили с помощью
метода микрокультур, позволяющего контролировать состояние и развитие
одиночных клеток. Основным показателем служило соотношение численности
делящихся, покоящихся и отмерших клеток в микрокультуре, что соответствует
соотношению
численностей
в
макрокультурах
(коэффициент
корреляции
удельного прироста клеток в макро- и микрокультурах составлял 0,96).
Статистическую обработку полученных результатов производили в соответствии с
«Методическим руководством по биотестированию воды» [9].
Влияние серебра в разных концентрациях на рост культур водоросли
показано на рис. 1.
140
% от контроля
120
100
80
60
40
20
0
0
5
10
15
20
25
30
35
сутки
контроль
0,0001 мг/л
0,001 мг/л
0,01 мг/л
Рис. 1 Относительная численность клеток Scenedesmus quadricauda в дважды
синхронизированной культуре при действии нитрата серебра
Существенное подавление роста отмечено только при концентрации серебра
0,01 мг/л, в то время как при 0,0001 и 0,001 мг Ag/л наблюдалась стимуляция.
Очевидно это связано с тем, что при малых концентрациях эффект металла
Электронный научный журнал «ИССЛЕДОВАНО В РОССИИ»
2329 http://zhurnal.ape.relarn.ru/articles/2006/245.pdf
компенсировался защитными механизмами клеток. Кроме того, катионы серебра
могли просто связываться компонентами внешней среды. Так, было показано, что
устойчивость водорослей в фазе логарифмического роста к токсикантам может
зависеть от выделения молодыми клетками метаболитов, способных связывать
потенциально вредоносные вещества в окружающей среде [13, 14]. Эти
метаболиты могли выполнять защитную функцию при малых концентрациях
токсиканта. Однако при более высокой концентрации такой защиты оказалось уже
недостаточно. По данным люминесцентной микроскопии после трех этапов
интоксикации в популяции оставались живыми единичные клетки (менее 1 %).
Фракционный клеточный состав культуры был исследован методом
микрокультур. Если в первые трое суток в контроле фракция покоящихся клеток
составляла 50% в популяции, то в дальнейшем преобладала фракция делящихся
клеток (рис.2).
а) без интоксикации (контроль)
б) 0,0001 мгAg/л
100%
100%
80%
80%
60%
60%
40%
40%
20%
20%
0%
0%
0-3
7-10
14-17 21-24 28-31
0-3
7-10
сутки
в) 0,001 мгAg/л
г) 0,01 мгAg/л
100%
100%
80%
80%
60%
60%
40%
40%
20%
20%
0%
0%
0-3
7-10
14-17 21-24 28-31
сутки
14-17 21-24 28-31
сутки
0-3
7-10
14-17 21-24 28-31
сутки
покоящиеся
отмершие
размножившиеся
Рис. 2. Фракционный состав микрокультур Scenedesmus quadricauda при действии
нитрата серебра
Через две недели популяция состояла только из размножающихся клеток, а к
концу опыта они составили 60%. При концентрации 0,0001 мг Ag/л наблюдалось
постепенное снижение числа покоящихся клеток и увеличение делящихся, число
которых к концу опыта составило 92%. Наибольшая численность покоящихся
Электронный научный журнал «ИССЛЕДОВАНО В РОССИИ»
2330 http://zhurnal.ape.relarn.ru/articles/2006/245.pdf
клеток (до 96%) обнаружена при концентрации 0,001 мг Ag/л в конце опыта (28-31
сутки), т.е. происходило торможение процессов клеточного деления, тогда как при
других концентрациях, наоборот, наблюдалась стимуляция этого процесса. При
концентрации 0,01 мг Ag/л число делящихся клеток снижалось в первые 10 суток
опыта (до 8,3%). Затем происходило увеличение числа размножающихся клеток за
счет снижения доли покоящихся. К концу опыта популяция в этой концентрации
серебра была представлена в основном размножающимися клетками (75%) при
пониженной общей численности клеток.
В 90-дневном опыте (первые три этапа) с изменяющимся концентрационным
режимом сменилось не менее 30 генераций клеток при средней скорости деления
одной клетки 2-3 суток. Спустя 90 суток после отмыва дистиллированной водой
водоросли были перемещены в чистую среду (этап IV).
Восстановление культуры происходило медленно в течение 20 суток за счет
оставшихся живых клеток, а к концу опыта численность клеток увеличилась более
чем в 4 раза по сравнению с первоначальной. Если в первые 15 суток популяция
была представлена в основном покоящимися клетками (90%), то к концу опыта (на
28-30 сутки) культура состояла почти на 80% из размножившихся клеток, хотя
общая численность была низкой (почти в 5 раз ниже, чем в контроле). Тем не
менее,
за
счет
резерва
покоящихся
клеток
происходило
постепенное
восстановление культуры.
Структурный состав популяции после прекращения токсической нагрузки на
этапе IV был близок составу популяции после интоксикации при концентрации
0,01 мг Ag/л на этапе I (рис.3).
Это свидетельствует о том, что после прекращения токсической нагрузки в
процессе восстановления популяции проявляется либо материальная, либо
функциональная кумуляция серебра. Поэтому структурный состав популяции,
пережившей интоксикацию, после прекращения экспозиции отражал последствия
токсического воздействия и был сходен с составом, установленным после
первичного воздействия серебра при концентрации 0,01 мг Ag/л.
Электронный научный журнал «ИССЛЕДОВАНО В РОССИИ»
2331 http://zhurnal.ape.relarn.ru/articles/2006/245.pdf
А
Б
100%
100%
80%
80%
60%
60%
40%
40%
20%
20%
0%
0%
0 (контр.)
0.01
Ag мг/л
0' (контр.)
0.1--0
Ag мг/л
покоящиеся
размножившиеся
отмершие
Рис. 3. Фракционный состав культуры водоросли Scenedesmus quadricauda при
действии нитрата серебра на разных этапах экспозиции:
А – на 28 – 31е сутки в концентрации 0,01 мг Ag/л (I этап);
Б – на 26 – 28е сутки после перемещения из концентрации 0,1 мг Ag/л в чистую
среду (IV этап).
Известно представление об альгостатическом действии серебра, которое
заключается в подавлении роста популяции водорослей [9]. Такой эффект может
быть результатом либо подавления размножения, либо высокой смертности клеток,
практически равной численности вновь нарождающихся. Наши наблюдения за
микрокультурами показывают, что при действии разных концентраций серебра на
протяжении опыта реализуются оба этих механизма.
Если при концентрации 0,001 мг Ag/л спад численности клеток в первую
декаду был связан с повышенной смертностью, а после 15 суток - с подавлением
размножения, то при концентрации 0,0001 мг Ag/л он происходил, главным
образом, за счет повышенной смертности клеток.
Таким образом, альгостатический механизм серебра и других загрязнителей
окружающей среды может быть разносторонним, и метод микрокультур открывает
возможности для его исследований.
Сходство фракционного состава популяции S. quadricauda в чистой среде
(после тройной интоксикации) с составом после первичной экспозиции при 0,01 мг
Ag/л свидетельствует об активизации адаптационных механизмов клеток в период
первичной интоксикации.
Электронный научный журнал «ИССЛЕДОВАНО В РОССИИ»
2332 http://zhurnal.ape.relarn.ru/articles/2006/245.pdf
Литература
1. Строганов Н.С. 1973. Теоретические аспекты действия пестицидов на водные
организмы // Эксп. вод. токсикология. Рига: Зинатне. Вып. 5. С. 11-37.
2. Гапочка Л.Д. 1981. Об адаптации водорослей к токсическому воздействию. М.:
МГУ. 80 с.
3. Гроздинский Д.М. 1983. Надежность растительных систем. Киев: Наукова
думка. 365 с.
4. Филенко О.Ф., Дмитриева А.Г., Марушкина Е.В. 2004. Исследование структуры
модельной популяции водоросли Scenedesmus quadricauda методом раздельного
культивирования клеток // Сборник материалов. Международная научнопрактическая конференция МГУ-СУНИ «Человечество и окружающая среда».
26-28 октября 2004 года, Россия, Москва, МГУ им. М.В. Ломоносова. С. 190193.
5. Марушкина
Е.В.
2005.
Исследование
состояния
популяции
водоросли
Scenedesmus quadricauda в норме и при интоксикации методом микрокультур.
Автореф. дисс. М. 24 с.
6. Дмитриева А.Г., Кожанова О.Н., Дронина Н.Л. 2002. Физиология растительных
организмов и роль металлов. М.: Изд-во МГУ. 160 с.
7. Кульский Л.А. 1962. Серебряная вода. Киев. 60 с.
8. Успенская В.И. 1966. Экология и физиология питания пресноводных
водорослей. М.: МГУ. 124 с.
9. Методическое руководство по биотестированию воды РД 118-02-90, 1991. М. 48
с.
10. Владимирова М.Г., Семененко В.Е. 1962. Интенсивная культура одноклеточных
водорослей. М.: Изд-во АН СССР. 59 с.
11. Горюнова С.В. 1952. Применение метода флуоресцентной микроскопии для
определения
живых
и
мертвых
клеток
водорослей
//
Труды
ин-та
микробиологии АН СССР. М. Вып. 2. С. 64 – 78.
12. Дмитриева А.Г. 1988. Метод биотестирования по определению живых и
мертвых клеток водорослей с помощью люминесцентной микроскопии //
Методы биотестирования вод. Черноголовка. С. 85 – 89.
Электронный научный журнал «ИССЛЕДОВАНО В РОССИИ»
13. Сиренко
Л.А.
1970.
2333 http://zhurnal.ape.relarn.ru/articles/2006/245.pdf
Физиологические
основы
массового
размножения
синезеленых водорослей в водохранилищах и методы его регулирования.
Автореф. докт. дисс. Киев. 48 с.
14. Шестерин
И.С.
1972.
Изучение
причинных
связей,
определяющих
взаимоотношения зеленых протококковых водорослей на уровне метаболитов.
Автореф. дисс. М. 24 с.